DE69837255T2

DE69837255T2 - Bestimmung der anzahl von nukleinsäurewiederholungsequenzeinheiten durch schrittweise primerverlängerung

Info

Publication number: DE69837255T2
Application number: DE69837255T
Authority: DE
Inventors: Kenneth J. San Jose LIVAK; Adam L. San Francisco LOWE; Andrew J. Redwood City BLASBAND
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-05-27
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2018-05-12
Also published as: AU7481598A; EP0983383B1; CA2291440C; JP3509025B2; EP0983383A1; AU744027B2; DE69837255D1; US5945284A; CA2291440A1; JP2000513587A; WO1998054362A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Kits, die nützlich zum Bestimmen der Länge repetitiver Nukleinsäuresequenzen sind. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren und Kits, die nützlich zum Bestimmen der Länge repetitiver Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung einer diskontinuierlichen Primerverlängerungsreaktion sind.
LITERATURANGABEN

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HINTERGRUND
Verfahren zur genetischen Polymorphismusanalyse haben weite Verbreitung in Grundlagenforschung, klinischer Diagnostik, Gerichtsmedizin und auf anderen Gebieten gefunden. Ein besonders nützliches Verfahren zum Nachweis genetischer Polymorphismen beruht auf Variationen in der Länge repetitiver Sequenzen, wobei solche Verfahren wechselnd als Analyse kurzer Tandemwiederholungen (short tandem repeat analysis, STR), Analyse variabler Anzahlen an Tandemwiederholungen (variable number of tandem repeat analysis, VNTR), Minisatellitenanalyse und Mikrosatellitenanalyse bezeichnet werden.
Der Nachweis von Längenpolymorphismen in repetitiven Nukleinsäuresequenzen beruhte bislang auf der Gelelektrophorese zur Bestimmung der Länge der repetitiven Sequenz. Jedoch weist die Gelelektrophorese einige bedeutsame Nachteile im Zusammenhang mit der Analyse repetitiver Sequenzlängenpolymorphismen auf. Erstens sind molekulare Längenmessungen, die auf elektrophoretischer Mobilität beruhen, aufgrund einer komplizierten Beziehung zwischen molekularer Größe und elektrophoretischer Mobilität von Natur aus ungenau. Zweitens wird der Grad, bis zu dem der elektrophoretische Vorgang vervielfältigt werden kann, durch die Anzahl der Elektrophoresebahnen und durch die Größe der unterschiedlichen Loci, die man in einer einzelnen Bahn laufen lässt, begrenzt, d.h. es müssen Loci ausgewählt werden, die elektrophoretisch nicht co-migrieren.
ZUSAMMENFASSUNG
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst eine diskontinuierliche Primerverlängerungsreaktion, wobei ein Primer in diskreten Schrittgrößen so verlängert wird, dass bei jeder Schrittgröße der Primerverlängerung der Primer um einen Betrag verlängert wird, der einer einzelnen repetitiven Einheit entspricht. Nachfolgend zu jeder Erhöhung der diskreten Primerverlängerung wird ein Nachweisschritt durchgeführt, in welchem eine Signalmodulation nachgewiesen wird, wenn der Primer um einen Betrag verlängert worden ist, der gleich der gesamten Länge eines repetitiven Bereichs ist. Auf diese Weise wird durch Zählen der Anzahl der Erhöhungsschritte der diskreten Primerverlängerung, die benötigt werden, um eine Signalmodulation zu bewirken, die Anzahl repetitiver Einheiten bestimmt, die den repetitiven Bereich ausbilden.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein exaktes und reproduzierbares Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten bereitzustellen, die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz ausbilden.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten bereitzustellen, die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz ausbilden, das eine große Anzahl an Messungen parallel durchführen kann.
Es ist noch ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten bereitzustellen, die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz ausbilden, das keine elektrophoretische Trennung benötigt.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kits und Reagentien bereitzustellen, die zum Durchführen eines Verfahrens zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten, die einen repetitiven Bereich einer repetitiven Nukleinsäuresequenz ausbilden, nützlich sind und die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen.
In einem ersten Aspekt werden die oben genannten und anderen Ziele der Erfindung durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure gemäß anhängendem Patentanspruch 1 erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung umfasst der Schritt des Durchführens einer zweiten Primerverlängerungsreaktion zusätzlich das Umsetzen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids mit einem Primerterminationsreagens.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid an einem festen Träger befestigt. Vorzugsweise ist einer der Primer oder die Zielnukleinsäure an den festen Träger befestigt.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist die Markierung ein fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Molekül.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung ist die Markierung über einen spaltbaren Linker an das verlängerbare Nukleotid geknüpft. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung wird die Zielnukleinsäure vor der Analyse vervielfältigt. Vorzugsweise wird solch eine Vervielfältigung mittels einer PCR erreicht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung umfasst der Schritt des Behandelns der Markierung, um die Markierung nichtnachweisbar zu machen, entweder das Abspalten der Markierung vom markierten, verlängerbaren Nukleotid oder das Zerstören einer Signal-erzeugenden Eigenschaft der Markierung.
In einem zweiten Aspekt werden die oben genannten und andere Ziele der Erfindung durch ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure gemäß dem anhängenden Patentanspruch 12 erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung ist das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid an einem festen Träger befestigt. Vorzugsweise ist entweder der Primer oder die Zielnukleinsäure an dem festen Träger befestigt.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung wird die Zielnukleinsäure vor der Analyse vervielfältigt. Vorzugsweise wird solch eine Vervielfältigung mittels einer PCR erreicht.
In einem dritten Aspekt werden die oben genannten und andere Ziele der Erfindung durch die Verwendung eines Kits zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure gemäß dem anhängenden Patentanspruch 19 erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dritten Aspekts der Erfindung ist der Primer an einem festen Träger befestigt.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung ist die Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung ist die Markierung an dem verlängerbaren Nukleotid über einen spaltbaren Linker befestigt.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, Abbildungen und anhängenden Patentansprüche besser verständlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine schematische Darstellung einer Zielnukleinsäure.
2A-C zeigen einen ersten Aspekt des Verfahrens der Erfindung, wobei ein verlängerbares Nukleotid markiert wird und die Markierung nachfolgend zu jedem diskreten Erhöhungsschritt der Primerverlängerung nicht-nachweisbar gemacht wird.
3A-B zeigen einen zweiten Aspekt des Verfahrens der Erfindung, wobei ein Nukleotidterminator markiert wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Jetzt wird im Detail auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, wobei Beispiele für diese in den angefügten Zeichnungen dargestellt sind. Während die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführüngsformen beschrieben werden wird, wird es selbstverständlich sein, dass sie nicht dazu dienen sollen, die Erfindung auf jene Ausführungsformen zu begrenzen. Im Gegenteil, die Erfindung ist dazu vorgesehen, Alternativen, Modifikationen und Entsprechungen abzudecken, die innerhalb der Erfindung, wie sie durch die anhängenden Patentansprüche definiert ist, eingeschlossen sein könnten.
I. DEFINITIONEN
Sofern nicht anders angegeben, sollen die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wie sie hierin verwendet werden, die folgenden Bedeutungen haben:
„Nukleosid" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidinnukleosidbase, z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Deazaadenin, Deazaguanosin und ähnlichem besteht, und die an der 1'-Position mit einer Pentose einschließlich 2'-Deoxy- und 2'-Hydroxylformen verbunden ist (Siryer). Der Begriff „Nukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids, z.B. einen Triphosphatester, wobei die häufigste Stelle der Veresterung die Hydroxylgruppe darstellt, die an der C-5-Position der Pentose gebunden ist. An vielen Stellen in der vorliegenden Offenbarung soll der Begriff Nukleosid sowohl Nukleoside als auch Nukleotide einschließen. Die Begriffe Nukleotid und Nukleosid, wie sie hierin verwendet werden, sollen synthetische Analoga mit modifizierten Nukleosidbasenresten, mit modifizierten Zuckerresten und/oder modifizierten Phosphatesterresten, z.B. wie an anderer Stelle beschrieben (Scheit; Eckstein), umfassen.
„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" beziehen sich auf lineare Polymere aus Nukleotidmonomeren, einschließlich einzel-, doppel- und dreisträngige Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, deren α-anomere Formen und ähnliches. Üblicherweise sind die Nukleosidmonomere über Phosphodiesterverknüpfungen verbunden, wobei sich der Begriff „Phosphodiesterverknüpfung" wie er hierin verwendet wird, auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, die deren Phosphatanaloga einschließen, wobei das Phosphoratom in der Oxidationsstufe +5 vorliegt und eines oder mehrere der Sauerstoffatome durch einen Nicht-Sauerstoffrest ersetzt ist. Beispielhafte Phosphatanaloga umfassen Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenat, Phosphordiselenat, Phosphoranilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat, Borphosphate und ähnliche einschließlich zugehöriger Gegenionen, z.B. H, NH₄, Na und ähnliche, wenn solche Gegenionen vorhanden sind. Alternativ können Polynukleotide Polymere aus nicht-nukleotidischen Monomeren, die über Phosphodiesterverknüpfungen oder andere Verknüpfungen verbunden sind, umfassen, die dazu in der Lage sind, sequenzspezifische Hybride mit einer Zielnukleinsäure auszubilden, z.B. Peptidnukleinsäure- (PNA)-Polymere. Polynukleotide reichen typischerweise in ihrer Größe von wenigen monomeren Einheiten, z.B. 8-40, bis zu einigen Tausend monomeren Einheiten. Jedes Mal, wenn ein Polynukleotid durch eine Sequenz aus Buchstaben wie „ATGCCTG" dargestellt wird, versteht es sich, dass die Nukleotide in 5'→3'-Reihenfolge von links nach rechts angeordnet sind und dass „A" Desoxyadenosin bezeichnet, „C" Desoxycytidin bezeichnet, „G" Desoxyguanosin bezeichnet und „T" Thymidin bezeichnet, sofern nichts anderes angegeben ist.
„Verlängerbares Nukleotid" bezeichnet jedes Nukleotid, das, wenn es in ein Primerverlängerungsprodukt während einer Primerverlängerungsreaktion eingebaut wird, die weitere Verlängerung eines solchen Primerverlängerungsprodukts erlaubt. Beispielhafte verlängerbare Nukleotide umfassen 2'-Desoxynukleotidtriphosphate, z.B. 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxy-7-deazadesoxyguanosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat, 2'-Desoxythymidin-5'-triphosphat und 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat. Optional enthalten eines oder mehrere der verlängerbaren Nukleotide eine Markierung.
„Nukleotidterminator" bezeichnet jedes Nukleotid, das, wenn es in ein Primerverlängerungsprodukt eingebaut wird, die weitere Verlängerung eines solchen Primerverlängerungsprodukts verhindert. Eine Voraussetzung für einen Nukleotidterminator ist es, dass, wenn der Nukleotidterminator einen Ribofuranose-Zuckerteil enthält, die 3'-Position keine Hydroxygruppe aufweisen darf, die dazu geeignet ist, nachfolgend von einer Polymerase dazu verwendet zu werden, zusätzliche Nukleotide einzubauen. Alternativ könnte ein Ribofuranose-Analogon wie Arabinose verwendet werden. Beispielhafte Nukleotidterminatoren umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofu ranosyl, β-D-Arabinofuranosyl, 3'-Desoxy-β-D-arabinofuranosyl, 3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosyl und 2',3'-Didesoxy-3'-fluoro-β-D-ribofuranosyl (Chidgeavadze). Nukleotidterminatoren schließen auch reversible Nukleotidterminatoren ein (Metzker).
„Polymerase" bezeichnet ein Enzym oder einen anderen Katalysator, der geeignet ist, eine Reaktion zu katalysieren, die zu einem Zielsequenz-abhängigen Einbau eines Nukleotids an ein 3'-Ende eines Primers oder eines Primerverlängerungsprodukts führt, wenn solch ein Primer oder Primerverlängerungsprodukt an eine Zielnukleinsäure angelagert ist. Beispielhafte Polymerasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Pfu DNA-Polymerase, E. coli-Polymerase I, T-7-Polymerase, reverse Transkriptase, Taq DNA-Polymerase und ähnliche (Kornberg und Baker).
„Markierung" bezeichnet jeden Rest, der, wenn er an einem Nukleotid oder Polynukleotid der Erfindung befestigt ist, solch ein Nukleotid oder Polynukleotid detektierbar macht, wenn man bekannte Detektionsmittel verwendet. Markierungen können direkte Markierungen, die selbst detektierbar sind, oder indirekte Markierungen sein, die in Kombination mit anderen Agenzien detektierbar sind. Beispielhafte direkte Markierungen umfassen, aber sind nicht beschränkt auf Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, Spin-Markierungen, chemilumineszierende Markierungen und ähnliche. Beispielhafte indirekte Markierungen schließen Enzyme ein, die ein Signal-erzeugendes Ereignis katalysieren, und Liganden, wie ein Antigen oder Biotin, die spezifisch mit hoher Affinität an einen detektierbaren Anti-Liganden wie einem markierten Antikörper oder Avidin binden können.
„Primerverlängerungsreaktion" bezeichnet eine Reaktion zwischen einem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid und einem Nukleotid, die zu der Hinzufügung des Nukleotids an ein 3'-Ende des Primers führt, so dass das hinzugefügte Nukleotid komplementär zum entsprechenden Nukleotid der Zielnukleinsäure ist.
„Primärverlängerungsreagens" bezeichnet ein Reagens, das Komponenten enthält, die notwendig sind, um eine Primerverlängerungsreaktion zu bewirken. Primerverlängerungsreagentien enthalten typischerweise (i) ein Polymerase-Enzym; (ii) einen Puffer und (iii) ein oder mehrere verlängerbare Nukleotide.
„Spezifisch bindendes Paar" bezieht sich auf ein Paar aus Molekülen, die spezifisch aneinander binden, um einen Bindungskomplex auszubilden. Beispiele für spezifi sche Bindungspaare umfassen, aber sind nicht beschränkt auf Antikörper-Antigen-Paare (oder Antikörper-Hapten-Paare), Ligand-Rezeptor-Paare, Enzym-Substrat-Paare, Biotin-Avidin-Paare, Polynukleotide mit komplementären Basenpaaren und ähnliche.
„Primer" ist ein Polynukleotid, das dazu geeignet ist, sich selektiv an eine vorgegebene Zielsequenz anzulagern und danach als ein Initiationspunkt für eine Primerverlängerungsreaktion zu dienen, wobei der Primer in einer 5'→3'-Richtung verlängert wird.
II. IN DEM VERFAHREN DER ERFINDUNG VERWENDETE MATERIALIEN
A. Zielnukleinsäure
Eine Zielnukleinsäure zur Verwendung mit der Erfindung kann aus jedem lebendigen oder einstmals lebendigen Organismus stammen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Prokaryont, Eukaryont, Pflanze, Tier und Virus. Die Zielnukleinsäure kann aus einem Zellkern stammen, z.B. genomische DNA, oder sie kann extranukleäre Nukleinsäure sein, z.B. Plasmid-, Mitochondriennukleinsäure und ähnliche.
Viele Verfahren zur Isolierung und Reinigung einer Zielnukleinsäure zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung stehen zur Verfügung. Das bevorzugte Reinigungsverfahren sollte eine Zielnukleinsäure bereitstellen, die ausreichend frei von Protein ist, um eine effiziente Primerverlängerung und Nukleinsäurevervielfältigung zu ermöglichen. Bevorzugte Reinigungsverfahren umfassen (i) organische Extraktion gefolgt von Ethanolfällung, z.B. unter Verwendung eines organischen Phenol/Chloroform-Reagens (Ausubel), vorzugsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Extraktors, z.B. der von PE Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältliche DNA-Extraktor Modell 341; (ii) Festphasenadsorptionsverfahren (Walsh, Boom); und (iii) durch Salz ausgelöste DNA-Fällungsverfahren (Miller), wobei solche Verfahren üblicherweise als „Aussalz"-Verfahren bezeichnet werden. Optimalerweise geht jedem der obigen Reinigungsverfahren ein enzymatischer Verdauschritt voraus, um das Entfernen von Protein aus der Probe zu unterstützen, z.B. Verdau mit Proteinase K oder anderen ähnlichen Proteasen.
Um die Empfindlichkeit des Verfahrens der Erfindung zu erhöhen, wird die Zielnukleinsäure vorzugsweise unter Verwendung eines geeigneten Nukleinsäurevervielfäl tigungsverfahrens vervielfältigt, bevor das Verfahren durchgeführt wird. Solch eine Vervielfältigung kann linear oder exponentiell sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vervielfältigung der Zielnukleinsäure unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Mullis) erreicht. Im Allgemeinen besteht die PCR aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt, der die Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäureprobe trennt, gefolgt von der Wiederholung (i) eines Anlagerungsschritts, der den Vervielfältigungsprimern gestattet, sich spezifisch an Positionen anzulagern, die eine Zielsequenz flankieren; (ii) eines Verlängerungsschritts, der die Primer in einer 5'→3'-Richtung verlängert, wodurch ein Nukleinsäurevervielfältigungsprodukt gebildet wird, das zu der Zielsequenz komplementär ist, und (iii) eines Denaturierungsschritts, der die Trennung des Verlängerungsprodukts und der Zielsequenz bewirkt. Jeder der obigen Schritte kann bei einer unterschiedlichen Temperatur durchgeführt werden, wobei die Temperaturänderungen unter Verwendung eines Thermocyclers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) bewirkt werden können.
Die verallgemeinerte Struktur einer Zielnukleinsäure zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in 1 gezeigt, wobei die Zielnukleinsäure 5 einen 5'-flankierenden Teil 10 einschließlich eines zum Primer komplementären Teils 15, einen 3'-flankierenden Teil 25 und einen repetitiven Bereich 20, der sich zwischen dem 5'-flankierenden Teil und dem 3'-flankierenden Teil befindet, umfasst. Der repetitive Bereich 20 der Zielnukleinsäure umfasst mehrere repetitive Einheiten (R)_n 21, wobei R eine repetitive Einheit bezeichnet und n die Anzahl repetitiver Einheiten bezeichnet, die den repetitiven Bereich bilden. Die repetitive Einheit R kann jeder Typ eines repetitiven Motivs sein, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf eine Milcrosatelliten-Wiederholung (Webber und May; Smeets; Williamson), eine Minisatelliten-Wiederholung (Jeffreys, Caskey) oder eine α-Satelliten-Wiederholung (Jabs).
Der repetitive Bereich kann aus mehreren Typen repetitiver Einheiten oder aus repetitiven Einheiten bestehen, die selbst polymorph sind.
B. Primer
Primer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind dafür vorgesehen, ein Gleichgewicht zwischen der Spezifität der Primeranlagerung, d.h. der Frequenz, mit der eine unerwünschte Zielsequenz an einer Primerverlängerungsreaktion teilnimmt, und der Effizienz der Primerverlängerung, d.h. dem Ausmaß, mit dem eine erwünschte Zielsequenz an der Primerverlängerungsreaktion teilnimmt, zu erhalten.
Die Spezifität der Primeranlagerung wird im Allgemeinen durch die Länge des Primers und die Temperatur der Anlagerungsreaktion gesteuert. Polynukleotide zwischen ungefähr 18 und 24 Basen sind bevorzugt, weil solche Polynukleotide dazu tendieren, sehr sequenzspezifisch zu sein, wenn die Anlagerungstemperatur wenige Grade um eine Primerschmelztemperatur herum eingestellt wird (Dieffenbach). Um Primerverlängerung zu ermöglichen, enthält ein 3'-Ende des Primers eine -OH-Gruppe oder einen anderen Rest, der den Einbau eines Nukleotids an dem 3'-Ende des Primers gestattet. Es gibt eine Anzahl von Computerprogrammen, um die Primerwahl in unterschiedlichen Zusammenhängen zu ermöglichen (Osborne; Montpetit).
Die Sequenz des Primers wird so gewählt, dass sich der Primer an den zum Primer komplementären Teil des 3'-flankierenden Teils der Zielnukleinsäure anlagert. Vorzugsweise lagert sich der Primer so an, dass ein 3'-Ende des Primers zu einem 3'-Ende eines repetitiven Bereichs einer Zielnukleinsäure benachbart ist. Der Primer kann sich jedoch auch an ein Segment des repetitiven Bereichs der Zielnukleinsäure anlagern, solange er wenigstens zum Teil an dem 3'-flankierenden Teil des Ziels verankert ist.
Vorzugsweise werden die Primer der Erfindung auf herkömmliche Weise auf einem automatisierten DNA-Synthesizer, z.B. DNA/RNA-Synthesizer Modell 392 oder 394 von PE Applied Biosystems (Foster City, CA) unter Verwendung chemischer Standardreaktionen, z.B. Phosphoramidit-Chemie (Beaucage) synthetisiert. In einem alternativen Verfahren können Primer aus einer biologischen Quelle isoliert werden.
C. Festphasenträger
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid während eines Trennschritts an einem Festphasenträger befestigt. Solch eine Befestigung kann entweder durch die Zielnukleinsäure oder durch das Primerpolynukleotid erfolgen.
Festphasenträger zur Verwendung mit der Erfindung können eine große Formenvielfalt aufweisen, einschließlich Mikropartikel, Beads, Membranen, Objektträger, Platten, im Mikromaßstab bearbeitete Chips und ähnliche. Außerdem können die Festphasenträger der Erfindung eine große Vielfalt an Zusammensetzungen umfassen, einschließlich Glas, Kunststoff, Silizium, Alkanthiolat-derivatisiertes Gold, Cellulose, niedrigvernetztes und hochvernetztes Polystyrol, Silicagel, Polyamid und ähnliche.
Wenn die Befestigung des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den Primer erfolgt, können die Primer mit einem Festphasenträger verwendet werden, auf dem sie synthetisiert wurden, oder sie können separat synthetisiert werden und an einem Festphasenträger zur Verwendung während oder vor dem Trennschritt des Verfahrens befestigt werden.
Wenn Primer mit demselben Festphasenträger verwendet werden, auf dem sie synthetisiert werden, kann ein solcher Träger eine Vielzahl an Formen umfassen und eine Vielfalt an Verknüpfungsgruppen enthalten. Solche Träger können Mikropartikel oder planare Anordnungen oder Matrizen aus Bereichen umfassen, die im Wesentlichen gleichförmige Primerpopulationen aufweisen. Eine große Vielfalt an Mikropartikelsyntheseträgern kann mit der Erfindung verwendet werden, einschließlich Mikropartikel, die aus „controlled pore glass" (CPG), hochvernetztem Polystyrol, Acrylcopolymeren, Cellulose, Nylon, Dextran, Latex, Polyacrolein und ähnlichen hergestellt sind. Mikropartikelträger enthalten zusätzlich handelsübliche Nukleosid-derivatisierte CPG- und Polystyrol-Beads (erhältlich z.B. von Applied Biosystems, Foster City, CA); derivatisierte magnetische Beads; mit Polyethylenglykol gepfropftes Polystyrol (z.B. TentaGel, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland); und ähnliche. Die Auswahl der Trägereigenschaften wie Material, Porosität, Größe, Form und ähnliches und der Art der verwendeten Verknüpfungsgruppe hängt von den Bedingungen ab, unter denen die Primer verwendet werden. Zum Beispiel sind in der vorliegenden Erfindung Träger und Linker bevorzugt, die die sterische Hinderung der Polymeraseenzyme minimieren und die den Zugang zum Nukleotidsubstrat ermöglichen. Andere wichtige Faktoren, die beim Auswählen des geeignetsten Mikropartikelträgers berücksichtigt werden müssen, umfassen Gleichförmigkeit der Größe, Effizienz als ein Syntheseträger, Ausmaß, zu dem der Oberflächeninhalt bekannt ist, und optische Eigenschaften, z.B. stellen durchsichtige glatte Beads Vorteile bei der Instrumentierung bereit, wenn man große Zahlen von Beads auf einer Oberfläche verwendet.
Wie oben erwähnt, können Primer auch auf einem einzelnen (oder einigen wenigen) Festphasenträger synthetisiert werden, um eine Anordnung aus gleichförmig mit Primern beschichteten Bereichen zu bilden. Das heißt innerhalb jedes Bereichs in solch einer Anordnung wird der gleiche Primer synthetisiert. Verfahren zum Synthetisieren solcher Anordnungen sind an anderer Stelle offenbart (Pease; Southern).
Wenn Primer separat synthetisiert werden und nachfolgend zur Verwendung an einem Festphasenträger befestigt werden, kann der Primer an dem Träger über eine kovalente Verknüpfung oder eine nicht-kovalente Verknüpfung befestigt werden. Wenn der Primer an dem festen Träger über eine nicht-kovalente Verknüpfung befestigt ist, enthält der Primer einen Teil eines spezifischen Bindungspaars, z.B. Biotin, und der andere Teil des Paars ist an dem festen Träger befestigt, z.B. Avidin. Mehrere Verfahren zur kovalenten Anbindung von Polynukleotiden an feste Träger stehen zur Verfügung, z.B. über die Reaktion eines 5'-Amino-Polynukleotids mit einem Isothiocyanat-funktionalisiertem Glasträger (Guo). Ein weiter Bereich an beispielhaften Verknüpfungsgruppen zum entweder kovalenten oder nicht-kovalenten Befestigen von Primern an festen Trägern ist an anderer Stelle offenbart. (Pon; Webb; Barany; Damha; Beattie; Maskos und Southern).
Wenn die Befestigung des Primer-Matrizen-Hybrids über die Matrizennukleinsäure erfolgt und die Matrizennukleinsäure ein PCR-Vervielfältigungsprodukt darstellt, können die Mittel zur kovalenten oder nicht-kovalenten Befestigung in einen PCR-Primer eingebaut werden, der verwendet wird, um die PCR auszuführen. Folglich kann der PCR-Primer einen Teil eines spezifischen Bindungspaars, z.B. Biotin, oder eine reaktive Gruppe enthalten, die mit einem funktionalisierten festen Träger reagieren kann, um eine kovalente Verknüpfung zu bilden, z.B. eine 5'-Aminogruppe, die mit einem Isothiocyanat-funktionalisiertem Glasträger reagiert.
D. Markierte Nukleotide
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung enthalten eines oder mehrere verlängerbare Nukleotide und/oder Nukleotidterminatoren eine Markierung. Die Markierung ist an dem Nukleotid auf solch eine Art und Weise befestigt, dass die Markierung den Polymerase-vermittelten Einbau des markierten Nukleotids in einer Primerverlängerungsreaktion nicht wesentlich beeinträchtigt. Viele alternative Verfahren zum Markieren von Nukleotiden in einer zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeigneten Art und Weise stehen zur Verfügung (Kricka). Bei einer bevor zugten Art von Markierungsverfahren wird eine Nukleosidbase des Nukleotids modifiziert, eine Markierung zu enthalten, d.h. die N-6-Position einer Purinbase oder die C-5-Position einer Pyrimidinbase. Eine besonders bevorzugte Art markierter Nukleotide sind die Propargylethoxyaminonukleotide (Khan).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein markiertes, verlängerbares Nukleotid dazu geeignet, nicht-nachweisbar gemacht zu werden, z.B. durch Behandlung mit einem geeigneten Reagens oder elektromagnetischer Strahlung. In dieser Ausführungsform kann das markierte, verlängerbare Nukleotid entweder durch Entfernen der Markierung von dem Nukleotid oder durch Zerstören der Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung nicht-nachweisbar gemacht werden.
Mehrere Verfahren zum Befestigen einer Markierung an einem verlängerbaren Nukleotid, so dass die Markierung leicht entfernt werden kann, stehen zur Verfügung. Beispielhafte abspaltbare Linker zum Verbinden einer Markierung mit einem Nukleotid umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (N-[4-(p-Azidosalicylamido)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio]propionamid (APDP), (Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxyl)ethyl]sulfon (BSOCOES), Disuccinimidyltartrat (DST) und Ethylenglycobis[succinimidylsuccinat] (EGS) und ähnliche (Pierce-Katalog).
Bevorzugte Markierungen, deren Signal-erzeugende Eigenschaften bei Behandlung mit einem geeigneten Reagens oder mit elektromagnetischer Strahlung zerstört werden können, umfassen fluoreszierende Markierungen, deren fluoreszierende Eigenschaften mittels Fotozerstörung durch Exposition gegen Licht von hoher Intensität oder mittels chemischem Abbau durch Behandlung mit oxidierenden Chemikalien, z.B. Sauerstoff, Natriumhypochlorit, Permanganat und ähnlichen, zerstört werden können. Alternative bevorzugte Arten von Markierungen umfassen Enzyme, die durch Reaktion mit einem irreversiblen Enzyminhibitor oder durch Denaturierung nicht-nachweisbar gemacht werden können, und chemilumineszierende Markierungen, die nur eine einzelne Licht-erzeugende Umwandlung durchlaufen können und somit selbst-zerstörend sind.
E. Erste und zweite Primerverlängerungsreagentien
Die vorliegende Erfindung umfasst erste und zweite Primerverlängerungsreagentien, die, wenn sie gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden, die Verlänge rung eines Primers in diskreten Schrittweiten einzelner repetitiver Einheiten voranschreiten lassen, d.h. der Primer wird nur um eine repetitive Einheit pro diskretem Primerverlängerungsreaktionszyklus verlängert.
Das erste Primerverlängerungsreagens der Erfindung umfasst einen Satz verlängerbarer Nukleotide, die es einer Primerverlängerungsreaktion erlauben, nur so weit voranzuschreiten, dass ein Primer um einen Betrag verlängert wird, der kleiner als eine gesamte repetitive Einheit ist. Folglich kann in Abhängigkeit von der speziellen Sequenz der repetitiven Einheit das erste Primerverlängerungsreagens eine Vielfalt möglicher Kombinationen verlängerbarer Nukleotide umfassen. Wenn die Sequenz der repetitiven Einheit AGCT lautet, könnte z.B. das erste Primerverlängerungsreagens verlängerbare Nukleotide T (komplementär zu A), T und C (komplementär zu A und G) oder T und C und G (komplementär zu A und G und C) enthalten. Um jedoch eine ungesteuerte fortlaufende Primerverlängerung zu verhindern, darf das erste Primerverlängerungsreagens nicht alle verlängerbaren Nukleotide T und C und G und A enthalten.
In bestimmten Situationen ist es erwünscht, das erste Primerverlängerungsreagens in separate Unterreagentien zu unterteilen, so dass jedes Unterreagens verlängerbare Nukleotide enthält, die dafür ausreichend sind, die Verlängerung eines Primers nur so weit zu erlauben, dass ein Unterabschnitt der repetitiven Sequenz gebildet wird. Wenn die repetitive Einheit ATGCCGT lautet, könnte z.B. ein Unterreagens des ersten Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren Nukleotide T, A und C enthalten, während ein anderes Unterreagens des ersten Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren Nukleotide G und C enthält.
Das zweite Primerverlängerungsreagens der Erfindung umfasst einen Satz verlängerbarer Nukleotide, die es einem Primerverlängerungsreagens erlauben, nur so weit voranzuschreiten, dass der Teil einer repetitiven Einheit synthetisiert wird, der nicht durch das erste Primerverlängerungsreagens synthetisiert wurde. Somit kann in Abhängigkeit von der speziellen Sequenz der repetitiven Einheit und der Zusammensetzung des ersten Primerreagens das zweite Primerverlängerungsreagens eine Vielfalt möglicher Nukleotidkombinationen umfassen. Das oben diskutierte Beispiel fortführend könnte das zweite Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren Nukleotide G und A enthalten, wenn die Sequenz der repetitiven Einheit AGCT lautet und das erste Primerverlängerungsreagens die verlängerbaren Nukleotide T und C enthält.
F. Primerterminationsreagens
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Primerterminationsreagens, um die Termination der Primerverlängerung zu bewirken, so dass keine weitere Primerverlängerung erzielt werden kann, sobald ein Primerverlängerungsprodukt mit dem Primerterminationsreagens reagiert hat.
Das Primerterminationsreagens der Erfindung umfasst einen oder mehrere Nulcleotidterminatoren und optional einen Satz verlängerbarer Nukleotide, die eine Primerverlängerungsreaktion nur so weit voranschreiten lassen, dass ein Primer um einen Betrag verlängert wird, der kleiner als eine gesamte repetitive Einheit in einer Primerverlängerungsreaktion ist. Somit kann in Abhängigkeit von der speziellen Sequenz der repetitiven Einheit, der Sequenz des 3'-flankierenden Teils der Zielnukleinsäure und der Zusammensetzung der ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien das Primerverlängerungsreagens eine Vielfalt möglicher Kombinationen an verlängerbaren Nukleotiden und Nukleotidterminatoren enthalten. Wenn die Sequenz der repetitiven Einheit z.B. AGCT lautet und das erste Nukleotid des 3'-flankierenden Teils G ist und die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien die verlängerbaren Nukleotide T, C, G und A enthalten, würde das Primerterminationsreagens nur den Nukleotidterminator C enthalten, wobei dieser Nukleotidterminator komplementär zu dem in dem 3'-flankierenden Teil befindlichen G ist. Wenn die ersten und zweiten Primerverlängerungsreagentien nur die verlängerbaren Nukleotide T und C enthalten, würde das Primerverlängerungsreagens alternativ die verlängerbaren Nukleotide G und A und den Nukleotidterminator C enthalten.
In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung umfasst das Primerverlängerungsreagens einen markierten Nukleotidterminator. Das Markieren des Nukleotidterminators wird im Wesentlichen wie oben in Abschnitt D beschrieben ausgeführt.
III. DAS VERFAHREN
Eine bevorzugte Ausführungsform eines ersten Aspekts des Verfahrens der Erfindung ist schematisch in 2A-C dargestellt. In der Figur wird das Verfahren auf eine Zielnukleinsäure 5 mit einem repetitiven Bereich 20, der aus zwei Kopien einer Zweibasenwiederholung mit der Sequenz „AC" besteht, und mit einem 5'-flan kierenden Bereich 25 mit einem G-Nukleotid, das an den repetitiven Bereich angrenzt, angewendet. In dieser bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts wird ein Primer 200 an einen zum Primer komplementären Teil 15 der Zielnukleinsäure 5 angelagert, wodurch sich ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid bildet. Das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid wird dann mit einem ersten Primerverlängerungsreagens umgesetzt, das ein markiertes, verlängerbares Nukleotid T enthält, was zum Einbau des markierten T-Nukleotids in das 3'-Ende eines Primerverlängerungsprodukts 210 führt. Nachfolgend zur Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagens wird das erste Primerverlängerungsreagens von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt und das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid wird mit einem zweiten Primerverlängerungsreagens umgesetzt, das ein verlängerbares G-Nukleotid enthält, was zu der Hinzufügung des G-Nukleotids in ein 3'-Ende des Primerverlängerungsprodukts 215 führt. Als nächstes wird das nicht-reagierte zweite Primerverlängerungsreagens von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt, und eine Messung wird durchgeführt, um die Menge des in das Primerverlängerungsprodukt eingebauten, markierten, verlängerbaren Nukleotids zu bestimmen. Wie durch das Säulendiagramm in der Figur angezeigt, wird zu diesem Punkt in dem Verfahren ein großes Signal detektiert, was das Vorhandensein des eingebauten, markierten T-Nukleotids anzeigt. Schließlich wird die an dem eingebauten, verlängerbaren Nukleotid befestigte Markierung nicht-nachweisbar gemacht, um das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid für einen nachfolgenden, diskreten Primerverlängerungsreaktionszyklus vorzubereiten. In dem Beispiel werden die oben beschriebenen Verfahrensschritte, wie in 2B und 2C gezeigt, noch zweimal wiederholt. Bei dem in 2C gezeigten dritten Zyklus ist die Intensität des gemessenen Signals wesentlich reduziert im Vergleich zu den Signalintensitäten, die bei den ersten zwei Zyklen beobachtet wurden, weil das markierte, verlängerbare Nukleotid T an diesem Punkt nicht in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut werden kann. Folglich zeigt diese in dem dritten Zyklus beobachtete Verringerung im gemessenen Signal an, dass der repetitive Bereich nur zwei Kopien der repetitiven AC-Einheit enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines zweiten Aspekts des Verfahrens der Erfindung ist in 3A-B gezeigt. Wie zuvor wird das Verfahren auf eine Zielnukleinsäure mit einem repetitiven Bereich, der aus zwei Kopien einer Zweibasenwiederholung mit der Sequenz „AC" besteht, und mit einem 5'-flankierenden Teil mit einem G-Nukleotid, das an die repetitive Region angrenzt, angewendet. In dieser bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts wird wie zuvor ein Primer 200 an einen zum Primer komplementären Teil 15 einer Zielnukleinsäure 5 angelagert, wodurch sich ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid bildet. Das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid wird dann mit einem ersten Primerverlängerungsreagens umgesetzt, das ein nicht-markiertes, verlängerbares Nukleotid T enthält, was zum Einbau des nicht-markierten T-Nukleotids in das 3'-Ende eines Primerverlängerungsprodukts 310 führt. Nachfolgend zur Reaktion mit dem ersten Primerverlängerungsreagens wird das erste Primerverlängerungsreagens von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt, und das Zielnkleinsäure-Primer-Hybrid wird mit einen zweiten Primerverlängerungsreagens, das ein verlängerbares G-Nukleotid enthält, und mit einem Primerterminationsreagens, das einen markierten C-Nukleotidterminator enthält, umgesetzt, was zu der Hinzufügung nur des verlängerbaren G-Nukleotids in das 3'-Ende des Primerverlängerungsprodukts 315 führt. Als nächstes werden das nichtreagierte zweite Primerverlängerungsreagens und das Primerterminationsreagens von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt, und eine Messung wird durchgeführt, um die Menge des in das Primerverlängerungsprodukt eingebauten, markierten Nukleotidterminators zu bestimmen. Wie in der Figur angezeigt, wird an diesem Punkt des Verfahrens kein Signal detektiert, was anzeigt, dass der markierte Nukleotidterminator während dieses Zyklus des Verfahrens nicht in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut wird. In 3B wird der oben beschriebene Verfahrensschritt wiederholt. In diesem in 3B gezeigten zweiten Zyklus ist die Intensität des gemessenen Signals wesentlich erhöht im Vergleich zu der in dem ersten Verfahrensschritt beobachteten, nominellen Nullsignalintensität, weil während des zweiten Schritts der markierte C-Nukleotidterminator in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut wird.
Die folgende Diskussion stellt eine detailliertere Beschreibung der oben beschriebenen Verfahrensschritte des ersten und zweiten Aspekts der Erfindung bereit.
A. Primeranlagerung
Die Anlagerungsreaktion wird unter Bedingungen durchgeführt, die stringent genug sind, um Sequenzspezifität sicherzustellen, aber ausreichend tolerant sind, um die Bildung stabiler Hybride mit einer akzeptablen Geschwindigkeit zuzulassen. Die für die Primeranlagerung benötigte Temperatur und Zeitdauer hängen von mehreren Faktoren einschließlich der Basenzusammensetzung, der Länge und Konzentration des Primers und der Natur des verwendeten Lösungsmittels ab, z.B. von der Konzentration der Kosolventien wie DMSO, Formamid oder Glycerin und von Gegen ionen wie Magnesium. Üblicherweise wird die Hybridisierung mit synthetischen Polynukleotiden bei einer Temperatur durchgeführt, die ungefähr 5 bis 10°C unter der Schmelztemperatur des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids in dem Anlagerungslösungsmittel liegt. Vorzugsweise liegt die Anlagerungstemperatur in dem Bereich von 55 bis 75°C, und die Primerkonzentration beträgt ungefähr 0,2 μM. Unter diesen bevorzugten Bedingungen wird die Anlagerungsreaktion in nur wenigen Sekunden vollständig sein.
B. Primerverlängerungsreaktion
Die Zeit, die benötigt wird, um eine Primerverlängerungsreaktion auszuführen, hängt von der Länge und der Konzentration der Zielsequenz und von der Reaktionstemperatur ab. Schätzungen für die Geschwindigkeit des Nukleotideinbaus unter typischen Bedingungen schwanken von 35 bis 100 Nukleotiden pro Sekunde in Abhängigkeit von dem Puffer, dem pH-Wert, der Salzkonzentration, dem Polymerase-Enzym und der Natur der DNA-Matrize.
Um eine Primerverlängerungsreaktion zu erreichen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung in diskreten Schrittweiten aus einzelnen repetitiven Einheiten voranschreitet, wird die Primerverlängerungsreaktion in zwei unabhängige Schritte geteilt: eine erste Primerverlängerungsreaktion und eine zweite Primerverlängerungsreaktion. In der ersten Primerverlängerungsreaktion wird der Primer um einen Betrag verlängert, der kleiner als die Länge einer einzelnen repetitiven Einheit ist, wobei die Steuerung des Ausmaßes der Primerverlängerung durch die Zusammensetzung eines ersten Primerverlängerungsreagens bewirkt wird. In der zweiten Primerverlängerungsreaktion wird der Primer so weit verlängert, dass in Verbindung mit der ersten Primerverlängerungsreaktion der Primer um einen Betrag verlängert wird, der der Länge einer einzelnen repetitiven Einheit entspricht.
Gemäß dem ersten Aspekt des Verfahrens der Erfindung enthält eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagentien ein markiertes, verlängerbares Nukleotid.
Auch gemäß dem ersten Aspekt des Verfahrens der Erfindung enthält das zweite Primerverlängerungsreagens in einer Variante der oben beschriebenen diskreten Zweischrittverlängerungsreaktion ein Primerterminationsreagens. Wenn nach einer zweiten Primerverlängerungsreaktion der Primer bis zum Ende des repetitiven Be reichs der Zielnukleinsäure verlängert worden ist, wird somit ein Nukleotidterminator in das Primerverlängerungsprodukt eingebaut, was folglich jede weitere Verlängerung jenes Primerverlängerungsprodukts verhindert. Dies ist vorteilhaft, weil es die Möglichkeit beseitigen wird, dass irgendeine störende Primerverlängerung über den repetitiven Bereich der Zielnukleinsäure hinaus stattfinden wird. Diese Ausführungsform der Erfindung ist dort besonders bevorzugt, wo zwei Allele einer repetitiven Sequenz gleichzeitig untersucht werden.
Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung ist in der zweiten Primerverlängerungsreaktion ein Primerterminationsreagens enthalten, das einen markierten Nukleotidterminator umfasst. Vorzugsweise wird der markierte Nukleotidterminator so ausgewählt, dass er komplementär zu dem Nukleotid an dem 3'-Ende des 3'-flankierenden Bereichs der Zielnukleinsäure ist, das an den repetitiven Bereich einer solchen Zielnukleinsäure angrenzt.
C. Trennung von Primer und Primerverlängerungsreagentien
Zwischen den ersten und zweiten Primerverlängerungsreaktionen wird ein Trennschritt durchgeführt, um ein Durchmischen des ersten und des zweiten Primerverlängerungsreagens zu verhindern und um dadurch eine ungesteuerte Primerverlängerung zu verhindern. Die zum Ausführen des Trennschritts verwendeten Mittel können beliebige Mittel sein, die dazu geeignet sind, das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid von dem ersten und/oder zweiten Primerverlängerungsreagens zu trennen. Beispielhafte Trennverfahren umfassen, aber sind nicht beschränkt auf HPLC, Elektrophorese, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion, Adsorption und ähnliche.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid während des Trennschritts so an einem festen Träger befestigt, dass die Primerverlängerungsreagentien einfach durch Waschen des festen Trägers von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt werden können. Gemäß dieser Ausführungsform kann der Primer vor oder nach Durchführung der ersten Primerverlängerungsreaktion an dem festen Träger befestigt werden. Die Waschbedingungen sind derart, dass das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid nicht wesentlich beschädigt wird, und eine unspezifische Adsorption der Primerverlängerungsreagentien minimiert wird.
D. Messen eines Signals
Im Anschluss an entweder die erste oder die zweite Primerverlängerungsreaktion wird ein Detektionsschritt durchgeführt, bei dem die Menge an intakter Markierung bestimmt wird, die in ein Primerverlängerungsprodukt eingebaut worden ist. Jedes Nachweisverfahren kann verwendet werden, das für die Art der verwendeten Markierung geeignet ist. Somit umfassen mögliche Nachweisverfahren radioaktive Detektion, den Nachweis optischer Adsorption, z.B. Nachweis von UV-VIS-Absorption, Nachweis optischer Emission, z.B. Fluoreszenz oder Chemilumineszenz.
Der Messschritt kann in Abhängigkeit von dem ausgeführten Aspekt der Erfindung und der Zusammensetzung des ersten und zweiten Primerverlängerungsreagens an verschiedenen Punkten in dem Verfahren stattfinden. Beim ersten Aspekt findet der Messschritt vorzugsweise statt, nachdem mit dem Primerverlängerungsreagens, das das markierte, verlängerbare Nukleotid enthält, umgesetzt worden ist und nachdem dieses von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt wurde. Bei dem zweiten Aspekt findet der Messschritt statt, nachdem mit dem Primerterminationsreagens, das den markierten Nukleotidterminator enthält, umgesetzt wurde und nachdem dieses von dem Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid abgetrennt wurde.
E. Eine Markierung nicht-nachweisbar machen
Gemäß dem ersten Aspekt des Verfahrens der Erfindung wird, sobald ein Signal von einer Markierung nachgewiesen wird, die Markierung nicht-nachweisbar gemacht, bevor ein nachfolgender Zyklus diskreter Primerverlängerung durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung nicht-nachweisbar gemacht, indem die Markierung von dem in das Primerverlängerungsprodukt eingebauten, markierten, verlängerbaren Nukleotid abgespalten wird. Das zum Abspalten der Markierung von dem Nukleotid verwendete Verfahren hängt von der Art der spaltbaren Verknüpfung ab, die verwendet wurde, um die Markierung und das Nukleotid zu verbinden. Siehe oben. Beispielhafte Spaltungsreagentien umfassen Thiol, Base, Periodat, Hydroxylamin und ähnliche. In einem bevorzugten Verfahren wird die Markierung an einem Basenteil eines Uracilnukleotids befestigt, und im Anschluss an die Detektion wird die Markierung von dem markierten, verlänger baren Nukleotid durch Behandlung mit dem Enzym Uracil-N-Glycosylase (UNG) abgespalten.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung durch Zerstören der Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung selbst nicht-nachweisbar gemacht. In Abhängigkeit von der Art des verwendeten Labels gibt es mehrere Verfahren, die zum Zerstören der Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung verwendet werden können. Wenn die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist, kann die Markierung z.B. durch Fotobleichung des Farbstoffs unter Verwendung einer intensiven Lichtquelle in einer sauerstoffreichen Umgebung nicht-nachweisbar gemacht werden. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann die Markierung durch Umsetzen der Markierung mit einem irreversiblen Enzyminhibitor, der das Enzym außer Stande setzt, eine Signal-erzeugende Reaktion zu katalysieren, nichtnachweisbar gemacht werden. Wenn die Markierung ein chemilumineszierendes Mittel ist, das nur eine einzige Licht-erzeugende Umwandlung durchlaufen kann, ist die Markierung selbst-zerstörend und benötigt folglich keine getrennte Reaktion, um die Markierung nicht-nachweisbar zu machen (Bronstein).
IV. KITS ZUM DURCHFÜHREN DES VERFAHRENS
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Kits zum Durchführen verschiedener Aspekte und Ausführungsformen der Verfahren der Erfindung. In einem ersten Aspekt umfassen Kits der Erfindung einen Primer, ein erstes Primerverlängerungsreagens und ein zweites Primerverlängerungsreagens, wobei wenigstens eines von dem ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagens ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran befestigten Markierung enthält. Vorzugsweise kann die an dem verlängerbaren Nukleotid befestigte Markierung in der Folge eines Behandlungsschritts, der darin effektiv ist, die Markierung von einem Primerverlängerungsprodukt abzuspalten und/oder die Signal-erzeugenden Eigenschaften der Markierung zu zerstören, nicht-nachweisbar gemacht werden. Vorzugsweise ist der Primer an einen festen Träger gebunden oder er ist dazu befähigt, über ein spezifisches Bindungspaar oder durch eine kovalente Verknüpfungsgruppe an einen festen Träger gebunden zu werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst dieser Aspekt der Erfindung einen Festphasenträger zur Befestigung eines Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den Primer oder über die Zielnukleinsäure. Optional enthalten die Kits des ersten Aspekts der Erfindung ein Primerterminationsreagens.
In einem zweiten Aspekt umfassen die Kits der Erfindung einen Primer, ein erstes Primerverlängerungsreagens, ein zweites Primerverlängerungsreagens und ein Primerterminationsreagens, wobei das Primerterminationsreagens einen Nukleotidterminator mit einer daran befestigten Markierung umfasst. Das zweite Primerverlängerungsreagens und das Primerterminationsreagens können entweder getrennt oder zusammen als eine Mischung abgepackt sein. Vorzugsweise ist der Primer an einen festen Träger gebunden, oder er ist dazu befähigt, über ein spezifisches Bindungspaar oder über eine kovalente Verknüpfungsgruppe an einen festen Träger gebunden zu werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst dieser Aspekt der Erfindung einen Festphasenträger zur Befestigung eines Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids über den Primer oder über die Zielnukleinsäure.
Obwohl oben nur wenige Ausführungsformen im Detail beschrieben worden sind, werden gewöhnliche Fachleute in der Molekularbiologie klar verstehen, dass in der bevorzugten Ausführungsform viele Modifikationen möglich sind, ohne von deren Lehren abzuweichen. Dementsprechend sollen alle solchen Modifikationen im Umfang der nachfolgenden Patentansprüche eingeschlossen sein.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure, das die Schritte umfasst: (a) Anlagern eines zum Primer komplementären Teils einer Zielnukleinsäure an einen Primer, wodurch ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid gebildet wird; (b) Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes, wobei das erste Primerverlängerungsreagenz es einer ersten Primerverlängerungsreaktion erlaubt, nur in dem Maß voranzuschreiten, dass ein Primer um einen Betrag verlängert wird, der weniger als die gesamte repetitive Einheit beträgt; (c) Trennen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids und des nichtreagierten ersten Primerverlängerungsreagenzes; (d) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenzes, wobei das zweite Primerverlängerungsreagenz es einer zweiten Primerverlängerungsreaktion erlaubt, nur in dem Maß voranzuschreiten, dass der Teil einer repetitiven Einheit synthetisiert wird, der nicht durch das erste Primerverlängerungsreagenz synthetisiert wurde, und wobei wenigstens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran befestigten Markierung umfasst; (e) Trennen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids von nicht-reagiertem zweiten Primerverlängerungsreagenz; (f) Messen eines durch die Markierung erzeugten Signals; und (g) Behandeln der Markierung, um die Markierung nicht nachweisbar zu machen; und (h) Wiederholen eines Zyklus der Schritte (a) bis (g), bis das Signal wesentlich geringer ist als ein Signal, das in einem vorangegangenen Zyklus nachgewiesen wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (d) zusätzlich das Umsetzen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids mit einem Primerterminationsreagenz umfasst, wobei das Terminationsreagenz einen oder mehrere Nukleotidterminatoren umfasst, die die weitere Verlängerung eines Primerverlängerungsprodukts verhindern, wenn sie in ein Primerverlängerungsprodukt eingebaut werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Primer an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielnukleinsäure an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung über einen spaltbaren Linker an das verlängerbare Nukleotid geknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielnukleinsäure vor der Analyse vervielfältigt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Vervielfältigung mittels einer PCR erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Behandelns der Markierung, um die Markierung nicht nachweisbar zu machen, das Abspalten der Markierung vom markierten, verlängerbaren Nukleotid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Behandelns der Markierung, um die Markierung nicht nachweisbar zu machen, das Zerstören einer Signal-erzeugenden Eigenschaft der Markierung umfasst.
Verfahren zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure, das die Schritte umfasst: (a) Anlagern eines zum Primer komplementären Teils einer Zielnukleinsäure an einen Primer, wodurch ein Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid gebildet wird; (b) Durchführen einer ersten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines ersten Primerverlängerungsreagenzes, wobei das erste Primerverlängerungsreagenz es einer ersten Primerverlängerungsreaktion erlaubt, nur in dem Maß voranzuschreiten, dass ein Primer um einen Betrag verlängert wird, der weniger als die gesamte repetitive Einheit beträgt; (c) Trennen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids und des nichtreagierten ersten Primerverlängerungsreagenzes; (d) Durchführen einer zweiten Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung eines zweiten Primerverlängerungsreagenzes, wobei das zweite Verlängerungsreagenz es einer zweiten Primerverlängerungsreaktion erlaubt, nur in dem Maß voranzuschreiten, dass der Teil einer repetitiven Einheit synthetisiert wird, der nicht durch das erste Primerverlängerungsreagenz synthetisiert wurde, und mit einem Primerterminationsreagenz, das einen Nukleotidterminator umfasst, der ein Reagenz mit daran befestigter Markierung aufweist; (e) Trennen des Zielnukleinsäure-Primer-Hybrids von nicht-reagiertem zweiten Primerverlängerungsreagenz; (f) Messen eines durch die Markierung erzeugten Signals; und (g) Wiederholen eines Zyklus der Schritte (a) bis (f), bis ein Signal nachgewiesen wird, das den Einbau des Nukleotidterminators anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Zielnukleinsäure-Primer-Hybrid an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Primer an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zielnukleinsäure an einem festen Träger befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zielnukleinsäure vor der Analyse vervielfältigt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Vervielfältigung mittels einer PCR erreicht wird.
Verwendung eines Kits zum Bestimmen der Anzahl repetitiver Einheiten in einem repetitiven Bereich einer Zielnukleinsäure in Übereinstimmung mit einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-18, wobei das Kit umfasst: einen Primer mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Primer-komplementären Teil einer Zielnukleinsäure ist; ein erstes Primerverlängerungsreagenz; und ein zweites Primerverlängerungsreagenz, wobei wenigstens eines der ersten oder zweiten Primerverlängerungsreagenzien ein verlängerbares Nukleotid mit einer daran befestigten Markierung enthält.
Verwendung eines Kits nach Anspruch 19, wobei der Primer an einem festen Träger befestigt ist.
Verwendung eines Kits nach Anspruch 19, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden und chemilumineszierenden Molekülen.
Verwendung eines Kits nach Anspruch 19, wobei die Markierung an dem verlängerbaren Nukleotid über einen spaltbaren Linker befestigt ist.