DE69926057T2

DE69926057T2 - Didesoxy farbterminatoren

Info

Publication number: DE69926057T2
Application number: DE69926057T
Authority: DE
Inventors: Shiv Kumar; Satyam Nampalli; F. Bernard McARDLE; W. Carl FULLER
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: EP1060264A1; JP4306960B2; CA2319777C; WO1999040223A1; ATE299190T1; US6949635B1; AU2571799A; DE69926057D1; EP1060264A4; JP2002505853A; EP1060264B1; CA2319777A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Sequenzieren von Farbstoffterminatornucleinsäure und Reagenzien für ein derartiges Sequenzieren.
Hintergrund der Erfindung
Das Folgende ist eine Diskussion der relevanten Technik, von der keine als Stand der Technik für die beigefügten Ansprüche anerkannt wird.
Sequenzreaktionsprodukte müssen markiert werden. Dies kann ausgeführt werden unter Verwendung von markierten Primern, markierten Nucleotiden (üblicherweise radioaktive dNTPs) oder markierten ddNTP-Terminatoren. Die Verwendung von markierten Terminatoren besitzt den Vorteil, dass False-Stops undetektierbar bleiben.
DNA-Sequenzbänder besitzen nicht notwendigerweise einheitliche Intensitäten. Es ist nützlich, Bandintensitäts-Variabilität numerisch auszudrücken. Dies kann ausgeführt werden durch Angeben des Verhältnisses der maximalen zur minimalen Intensität von benachbarten Bändern (innerhalb eines Fensters von vielleicht 40 Basen), in einer DNA-Sequenz, oder mit einer Normierung und Korrektur eines systematischen „Drifts" in der Intensität durch Angeben des quadratischen Mittelwerts von Bandintensitäten (typischerweise Peak-Höhen) (Fuller, C.W., Comments 16 (3):1–8, 1989). Es ist vorteilhaft, Einheitlichkeit von Bandintensitäten zu haben, da die Sequenzgenauigkeit und Read-Length mit Bändern einer einheitlicheren Intensität verbessert wird.
Zum genauen Lesen muss die Mobilität eines beliebigen gegebenen Sequenzreaktionsproduktes durch das Elektrophoresegel mit einer Geschwindigkeit wandern, die proportional nur zu seiner Länge ist. Produkte, die schneller oder langsamer als normal für eine gegebenen Länge wandern, werden zu Sequenzungenauigkeiten oder Fehlern führen, die als „Kompressionen" bekannt sind.
Anormale Wanderungsgeschwindkeit kann durch Sekundärstruktur der DNA verursacht werden und ist offenbar die Ursache für die meisten „Kompressions"-Artefakte, die in Radioaktivmarkierungs- (und anderen) Sequenzierungsexperimenten bei GC-reichen Bereichen gesehen werden. Diese können oft durch die Verwendung von Analoga von dGTP, wie 7-deaza-dGTP oder dITP aufgelöst werden. Andere kompressionsartige Artefakte werden beobachtet, wenn einige mit Farbstoff markierte ddNTPs für das Sequenzieren verwendet werden. Mehrere Beispiele davon können in Lee, L.G., Connell, C.R., Woo, S.L., Cheng, R.D., McArdle, B.F., Fuller, C.W., Halloran, N.C., und Wilson, R.K., Nucleic Acids Res., 20:2471-2483, 1992 gesehen werden (siehe 4g, 4h und 6h unter Verwenden von ddCTP, das mit Tetramethylbodipy und TMR markiert ist, oder ddGTP, das mit Bifluor markiert ist). Diese kompressionsartigen Artefakte werden erzeugt, sogar in Sequenzen, die kompressionsfrei sind, wenn sie radioaktiv oder mit Farbstoffmarkierten Primern sequenziert werden. Diese Artefakte können manchmal durch Substituieren von dITP durch dGTP oder alpha-Thio-dNTPs durch normale Thio-dNTPS eliminiert werden (Lee, L.G. et al, Nucleic Acids Res., 20-2471-2483, 1992; US-Patent Nr. 5,187,085). Ähnliche Artefakte, die mit den Fluoresceinfarbstoffmarkierten ddNTPs gesehen werden, die durch Applied Biosystems für Farbstoff-Terminator-Sequenzieren mit T7 DNA-Polymerase verkauft wird, werden durch Substituieren von alpha-Thio-dNTPs durch normale dNTPs aufgelöst (Lee, L.G. et al., Nucleic Acids Res., 20:2471-2483, 1992; US-Patent 5,187,085).
Proben, J.M., Trainor, G.L., Dam, R.J., Hobbs, F.W., Robertson, C.W., Zagursky, R.J., Cocuzza, A.J., Jensen, M.A. und Baumeister, K., Science 238:336-41 (1987) führten ein Sequenzieren unter Verwenden von Terminatoren aus, die mit substituierten Succinyl-Fluoresceinen markiert waren, mit Linkern einer Länge von 10 Atomen, zusammen mit dATP, dCTP, dTTP, 7-deaza-dGTP und AMV-Reverse-Transkriptase und einem Fluoreszenz-detektierenden Instrument. Von 6 dieser Veröffentlichung ist klar, dass Gesamtbandintensitäten mehr als zehnfach variierten, viel mehr als die besten verfügbaren gegenwärtigen Verfahren, mit Farbstoff-Primern oder radioaktiven Markern.
US-Patent Nr. 5,558,991 (Trainor, G.I.) bezieht sich auf DNA-Sequenzieren und auf ein Verfahren zur DNA-Sequenzanalyse unter Verwenden des Sanger-Ketten-Terminations-Verfahrens, wodurch der Kettenterminator einen Reporter trägt. Bevorzugte Reporter sind Fluoreszenz-Farbstoffe, die auf dem Xanthen-Chromophor basieren.
Didesoxy-NTP-Terminatoren, die dieselbe grundlegende Struktur wie die Prober-et-al-Terminatoren (1987) besitzen, aber vier Rhodamin-Farbstoffe, die anstelle der Succinyl-Fluoresceine verwendet werden, und Linker von 5 Atomen in der Länge besitzen, wurden zum Sequenzieren mit Taq-Polymerase verwendet. Um diese Terminatoren zu verwenden, wird dITP anstelle von dGTP oder 7-deaza-dGTP verwendet, um schwerwiegende „Kompressions"-Artefakte zu eliminieren. Dieses Verfahren wurde ausgeführt, unter Verwenden einer klonierten Taq-DNA-Polymerase (Bergot, WO 9105060; Parker, L.T., Deng, Q., Zakeri, H., Carlson, C., Nickerson, D.A., Kwok, P.Y., Biotechinques 19(1):116-121, 1995) und mit einem Mutanten der Taq-Polymerase (D49G, AmpliTaq CS), dem eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität fehlt. Jedoch variieren die Bandintensitäten um soviel wie das Zwanzigfache, was die Genauigkeit und die Read-Length, die mit dem Verfahren möglich ist, begrenzt (Parker, L.T., Deng, Q., Spurgeon, S., Kwok, P.Y., Nickerson, D.A., Biotechniques 21(4):694-699, 1996).
Lee, L.G., Connell, C.R:, Woo, S.L., Cheng, R.D., McArdle, B.F., Fuller, C.W., Hallorand, N.D. und Wilson, R.K., Nucleic Acids Res., 20:2471, 1992) beschreiben Sequenzieren mit einem Satz von ddNTP-Terminatoren und T7-DNA-Polymerase. Alle besitzen fluoresceinartige Farbstoffe, die an die ddNTPs auf im wesentlichen dieselbe Weise wie die für Tag-Sequenzieren verwendeten Rhodamin-Terminatoren gekoppelt sind. Diese werden mit modifizierter T7-DNA-Polymerase (Sequenase^TM Version 2.0) und alpha-Thio-dNTP modifiziert. Die Thio-dNTPs werden verwendet, um „Kompressions"-Artefakte aufzulösen, wie dITP für die Taq-Farbstoff-Terminator-Verfahren verwendet wird. Die Ergebnisse mit diesem System sind derart, dass die Bänder in der Intensität ungefähr um das Zehnfache variieren.
Wayne Barnes hat ein Protokoll für Farbstoff-Terminator-Sequenzieren mit FY-modifizierten Polymerasen und Mn²⁺ veröffentlicht (Scientech Corp. St. Louis, MO). Die Bänder sind mit diesem Verfahren einheitlicher und variieren ungefähr höchstens um das 4.5-fache.
Fluorescein-12 ddNTPs, die eine Linkerlänge von 12 Atomen besitzen, und Biotin-11 ddNTPs, die eine Linkerlänge von 11 Atomen besitzen, sind erhältlich (Dupont NEN, Wilmington, DE). Diese markierten ddNTPs werden als nützlich in Sequenzierrektionen beschrieben.
ABI PRISM offenbaren Dichlorrhodamin-Farbstoffe, die an Terminatoren durch Propargyl/Ethylenoxid/Amino („EO") -Linker mit acht Atome in der Länge zum Sequenzieren gebunden sind (Rosenblum, B.B., Lee, L.G. Spurgeon, S.L., Khan, S.H., Menchen, S.M., Heiner C.R. und Chen, S.M., Nucleic Acids Res. 25(22):4500-4504, 1997).
Cyanin-Farbstoffe wurden in Farbstoff-Terminatoren zum Sequenzieren genutzt (Lee et al., Nucleic Acids Res., 20(10):2471, 1992).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue, Didesoxy-Farbstoff-markierte Terminatoren bereit, die in einer Anzahl von biologischen Prozessen nützlich sind, umfassend das Bereitstellen von einheitlichen Bandintensitäten und die Auflösung von Farbstoffinduzierten „Kompressions"–Artefakten beim DNA-Sequenzieren. Die Didesoxy-Farbstoff-markierten Terminatoren der vorliegenden Erfindung sind besonders gut für die Verwendung mit DNA-Polymerasen geeignet, die thermostabil sind, oder die eine veränderte dNMP-Bindungsstelle enthalten (Tabor et al., US-Patent Nr. 5,614,365). Die Verwendung der Terminatoren der vorliegenden Erfindung zum Sequenzieren erfordert nicht die Verwendung von Nucleotid-Analoga wie dITP oder alpha-Thio-Nucleotide, um die durch Farbstoff induzierten „Kompressions"-Artefakte zu eliminieren. Der Anmelder hat überraschenderweise herausgefunden, dass es eine starke Korrelation zwischen der Länge des Links zwischen dem Farbstoffmolekül und dem Nucleotid und der Band-Einheitlichkeit gibt, aber eine geringe Korrelation zwischen der Art des Farbstoffs (oder anderen Parametern) und der Band-Einheitlichkeit. Farbstoff-Terminatoren mit Linkern von 10 oder mehr Atomen (erweitete Linker) bis zu 25 Atomen (10, 11, 12... 25) erzeugen, wenn sie in Sequenzier-Reaktion verwendet wurden, Bänder einer beträchtlich verbesserten Einheitlichkeit in Sequenzer-Gelen im Vergleich zu den Farbstoff-Terminatoren mit Linkern von weniger als 10 Atomen.
Die Farbstoff-Terminatoren der vorliegenden Erfindung mit erweiterten Linkern werden typischerweise in Gruppen von vier (ATGC) mit oder ohne eine thermostabile DNA-Polyermase geliefert und sind besonders nützlich in einem Verfahren der Sequenz-Analyse.
In einem ersten Aspekt bietet die Erfindung ein Kit zum Sequenzieren von DNA, umfassend ein erstes, zweites, drittes und viertes Farbstoff-Terminator-Molekül, wobei jedes der Farbstoff-Terminator-Moleküle unterschiedlich ist und jedes eine Verbindung der Formel (I) umfasst:
wobei A ein Cynaninfarbstoff ist der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cyaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht;
B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituierten Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist;
C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für ddA und ddG und an Position 5 für ddC und ddT kovalent gebunden ist und wobei R für ein Triphosphat steht; und eine thermostabile DNA-Polymerase.
Mit „Linker" ist eine Kette von mindestens 10 Atomen gemeint, die Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff umfasst und das Farbstoffmolekül mit dem Didesoxynucleotid verbindet. Die Kette kann auch substituierten Kohlenstoff oder Schwefel enthalten. Die Verbindung erfolgt typischerweise an der Einheit der aromatischen Base des Nucleotids. Die ersten zwei Atome des Linkers, der an die Base gebunden ist, sind typischerweise mit in einer Dreifach-Bindung verknüpft.
Mit „substituierten Kohlenstoff" ist gemeint, dass ein oder mehrere Wasserstoffe durch einen Ersatzgruppe wie, aber nicht beschränkt, auf Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, Sauerstoff, Schwefel, Nitroxy, Halogen, -N(CH₃)₂, Amino und -SH ersetzt sind.
Mit „thermostabiler DNA-Polyermase" ist gemeint, dass eine DNA-Poylmerase eine Halbwertszeit von weniger als 5 Minuten bei 90°C besitzt. Derartige Polymerasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DNA-Polymerasen, die von Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermococcus littoralis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga maritima, und Thermotoga neapolitana codiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die thermostabile DNA-Polymerase eine veränderte dNMP-Bindungsstelle auf, damit der Einbau von Didesoxynucleotiden relativ zu der natürlichen Polymerase verbessert ist. Eine DNA-Polymerase mit einer veränderten dNMP-Bindungsstelle diskriminiert nicht beträchtlich zwischen Didesoxynucleotiden und Desoxynucleotiden. Die Chance, ein Didesoxynucleotid einzubauen, ist annähernd dieselbe, wie jene eines Desoxynucleotids, oder mindestens 1/10 des Wirkungsgrades eines Desoxynucleotids.
In einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung eine Verbindung der Formel (I):
wobei A ein Cyaninfarbstoff der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cynaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht;
B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituierten Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist;
C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für die Purine (ddG, ddA) und an Position 5 für die Pyrimidine (ddT, ddC) kovalent gebunden ist, und wobei r für ein Mono- oder Triphosphat steht.
Der Begriff „Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen" bezieht sich auf SO₃H-Gruppen oder Salze davon.
Der Begriff „Ester" bezieht sich auf eine chemische Einheit mit der Formel -(R)n-COOR', wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus gesättigten oder ungesättigten Alkyl und fünf-gliedrigen oder sechs-gliedrigen Aryl- oder Heteroaryleinheiten besteht, und wobei n für 0 oder 1 steht.
Der Begriff „Amid" bezieht sich auf einen chemischen Substituenten der Formel -NHCOR, wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyl und fünf-gliedrigen oder sechs-gliedrigen Aryl- oder Heteroaryl-Ringeinheiten, wobei der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Alkyl, Halogen, Trihalomethyl, Carboxylat, Nitro oder Ester.
Der Begriff „Ether" bezieht sich auf eine chemische Einheit der Formel R-O-R', wobei R und R' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus gesättigten oder ungesättigten Alkyl und fünf-gliedrigen oder sechs-gliedrigen Aryl- oder Heteroaryleinheiten.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoff. Die Alkylgruppe steht bevorzugt für 1–10 Kohlenstoffe, bevorzugter ein Niederalkyl von 1 bis 7 Kohlenstoffen und am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffe. Typische Alkygruppen umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Tertiärbutyl, Pentyl, Hexyl und dergleichen. Die Alkylgruppe kann substituiert sein und einige typische Alkylsubstituenten umfassen Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, Sauerstoff, Schwefel, Nitroxy, Halogen, -N(CH₃)₂, Amino und -SH.
Der Begriff „Aryl" bezieht sich auf eine aromatische Gruppe, die mindestens einen Ring besitzt, der ein konjugiertes pi-Elektronen-System besitzt und sowohl carbozyklische Aryl- (z.B. Phenyl) und heterozyklische Arylgruppen (z.B. Pyridin) umfasst. Der Begriff „carbozyklisch" bezieht sich auf eine Verbindung, die eine oder mehrere kovalent geschlossene Ringstrukturen enthält, und dass die Atome, die das Rückgrad des Ringes bilden, alle Kohlenstoffatome sind. Der Begriff unterscheidet daher carbozyklische von heterozyklischen Ringen, in denen das Ring-Rückgrad mindestens 1 Atom enthält, das sich von Kohlenstoff unterscheidet. Der Begriff „Heteroaryl" bezieht sich auf eine Arylgruppe, die mindestens einen heterozyklischen Ring enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus:
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-,
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₉-NH-SO₂-,
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO-,
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-,
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₅, und
-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO-.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Didesoxy-Farbstoff-Terminatoren eine Verbindung der Formel (II):
eine Verbindung der Formel (III):
eine Verbindung der Formel (IV):
eine Verbindung der Formel (V):
Die Cy5.5-ddGTP- und -ddCTP-Verbindungen besitzen einen Linker von 10 Atomen in der Länge. Die Cy5.5-ddCTP- und -ddTTP-Verbindungen besitzen einen Linker von 17 Atomen in der Länge.
In einem dritten Aspekt bietet die Erfindung eine Desoxyribonucleinsäure-Sequenz, die die Verbindung der Formel I, II, III, IV oder V enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform bietet die Erfindung ein Kit zum DNA-Sequenzieren, umfassend Verbindungen der Formel II, III, IV und V.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Kit weiter eine stabile DNA-Polymerase auf; die thermostabile DNA-Polymerase besitzt eine veränderte dNMP-Bindungsstelle, damit der Einbau von Didesoxynucleotiden relativ zur natürlichen Polymerase verbessert ist.
Der Anmelder hat überraschender Weise gefunden, dass ein Parameter, der am stärksten mit der Bandeinheitlichkeit korreliert, die Länge des Linkers zwischen dem Farbstoff und dem ddNTP ist. Der Anmelder fand, das durch Erweitern der Linkerlänge zwischen dem Farbstoff und dem Nucleotid für eine beliebige Farbstoff:ddNTP-Kombination auf mindestens 10 Atome, die Bandeinheitlichkeit wesentlich verbessert ist und es keine durch Farbstoff induzierte Kompressions-Artefakte gibt.
Daher bietet in einem vierten Aspekt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Nucleotidbasen-Sequenz eines DNA-Moleküls, umfassend die Schritte des Inkubierens eines DNA-Moleküls, das mit einem Primer-Molekül assoziiert wurde, das fähig ist, an das DNA-Molekül zu hybridisieren, in einem Gefäß, das eine thermostabile DNA-Polymerase, einen eines Satzes von vier Farbstoff-Terminatoren enthält, wobei jeder der Farbstoff-Terminatoren eine Verbindung der Formel (I) enthält:
wobei A ein Cyaninfarbstoff der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cyaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht;
B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituiertem Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist;
C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für ddA und ddG und an Position 5 für ddC und ddT kovalent gebunden ist und wobei R für ein Triphosphat steht; und Auftrennen von DNA-Produkten der Inkubationsreaktion nach der Größe, wodurch mindestens ein Teil der Nucleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Farbstoff-Terminator eine Verbindung der Formel II, III, IV oder V; die thermostabile DNA-Polymerase besitzt eine veränderte dNMP-Bindungsstelle.
Andere Merkmale und Zweckmäßigkeiten der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von deren bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen.
Alle Artikel, Publikationen und Patente, die in dieser Anmeldung zitiert werden, sind hierdurch durch Bezugnahme in Ihrer Gesamtheit enthalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 präsentiert DNA-Sequenzdaten, die unter Verwenden von M13mp18, das ein 115bp-SauAl-Fragment von Lambda, eingefügt an der BamHI-Stelle enthält, und Cy5.5-ddGTP-, -ddATP-, -ddTTP-, und -ddCTP-Farbstoff-Terminatoren erzeugt wurden.
2 ist ein Diagramm der Bandintensitäts-Variabilität (rms) vs Linkerlänge (Atome).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die folgenden Beispiele sind angegeben zum weiteren Veranschaulichen verschiedener Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sind auf keine Weise als den Umfang beschränkend beabsichtigt.
Beispiel 1: Synthese von Didesoxy-Farbstoff-Terminatoren – Cy5.5-Didesoxynucleosid-Triphosphate
Farbstoffterminatoren, markiert mit Cy5.5, wurden aus Propargylaminodidesoxynucleotiden hergestellt (Prober, J.M., Trainor, G.L., Dam, R.J., Hobbs, F.W., Robertson, C.W., Zagursky, R.J., Cocuzza, A.J., Jensen, M.A. und Baumeister, K., Science 238:336-41 (1987); US-Patent Nr. 5,242,796, 5,306,618 und 5,332,666) und „CyDye Fluorolink Cy5.5. Mono Reactive Dye" -Produkt PA25501 (Amersham Life Science), um die Verbindungen II, III, IV und V zu erzeugen. Im Falle von ddG und ddA wurde das Propargylaminonucleotid direkt mit dem N-Hydroxysuccinimidyl-Ester des Cy5.5-Farbstoffs umgesetzt. Im Falle von ddC und ddT wurde eine längerer Linker durch Umsetzen des Propargylaminonucleotids mit dem N-Hydroxysuccinimidyl-Ester der N-Trifluoracetyl-6-Aminocapronsäure gefolgt von Hydrolyse in wässrigem Ammoniak der Trifluoracetylgruppe konstruiert. Die resultierende Verbindung wurde dann mit dem N-Hydroxysuccinimidyl-Ester des Cy5.5-Farbstoffs umgesetzt, um den 17-Atom-Linker zwischen dem Cy5.5-Farbstoff und der Pyrimidinbase zu ergeben.
Zusätzlich zu Cy5.5-Farbstoffen, würden jene Fachleute wissen, wie andere Farbstoffe identifiziert und genutzt werden, einschließlich andere Cyaninfarbstoffe, mit den geeigneten optischen Eigenschaften. Auch ist die Konstruktion und das Binden verschiedener Linker in der Technik gut bekannt. Geeignete Reagenzien für die Linker-Konstruktion umfassen eine oder mehrere Verbindungen, bestehend aus aktivierten Formen von Amino-geschützten Alkyl- oder Arylaminosäuren, wie Verbindungen der Formel R-NH-(CH₂)_n-CO₂R' oder R-NH-(CH₂)_nX(CH₂)_m-CO₂R', wobei R eine säure- oder basenlabile Schutzgruppe ist, R' ein reaktives Ester oder eine Anhydridgruppe, X für Aryl, O, S, oder NH steht, und wobei n und m 0–12 betragen. Andere Linker, die durch N- oder O- oder S-Alkylierung konstruiert werden, sind auch geeignet. Die genaue Linkerlänge, von mindestens 10 Atomen, für einen speziellen Farbstoff und die Didesoxynucleotid-Kombination kann empirisch durch Überwachen der Bandeinheitlichkeit beim DNA-Sequenzieren wie beschrieben bestimmt werden (siehe Beispiel 3).
Beispiel 2: Farbstoff-Terminator-Cycle-Sequenzieren
DNA-Cycle-Sequenzieren wurde ausgeführt unter Verwenden von Thermo Sequenase^TM-DNA-Polymerase (Amersham, Cleveland, OH) und Cy5.5-Didesoxy-Farbstoff-Terminatoren unter Verwenden des folgenden Cycle-Sequenzierprotokolls:

1. Eine Grundmischung wurde hergestellt, die aus dem folgenden bestand:
10X-Reaktionspuffer: 150mM Tris-HCl pH 9,5 35mM MgCl₂ Polymerase: Thermo Sequenase ^TM-DNA-Polymerase, 10U/μl, 0,0017U/μl, anorganische Thermoplasma-Acidophilum-Pyrophosphatase: 20mM Tris-HCl, pH 8,5, 1mM DTT, 0,1mM EDTA, 0,5% Tween-20, 0,5% Nonidet P-40 und 50% Glycerol.
2. Vier Mikrozentrifugenröhrchen wurden markiert und 2μl Lösung von Cy5.5-markiertem ddG, ddA, ddT, ddC wurde in jedes Röhrchen gegeben. 25:1 ddG-Mischung, 300μM jeweils von dGTP, dATP, dTTP & dCTP, 12uM Cy5.5-ddGTP 25:1 ddA-Mischung, 300μM jeweils von dGTP, dATP, dTTP & dCTP, 12μM Cy5.5-ddATP 25:1 ddT-Mischung, 300μM jeweils von dGTP, dATP, dTTP & dCTP, 12μM Cy5.5-ddTTP 25:1 ddC-Mischung, 300μM jeweils von dGTP, dATP, dTTP & dCTP, 12μM Cy5.5-ddCTP
3. Sechs μl der Grundmischung (aus Schritt 1) wurde in jede der vier Röhrchen vom oben angegebenen Schritt 2 aliquotiert. Cycling wurde wie folgt ausgeführt: 95°C (30s), 45–55°C (30s) und 72°C (60s) für 35 Zyklen, dann bei 72°C 5–7 Minuten lang inkubiert.
4. Ein μl von 8M Ammoniumacetat wurde zu jedem Röhrchen gegeben. Dann wurden 27μl (annähernd dreimal das Reaktionsvolumen) von im Kühlschrank gekühltem 100%-igen Ethanol zugegeben. Die Mischung wurde gemischt und auf Eis 20 Minuten lang angeordnet, um die DNA zu präzipitieren.
5. Die Mischung wurde dann in einer Mikrozentrifuge (~12.000 Upm) 20–30 Minuten lang entweder bei Raumtemperatur oder 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und dann wurden 200μl 70%-iger Ethanol zugegeben, um das DNA-Pellet zu waschen.
6. Die Mischung wurde wieder 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet getrocknet (in einer Vakuum-Zentrifuge), 2–3 Minuten lang.
7. Jedes Pellet wurde in 6μl Formamide Loading Dye (Amersham, Cleveland, OH) resuspendiert, kräftig verwirbelt (10–20s), um sicher zu stellen, dass die gesamte DNA aufgelöst war. Die Mischung wurde kurz zentrifugiert, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
8. Proben wurden auf 70°C 2–3 Minuten lang erwärmt, um die DNA zu denaturieren, dann auf Eis angeordnet.
9. Dann wurden 1,5–2μl des Volumens auf eine Spur des Sequenziergels geladen und man lies das Gel auf dem MICRO Gene Blaster-Instrument (VGI) laufen.

Die Template-DNA war für diese Sequenz M13mp18, die ein 115bp-Sau3Al-Fragment vom Bakteriophagen Lambda, eingesetzt an der BamHI-Stelle, enthielt (Produkt-Nummer US 70171 Amersham). Der Primer ist der –40-Forward 23-mer-Universalprimer (5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3')(SEQ. ID-Nr. 1). Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Beispiel 3: Korrelation der Linkerlänge und der Bandintensitäts-Variabilität
Sequenzierreaktionen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit verschiedenen Farbstoffmolekülen, die an Didesoxynucleotiden mit Linkern verschiedener Längen gebunden waren, ausgeführt (siehe Tabelle 1). Die markierten DNA-Produkte wurden dann auf Denaturierungs-Polyacrylamidgelen getrennt und die markierten Produkte wurden durch Fluoreszenz detektiert. Die Intensität der Bänder wird als die Höhe der Peaks in einem Diagramm der Fluoreszenz (in willkürlichen Einheiten) gegen die Zeit genommen. Typischerweise können systematische Variationen in den Peakhöhen in Diagrammen von Peakhöhen, die sequentiell geplottet werden, gesehen werden. Diese systematischen Variationen in den Peakhöhen können durch Fitten nach der Methode der kleinsten Quadrate als eine Polynominalfunktion zweiter Ordnung modelliert werden. Dividieren der Peakhöhe für jedes Band durch den Wert der als Kurve gefitteten Polynominalfunktion, ergibt eine normierte Bandintensität für jeden Peak. Die Variation in diesen Bandintensitäten kann als die Quadratwurzel der Varianz
der normierten Peakhöhen ausgedrückt werden, die typischerweise Werte zwischen 0 und 1 besitzt, wobei mehr Variabilität durch höhere Zahlen repräsentiert ist (Fuller, C.W., Comments 16(3):1-8. 1989). Dieser Wert ist numerisch gleich dem quadratischen Mittelwert (RMS), wenn 1,0 von den normierten Peakhöhen subtrahiert wird. Diese Werte sind in Tabelle 1 angegeben und in 2 graphisch dargestellt. Die Variabilität der Bandintensitäten ist beträchtlich verringert, wenn Linker von 10 oder mehr Atomen in der Länge verwendet wurden, was zu Sequenzdaten führte, die leichter genau zu interpretieren waren. Tabelle 1

^a Abkürzungen für Farbstoffe: Fl, Carboxyfluorescein; R110, Rhodamin, 110; R6G, Rhodamin 6G; ROX, Rhodamin X; TMR, Tetramethylrhodamin; TXR, Texas Red (Molecular Probes). Die Farbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5 und Cy5.5 waren von Amersham Life Science, Cleveland, OH.
^b Die Linkerlänge ist die Anzahl von Atomen zwischen der Ringstruktur der Nucleosidbase (A, C, G oder T) und der Ringstruktur des Farbstoffs. Linkerstrukturen
^c-C≡C-CH₂-NH-CO
^d-C≡C-CH₂-NH-SO₂-
^e-C≡C-CH₂-NH-CS-NH
^f-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-
^g-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₉-NH-SO₂
^h-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO
ⁱ-C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅
^j-C≡C-CH₂-NH-CO-(-CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₅-
^k-C≡C-CH₂-NH-CO-(-CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO-

Claims

Kit zum Sequenzieren von DNA, umfassend ein erstes, zweites, drittes und viertes Farbstoffterminatormolekül, wobei jedes der Farbstoffterminatormoleküle unterschiedlich ist und jedes eine Verbindung der Formel (I) umfasst:
wobei A ein Cyaninfarbstoff der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cyaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht; B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituiertem Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist; C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für ddA und ddG und an Position 5 für ddC und ddT kovalent gebunden ist und wobei R für ein Triphosphat steht; und eine thermostabile DNA-Polymerase.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine veränderte dNMP-Bindungsstelle aufweist, damit der Einbau von Didesoxynucleotiden relativ zu der natürlichen Polymerase verbessert ist.
Verbindung der Formel (I):
wobei A ein Cyaninfarbstoff der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cyaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht; B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituiertem Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist; C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für ddA und ddG und an Position 5 für ddC und ddT kovalent gebunden ist und wobei R für ein Mono- oder Triphosphat steht.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei der Linker aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-, -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₉-NH-SO₂-, -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO-, -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-, -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH2)₅-, und -C≡C-CH₂-NH-CO-(CH₂)₅-NH-CO-(CH₂)₁₀-NH-CO-.
Verbindung nach Anspruch 3 der Formel (II):
Verbindung nach Anspruch 3 der Formel (III):
Verbindung nach Anspruch 3 der Formel (IV):
Verbindung nach Anspruch 3 der Formel (V):
Desoxyribonucleinsäuresequenz, enthaltend die Verbindung der Formel I.
Desoxyribonucleinsäuresequenz nach Anspruch 9, enthaltend die Verbindung der Formel II, III, IV oder V.
Kit zum Sequenzieren von DNA, umfassend Verbindungen der Formel II, III, IV und V.
Kit nach Anspruch 11, weiter umfassend eine thermostabile DNA-Polymerase.
Kit nach Anspruch 12, wobei die Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine veränderte dNMP-Bindungsstelle aufweist, damit der Einbau von Didesoxynucleotiden relativ zu der natürlichen Polymerase verbessert ist.
Verfahren zum Bestimmen der Nucleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls, mit den Schritten: Inkubieren eines DNA-Moleküls, das mit einem Primermolekül assoziiert wurde, das fähig ist, an das DNA-Molekül zu hybridisieren, in einem Gefäß, das eine thermostabile DNA-Polymerase, einen eines Satzes von vier Farbstoffterminatoren enthält, wobei jeder der Farbstoffterminatoren eine Verbindung der Formel (I) enthält:
wobei A ein Cyaninfarbstoff der Struktur
ist und die gekrümmten Linien Kohlenstoffatome repräsentieren, die für die Formulierung von Cyaninfarbstoffen nötig sind, X und Y aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und CH₃-C-CH₃ besteht, m eine ganze Zahl ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus 1, 2, 3 und 4 besteht, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus H, OH, CO₂H, Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppen, Estern, Amiden, Ethern, Alkyl- oder Arylgruppen und B, und ein R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für B steht; mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ oder R⁷ für eine Sulfonsäure- oder Sulfonatgruppe steht; B für einen Linker von mindestens 10 Atomen in der Länge steht, wobei die Atome aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, substituiertem Kohlenstoff und Schwefel, und der Linker an einem Ende an A und an dem anderen Ende an C gebunden ist; C für ein Didesoxynucleotid steht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
und wobei der Linker an das Didesoxynucleotid an Position 7 für ddA und ddG und an Position 5 für ddC und ddT kovalent gebunden ist und wobei R für ein Triphosphat steht; und Auftrennen von DNA-Produkten der Inkubationsreaktion nach der Größe, wodurch mindestens ein Teil der Nucleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.
Verfahren zum Bestimmen der Nucleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls, mit den Schritten: Inkubieren eines DNA-Moleküls, das mit einem Primermolekül assoziiert wurde, das fähig ist, an das DNA-Molekül zu hybridisieren, in einem Gefäß, das eine thermostabile DNA-Polymerase, eine Verbindung der Formel II, III, IV oder V enthält, und Auftrennen von DNA-Produkten der Inkubationsreaktion nach der Größe, wodurch mindestens ein Teil der Nucleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine veränderte dNMP-Bindungsstelle aufweist, damit der Einbau von Didesoxynucleotiden relativ zu der natürlichen Polymerase verbessert ist.