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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Verfahren zur Sequenzierung von Polynukleotiden. Insbesondere betrifft
die Erfindung ein verbessertes Terminator-Sequenzierungsverfahren,
das den sequenzierbaren Bereich von Basen, die an Sequenzprimen
angrenzen, erweitert.
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Referenzen
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Sequenzbestimmung von Polynukleotiden
spielt eine zunehmend wichtige Rolle in der biochemischen Forschung
und Industrie. Beispielsweise wurden Sequenzen von Gesamtgenomen
kürzlich
von Eukaryoten, C. elegans und S. Cerevisiae (z.B. siehe Science
282: 2012 (1998)) berichtet, und zur Zeit laufen erhebliche Anstrengungen,
um das humane Genom zu sequenzieren. Die Kenntnis biologischer Polynukleotidsequenzen
ist nicht nur nützlich,
um Gensequenzen und assoziierte Genprodukte von verschiedenen Organismen
zu charakterisieren und zu vergleichen, sondern auch für die Entwicklung
von diagnostischen Tests, z.B. zum Nachweis von genetischen Mutationen,
zur Bestimmung von Genotypen, zur Diagnose von Erkrankungen, zur
Forensik und zur Identifizierung therapeutischer Ziele.
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Während
der letzten zwei Jahrzehnte gab es zwei Hauptansätze zur Nukleotidsequenzbestimmung: Das
Kettenabbruchverfahren von Sanger und Coulson (1977) und das chemische
Abbauverfahren von Maxam und Gilbert (1977). Beide Verfahren erfordern
die Erzeugung von einem oder mehreren Sätzen markierter DNA-Fragmente,
die jeweils einen gemeinsamen Ursprung haben und jeweils mit einer
bekannten Base enden. Der Satz oder die Sätze von Fragmenten müssen dann
nach Größe getrennt
werden, um die Zielsequenz zu offenbaren.
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Vor kurzem wurde das Kettenabbruchverfahren
zum Standardverfahren für
alle zur Zeit erhältlichen, automatisierten
DNA-Sequenzierungsgeräte.
Dieses Verfahren schließt
generell enzymatische Verlängerung eines
5'-Primers entlang
eines Ziel-Template-Strangs in Anwesenheit von vier Standard-Deoxyribonukleotidbasen
ein plus einen oder mehrere Dideoxynukleotid-Terminatoren. Der Einbau
eines Terminators während der
Primerverlängerung
resultiert in einem Gemisch von Produkten variabler Länge, die
jeweils an ihren 3'-Enden
mit dem Terminator abschließen.
Wie ursprünglich
vorgeschlagen, werden vier getrennte Sequenzierungsreaktionen für eine gegebene
Zielsequenz durchgeführt,
eine für
jeden Dideoxynukleotid-Basentyp. Die Produkte von jedem Gemisch
wurden dann in vier getrennten Bahnen aufgrund ihrer Größe aufgelöst, und
die Zielsequenz wurde aus der jeweiligen Anordnung der Wanderung
der Fragmente bestimmt.
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Modifikationen des Sanger-Verfahrens
wurden nachfolgend entwickelt, die spektral unterscheidbare, fluoreszierende
Markierungen, angeheftet an entweder die 5'-Verlängerungsprimer
(Smith, 1986) oder die 3'-Dideoxy-Terminatorbasen
(Prober, 1987; Prober 1995; Bergot, 1991), verwenden. Im ersten
Fall muss die Verlängerungsreaktion getrennt
für jede
unterschiedliche Terminatorbase in Anwesenheit eines geeigneten markierten
Primers (eine unterschiedliche Markierung für jeden unterschiedlichen Terminator)
durchgeführt werden,
wonach die markierten Verlängerungsprodukte
kombiniert werden können
und auf einem einzelnen Separierungsweg aufgelöst werden können. Im zweiten Fall kann
Primerverlängerung
in einem einzelnen Reaktionsgemisch durchgeführt werden, da basenspezifischer
Markierungseinbau mit großer
Genauigkeit durch ein Polymeraseenzym durchgeführt wird, gefolgt von Trennung
in einer einzelnen Trennungsbahn.
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Das Verfahren mit dem markieren Terminator
wurde zum Sequenzierungsverfahren der Wahl, da es signifikant weniger
Reaktionsgefäße einschließt und besser
zu handhaben ist. Allerdings ist dieses Verfahren begrenzt aufgrund
der Schwierigkeit, routinemäßig Sequenzierungsfragment-Nukleotide
nahe der Verlängerungsprimer
zu identifizieren. Die Extensionsreaktionen erfordern hohe Konzentrationen
markierter Terminatoren, um eine effiziente Produktion von Sequenzierungsfragmenten
sicherzustellen. Leider wandern restliche Terminatorbasen oder ihre
Abbauprodukte mit kurzen Sequenzierungsfragmenten, da sie ähnliche
Mobilitätseigenschaften
haben. Als eine Konsequenz waren Sequenzierungsdaten für kurze
Sequenzierungsfragmente entweder unzuverlässig oder vollständig unbrauchbar.
Theoretisch ist es möglich, übrige Terminatorbasen
vor der Sequenzanalyse zu entfernen, z.B. durch einen vorläufigen,
größenbasierten
Trennungsschritt. Allerdings führt
dies einen zusätzlichen
Schritt in das Sequenzierungsverfahren ein, was Sequenzanalysen
in großem Maßstab behindert.
Darüber
hinaus kann es sein, dass diese vorläufige Reinigung wiederholt
werden muss, bevor genügend
restliches Terminatormaterial entfernt wurde.
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Demgemäss ist es ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, ein Sequenzierungsverfahren mit einem markierten Terminator
zur Verfügung
zu stellen, das die Sequenzbestimmung nahe des Verlängerungsprimers
ermöglicht.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist
es, die Kontaminationsprobleme, die mit früheren markierten Sequenzierungsverfahren
mit markierten Terminatoren assoziiert waren, zu überwinden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
in einem Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung einer Sequenz von einem
oder mehreren Nukleotiden in einem Zielnukleotid zur Verfügung. In
diesem Verfahren wird ein zielspezifischer Primer in Kontakt gebracht
mit einer Polynukleotidprobe unter Bedingungen, die wirksam sind,
damit der Primer spezifisch an eine komplementäre Primer-Region in einem oder
mehreren Ziel-Polynukleotiden anlagert, um ein oder mehrere Ziel-Primerhybrid(e)
zu bilden. Der zielspezifische Primer enthält (i) ein zielbindendes Segment
und (ii) eine mobilitätsvermindernde
Gruppe, die nicht signifikant an das Ziel bindet. Das Hybrid (die
Hybride) werden mit einem Primer-Verlängerungsreagens in Anwesenheit
von wenigstens einem markierten 3'-Nukleotid-Terminator, der komplementär zu einem
ausgewählten
Zielnukleotid-Basentyp ist, unter Bedingungen, die wirksam sind,
um ein oder mehrere Primer-Verlängerungsprodukte,
die mit mindestens einem markierten 3'-Nukleotid-Terminator abschließen, zu
bilden. Die Primer-Verlängerungsprodukte
werden dann elektrophoretisch in einer Siebmatrix unter denaturierenden
Bedingungen getrennt, so dass kleinere Verlängerungsprodukte schneller
wandern als längere
Verlängerungsprodukte,
und die gewünschte
Sequenzinformation wird dann auf der Basis der Mobilitäten und
Terminatormarkierung(en) der (des) getrennte(n) Verlängerungsprodukts
(-produkten) bestimmt.
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In einer Ausführungsform wird die Primerverlängerung
in Anwesenheit von wenigstens einem verlängerbaren Nukleosidmonomer
durchgeführt,
zusätzlich
zu dem (den) markierten 3'-Nukleotid-Terminator(en) unter
Bedingungen, die wirksam sind, um das 3'-Ende von spezifisch hybridisierten
Primern durch Zusetzen von ziel-komplementären Polynukleotidmonomeren
und Terminator(en) zu verlängern,
um ein oder mehrere Primer-Verlängerungsprodukte
zu bilden.
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In einer anderen Ausführungsform
wird Primerverlängerung
in Abwesenheit von verlängerbaren
Nukleotiden durchgeführt,
unter Bedingungen, die wirksam sind, den Terminator nur an den angelagerten
Primer in dem Hybrid anzuhängen,
wenn der Terminator komplementär
zu einer Base in dem Zielnukleotid ist, das unmittelbar angrenzend
an das verlängerbare
Ende des angelagerten Primers ist.
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Der (die) Terminator(en), der (die)
in der vorliegenden Erfindung verwendet wird (werden), schließen eine
Markierung ein, die während
der elektrophoretischen Wanderung des einen oder der mehreren Verlängerungsprodukte
nachgewiesen werden kann. In einer Ausführungsform enthält wenigstens
ein 3'-Nukleotidterminator
eine Fluoreszenzmarkierung. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Verlängerung
in Anwesenheit von vier verschiedenen 3'-Nukleotidterminatoren durchgeführt, die
(i) jeweils komplementär
zu einem unterschiedlichen Nukleotid-Basentypus sind und (ii) jeweils
eine unterscheidbare, fluoreszierende Markierung enthalten, die
den Basentypus des Terminators identifiziert.
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Zur Sequenzbestimmung werden die
Sequenzverlängerungsprodukte
auf der Basis der Größe durch jedes
Verfahren, in dem kleinere Fragmente vor größeren Fragmenten eluieren,
getrennt. Beispielsweise können
die Produkte durch Slab-Gel-Elektrophorese, Kapillarelektrophorese
oder Mikrokanal-Elektrophorese getrennt werden, vorzugsweise unter
Verwendung einer Siebmatrix.
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In einer Ausführungsform umfasst die mobilitätsvermindernde
Gruppe ein Polymersegment, das im Wesentlichen nicht an das (die)
Ziel-Polynukleotid(e) bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Polymersegment ein Polynukleotidsegment, das im Wesentlichen
nicht an das (die) Ziel-Polynukleotid(e) bindet. In anderen Ausführungsformen
umfasst das Polymersegment eine Nicht-Polynukleotidgruppe, wie ein Nicht-Polynukleotidpolymer
von Untereinheiten.
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Die mobilitätsvermindernde Gruppe kann
ausgewählt
werden, um die Mobilitätsrate
von jedem Primer-Verlängerungsprodukt
um eine spezifische Menge zu verringern. In einer Ausführungsform
verringert die mobilitätsvermindernde
Gruppe die Mobilitätsrate
von jedem Primer-Verlängerungsprodukt
in einer Menge, äquivalent
zu wenigstens 4 zusätzlichen
Nukleotidbasen, verglichen mit der Mobilität eines korrespondierenden
Primer-Verlängerungsprodukts,
dem die mobilitätsvermindernde
Gruppe fehlt. In anderen Ausführungsformen
ist die Menge der Verringerung der Mobilität äquivalent zu dem Zusatz von
wenigstens 10 zusätzlichen Nukleotidbasen,
wenigstens 15 zusätzlichen
Nukleotidbasen oder wenigstens 20 zusätzlichen Nukleotidbasen, gemäß den Bedürfnissen
und der Anordnungswahl des Benutzers.
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Die Erfindung schließt auch
einen Kit ein, der nützlich
zur Durchführung
von Verfahren, wie den vorstehend beschriebenen, ist: Der Kit schließt einen
zielspezifischen Primer ein, der enthält: (i) ein Zielbindesegment
und (ii) eine mobilitätsvermindernde
Gruppe, die nicht signifikant das Ziel bindet. Der Kit kann zusätzlich einen
oder mehrere der folgenden einschließen: wenigstens einen markierten
Nukleotidterminator, wenigstens ein verlängerbares 3'-Nukleosid und ein Primer-Verlängerungsreagens,
wie ein Polymeraseenzym. Der Kit kann auch Instruktionen zur Verwendung
des Kits in Übereinstimmung
mit der Erfindung einschließen.
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Diese und andere Ziele und Eigenschaften
der Erfindung werden offensichtlicher im Licht der nachstehenden
Diskussion.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung ist darauf
gerichtet, verbesserte Sequenz-Lesefähigkeit für Zielsequenzregionen zur Verfügung zu
stellen, die angrenzend an das 3'-Ende
eines Sequenzierprimers lokalisiert sind. Bei vielen Terminator-basierten
Sequenzprotokollen ist die Fähigkeit,
Sequenz-Zielregionen in der Nähe
des 3'-Endes von
Sequenzierprimern zu sequenzieren, gestört, aufgrund der Interferenz
von gleichzeitig wandernden, markierten 3'- Terminatoren
oder ihren Abbauprodukten. Obwohl dieses Problem durch Entfernen übriger Terminatoren,
nachdem die Primerextension vollständig ist, reduziert werden
kann, ist häufig
mehr als ein Reinigungsschritt erforderlich, um zufriedenstellende
Ergebnisse zu erhalten. Es würde
deshalb vorteilhaft sein, wenn Zielregionen in der Nähe des Primers,
z.B. direkt angrenzend an das 3'-Ende
des Primers, leicht sequenziert werden könnten, ohne mehr als einen
Vorreinigungsschritt, um übrige
Terminatoren zu entfernen.
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Diese Zielsetzung wird in der vorliegenden
Erfindung erreicht durch Verwendung eines Sequenzierprimers, der
eine mobilitätsvermindernde
Gruppe enthält,
die die Mobilitätsraten
der Primer-Verlängerungsprodukte
reduziert, im Verhältnis
zu den Mobilitätsraten
von vergleichbaren Verlängerungsprodukten,
die ohne die mobilitätsvermindernde
Gruppe gebildet werden. Durch Reduzieren der Mobilität der Verlängerungsprodukte kann
die Interferenz, die durch Überlappen
von markierten Terminatoren und ihren Abbauprodukten entsteht, reduziert
oder eliminiert werden, da die Terminatoren vor den Primer-Verlängerungsprodukten
eluieren. Die Erfindung erweitert somit die sequenzierbaren Bereiche
der Primer-Verlängerungsprodukte.
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I. Definitionen
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Wie hier verwendet, haben die nachstehenden
Ausdrücke
die folgenden Bedeutungen, wenn diese nicht anders angegeben sind:
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"Nukleosid" bezieht sich auf
eine Verbindung, die eine Basenpaarungsgruppe (auch bezeichnet als „Base") enthält, wie
ein Purin, Deazapurin oder Pyrimidin-Nukleosidbase, z.B. Adenin,
Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin oder
jedes funktionelle Äquivalent
davon, das an einer Rückgratgruppe,
wie einem Zuckerring oder jedem funktionellen Äquivalent davon, befestigt
ist. Nukleoside schließen
natürlich
vorkommende Nukleoside, die eine Basenpaarungsgruppe enthalten (A,
C, G, T oder U) ein, verbunden mit dem 1-Kohlenstoff eines Pentoserings,
einschließlich
2-Deoxy- und 2'-Hydroxylformen davon
(Kornberg, 1992) und mit Pentose-Analoga und Offenring-Äquivalente davon (Scheit, 1980;
Uhlman, 1990). Beispielsweise wird Inosin (dITP) häufig zur
Sequenzierung als ein Ersatz für
Guanosin (dGTP) verwendet, um die Bandenkompression in Poly-G-Sequenzbereichen
zu reduzieren.
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Der Ausdruck „Nukleotid", wie hier verwendet, bezieht sich auf
einen Phosphatester eines Nukleosids, z.B. einen Triphosphatester,
wobei die häufigste
Stelle der Veresterung die Pentose-5'-Hydroxylgruppe ist. In bestimmten Fällen bezieht
sich der Ausdruck „Nukleosid" der Einfachheit
halber sowohl auf Nukleoside als auch Nukleotide. Die Ausdrücke Nukleotid
und Nukleosid, wie hier verwendet, sollen synthetische Analoga einschließen, die modifizierte
Nukleotidbasengruppen besitzen, modifizierte Zuckergruppen und/oder
modifizierte Phosphatestergruppen, z.B. wie woanders beschrieben
(Scheit, 1980; Eckstein, 1991).
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"Polynukleotid" und "Oligonukleotid" bezieht sich auf
ein Polymer von Nukleosidmonomeren, einschließlich Einzel-, Doppel- und
Dreifach-Strang-Deoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, α-anomerische
Formen davon, und dergleichen. Gewöhnlich sind die Nukleosidmonomere
durch Phosphodiesterverbindungen verbunden, d.h., ein Phosphatdiester
oder ein Analog davon, in dem das Phosphatatom in dem +5-Oxidationsstatus
ist, und ein oder mehrere der Sauerstoffatome werden durch eine
Nicht-Sauerstoffgruppe ersetzt. Exemplarische Phosphat-Analoga schließen Phosphorothioat,
Phosphorodithioat, Phosphoroselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilinothioat,
Phosphoranilidat, Phosphoramidat, Borphosphate und dergleichen ein, einschließlich assoziierten
Gegenionen, z.B. H+, NH4
+, Na+, und dergleichen,
falls solche Gegenionen vorliegen. „Polynukleotide" und „Oligonukleotide" schließen auch
Polymere von Nicht-Nukleotidmonomeren ein, die durch Phosphatester
oder andere Verbindungen, die in der Lage sind, sequenzspezifische
Hybride mit einer Zielnukleinsäure
zu bilden, verbunden sind, z.B. Peptidnukleinsäuren (PNAs; z.B. vgl. Knudsen,
1996). Polynukleotide reichen in ihrer Größe typischerweise von wenigen
Monomereinheiten, z.B. 8–40,
bis zu Hunderten oder Tausenden monomerer Einheiten. Wann immer
ein Polynukleotid durch eine Abfolge von Buchstaben dargestellt
ist, wie „ATGCCTG", versteht es sich,
dass die Nukleotide von links nach rechts in 5'- zu 3'-Ordnung sind und dass „A" Deoxyadenosin bezeichnet, „C" Deoxycytidin bezeichnet, „G" Deoxyguanosin bezeichnet und „T" Thymidin bezeichnet,
falls nicht anders angegeben.
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„Primer" bezeichnet ein Polynukleotid, das in
der Lage ist, sich selektiv an eine spezifizierte Zielsequenz anzulagern
und danach als ein Initiationspunkt einer Primer-Verlängerungsreaktion
zu dienen, in der 5'→3'- oder 3'→5'-Richtung.
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„Primer-Verlängerungsreaktion" bezeichnet eine
Reaktion zwischen einem Template-Primerhybrid (Matrizen-Primerhybrid)
und einem oder mehreren Nukleotiden, was in der Addition von einem
oder mehreren Nukleotiden an ein ausgewähltes Ende des Primers resultiert,
so dass das zugefügte
Nukleotid komplementär zu
dem korrespondierenden Nukleotid in der Ziel-Template-Nukleinsäure ist.
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„Verlängerbarer Primer" bezieht sich auf
einen Primer, der in der Lage ist, ein Nukleotid an ein verlängerbares
Ende des Primers verbunden zu haben (kovalent verbunden), typischerweise
das 3'-Ende des
Primers.
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„Zielspezifischer Primer" bezieht sich auf
einen Primer, der ein Zielbindesegment besitzt, das exakt oder im
Wesentlichen komplementär
zu einer Zielsequenz ist, so dass der Primer spezifisch an ein gewünschtes
Ende bindet, ohne signifikant an Nicht-Zielsequenzen unter ausreichend
stringenten Hybridisierungsbedingungen zu binden.
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„Nukleotidterminator" bezieht sich auf
ein Nukleotid oder Nukleosid, das (i) kovalent mit einem Ende eines
verlängerbaren
Primers zu verbinden ist, wenn der Primer an ein komplementäres Template
angelagert ist, jedoch (ii) nicht in der Lage ist, unter den Bedingungen,
die verwendet wurden, um den Nukleotidterminator an den Primer kovalent
zu binden, weiter verlängert
zu werden.
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„Spezifisches Bindungspaar" bezieht sich auf
ein Paar von Molekülen,
das spezifisch aneinander bindet, um einen Bindekomplex zu bilden.
Beispiele spezifischer Bindepaare schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf Antikörper-Antigen(oder
Hapten)-Paare, Liganden-Rezeptorpaare, Enzym-Substratpaare, Biotin-Avidin-Paare,
Polynukleotide, die komplementäre
Basenpaare haben, und dergleichen.
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„Primer-Verlängerungsreagens" beschreibt ein Enzym
oder anderen Katalysator, das/der in der Lage ist, eine Reaktion,
die zur kovalenten Anheftung von einem Nukleotidterminator an ein
Ende eines Primers führt,
zu katalysieren, wenn der Primer an eine komplementäre Zielnukleinsäure angelagert
ist.
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„Markierung" bezeichnet jede
Gruppe, die, wenn sie an ein Nukleotid oder Polynukleotide der Erfindung
geheftet ist, dieses Nukleotid oder Polynukleotide unter Verwendung
von bekannten Nachweismitteln nachweisbar macht.
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Eine „Siebmatrix" oder ein „Siebmedium" bezeichnet ein Elektrophoresemedium,
das quervernetzte oder nicht-quervernetzte Polymere enthält, die
wirksam sind, um elektrophoretische Wanderung von geladenen Spezies
durch die Matrix zurückzuhalten,
so dass kleinere Verlängerungsprodukte
schneller als größere Verlängerungsprodukte
wandern.
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A. Probennukleinsäuren
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Die Zielnukleinsäuren zur Verwendung gemäß der Erfindung
können
von jeder Quelle abgeleitet sein, ob synthetisch oder natürlich, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf Organismen, wie Prokaryoten, Eukaryoten, Pflanzen, Tiere und
Viren, genauso wie synthetische Nukleinsäuren. Die Zielnukleinsäuren können von jedem
Probentyp einer breiten Vielzahl von Probentypen stammen, wie Zellnuklei
(z.B. genomische DNA), und extranukleäre Nukleinsäuren, z.B. Plasmide, mitochondriale
Nukleinsäuren
und dergleichen.
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Die Ziel-Polynukleotide können in
Einzel- oder Doppelstrangform gemäß bekannter Techniken erhalten
werden. Die Zielnukleinsäuren
können
DNA oder RNA einschließen
und sind gewöhnlich
DNA.
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Viele Verfahren sind erhältlich zur
Isolierung und Reinigung von Zielnukleinsäuren zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise sind die Zielnukleinsäuren ausreichend
frei von Proteinen und jeglichen anderen interferierenden Substanzen,
um zielspezifische Primeranlagerung und -verlängerung zu ermöglichen.
Bevorzugte Reinigungsverfahren schließen ein (i) organische Extraktion,
gefolgt von Ethanolpräzipitation,
z.B. unter Verwendung eines organischen Phenol-/Chloroform-Reagens (Ausubel),
vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Extraktors,
z.B. ein Modell 341 DNA-Extractor von PE Biosystems (Foster City,
CA); (ii) Festphasen-Absorptionsverfahren
(Walsh, 1991; Boom), und (iii) salzinduzierte DNA-Präzipitationsverfahren
(Miller) wie Verfahren, die typischerweise als „Aussalz"-Verfahren bezeichnet werden. Optimalerweise
geht jedem der vorstehenden Reinigungsverfahren ein Enzymverdauschritt
voraus, der dazu beiträgt,
Proteine aus der Probe zu entfernen, z.B. Verdau mit Proteinase
K oder anderen ähnlichen
Proteasen.
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Um den Nachweis zu erleichtern, können die
Zielnukleinsäuren
vor der Fragmentanalyse unter Verwendung eines geeigneten Amplifikationsverfahrens
amplifiziert werden. Diese Amplifikation kann linear oder exponentiell
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Amplifikation der Zielnukleinsäure erreicht unter Verwendung
der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) (Mullis). Generell besteht die PCR aus einem anfänglichen
Denaturierungsschritt, der die Stränge von jeder Doppelstrang-Nukleinsäureprobe
trennt, gefolgt von der Wiederholung von (i) einem Anlagerungsschritt,
der es den Amplifikationsprimern ermöglicht, spezifisch an Positionen,
die eine Zielsequenz flankieren anzulagern; (ii) ein Verlängerungsschritt,
der die Primer in einer 5'-
zu 3'-Richtung verlängert, wodurch
eine Amplicon-Nukleinsäure
gebildet wird, die komplementär
zur Zielsequenz ist und (iii) ein Denaturierungsschritt, der die
Trennung des Amplicons von der Zielsequenz verursacht. Jeder der
vorstehenden Schritte kann bei einer unterschiedlichen Temperatur
durchgeführt
werden, vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten Thermocyclers,
(PE Biosystems, Foster City, CA).
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In einer bevorzugten Ausführungsform,
wenn ein Ziel-Amplifikationsschritt verwendet wird, wird PCR-Amplifikation
in Anwesenheit von dUTP anstelle von dTTP durchgeführt und
die Amplifikation wird vorzugsweise durch Behandlung mit E.-coli-Uracil-N-Glykosylase
(UNG) durchgeführt,
um die Verschleppung von Templates von früheren Amplifikationen zu reduzieren,
wie gelehrt von Longo et al. (1990) und Hartley (1991). Praktischerweise
ist ein Kit zur Durchführung
dieser PCR-Technik erhältlich
von PE Biosystems (GEBEAMP Carry- Over
Prevention Kit, Part Nr. N808–0068).
In Kürze,
das ursprüngliche
Reaktionsgemisch zur PCR-Amplifikation von Zielpolynukleotid(en)
wird modifiziert, um dUTP anstelle von dTTP einzuschließen. Nach
Zusatz von MgCl2 und DNA-Template wird UNG-Enzym
zugesetzt (PE Biosystems, Part Nr. N808–0096), und das Gemisch wird
bei einer Temperatur von bis zu 50°C für eine ausreichende Zeit (z.B.
1 bis 10 Minuten) inkubiert, um UNG-enthaltende, PCR-amplifizierte
DNA-Kontaminanten von früheren
Amplifikationen zu spalten. Das UNG-Enzym spaltet nicht dUTP-Monomere. Das
Gemisch wird dann bei 95°C
für 10
Minuten inkubiert, um (1) jegliche Polynukleotide, die abasisches
(abasic) dU enthalten, das durch UNG erzeugt wurde, zu spalten,
(2) das UNG irreversibel zu inaktivieren und (3) Template-DNA und Primer zu
denaturieren. Diese Bedingungen inaktivieren eine thermostabile
Polymerase, wie „AMPLITAQ" oder „AMPLITAQ
GOLD" (erhältlich von
PE Biosystems) nicht signifikant. Das Gemisch wird dann für eine ausgewählte Anzahl
von PCR-Zyklen zyklisiert, bis die gewünschte Amplifikationsmenge
erreicht wurde. Ein geeigneter Thermocycler ist ein PE Biosystems „GENEAMP
PCR INSTRUMENT SYSTEM".
Vorzugsweise ist die Primer-Anlagerungstemperatur
größer als 55°C, um die
Aktivität
von jeglichem übrigem
UNG-Enzym zu unterdrücken.
Nach dem letzten Zyklus wird die Probe vorzugsweise bei 72°C gehalten,
bevor sie aus dem Thermocycler entfernt wird. Nach der Entfernung wird
das Gemisch vorzugsweise sofort bei –20°C gelagert oder wird mit einem
gleichen Volumen Chloroform behandelt, um jegliche restliche UNG-Aktivität zu denaturieren.
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B. Sequenzierreagenzien
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Die vorliegende Erfindung verwendet
einen verlängerbaren,
zielspezifischen Primer, einen oder mehrere markierte Nukleotidterminatoren
und andere Reagenzien zur Erzeugung eines 3'-markierten Primer-Verlängerungsprodukts
zur Sequenzierung. Ausgewählte
Reagenzien werden nachstehend diskutiert.
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1. Nukleotidterminatoren
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Jeder Nukleotidterminator ist jedes
Nukleotid, das komplementär
zu einer ausgewählten
Polynukleotidbase ist, wie A, C, G, T oder U und ist auch in der
Lage, kovalent mit dem 3'-Ende
des Sequenzierungsprimers oder mit dem wachsenden Primer-Verlängerungsprodukt
verbunden zu werden, wenn der Primer oder das Verlängerungsprodukt
spezifisch an ein Zielpolynukleotid-Template angelagert wird. Somit
enthält
der Nukleotidterminator zur kovalenten Verbindung mit dem 3'-Ende eines Sequenzierungsprimers
oder mit dem Verlängerungsprodukt
davon (1) eine geeignete 5'-reaktive Gruppe,
wie eine 5'-Triphosphatgruppe
zur Reaktion mit einer Primer-3'-Hydroxyl-Gruppe; allerdings
ist der Terminator (2) nicht in der Lage zur weiteren Verlängerung
in 3'-Richtung, z.B. durch
Besitz eines 3'-Deoxy-Substituenten
oder einer 3'-Hydroxy-Blockierungsgruppe in
einer Ribose oder in einem Deoxyribosering anstelle einer 3'-Hydroxyl-Gruppe. Beispiele von 3'-Deoxy-Substituenten
schließen
z.B. Wasserstoff, 3'-Fluor, 3'-Amino und 3'-Azido ein (Mikhailopulo
et al., 1989; Krayevski et. al., 1984 Chidgeavadze, 1986). Beispiele
von 3'-Hydroxy-Blockierungsgruppen
schließen
beispielsweise Phosphat, Phosphonat, t-Boc und O-Acetyl ein. Exemplarische
Nukleotid-Zuckergruppen schließen
2',3'-Dideoxy-C-D-Ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl,
3'-Deoxy-β-D-Arabinofuranosyl,
3'-Amino-2',3'-Dideoxy-β-D-Ribofuranosyl
und 2',3'-Dideoxy-3'-Fluoro-β-D-Ribofuranosyl
ein (z.B. Chidgeavadze, 1985).
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Jeder Nukleotidterminator schließt eine
nachweisbare Markierungsgruppe zum Nachweis von Verlängerungsprodukten
von Sequenzierungsprimern ein, die den Terminator enthalten. Markierungen
können
direkte Markierungen sein, die selbst nachweisbar sind, oder indirekte
Markierungen, die nachweisbar sind in Kombination mit der Verwendung
von sekundären
chemischen Agenzien. Exemplarische, direkte Markierungen schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf Fluorophoren, Chromophoren, Radioisotope (z.B. 32P, 35S, 14C, 3H), Dreh(spin)-Markierungen, chemilumineszierende
Markierungen und dergleichen. Exemplarische, indirekte Markierungen
schließen
Enzyme ein, die ein signalerzeugendes Ereignis katalysieren und
Liganden, die Teil spezifischer Bindungspaare sind, sowie ein Antigen
oder Biotin, das spezifisch mit hoher Affinität an einen nachweisbaren Anti-Liganden
binden kann, wie einen markierten Antikörper oder Avidin. Vorzugsweise
ist die Markierung eine nicht-radioisotope Markierung. In einer
stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist die Markierung eine fluoreszierende Markierung oder chemilumineszierende
Markierung, und am stärksten
bevorzugt ist eine fluoreszierende Markierung.
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Isotopmarkierungen können durch
bekannte Verfahren in Terminatoren eingeführt werden. Beispielsweise
kann 32P an der Alpha-Phosphat-Position
durch 5'-Phosphorylierung
eines geeigneten 5'-aktivierten Nukleosid-Vorläufers eingebaut
werden. 35S kann zu einem 5'-Alpha-Phosphoratom gegeben werden durch
bekannte Sulfurisierungsverfahren. Verfahren zum Einbau von Tritium
oder 14C in Nukleosid-Strukturen sind auch gut
bekannt.
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Nicht-isotope Markierungen können auch
durch bekannte Verfahren in Nukleosidanaloga eingebaut werden. Typischerweise
werden Markierungen an geeignete Substituentenpositionen angeheftet,
die in der Nukleosidbase lokalisiert sind, wie die 5-Position von Pyrimidinen
und die 7'-Position
von 7-Deazapurinen (z.B. Prober, 1987, 1995; Menchen et al. 1991,
1994; Lee et al., 1992a, b).
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Eine fluoreszierende Markierung,
die in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sollte die folgenden
Eigenschaften haben: (1) eine unterscheidbare Emissionswellenlänge, die
es ermöglicht,
die Markierung leicht nachzuweisen und sie von anderen basenspezifischen
Markierungen, die vorliegen können,
zu unterscheiden, (2) eine enge Emissionsbandbreite, um die spektrale Überlappung
mit anderen Markierungen zu reduzieren, (3) ein Absorptionsspektrum,
das zugänglich
für eine
Anregung durch eine günstige
Lichtquelle ist, wie einen Argon-Laser mit Emissions-Peaks bei 488
nm und 514 nm, (4) hohe Quantenausbeute, was bedeutet, dass die
fluoreszierende Emission die allgemeine Route der Entspannung nach
Anregung ist, (5) sterische und chemische Eigenschaften, die mit
der Prozessierung durch eine DNA- oder RNA-Polymerase kompatibel
ist, zum Anhängen
an ein Primer-Verlängerungsfragment
und (6) Stabilität
gegenüber
Verlängerungs-,
Trennungs- und Nachweisschritten.
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Viele nützliche, fluoreszierend markierte
Nukleotidterminatoren wurden beschrieben. Prober et al. (1987, 1995)
offenbart bestimmtes Xanthen (Succinylfluoreszeine), das in einer
einzelnen Verlängerungsreaktion
verwendet werden kann, gefolgt von elektrophoretischer Trennung
in einer einzelnen Spur. Zusätzliche, bessere
fluoreszierende Markierungen sind offenbart in Bergot et al. (1991;
1994) und Rosenblum et al. (1997) (9'-Phenylrhodamin-Rückgrat,
mit oder ohne 4,7-Dichlorsubstitution): Menchen et al. (1991; 1994)
4,7-Dichlorfluoreszeine);
Lee et al. (1992a; 1992b) (Fluoreszein-Rückgrate); und Lee et al. (1997a,
b) und Rosenblum et al. (1997) (4,7-Dichlororhodamine („dRhodamine"), und Fluoreszein-Rhodamin-Donor-Akzeptor-Konjugate). Die
letztere Klasse fluoreszierender Markierungen ist zu bevorzugen,
da sie vierfarbige Farbstoffsätze
mit hochspektraler Auflösung
und sehr hohen Quanteneffizienzen (100%) zur Verfügung stellen
können.
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Markierungen können leicht an Nukleotidbasen
angeheftet werden, insbesondere an die 5'-Position von
Pyrimidinen und die 7-Position von Deazapurinen. Substitutionen
an diesen Positionen interferieren generell nicht mit normaler Basenpaarung
der assoziierten Basen und sind zur gleichen Zeit akzeptabel zur
Prozessierung durch verschiedene Polymerasen (Prober, 1995, Seite
17).
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Der Linker kann allgemein eine Anzahl
von verschiedenen Formen annehmen, so dass die Länge und Starrheit der Verbindung
zwischen der Terminatorbase und der Markierung stark variieren kann.
Es wurden beispielsweise mehrere geeignete Basenmarkierungsverfahren
berichtet, die verwendet werden können, z.B. Gibson et al. (1987),
Gebeyehu et al. (1987), Haralambidis et al. (1987), Haugland (1989),
Menchen (1994), Lee et al. (1992b) und dergleichen. Insbesondere
können
Fluoreszein- und Rhodamin-Markierungen modifiziert werden, um geeignete
Funktionalitäten
zu enthalten, wie Carbonyl, Sulfonyl, Isothiocyanat, Succinimidyl Carboxylat,
Phosphoramidit, Amino und Methylamino (z. B. Menchen, 1994). In
einer Ausführungsform
wird die Verbindungsgruppe zwischen der Markierung und der Base
durch Reagieren eines N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Esters einer Fluoreszenzmarkierung
mit einer Alkynylamino-derivatisierten Base eines Terminators (der
einen 3-Amino-1-Propynyl-Linker
enthält)
gebildet, wie gelehrt von Prober et al. (1995) und Hobbs et al. (1991,
1992). Längere
Linker können
auch verwendet werden, wie der Propynylethoxyamino-Linker, beschrieben
von Rosenblum et al. (1997), der verwendet wurde um die 5- oder
6-Carboxygruppen
von Rhodaminverbindungen mit den Basenresten von ddT, ddC und ddG
zu verbinden. Bei Doner-Akzeptor-Fluoreszenzmarkierungen (auch manchmal
Energie-Transfer-Farbstoffe
genannt) kann der Donor und Akzeptor auch durch eine Vielzahl von
Linkern verbunden sein, wie beschrieben in Lee et al. (1997a) und
Rosenblum et al. (1997), von denen ein 4'-Aminomethylbenzoat-enthaltender Linker
bevorzugt ist. Weitere Details hinsichtlich verschiedener Verbindungstechniken
können
beispielsweise in Lee et al. (1992b), Prober et al. (ebenda), Rosenblum
et al. (1997) und Lee et al. (1997a, b) gefunden werden.
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2. Primer
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Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet vorzugsweise
zielspezifische Primer, die (i) ein Ziel-bindendes Segment und (ii)
eine mobilitätsverringernde
Gruppe, die nicht das Ziel bindet enthalten. Primer können durch
jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, vorzugsweise unter
Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers, z.B. PE-Biosystems (Forster
City, CA) Modell 392 oder 394 DNA/RNA-Synthesizer, unter Verwendung
von Standardchemie, z.B. Phosphoramidit-Chemie (Beaucage; Gaint,
1984, 1990).
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Die Sequenz des zielbindenden Segments
des Primers wird ausgewählt,
um an eine ausgewählte, komplementäre Zielsequenz
zu hybridisieren. Typischerweise ist die ausgewählte Zielsequenz eine universelle Primersequenz
aus einem Klonierungsvektor, wie einem Plasmid (z.B. m13 Phage),
in die die Probe kloniert wurde. Alternativ kann das zielbindende
Segment ausgewählt
sein, um an eine konservierte Region stromaufwärts eines Ziellocus, der sequenziert
werden soll, oder an eine einzigartige Zielsequenz stromaufwärts einer Region
von Interesse anzulagern.
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Die Länge des zielbindenden Segments
ist ausgewählt,
um spezifische Hybridisierung des Primers an das gewünschte Ziel
sicher zu stellen, ohne signifikante Kreuzhybridisierung mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren in der
Probe. Vorzugsweise liegt die Schmelztemperatur des zielbindenden
Segments zwischen 35 und 75 Grad Celsius, stärker bevorzugt zwischen 50
und 70 Grad und noch stärker
bevorzugt zwischen 55 und 65 Grad. Die ausgewählte Schmelztemperatur kann
erreicht werden durch eine geeignete Auswahl der Basenzusammensetzung
und Länge
des Bindesegments, basierend auf bekannten Verfahren zur Einschätzung von
Primer-Schmelztemperaturen (z.B. Breslauer, 1986; Rychlik, 1989
und 1990; Wetmur 1991; Osborne, 1991; Montpetit, 1992). Typischerweise
ist das zielbindende Segment zwischen 15 und 30 Basen lang. Eine
Länge des
zielbindenden Segments zwischen 18 und 24 Basen ist gewöhnlich bevorzugt,
da solche Oligonukleotide dazu neigen, sehr sequenzspezifisch zu
sein, wenn die Anlagerungstemperatur innerhalb von ein paar Grad einer
Primer-Schmelztemperatur eingestellt wird (Dieffenbach, 1995).
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Das Zielbindesegment ist vorzugsweise
verlängerbar
konstruiert, was bedeutet, dass ein Nukleotidmonomer oder -terminator
an eines der Enden des Zielbindesegments angehängt werden kann, wenn das Zielbindesegment
mit einer komplementären
Zielsequenz hybridisiert wird. Typischerweise ist das verlängerbare
Ende des Primers an dem 3'-Terminus des Zielbindesegments
lokalisiert, so dass die 3'-terminate
Base eine 3'-Hydroxyl-,
3'-Amino- oder andere
reaktive Gruppe enthält,
die kovalent mit einem Nukleotidterminator durch ein Primerverlängerungsreagens
verbunden werden kann. Am häufigsten
enthält
das 3'-Ende des
Primers eine 3'-terminale
Hydroxylgruppe.
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Wie vorstehend erwähnt, schließt der Sequenzierungsprimer
zusätzlich
eine mobilitätsvermindernde Gruppe
ein, die nicht signifikant an das Ziel-Polynukleotid bindet oder
hybridisiert. Ein Hauptzweck der mobilitätsvermindernden Gruppe ist
es, die Geschwindigkeit der Mobilität des Sequenzierungsverlängerungsprodukts
zu reduzieren, so dass markierte Terminator-Abbauprodukte vor nicht
verlängertem
Primer während elektrophoretischer
Trennung eluieren. Insbesondere kann die mobilitätsvermindernde Gruppe so ausgewählt sein,
um die Mobilitätsrate
von jedem Primerverlängerungsprodukt
durch eine spezifische Menge zu verringern, z.B. durch eine Mengeäquivalenz
zu der Anwesenheit von wenigstens 10 zusätzlichen Nukleotidbasen in
dem Primer, im Verhältnis
zu der Mobilität
eines korrespondierenden Primer-Verlängerungsprodukts, dem die mobilitätsvermindernde
Gruppe fehlt.
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In einer ersten Ausführungsform
enthält
die mobilitätsvermindernde
Gruppe ein Polynukleotidsegment. Die Sequenz des Polynukleotids
ist ausgewählt,
um nicht komplementär
gegenüber
dem Probenpolynukleotid zu sein, so dass weder spezifische noch
unspezifische Hybridisierung mit Probennukleotiden auftreten kann.
Beispielsweise kann das Segment homopolymer sein (z.B. poly- C,
G, A oder T), oder es kann dimere Wiederholungen enthalten, wie
Poly-(TC)) (Beispiel 1), poly (CA) oder dergleichen. Die genaue
Sequenz der mobilitätsvermindernden
Gruppe ist normalerweise nicht wichtig, solange die Probe nicht
eine genau komplementäre
Sequenz zu dem Segment enthält
und solange die zielspezifische Anlagerung und Primerverlängerung
zuverlässig
für Sequenzbestimmung
durchgeführt
werden kann.
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In einer zweiten generellen Ausführungsform
ist die mobilitätsvermindernde
Gruppe ein Nicht-Polynukleotidpolymer. Das Polymer kann beispielsweise
ein Homopolymer oder Block-Copolymer sein und kann eine lineare,
Comb(Kamm)-, verzweigte, dentritische oder andere Architektur besitzen.
Bevorzugte Polymere sind diejenigen, die hydrophil sind oder wenigstens
ausreichend hydrophil, wenn sie an das Zielbindesegment gebunden
sind, um sicher zu stellen, dass der Primer leicht löslich in
wässrigem
Medium ist. Das Polymer sollte auch nicht die Hybridisierung des
Zielbindesegments an das Ziel-Polynukleotid beeinflussen.
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Exemplarische Polymere können hergestellt
werden aus Ethylenoxid, Glykolsäure,
Milchsäure,
Aminosäureresten
und Polypeptiden, Sacchariden und Oligosacchariden, Polyurethanen,
Polyamiden, Polysulfonamiden, Polysulfoxiden und Block-Copolymeren
davon, einschließlich
Polymeren, die zusammengesetzt sind aus Einheiten von multiplen
Untereinheiten, verbunden durch geladene oder ungeladene Verbindungsgruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die mobilitätsvermindernde
Gruppe ein Polymer aus Ethylenoxidpolymeren, der Form [–(OCH2CH2)nOP(=O)(O-)–]m, wobei n 5 oder 6 ist und m 2 bis 20 ist
oder bevorzugter von 5 bis 10 ist. Solche Ethylenoxid-enthaltenden
Polymere können
hergestellt werden aus Penta-Ethylenoxid- oder Hexa-Ethylenoxid-Polymerblöcken, die
dann konvertiert werden, um Phosphoramidit-Derivate zu aktivieren,
gefolgt von sequentiellem Zusatz einer ausgewählten Anzahl von Polymerblockphosphoramiditen
an das 5'-terminale
Ende eines Zielbindesegments durch Standardphosphoramidit-Syntheseverfahren
(z.B. vgl. Grossuran et al., 1996, in Beispielen 1 bis 4).
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Studien zur Unterstützung der
Erfindung weisen darauf hin, dass jede Einheit von –(OCH2CH2)5OPO2– die
Mobilität
von einem angehängten
Polynukleotid durch das Äquivalent
von etwa 2 zusätzlichen
Nukleotiden verringert und jede Einheit von –(OCH2CH2)6(OPO2– die Mobilität von einem
angehängten
Polynukleotid durch das Äquivalent
von etwa 2,5 zusätzlichen
Nukleotiden verringert.
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Die mobilitätsverringernde Gruppe kann
einem jeden Teil des Zielbindesegments angehängt werden, unter der Voraussetzung,
dass das Zielbindesegment Primerverlängerung entlang des beabsichtigten Ziel-Templates
ermöglicht.
Am einfachsten wird die mobilitätsvermindernde
Gruppe mit dem 5'-Ende
des Zielbindesegments des Primers verbunden. Wenn die mobilitätsvermindernde
Gruppe ein Polynukleotid ist, kann die Gruppe durch synthetische
Standardverfahren zuverlässig
in den Primer eingebaut werden. Ähnlich
kann eine Nicht-Polynukleotidgruppe, die die Mobilität verringert,
durch Standardverbindungsverfahren zugesetzt werden oder kann auf
ein Zielbindesegment durch schrittweisen Zusatz von Polymerkettenuntereinheiten
auf das Bindesegment unter Verwendung von Standard-Festphasensyntheseverfahren
aufgebaut werden. Zusätzlich,
obwohl die Erfindung hier im Hinblick auf eine Einzelpolymerkette
beschrieben werden kann, die an einer Einzelstelle an ein assoziiertes
Zielbindesegment angehängt
ist, zieht die Erfindung auch Zielbindesegmente in Erwägung, die
durch mehr als ein Polymerkettenelement derivatisiert sind, indem
die Elemente kollektiv die Polymerkette bilden. Verfahren zur Synthese
von ausgewählten
Längenpolymerketten
sind beschrieben z.B. in Grossman et al. (1996).
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3. Primerverlängerungsreagens
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Das Primerverlängerungsreagens kann jedes
chemische oder enzymatische Reagens sein, das wirksam ist, um Nukleotidmonomere
an das verlängerbare
Primerende anzuhängen,
die komplementär
zu dem Ziel-Template-Strang sind. In einer Ausführungsform ist das Primerverlängerungsreagens
ein DNA-Polymeraseenzym.
Exemplarische Polymeraseenzyme schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf Pfu-DNA-Polymerase, E.-coli-Polymerase-1, T7-Polymerase, AMV-reverse
Transkriptase, Taq-DNA-Polymerase, AMPLITAQ-DNA-Polymerase FS, Klenow-Fragment,
Vent-DNA-Polymerase und dergleichen (z.B. Kornberg und Baker). RNA-Polymerasen
und reverse Transkriptasen können
auch verwendet werden, z.B. für
RNA-Primer.
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II. Verfahren
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In der Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird eine ausgewählte
Polynukleotidprobe mit einem zielspezifischen Primer in Kontakt
gebracht, unter Bedingungen, die wirksam für den Primer sind, damit dieser
spezifisch an primerkomplementäre
Region in einem oder mehreren Zielpolynukleotiden anlagert, um ein
oder mehrere Ziel-Primer-Hybride) zu bilden.
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Wie vorstehend diskutiert, kann das
Ziel Einzel- oder Doppelstrang-DNA sein und kann hergestellt werden
in Übereinstimmung
mit bekannten Verfahren, z.B. durch Ultrafiltration unter Verwendung
einer „MIKROCON-100"-Membran von Amicon,
Inc. (Beverly, MA) oder unter Verwendung einer „CENTRI-SEP"-Zentrifugationssäule (Princeton)
oder durch Behandlung der Probe mit Garnelen-alkalischer Phosphatase
und Exonuklease-1 (z.B. unter Verwendung eines „PCR PRE-SEQUENZIERUNGS-KITS" von Amersham-Pharmacia
Biotech). Für
größere DNA-Ziele,
wie bakterielle, künstliche
Chromosomen (BACs), ist es bevorzugt, dass das DNA-Ziel Cäsiumchlorid-Bandierung
oder alkalischer Lyse (Marra et al., 1996) mit Extra-Phenolextraktin
und Isopropanol-Präzipitationsschritten,
falls notwendig, unterworfen wird. Kommerzielle Kits für BAC-DNA-Präparation
sind auch erhältlich
(LigoChem., http://www.ligochem.com).
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Der Anlagerungsschritt wird durchgeführt unter
Bedingungen, die stringent genug sind, um Sequenzspezifität zu garantieren
und noch ausreichend durchlässig
genug, um die Bildung von stabilen Hybriden in einer akzeptablen
Menge zu erlauben. Die Temperatur und die Länge der Zeit, die erforderlich
ist zur Primer-Anlagerung hängen
von verschiedenen Faktoren einschließlich der Basenzusammensetzung,
Länge und Konzentration
des Primers und der Natur des verwendeten Lösungsmittels ab, z.B. die Konzentration
von Ko-Lösungsmitteln,
wie DMSO (Dimethylsulfoxid), Formamid oder Glyzerin und Gegenionen,
wie Magnesium oder Mangan. Typischerweise wird Hybridisierung (Anlagerung)
durchgeführt
bei einer Temperatur, die etwa 5 bis 10°C unter der Schmelztemperatur
des Ziel-Primer-Hybrids in der Anlagerungslösung liegt. Typischerweise reicht
die Anlagerungstemperatur von 55 bis 75°C und die Primer-Konzentration
ist etwa 0,2 μM.
Unter solchen Bedingungen ist die Anlagerungsreaktion normalerweise
innerhalb weniger Sekunden vollständig.
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Nach der Anlagerung des Primers an
das Ziel wird das (die) Hybrid(e) mit einem Primer-Verlängerungsreagens
reagiert, in Anwesenheit von wenigstens einem markierten 3'-Nukleotid-Terminator, komplementär zu einem
ausgewählten
Zielnukleotid-Basentyp, unter Bedingungen, die wirksam sind, um
ein oder mehrere Primer-Verlängerungsprodukte
zu bilden, die mit wenigstens einem markierten 3'-Nukleotid-Terminator enden.
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In einer Ausführungsform wird Primerverlängerung
in Abwesenheit von verlängerbaren
Nukleotiden durchgeführt,
unter Bedingungen, die wirksam sind, um den Terminator an den angelagerten
Primer in dem Hybrid nur anzuhängen,
wenn der Terminator komplementär
zu einer Base in dem Ziel-Polynukleotid ist, das direkt angrenzend
an das verlängerbare
Ende des angelagerten Primers ist. Die Sequenz des Zielbindesegments
des Primers ist ausgewählt,
um an ein ausgewähltes
komplementäres
Ziel-Polynukleotid zu hybridisieren, das eine potentielle, polymorphe
Stelle enthält,
die direkt angrenzend an (direkt flankierend) der terminalen Base
an dem verlängerbaren
Ende des Primers lokalisiert ist. Die nachzuweisende Zielbase kann
jede Base sein, die ausreichend ist, um die Anwesenheit eines Polymorphismus
oder einer Mutation in einem Ziel-Polynukleotid zu identifizieren,
um ein bestimmtes Allel zu identifizieren oder um die Anwesenheit
einer potentiellen Zielsequenz auszuschließen. Beispielsweise kann die
Zielbase in einem genomischen DNA-Ziel ein einzelner Nukleotid-Polymorphismus
(SNP) sein, der mit dem Auftreten einer bestimmten Krankheit assoziiert
ist, mit einem NLA-Typus oder mit jedem anderen genotypischen oder
phänotypischen
Merkmal. Als weitere Veranschaulichung kann die Zielbase beispielsweise
festlegen (1) den Terminus eines Sequenzinserts; (2) den Terminus
einer entfernten Region, die gespleißt wurde zu der Primer-komplementären Region
in dem Ziel, als das Ergebnis einer Deletion von einer oder mehreren
Zielbasen, oder (3) den Terminus eines fehl-gespleißten mRNA-Segments.
In einigen Fällen
schließt
der Zielpolymorphismus oder die Mutation eine oder zwei mögliche alternative
Basen ein. Somit sollte das Reagieren eines angelagerten Primers
mit den korrespondierenden zwei komplementären Terminatorbasen in der
Anwesenheit eines Verlängerungsreagens
ausreichend sein, um wenigstens eine der zwei möglichen alternativen Sequenzen
zu identifizieren. Wenn der Zielpolymorphismus eine von drei oder
vier möglichen
Alternativen ist, sollte der angelagerte Primer ebenso mit der geeigneten
Anzahl von möglichen
Basentypen-Alternativen reagiert werden, um zu bestätigen, welche möglichen
Sequenzen tatsächlich
vorliegen.
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In einer weiteren Ausführungsform
wird Primerverlängerung
durchgeführt
in Anwesenheit von wenigstens einem verlängerbaren Nukleosidmonomer
zusätzlich
zu markierten 3'- Nukleotidterminator(en)
unter Bedingungen, die wirksam sind, um das 3'-Ende von spezifisch hybridisierten
Primern durch Zusatz von ziel-komplementären Polynukleotidmonomeren
und Terminatoren) zu verlängern,
um ein oder mehrere Primer-Verlängerungsprodukte
zu bilden. Typischerweise wird Verlängerung durchgeführt unter
Verwendung von vier Standard-Deoxyribonukleotidtriphosphaten (für A, C,
G, T, einschließlich
z.B. Ersetzen von dI für
dG und dU für
dT, falls angebracht) und einem, zwei, drei oder vorzugsweise vier
verschiedenen Nukleotidterminatoren, Terminator(en), um ein oder
mehrere Primer-Verlängerungsprodukte
zu bilden, um Sequenzinformation für Sequenzen, die eine Länge von
Dutzenden oder verschiedenen Hunderten haben, zur Verfügung zu
stellen.
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Die Konzentrationen von verlängerbaren
Nukleotiden (falls vorliegend) und markiertem Terminator sind abhängig von
der Wahl der Polymerase und anderen Parametern gemäß bekannten
Verfahren (vorstehende Zitate). Insbesondere kann die Terminator-Konzentration
optimiert werden, um die Signalintensität der Markierungen (falls mehr
als eine Markierung verwendet wird) zu berücksichtigen und jegliche Veränderungen ihrer
Inkorporationsraten durch die Polymerase (z.B. vgl. Terminator-Konzentrationen,
offenbart in Tabelle 1 von Rosenblum et al., 1997).
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Die Reaktionsbedingungen, die für Primer-Verlängerung
verwendet werden, können
alle geeigneten Bedingungen sein, die durch den Benutzer gewählt werden,
und sie werden generell von der Probenmenge abhängen, der Natur des/der Terminatoren)
und den Eigenschaften des Primer-Verlängerungsreagens. Vorzugsweise
ist das Primer-Verlängerungsreagens
eine DNA- oder RNA-Polymerase, und der markierte Nukleotid-Terminator enthält eine
5'-Triphosphatgruppe,
um kovalente Verbindung an eine 3'-Hydroxylguppe
des Primers zu erleichtern. Bedingungen zur Verlängerung angelagerter Primer
unter Verwendung von Nukleinsäurepolymerasen
sind gut bekannt (z.B. Ausubel, Sambrook). Beispielsweise können die
Reaktionsbedingungen optimiert werden gemäß bekannter Verlängerungsreagens-Kofaktorerfordernissen,
pH-Abhängigkeiten
und Puffer-Bevorzugungen.
Insbesondere wird die Wahl des Terminatortypus häufig die Wahl der Polymerase
beeinflussen. Beispielsweise sind die Xanthen-markierten Terminatoren,
beschrieben in Prober (1995) kompatibel mit T7-DNA-Polymerase, AMV-reverser
Transkriptase und Bakteriophage-T7-Polymerase, jedoch nicht mit Klenow-Fragment
der DNA-Polymerase-1. Für
die Rhodamin-markierten Terminatoren, beschrieben von Bergot et
al. (1991, 1994) ist Taq-DNA-Polymerase vorzuziehen. Die modifizierte
T7-DNA-Polymerase von Tabor und Richardson (1989, 1990) ist für Fluoreszein-Terminatoren
beschrieben von Menchen et al. (1991; 1994) und Lee et al. (1992a,
b) bevorzugt. Für
die 4,7-Dichlororhodamin-Terminatoren
und Rhodamin-Fluoreszein („BIGDYE") Energie-Transfer- Terminatoren, beschrieben
von Lee et al. (1997a, b) und Rosenblum et al. (1971), ist normalerweise „AMPLITAQ
DNA POLYMERASE FS" bevorzugt
(PE Biosystems). Reaktionsbedingungen für Primerverlängerung
unter Verwendung der vorstehenden Terminatoren sind beschrieben
in den vorstehenden Referenzen und anderswo und können leicht
durch Standardtechniken optimiert werden.
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Die Wahl des Primers und insbesondere
die Wahl der mobilitätsvermindernden
Gruppe werden von dem Typus des (der) markierten Terminators(Terminatoren)
abhängen,
der/die verwendet werden, und den Mobilitäten der Terminator-Abbauprodukte.
Beispielsweise enthalten Rhodamin-markierte Terminatoren eine resonanzstabilisierende,
positive Ladung, geteilt von 3- und 6-Stickstoffatomen, die die
Mobilität
des Terminators im Verhältnis
zu den korrespondierenden, nicht-markierten Terminatoren zurückhalten.
Somit können Rhodamin-Terminatoren und
ihre Abbauprodukte mit kurzen Primer-Verlängerungsprodukten komigrieren
und mit Sequenzbestimmungen interferieren. Ähnlich führen die „BIGDYE"-Rhodamin-/Fluoreszein-Terminatoren, beschrieben
von Lee et al. (1997) und Rosenblum et al. (1997) zu Abbauprodukten,
die mit kurzen Primer-Verlängerungsprodukten
interferieren können
aufgrund der Anwesenheit der positiv geladenen Rhodamingruppen.
Letztendlich, obwohl Fluoreszein-Terminatoren normalerweise vor
den Sequenzierungs-Primern wandern (aufgrund der Anwesenheit einer
resonanzstabilisierenden, negativen Ladung, geteilt von den 3- und
6-Sauerstoffatomen) kann Dephosphorylierung und Spaltung der Basengruppen
zu Abbauprodukten führen,
die mit Verlängerungsprodukten überlappen.
Entsprechend ist die Länge
der mobilitätsvermindernden
Gruppe in dem Primer ausgewählt,
um sicherzustellen, dass Primer-Verlängerungsprodukte eines bestimmten
Längenbereichs
und vorzugsweise alle Primer-Verlängerungsprodukte in einer Region
von Interesse sequenziert werden können, ohne Interferenz von
markierten Terminatoren oder Terminator-Abbauprodukten. In bestimmten,
bevorzugten Ausführungsformen
ist die mobilitätsvermindernde
Gruppe ausgewählt,
um die Mobilitätsrate
von jedem Primer-Verlängerungsprodukt
durch eine Menge, die wenigstens 4 oder wenigstens 10 zusätzlichen
Nukleotidbasen entspricht, zu verringern, im Vergleich zu der Mobilität eines
korrespondierenden Primer-Verlängerungsprodukts,
dem die mobilitätsvermindernde
Gruppe fehlt oder durch eine Menge gleich dem Zusatz von wenigstens
15 zusätzlichen
Nukleotidbasen oder durch eine Menge, die dem Zusatz von wenigstens
20 zusätzlichen
Nukleotidbasen entspricht.
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In einer Ausführungsform, in der ein oder
mehrere verlängerbare
Nukleotide verwendet werden, wird Primerverlängerung erreicht durch Teilen
des Hybridisierungsgemisches in zwei oder mehrere Aliquots, und jeder
Aliquot wird mit einem unterschiedlichen, einzelnen Nukleotid-Terminatorbasentyp
reagiert. Beispielsweise kann das Hybridisierungsgemisch in vier
Aliquots geteilt werden, und jedes Aliquot wird mit einem ausgewählten Terminator- Äquivalent zu A, C, G oder T/U
reagiert. Unter Verwendung dieses Ansatzes können alle Terminatoren die
gleiche Markierung enthalten, unter der Voraussetzung, dass die
Verlängerungsreaktionen für jeden
unterschiedlichen Terminatortyp während der Primer-Verlängerung
und elektrophoretischen Trennung getrennt voneinander gehalten werden.
Vorzugsweise wird das Hybridisierungsgemisch gleichzeitig in dem
gleichen Gemisch mit einem Satz von vier Terminatortypen, umfassend
A, C, G und U/T reagiert, die unterschiedliche Markierungen haben,
um jeden Terminatortyp zu identifizieren.
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Gemäß den verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung können
multiple Zyklen der Primerverlängerung
in dem Reaktionsgemisch durchgeführt
werden, unter Verwendung bekannter Verfahren (cycle sequencing),
um das Niveau der Verlängerungsprodukte
zur Analyse zu steigern. Somit können
Primer nach einer ersten Verlängerungsreaktion
(verlängert
oder nicht verlängert)
denaturiert werden von den Ziel-Polynukleotiden durch geeignete
Mittel (z.B. durch Erhitzen der Verlängerungsreaktion gut oberhalb
der Schmelztemperaturen der Verlängerungsprodukte),
gefolgt von Anlagerung von neuen, nicht verlängerten Primern auf die Ziel-Polynukleotide
und Primerverlängerung.
Da die nicht verlängerten
Primer normalerweise im Überschuss im
Verhältnis
zu den Ziel-Polynukleotiden
vorliegen, ist die Menge der verlängerten Primer, die wieder
an die Ziel-Polynukleotide
anlagern, normalerweise nicht signifikant. Beispielsweise kann ein
Verlängerungsgemisch durch
multiple Zyklen (z.B. 10 bis 50) gecycelt werden, umfassend (1)
Hitze bei 95°C
für 10
Sekunden (Denaturierung), 45°C
für 5 Sekunden
(Primer-Anlagerung)
und 60°C
für 1 bis
5 Minuten (Verlängerung).
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Nachdem die Bildung der Primer-Verlängerungsprodukte
abgeschlossen war, wird das Produktgemisch optional gereinigt, um übrige Terminatoren
und Terminator-Nebenprodukte und andere Reaktionskomponenten vor
der elektrophoretischen Trennung zu entfernen. Ein solcher Reinigungsschritt
(Schritte) kann nützlich
sein zur Reduktion der Masse markierter Terminatorprodukte der Probe.
Allerdings wird sich der Nutzen der Reinigung generell mit der Anzahl
der Reinigungsschritte verringern. Außerdem steigern Reinigungsschritte
die Kosten und die Zeit der Sequenzierung und können das Signal aufgrund des
Verlustes von Verlängerungsprodukten
reduzieren.
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Jedes geeignete Reinigungsverfahren
kann verwendet werden, wie Gel-Filtration, Ethanol-Präzipitation
oder Isopropanol-Präzipitation
gemäß bekannten
Techniken (z.B. vgl. mit dem Protokoll mit dem Titel „ABI PRISM
BIGDYE Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit", erhältlich von
PE Biosystems (1998), Foster City, CA). Beispielsweise wird Gel-Filtration
vorzugsweise unter Verwendung einer „CENTRI-SEP"-Spin-Säule (Zentrifugationssäule) von
Princeton Separations P/N CS-901) durchgeführt. Die Säule sollte vorsichtig oberhalb
der Mitte des Säulenbettes
geladen werden ohne Herabtropfen an der Innenseite der Säule.
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Nach der Beladung wird die Säule vorzugsweise
bei 325–730 × g für weniger
als 2 Minuten zentrifugiert. Das Filtrat enthält die gewünschten Verlängerungsprodukte,
die in einer Mikrofuge für
nachfolgende Trennung getrocknet werden können. Ethanol-Präzipitationen
werden vorzugsweise mit Natriumacetat durchgeführt. Beispielsweise können 50 μl nicht-denaturierter, 95%-iger
Ethanol und 2 μl
3 M Natriumacetat (pH 4,6 zu etwa 20 μl Verlängerungsreaktionsgemisch in
einem verschließbaren
Röhrchen
gegeben werden, um ein Endvolumen von 72 μl, enthaltend etwa 65% Ethanol,
herzustellen. Höhere
und geringere Ethanol-Konzentrationen können auch verwendet werden.
Das Röhrchen
wird dann verschlossen (z.B. mit einem Stück 3M „SCOTCH TAPE" 425-3-Aluminiumfolienband
mit selbstklebender Rückseite
und wird einige Male invertiert zum Mischen (oder wird durch Pipettieren
gemischt). Es wird dem Röhrchen
ermöglicht,
bei Raumtemperatur für
15 Minuten zu stehen, um vorzugsweise die Verlängerungsprodukte zu präzipitieren.
Das Röhrchen
wird dann 1400–3000 × g für 30 bis
45 Minuten zentrifugiert, um das Präzipitat zu pelletieren. Nach
der Zentrifugation wird das Klebeband sofort entfernt, ohne das
Pellet aufzuwirbeln, und der Überstand
wird entfernt durch Invertieren des Röhrchens auf ein Papiertuch.
Das invertierte Röhrchen
mit Papiertuch wird in eine Zentrifuge gebracht und bei 700 × g für eine Minute
zentrifugiert (spun). Das Pellet kann mit 50 bis 100 μl 70% Ethanol von
70% Ethanol gespült
werden, gefolgt von kurzem Vortexen, Zentrifugation, Entfernen des Überstands
und Trocknen des Pellets.
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Gemäß einem anderen Vorteil der
Erfindung kann die Anwesenheit einer mobilitätsvermindernden Gruppe, z.B.
eines Polynukleotidsegments, die Gewinnung von kurzen Primer-Verlängerungsprodukten
aus Ethanolpräzipitation
verbessern. Typischerweise ist die Gewinnung von Verlängerungsprodukten
abhängig von
der Ethanol-Konzentration. Geringere Ethanol-Konzentrationen neigen
dazu, geringere Mengen Terminatoren und Terminator-Abbauprodukte
zu präzipitieren.
Allerdings kann die Gewinnung von kurzen Primer-Verlängerungsprodukten
auch reduziert werden. Obwohl höhere
Ethanol-Konzentrationen
die Menge der präzipitierten,
kurzen Verlängerungsprodukte
steigern können,
kann andererseits die Präzipitation
von nicht-reagierten Terminatoren und Terminator-Abbauprodukten
auch gesteigert werden, was zu verstärktem Rauschen in dem resultierenden
Elektropherogramm führt.
Studien, die zur Unterstützung
der Erfindung durchgeführt
wurden, zeigen, dass kurze Verlängerungsprodukte,
die mit Primer erzeugt wurden, die eine mobilitätsvermindernde Gruppe enthalten,
hergestellt wurden, leichter durch Ethanolpräzipitation zu präzipitieren
sind als korrespondierende Verlängerungsprodukte,
denen die mobilitätsvermindernde
Gruppe fehlt. Somit können
geringere Ethanol-Konzentrationen verwendet werden, um selektiv
Verlängerungsprodukte
zu präzipitieren,
wohingegen unreagierte Terminatoren in dem Überstand bleiben. Demgemäss können Signale,
die durch markierte Terminatoren und Terminator- Abbauprodukte erzeugt werden, weiterhin
reduziert werden, so dass die Sequenzierung kurzer Verlängerungsprodukte
weiter vereinfacht wird.
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Die Verlängerungsprodukte können elektrophoretisch
unter denaturierenden Bedingungen in einer Siebmatrix getrennt werden,
so dass kleinere Verlängerungsprodukte
schneller als größere Verlängerungsprodukte
wandern. Die Siebmatrizes, die verwendet werden können, schließen kovalent
quervernetzte Matrizes ein, wie beispielsweise Acrylamid, kovalent
quervernetzt mit Bis-Acrylamid (Cohen et al., 1990); Gel-Matrizes, gebildet
mit linearen Polymeren (Matthies et al., 1992), und gel-freie Siebmedien
(Zhu et al. 1992). Vorzugsweise ist der Typus der elektrophoretischen
Matrix quervernetzt oder nicht quervernetztes Polyacrylamid, das eine
Konzentration (Gewicht zu Volumen) von zwischen 2–20 Gewichtsprozent
besitzt. Stärker
bevorzugt liegt die Polyacrylamidkonzentration zwischen etwa 4-8
Prozent. Die Trennmatrix kann zusätzlich denaturierendes Mittel
enthalten, z.B. 7 M Harnstoff, Formamid oder dergleichen. Detaillierte
Verfahren zur Konstruktion solcher Matrizes sind gegeben in Maniatis
et al. (1975, 1980) und Sambrook et al. (1982, 1989). Die optimale
Polymerkonzentration, pH, Temperatur, Konzentration des denaturierenden
Mittels, usw., die in einer bestimmten Trennung verwendet werden,
hängt von
Faktoren wie dem Größenbereich
der Verlängerungsprodukte,
die getrennt werden sollen, der Anzahl verschiedener Längenfragmente
und ihrer Basenzusammensetzungen ab. Demgemäss kann die Anwendung der Erfindung
vorhergehende Untersuchungen erfordern, um die Bedingungen für bestimmte
Trennungen zu optimieren.
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Die Konfiguration des Trennungsmediums
kann jegliche geeignete Konfiguration, ausgewählt von dem Benutzer, sein.
Typische Konfigurationen schließen
vertikale oder horizontale Slab-Gele, Kapillar-Elektrophoreseröhrchen und
Kanäle,
die in einem Substrat, wie Glas- oder Silikonsubstrat, gebildet
wurden, ein. Beispielsweise wird ein Kapillarröhrchen oder ein Mikrokanal
einen elektrophoretischen Pfad festlegen, der einen inneren Durchmesser
von 200 μm
oder weniger hat und stärker
bevorzugt 10 μm
oder weniger.
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Während
und nach der Trennung der Verlängerungsprodukte
kann eine Zielsequenz von der Anordnung der Wanderung der getrennten
Verlängerungsprodukte
bestimmt werden. Jedes Nachweisverfahren kann verwendet werden,
das für
den Typ der eingesetzten Markierung geeignet ist. Exemplarische
Nachweisverfahren schließen
radioaktive Detektion (z.B. unter Verwendung eines CCD- oder Phosphorimagers),
optische Absorptionsdetektion, z.B. UV-sichtbare Absorptionsdetektion und optische
Emissionsdetektion, z.B. Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, ein.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
werden die verschiedenen Verlängerungsprodukte
direkt nachgewiesen, ohne dass eine Reaktion der Fragmente mit zusätzlichen
chemischen Gruppen notwendig ist, um den Nachweis zu ermöglichen.
Beispielsweise können
fluoreszenz-markierte Verlängerungsprodukte
direkt gelesen werden, während
sie noch in einem Slab-Gel oder in einem Kapillarröhrchen,
wie vorstehend erwähnt,
sind.
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Insbesondere können fluoreszenzmarkierte Verlängerungsprodukte
durch Messung der Fluoreszenzemission von farbstoffmarkierten Polynukleotiden
nachgewiesen werden. Um einen solchen Nachweis durchzuführen, werden
die Polynukleotide durch Standardmittel beleuchtet, z.B. Quecksilberdampflampen
hoher Intensität,
Laser oder dergleichen. Vorzugsweise ist das Beleuchtungsmittel
ein Laser, der einen Beleuchtungsstrahl bei einer Wellenlänge zwischen
488 und 550 nm besitzt. Stärker
bevorzugt werden die Farbstoff-Polynukleotide
durch Laserlicht beleuchtet, das durch einen Argon-Ionen-Laser erzeugt
wird, insbesondere die 488- und 514-nm-Emissionslinien des Argon-Ionen-Lasers
oder die 532-nm-Emissionslinie
des Neodym-Festkörper-YAG-Lasers.
Verschiedene Argon-Ionen-Laser sind kommerziell erhältlich,
die gleichzeitig auf diesen Linien lasern, z.B. Cyonics. Ltd. (Sunnyvale,
Kalif.), Modell 2001 oder dergleichen. Die Fluoreszenz wird dann nachgewiesen
durch einen lichtempfindlichen Detektor, z.B. ein Fotomultiplier-Röhrchen,
eine ladungsgekoppelte Vorrichtung oder dergleichen. Exemplarische,
kommerziell erhältliche
Systeme zur Sequenzierung schließen einen ABI PRISM 310 (Kapillarelektrophorese)
und 377 (Slab-Gel-Elektrophorese) DNA-Sequenzer (PE Biosystems)
ein. Zusätzliche
Anleitung bezüglich
verschiedener Nachweismodi zur Sequenzbestimmung können gefunden
werden in Prober et. al., (1995), Rosenblum et al. (1997) und Lee
et al. (1997a, b). Basenabruf-Software
(base-calling software) ist erhältlich
von zahlreichen kommerziellen Quellen, um die Sequenzbestimmungen
weiterhin zu vereinfachen. Diese Software schließt vorzugsweise Algorithmen
zur Korrektur von Mobilitätsverschiebungen,
die durch markierte Terminatoren verursacht werden, ein.
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Wird die Sequenzierung unter Verwendung
von vier verlängerbaren
Nukleotidmonomeren durchgeführt
und vier verschieden markierter Terminatoren (oder vier verschiedenen
Terminatoren, die die gleiche Markierung enthalten, die getrennt
hergestellt und in getrennten Bahnen elektrophoretisch getrennt
werden), kann eine Sequenz von aufeinander folgenden Basen leicht
durch Zuordnen der Reihenfolge der Wanderung von Fragmenten, die
vier verschiedene Terminatoren enthalten, bestimmt werden. Allerdings
kann die Verwendung von weniger als vier unterschiedlichen Terminatoren
auch nützliche
Information in Form von elektrophoretischen Signaturen oder Fingerabdrücken (d.h.
Fragmente, die mit T enden) zur Verfügung stellen, die die Anwesenheit
oder Abwesenheit einer erwarteten Sequenz identifizieren können.
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Bei heterozygoten Proben kann die
Sequenzinformation durch Entfaltung überlappender Sequenzen erhalten
werden, wenn die beteiligten allelen Sequenzen bekannt sind und
ausreichend voneinander zu unterscheiden sind. Andernfalls kann
es notwendig sein, separat einen oder mehrere allelspezifische Primer
zu verwenden, die selektiv an eine Untergruppe alleler Sequenzen
hybridisieren, um die Analyse der Verlängerungsprodukte zu vereinfachen.
Bei Ausführungsformen,
die markierte Terminatoren in Abwesenheit von verlängerbaren
Nukleotidmonomeren verwenden, können
heterozygote Proben, typischerweise basierend auf der Anwesenheit
von zwei möglichen
Basentypen, in gleichen Mengen charakterisiert werden.
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III. Sequenzier-Kits
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In einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung
Kits und Reagenzien ein, die in jedem der vorstehenden Verfahren
verwendet werden können.
In einer Ausführungsform
schließt
die Erfindung einen Kit ein, der einen zielspezifischen Primer umfasst,
der enthält
(i) ein Zielbindesegment und (ii) eine mobilitätsvermindernde Gruppe, die
nicht signifikant das Ziel bindet. Der Kit kann zusätzlich eines
oder mehrere der folgenden einschließen: (b) wenigstens einen markierten
Nukleotidterminator, (c) wenigstens ein verlängerbares 3'-Nukleosid,
(d) ein Primer-Verlängerungsreagens,
wie ein Polymeraseenzym. Der Kit kann auch Instruktionen zur Verwendung
des Kits in Übereinstimmung
mit der Erfindung einschließen.
Vorzugsweise ist wenigstens ein markierter Nukleotidterminator ein
2',3'-Dideoxymononukleotid. In einer bevorzugten
Ausführungsform
schließt der
Kit vier unterschiedlich markierte Nukleotidterminatoren ein, die
komplementär
zu Adenin-, Guanin-, Cytosin- und entweder Thymin- oder Uracil-Basen
sind. Der Kit kann auch vier verlängerbare 3-Nukleoside einschließen, die
komplementär
zu A, G, C und U/T sind.
-
Aus dem Vorstehenden kann man entnehmen,
wie die Ziele und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Die Erfindung stellt
ein verbessertes Farbstoff-Terminator Polynukleotid-Sequenzierungsverfahren
zur Verfügung,
das die Probleme vermeidet, die aus der Ko-Migration von Farbstoff-Terminatoren
und Terminator-Abbauprodukten mit kurzen Primer-Verlängerungsprodukten
resultieren. Die Erfindung ermöglicht
die Sequenzierung von Polynukleotid-Regionen nahe des Verlängerungs-Primers,
die wichtig sein können
für die
Unterscheidung von polymorphen Varianten. Weiterhin erweitert die
Erfindung effektiv den Polynukleotid-Längenbereich, der sequenzierbar
ist durch Farbstoff-Terminator-basierender Sequenzierungsverfahren.
Die Erfindung ist somit insbesondere nützlich zur Sequenzierung von
einzelnen Polynukleotid-Zielen und heterozygoten Polynukleotid-Zielen
durch direkte Markierungsverfahren, in denen Sequenzinformation
abgeleitet wird, während
die Verlängerungsprodukte
in dem Trennungsmedium sind oder gerade aus dem Medium kommen (z.B.
Echtzeit-Beobachtung während
der Elektrophorese oder durch Scannen von Wanderungsmustern in einer
oder mehreren Bahnen über
einen ausgewählten
Längenbereich
in dem Gel), ohne dass eine Reaktion der Verlängerungsprodukte mit einem
sekundären
Reagens zum Nachweis erforderlich ist.
-
Beispiel 1
-
Eine Probe, die den humanen HLA-DRB-Locus
enthält,
wurde sequenziert nach den Protokollen, die in dem Protokollheft
für den „HLA-DRB
BIGDYE TERMINATOR SEQUENCING-BASED TYPING KIT" (PE Biosystems, 1998) beschrieben sind,
unter Verwendung von zwei Codon-86 GGT-spezifischen Primern für HLA-DRB
Exon 2 (umgekehrte Orientierung). Die zwei Primer hatten die folgenden
Sequenzen, wobei der zweite Primer eine Poly-d (TC)-mobilitätsvermindernde
Gruppe von 24 Basenlängen
enthält:
Primer-Verlängerungsreaktionen
wurden durchgeführt
unter Verwendung von dem einen oder dem anderen dieser Primer alleine
oder entweder (1) einem Gemisch, enthaltend vier BIGDYE-Terminatoren,
bezeichnet als ddT-EO-6CFB-dTMR, ddG-EP-5CFB-dR110, ddC-EO-6CFB-dROX und
ddA-PA-6CFB-dR6G (BIGDYE Ready Reaction Premix von PE Biosystems)
oder (2) einem Gemisch, enthaltend vier dRhodamin-Terminatoren, bezeichnet
als ddT-EO-6dROX, ddG-EO-5dR10, ddC-EO-5dTMR und ddA-PA-5dR6G (Rhodamine
Ready Reaction Premix von PE Biosystems), nach dem Verfahren, das
in dem Protokoll mit dem Titel „ABI PRISM BIGDYE Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, erhältlich von PE Biosystems, (1998),
beschrieben ist. Nach der Verlängerungsreaktion,
jedoch vor der Elektrophorese auf einem ABI PRISM Modell 377 DNA-Sequenzer,
wurde das Primer-Verlängerungsproduktgemisch
(10 μL)
mit 30 μL
100 : 4 (V : V) Gemisch von 100% Ethanol Natriumacetat (3 M, pH
4,6) gemischt. Die Ergebnisse waren wie folgt.
-
Bei der Verlängerungsreaktion unter Verwendung
von BIGDYE-Terminatoren und Primer 1 ko-migrierten verschiedene
große, übrige (nicht
eingebaute) Terminator-Peaks mit den 27 schnellsten, wandernden
Verlängerungsprodukten,
so dass die Bestimmung der Sequenz von etwa den ersten 30 Zielbasen
nach dem Primer nicht möglich
war. Im Gegensatz dazu wanderten die gleichen übrigen Terminator-Peaks für Verlängerungsprodukte,
die gebildet wurden unter Verwendung der BIGDYE-Terminatoren und
Primer 1 in einem Fenster von etwa 3 bis 27 Basen vor dem schnellsten,
wandernden Verlängerungsprodukt(Primer
plus Verlängerung
um eine Base). Sehr wenige, wenn überhaupt vorhandene Terminator-Peaks
wanderten mit den Primer-Verlängerungsprodukten,
so dass alle Primer-Verlängerungsprodukte
lesbar waren, einschließlich
der ersten 20 Ziel-Nukleotidbasen.
-
Bei den dRhodamin-Verlängerungsprodukten
war die Verwendung von Primer 2 wirksam, um zwei Hauptterminator-Peaks
dazu zu veranlassen, etwa 5 bis 8 Basen vor dem am schnellsten wandernden
Primer-Verlängerungsprodukt
zu wandern. Zusätzlich
wanderten auch verschiedene andere, kleine Terminator-Peaks vor
dem schnellsten wandernden Primer-Verlängerungsprodukt, so dass die
gesamte Zielsequenz leicht bestimmt werden konnte, einschließlich der
ersten 20 Zielbasen. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung von Primer
1 zur Ko-migration von mehreren der großen Terminator-Peaks in den
ersten 20 Primer-Verlängerungsprodukten,
so dass mehrere der ersten 20 Zielsequenzen nicht bestimmt werden
konnten.
-
Diese Untersuchung wurde wiederholt
unter Verwendung von 25 μL
Ethanol : Natriumacetatgemisch anstelle von 30 μL. Diese Modifikation bewirkte
eine Reduktion der Amplituden der übrigen Terminator-Peaks in
allen Fällen.
Bei Primer-Verlängerungsprodukten,
die mit Primer 1 gebildet wurden, waren die Spiegel der ∼ 20 schnellsten
wandernden Verlängerungsprodukte
allerdings wesentlich reduziert, so dass es schwierig oder unmöglich war,
die ersten 20 Zielbasen zu bestimmen. Im Gegensatz dazu waren Signale
der Verlängerungsprodukte,
die Primer 2 enthielten, stark auch für die 20 schnellsten wandernden
Verlängerungsprodukte,
aufgrund der effizienten Ethanolpräzipitation dieser Spezies.
-
Allgemein zeigen diese Ergebnisse,
dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zur Verbesserung
der Lesbarkeit von kurzen Primer-Verlängerungsprodukten ist, insbesondere
für die
ersten 20 Zielbasen.
-
SEQUENZPROTOKOLL
-
- < 110 > THE PERKIN ELMER CORPORATION
- < 120 > METHODE ZUR SEQUENZIERUNG
VON POLYNUKLEOTIDEN
- < 130 > 4402 WO
- < 140 > wird noch zugewiesen
- < 141 > 2000-02-16
- < 150 > 09/250, 422
- < 151 > 199-02-16
- < 160 > 2
- < 170 > Patentln Ver. 2.1
- < 210 > 1
- < 211 > 19
- < 212 > DNA
- < 213 > künstliche Sequenz
- < 220 >
- < 223 > Beschreibung der künstlichen
Sequenz: GGT-spezifischer Primer zur Amplifizierung des humanen
Codons-86 HLA-DRB Exon 2 Sequenz
- < 400 > 1
- gcactgtgaa gctctcacc
- < 210 > 2
- < 211 > 43
- < 212 > DNA
- < 213 > künstliche Sequenz
- < 220 >
- < 223 > Beschreibung der künstlichen
Sequenz: GGT-spezifischer Primer zur Amplifizierung des humanen
Codons-86 HLA-DRB Exon 2 Sequenz, mit 24 Basen-mobilitätsvermindernder
Gruppe
- < 400 > 2
- tctctctctc tctctctctc tctcgcactg tgaagctctc acc