DE69531831T2

DE69531831T2 - Verfahren mit einer hohen umsatzrate für das auffinden von sequenzen oder genetischen veränderungen in nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69531831T2
Application number: DE69531831T
Authority: DE
Inventors: Anthony P. Shuber
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1994-07-28
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2015-07-29
Also published as: CA2195880A1; EP0777750B1; AU697642B2; EP0777750A1; DE69531831D1; EP0777750A4; JPH10506267A; AU3365095A; WO1996003529A1; US5849483A; ATE250671T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Screening mit hohem Durchsatz von Nucleinsäureproben, um eine oder mehrere genetische Alterationen bei diesen Proben festzustellen. Die Erfindung betrifft ferner die Identifikation von bestimmten krankheitsverursachenden Nucleinsäuresequenzen bei Säugetieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zum Identifizieren genetischer Polymorphismen, zum Bestimmen der molekularen Basis genetisch bedingter Krankheiten und zum Bereitstellen von Carrier-Diagnostik und Pränataldiagnostik für die genetische Beratung verwendet werden. Ferner betrifft die Erfindung eine spezifische hochauflösende Identifikation von krankheitsverursachenden Mikroorganismen bei Säugetieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit zum Identifizieren und Erkennen von Unterschieden in Nucleinsäuresequenzen und insbesondere DNA-Sequenzen (z. B. Mutationen) ist bei der Diagnose von genetisch bedingten Krankheiten und der Identifikation von klinisch signifikanten Varianten krankheitsverursachender Mikroorganismen von zentraler Bedeutung. Ein Verfahren für die molekulare Analyse genetischer Variationen verwendet die Erkennung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs) unter Verwendung des Blotting-Verfahrens nach Southern (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503–517, 1975; Kan et al., Nature, 313: 369– 374, 1978; Wyman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 6754– 6758, 1980). Da dieser Ansatz verhältnismäßig beschwerlich ist, wurden neue Verfahren entwickelt, von denen einige auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruhen. Diese umfassen: RFLP-Analyse unter Verwendung von PCR (Chehab et al., Nature, 329: 293–294, 1987; Rommens et al., Am. J. Hum. Genet., 46: 395– 396, 1990), die Erzeugung von künstlichen RFLPs unter Verwendung von Primer-spezifischer Restriktionsstelle-Modifikation (Haliassos et al., Nucleic Acids Research, 17: 3606, 1989) und Hybridisierung auf Allele-spezifischen Oligonucleotiden (ASOs) (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986).
Diese Verfahren sind in ihrer Anwendbarkeit auf die komplexe Mutationsanalyse beschränkt. Z. B. wurden bei der Zystofibrose, einer rezessiven Erkrankung, die eine von 2000–2500 Lebendgeburten in den Vereinigten Staaten betrifft, mehr als 225 angenommene krankheitsverursachende Mutationen identifiziert. Ferner können mehrfache Mutationen in einem einzigen betroffenen Indiviuum vorliegen und durch wenige Basenpaare voneinander getrennt sein. Diese Erscheinungen bereiten einzigartige Schwierigkeiten bei der Entwicklung von klinschen Screening-Verfahren, die eine große Anzahl von DNA-Proben bewältigen können.
Porumb et al, Methods in Molecular and Cellular Biology, 1993, 4: 10–21 beschreibt die Verwendung von Thermoelution für die quantitative Bestimmung der Stabilität des Komplexes eines Oligonucleotids mit einer immobilisierten Nucleinsäure.
In Shuber et al., Human Molecular Genetics, 2: 153–158, 1993, beschreiben die Erfinder dieser Erfindung ein Verfahren, dass die gleichzeitige Hybridisierung von mehreren Oligonucleotidproben auf einer einzelnen DNA-Probe ermöglicht. Indem in die Hybridisierungsreaktion ein Agens aufgenommen wird, das die Ungleichheiten der Schmelztemperaturen von Hybriden beseitigt, die zwischen synthetischen Oligonucleotiden und der Ziel-DNA gebildet werden, ist es mit einem einzigen Test möglich, eine DNA-Probe auf das Vorhandensein verschiedener Mutationen zu testen. Üblicherweise können mehr als 50 ASOs gepoolt und zur Ziel-DNA hybridisiert werden; in einem zweiten Schritt werden die ASOs aus einem Pool, der ein positives Ergebnis hervorbringt, einzeln mit der gleichen DNA hybridisiert.
Dieses Verfahren ist jedoch durch die Erfordernis der Ausführung von aufeinanderfolgenden mehrfachen einzelnen Hybridisierungen zur Identifizierung der relevanten ASO aus dem Pool beschränkt. Es besteht daher in der Technik ein Bedarf nach verhältnismäßig kostengünstigen Verfahren, welche ein effizientes Screening einer großen Anzahl von Nucleinsäureproben und insbesondere DNA-Proben nach genetischen Sequenzen und Va riationen und die rasche Identifizierung der unterschiedlichen Sequenzen erlauben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren mit hohem Durchsatz zum Erkennen und Identifizieren von Sequenzen oder genetischen Alterationen (definiert als Nucleotidadditionen, -löschungen oder -substitutionen) in einer großen Anzahl von Nucleinsäureproben, was erreicht wird durch: Immobilisieren einer Mehrzahl der Nucleinsäureproben auf einem Träger; Bereitstellen einer Vielzahl von Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren; im wesentlichen gleichzeitiges Hybridisieren der immobilisierten Proben mit der Mehrzahl von Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren; Entfernen der Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere, die nicht mit den immobilisierten Proben hybridisieren; Separieren der hybridisierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere von den immobilisierten Proben; Identifizieren der separierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere, wobei die Identifikation der getrennten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere die Nucleinsäuresequenz oder eine oder mehrere genetische Alternation (en) identifiziert. Die getrennten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere können durch Sequenzierung identifiziert werden.
Erfindungsgemäß können sowohl die Ziel-Nucleinsäuresequenz und/oder die separierte Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Vereinfachen der Erkennung und Identifikation verstärkt werden. Es ist wichtig, dass die Hybridisierungen unter Bedingungen ausgeführt werden, die die Unterschiede in. der Schmelztemperatur der zwischen den verschiedenen Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren und der Ziel-Nucleinsäuresequenz gebildeten Hybride minimieren.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt autoradiografische Ergebnisse, die von der Hybridisierung einer Mehrzahl identischer Filter mit humangenetischer DNA mit ³²P-markierten ASOs erhalten wurden, die typisch für die verschiedenen Allele der Mukoviszidose-Trans membran-Regulatorgene (CFTR) sind. Die bei jeder Hybridisierung verwendeten ASOs sind links von jedem Filter identifiziert. Bahn 1 enthält jeweils DNA Mutant-Sequenz, die zu jeder ASO komplementär ist; Bahnen 2 bis 6 enthalten Wildtyp "normal" Sequenzen.
2 zeigt autoradiografische Ergebnisse, die von der Hybridisierung von vier identischen Filtern mit humangenetischer DNA mit ³²P-markierten ASOs erhalten wurden, die typisch für verschiedene Alleele der Mukoviszidose-Transmembran-Regulatorgene (CFTR) sind. Die bei jeder Hybridisierung verwendeten ASOs sind links von jedem Filter identifiziert. Die mit A bezeichneten Bahnen enthalten positive Kontroll-DNA-Proben. Bahnen B bis E enthalten Patientenproben, die, mit der Ausnahme von 8C (Verstärkungsfehler auf dem Probenduplikat) und D7, D8 und E7 (positive Kontrolle), doppelt analysiert werden.
3 zeigt die Identifikation von bestimmten Mutationen in pool-positiven Proben, die in 1 identifiziert sind. Die oberste Reihe jedes Filters enthält positive Kontrollproben für ASOs in, wie bezeichnet, Pool 1 und Pool 2. Pool 1, Bahn 1, G542X; Bahn 2, G551D; Bahn 3, R553X; Bahn 4, W1282X; Bahn 5, N1303K. Pool 2, Bahn 1; Δ507; Bahn 2, R117H; Bahn 3, 621 + 1 G → T; Bahn 4, S549N; Bahn 5, R560T; Bahn 6, 1717 – 1 G → A. Reihe B enthält Pool-1 oder Pool-2 positive Patientenproben. Bei Pool 1 enthalten Bahnen 1 und 2 Probe 4, Bahnen D und E aus 1. Bei Pool 2 enthalten Bahnen 1 und 2 Probe 3, Bahnen D und E aus 2. Bahnen 3 und 4 enthalten Probe 5, Bahnen D und E aus 2.
4 zeigt eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Verfahren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen:

1. Ein "Allele-typisches Oligonucleotid" (ASO), so wie es hier definiert ist, ist ein Oligonucleotid mit einer Sequenz, die gleich oder nahezu gleich einem bekannten Nucleinsäureteil ist. Oft enthält ein ASO eine kleine Änderung bezüglich der prevalenten "Wildtyp" Sequenz. Diese Änderung kann die Addi tion, Löschung oder Substitution einer oder mehrerer Nucleotide umfassen. ASOs können zum Identifizieren jeder Addition, Löschung oder Substitution bestimmt sein, solange die Nucleinsäuresequenz bekannt ist.
2. Eine "variante" Sequenz, so wie hier verwendet, enthält eine Nucleinsäuresequenz, die sich von einer bekannten Sequenz durch die Addition, Löschung oder Substitution einer oder mehrerer Nucleotide unterscheidet.
3. "Verstärkung" einer Nucleinsäuresequenz, so wie hier verwendet, bezeichnet die Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder anderer Verstärkungsmethoden zum Erhöhen der Konzentration einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Mischung von Nucleinsäuresequenzen. Für eine Beschreibung von PCR siehe Saiki et al., Science 239: 487 (1988).
4. "Chemische Sequenzierung" bezeichnet Verfahren wie z. B. das von Maxim und Gilbert (Maxim-Gilbert sequencing, Maxim and Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad Sci. USA 74: 560), bei dem Nucleinsäuren unter Verwendung einzelner basenspezifischer Reaktionen zufällige abgespalten werden.
5. "Enzymatische Sequenzierung" bezeichnet Verfahren wie z. B. das von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463), bei dem eine Einzelstrang DNA kopiert und zufällig unter Verwendung von DNA-Polymerase terminiert wird.
6. In dieser Beschreibung werden die Begriffe "gebunden" und "hybridisiert" austauschbar zum Bezeichnen der Bildung von Nucleinsäuren an Purin und Pyrimidin enthaltende Polymerduplexe verwendet. Der Begriff "Affinitäts-Reinigung" bezeichnet Reinigung unter Verwendung von Hybridisierung.
7. "Mit hohem Durchsatz" bezeichnet die Fähigkeit gleichzeitig eine große Anzahl von Nucleinsäureproben (z. B. über 50 oder 100 Nucleinsäureproben) und eine große Anzahl von Zielsequenzen innerhalb dieser Proben zu verarbeiten und zu screenen.
8. "Purin und Pyrimidin enthaltende Polymere" sollen DNA, RNA und andere Verbindungen umfassen, die zur Watson-Crick Basenpaarung geeignet sind und die nicht unbedingt eine Zuckerphosphat-Hauptkette, wie z. B. PNA, tragen. Siehe J. Am. Chem. Soc., 114: 1895–97 (1992).

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Nucleinsäureproben mit hohem Durchsatz auf Zielsequenzen oder SequenzAlterationen und insbesondere auf besondere DNA-Sequenzen in von einem Patienten isolierter DNA. Das Verfahren ist anwendbar, wenn Gegenstand des Interesses ein oder mehrere Gene oder genetische Loci sind. Es wird ebenfalls klar, dass dieses Verfahren ein rasches und ökonomisches Screening einer großen Anzahl von Nucleinsäureproben auf die interessierenden Zielsequenzen ermöglicht.
Bei einer Ausführungsform umfasst die bestimmte Nucleinsäuresequenz einen Teil einer Nucleinsäure, ein bestimmtes Gen oder einen genetischen Locus in einer Genom-DNA, von dem bekannt ist, dass er/es bei einem pathologischen Zustand oder Syndrom eine Rolle spielt. Nicht beschränkende Beispiele sind z. B. Mukoviszidose, Sichelzellenanämie, β-Thalassemia oder die Gaucher-Krankheit.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die bestimmte Nucleinsäuresequenz einen Teil eines bestimmten Gens oder genetischen Locus, von dem die Verbindung mit einer bestimmten Krankheit nicht bekannt ist, bei dem jedoch ein Polymorphismus bekannt oder vermutet ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform enthält die bestimmte Nucleinsäuresequenz einen Teil einer fremdartigen genetischen Sequenz, z. B. das Genom eines eindringenen Mikroorganismus. Nicht beschränkende Beispiele betreffen Bakterien und deren Phagen, Viren, Pilze, Protozoen und ähnliches. Die vorliegenden Verfahren sind insbesondere dann anwendbar, wenn zwischen verschiedenen Varianten oder Stämmen von Mikroorganismen unterschieden werden soll, um die geeigneten therapeutischen Eingriffe zu wählen.
Erfindungsgemäß stellt die Ziel-Nucleinsäure eine Probe einer von einem Patienten isolierten Nucleinsäure dar. Diese Nucleinsäure kann aus jeder Zellquelle oder Körperflüssigkeit gewonnen werden. Nicht beschränkende Beispiele von in der klinischen Praxis verfügbaren Zellquellen sind u. a. Blutzellen, Buccal-Zellen (Mundhöhlen-Zellen), Gebärmutterhals-Scheidenzellen, Ephithelialzellen aus Urin, Fötalzellen oder beliebige Zellen, die in durch eine Biopsy gewonnenem Gewebe vorliegen.
Körperflüssigkeiten können Blut, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Samen und Gewebeausfluss an Infektions- oder Entzündungsarten sein. Nucleinsäuren können aus der Zellquelle oder Körperflüssigkeit unter Verwendung eines beliebigen der zahlreichen bekannten Standardverfahren extrahiert werden. Es ist klar, dass das jeweilige, zum Extrahieren der Nucleinsäure verwendete Verfahren, von der Art der Quelle abhängig sein wird. Die minimale Menge von z. B. DNA, die zur Verwendung mit einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform extrahiert werden kann, ist etwa 5 pg (entsprechend etwa einem 1-Zellenäquivalent von einer Genomgröße von 4 × 10⁹ Basenpaaren).
Einmal extrahiert, kann die Ziel-nucleinsäure der vorliegenden Erfindung ohne weitere Manipulation verwendet werden. Alternativ können eine oder mehrere bestimmte, in der Zielnucleinsäure vorhandene Bereiche, durch PCR verstärkt werden. In diesem Fall werden die verstärkten Bereiche durch die Wahl von bestimmten, als Primer verwendeten Flankierungssequenzen, bestimmt. Das Verstärken bei diesem Schritt ermöglicht die vorteilhafte Steigerung der Konzentration von bestimmten Nucleinsäuresequenzen innerhalb der Zielsequenzpopulation. Die Länge von verstärkbaren Nucleinsäuresequenzen reicht von 80 by bis zu 30 kbp (Saiki et al., 1988, Science, 239: 487).
Bei einer Ausführungsform ist die Zielnucleinsäure mit oder ohne vorherige Verstärkung von bestimmten Sequenzen an eine Festphasen- oder Semi-Festphasenmatrix gebunden. Dies ermöglicht das gleichzeitiges Bearbeiten und Screening einer großen Anzahl von Nucleinsäureproben von verschiedenen Quellen. Nicht beschränkende Beispiele von zur erfindungsgemäßen Verwendung geeigneter Matrizen sind u. a. Nitrozellulose oder Nylonfilter, Glaskügelchen, mit Reagenzien zum Affinitätsanlagern beschichtete magnetische Kügelchen, behandelte oder unbehandelte Mikroliterscheiben, Polymergele, Agarose und ähnliches. Es ist dem Fachmann klar, dass das zum Binden der Zielnucleinsäure an die Matrix verwendete Verfahren von der jeweils verwendeten Matrix abhängt. Z. B. kann ein Binden an Nitrozellulose durch einfache Adsorption von Nucleinsäure an dem Filter, gefolgt vom Heizen des Filters bei 75–80°C im Vakuum für 15 Minuten bis 2 Stunden, erreicht werden. Alterna tiv können geladene Nylonmembranen verwendet werden, die keine weitere Behandlung der gebundenen Nucleinsäuren erfordern. Kügelchen und Mikroliterplatten, die mit Avidin beschichtet sind, können zum Binden von Zielnucleinsäure verwendet werden, an die Biotin angeknüpft wurde (z. B. durch die Verwendung von biotin-konjugierten PCR-Primern). Zusätzlich können Antikörper verwendet werden, um Zielnucleinsäuren an jeden der obigen festen Träger anzuknüpfen, indem die Oberflächen mit den Antikörpern beschichtet werden und ein antikörperspezifisches Hapten in die Zielnucleinsäure eingebracht wird.
Beim Anwenden der vorliegenden Erfindung wird die unbehandelte oder verstärkte Zielnucleinsäure, vorzugsweise an eine Festphasen- oder Semi-Festphasen-Matrix gebunden, mit einer Mischung aus Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren (im folgenden auch als "Polymer" oder "Polymere" bezeichnet) inkubiert. Diese Polymere können vorzugsweise allele-spezifische Oligonucleotide (ASOs) sein. 10 bis 200 ASOs können für eine einzige Hybridisierung gepoolt werden, vorzugsweise 50 bis 100 und besonders bevorzugt 50. Die Länge einzelner ASOs kann 16 bis 25 Nucleotide betragen, vorzugsweise 17 Nucleotiden.
Die Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere können chemisch durch technische Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung kommerziell verfügbarer automatischer Synthetisierer. Die Polymere können dann radioaktiv markiert werden (z. B. end-markiert mit ³²P unter Verwendung von Polynucleotidkinase) oder mit anderen, häufig verwendeten "Marken" ("tags") oder Reporter-Molekülen konjugiert werden. Zum Beispiel können Fluorochrome (wie z. B. FITC oder Rhodamin), Enzyme (wie z. B. Alkalin-Phosphatase), Biotin oder andere bekannte Markierungsverbindungen direkt oder indirekt angeknüpft werden. Ferner können bei Verwendung von Standardverfahren eine große Anzahl von zufällig permutierten Polymeren in einer einzigen Reaktion synthetisiert werden. Wie unten ausführlich beschrieben wird, erfordert die vorliegende Erfindung nicht, dass vor der Hybridisierung einzelne Hybridisierungssequenzen bestimmt werden. Stattdessen kann die Sequenz der gebundenen Polymere in einem späteren Schritt bestimmt werden.
Wie bei Shuber et al., 1993, Human Molecular Genetics, 2: 153–158, beschrieben, wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen durchgeführt, bei denen Polymere, wie solche mit verschiedenen Sequenzen, mit ihrer komplementären DNA mit gleicher Stärke hybridisieren. Dies wird erreicht durch: 1) Verwenden von Polymeren gleicher Länge; und 2) Einbringen von geeigneten Konzentrationen eines oder mehrerer Reagenzien in die Hybridisierungs-Mischung, welche die Ungleichheit der Schmelztemperaturen unter den Polymeren gleicher Länge aber unterschiedlicher Guanosin + Cytosin(G + C) – Zusammensetzungen aufheben. Für diesen Zweck verwendbare Reagenzien sind, ohne eine Einschränkung vorzunehmen, quarternäre Ammoniumverbindungen wie beispielsweise Tetramethylammoniumchlorid (TMAC).
TMAC führt durch einen nicht spezifischen Salzeffekt zur Verringerung der Wasserstoffbrückenbindungsenergien zwischen G-C-Basenpaaren. Gleichzeitig bindet es spezifisch an A-T-Paare und erhöht die thermische Stabilität dieser Bindungen. Diese entgegengesetzten Einflüsse bewirken die Verringerung der Bindungsenergie zwischen dem dreifach-wasserstoffgebundenen G-C-Basenpaar und dem zweifach-gebundenen A-T-Paar. Eine Konsequenz daraus ist, dass, wie oben beschrieben, die Schmelztemperatur von Nucleinsäure zu Nucleinsäure-Hybriden, welche in der Gegenwart von TMAC gebildet werden, nur eine Funktion der Länge der Hybride ist. Eine zweite Folge ist eine Zunahme in der Steigung der Schmelzkurve bei jeder Probe. Zusammen ermöglichen diese Effekte, dass die Stringenz der Hybridisierung bis zu dem Punkt erhöht wird, bei dem Einzel-Base-Unterschiede aufgelöst werden können, und nichtspezifische Hybridisierung minimiert wird (Wood et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 1585).
Für den Fachmann ist es klar, dass jedes Agens, welches diese Eigenschaften aufweist, beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Derartige Agenzien können leicht durch Bestimmen von Schmelzkurven für verschiedene Test-Oligonucleotide bei Vorhandensein und Wegfall von steigenden Konzentrationen dieses Agens identifiziert werden. Dies kann durch Binden einer Zielnucleinsäure an eine feste Matrix wie beispielsweise einen Nylonfilter, einzelnes Hybridisieren radio-markierter Oligonucleotide gleicher Länge aber unterschiedlicher G + C – Zusammensetzung an den Filter, Waschen des Filters bei zunehmender Temperatur und Messen der relativen Menge von an den Filter bei jeder Temperatur gebundenen radiomarkierten Proben erreicht werden. Ein Agens, das bei Vorhandensein in den oben beschriebenen Hybridisierungs- und Waschschritten, nahezu deckungsgleiche und steile Schmelzkurven für die verschiedenen Oligonucleotide ergibt, kann verwendet werden.
Beim Ausführen der vorliegenden Erfindung werden die Zielnucleinsäure und Polymere für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen inkubiert, um eine maximale spezifische Hybridisierung und eine minimale nicht-spezifische, d. h. Hintergrundhybridisierung, zu erzielen. Die zu berücksichtigenden Bedingungen sind u. a. die Konzentration jedes Polymers, die Temperatur der Hybridisierung, die Salzkonzentration und die Gegenwart oder Abwesenheit von unzusammenhängender Nucleinsäure. Es ist ferner klar, dass die Polymere in mindestens zwei Gruppen aufgeteilt werden können, wobei jede Gruppe eine ausreichende Anzahl von Polymeren enthält, um die Hybridisierung zu ermöglichen. Zum Beispiel kann es vorzuziehen sein, die Gesamtzahl der mit den Nucleinsäureproben zu hybridisierenden Polymere eines Pools in Gruppen von etwa 50 Polymeren aufzuteilen. Jede Gruppe von Polymeren kann mit den auf dem Träger immobilisierten Nucleinsäure in sequenzieller Weise hybridisiert werden, jedoch können die Polymere jeder Gruppe mit der Nucleinsäure zur im wesentlichen gleichen Zeit hybridisiert werden. Zusätzlich können immobilisierte Nucleinsäureproben mit zumindest einem Pool von Polymeren hybridisiert, die Identität der hybridisierenden Polymere bestimmt und dann die Nucleinsäureproben wieder mit dem gleichen oder anderen Polymer-Poolen hybridisiert werden.
Die Konzentration jedes Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymers kann von 0.025 bis 0.2 pmol pro ml Hybridisierungslösung reichen. Wenn Polymere mit bekannter Sequenz verwendet werden, wird die optimale Konzentration für jedes Polymer durch Test-Hybridisierung bestimmt, bei welcher das Signal-Rausch-Verhältnis (d. h. die spezifische gegen die nicht-spe zifische-Bindung) jedes Polymers bei zunehmender Konzentration von markierten Polymer gemessen wird. Um die Hintergrundhybridisierung weiter zu verringern, können Oligonucleotide mit der unmarkierten, nicht-veränderten (d. h. Wildtyp) Sequenz in die Reaktionsmischung mit einem 1 bis 100fachen Konzentrationsäquivalent von der Konzentration des markierten Polymers aufgenommen werden.
Die Temperatur für die Hybridisierung ist derart optimiert, dass sie für die Länge der verwendeten Polymere so hoch wie möglich ist. Dies kann unter Verwendung der oben beschriebenen-Schmelzkurven-Bestimmungsverfahren empirisch bestimmt werden. Für den versierten Praktiker ist es klar, dass die Bestimmung der optimalen Zeit, Temperatur, Polymerkonzentration und Salzkonzentration zusammen vorgenommen werden sollte.
Nach der Hybridisierung werden ungebundene Polymere durch Waschen der matrix-gebundenen Nucleinsäure in einer TMAC oder andere Verbindungen enthaltenden Lösung entfernt, unter Bedingungen, die perfekt angepasste Nucleinsäuren an Polymerhybriden erhalten. Die Waschbedingungen wie beispielsweise Temperatur, Art und Konzentration von Salzen und die Waschzeit werden, wie oben beschrieben, empirisch bestimmt. Zu diesem Zeitpunkt kann das Vorliegen von gebundenen Polymeren vor dem Weiterverfahren mit dem Trennschritt (siehe unten) bestimmt werden. Verschiedene Verfahren zur Bestimmung werden von der Markierung oder der Marke abhängen, die in die Polymere eingebracht ist. Zum Beispiel kann die Detektion radioaktiv markierter oder chemilumineszenter ASOs, die an die Zielnucleinsäuren gebunden wurden, durch Belichtung des Filters auf einen Röntgenfilm erfolgen. Alternativ können Polymere mit fluoreszenten Markierungen durch Anregung mit einem Laser oder einem lampenbasierten System bei der spezifischen Absorptionswellenlänge des Fluoreszenzreporters erkannt werden. Ferner können die Polymere jeweils zusätzlich zu der Probensequenz eine molekülgewichtverändernde Entität (MWME) tragen, die für jedes Mitglied des Polymerpools einzigartig ist. Die MWME ist an der Hybridisierungsreation nicht beteiligt, ermöglicht jedoch die direkte Identifikation der getrennten Polymere durch Bestimmung des relativen Molekulargewichts mit einer beliebigen An zahl von Verfahren. Andere Verfahren zur Bestimmung und Identifikation sind weiter unten beschrieben.
In einem nachfolgenden Schritt werden die gebundenen Polymere von den matrixgebundenen Zielnucleinsäuren getrennt. Die Trennung kann durch beliebige technisch bekannte Mittel erreicht werden, die Nucleinsäuren an Polymerhybriden destabilisieren, d. h. Verringerung des Salzes, Erhöhen der Temperatur, dem Aussetzen von Formamid, Alkali, etc. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die gebundenen Polymere getrennt, indem die Zielnucleinsäure-Polymerkomplexe in Wasser inkubiert werden und die Reaktion über die Schmelztemperatur der Nucleinsäure an Polymerhybriden hinaus aufgeheizt wird. Dies erübrigt den Bedarf der weiteren Behandlung oder Reinigung der getrennten Polymere.
Erfindungsgemäß können die getrennten Polymere mit einer Anzahl verschiedener Verfahren identifiziert werden, die für den Fachmann leicht zu erkennen sind. Zielsequenzen und verschiedene genetische Alterationen können durch die Verwendung von Polymeren mit einzigartigen Sequenzen identifiziert werden. Durch Sequenzierung des Polymers ist es möglich, die Zielsequenz oder genetische Alterationen in den Nucleinsäureproben entsprechend zu identifizieren.
Ferner können getrennte Polymere durch die Verwendung von Hybridisierungs-Arrays identifiziert werden. In solchen Arrays werden Purin und Pyrimidin enthaltende Polymere mit vorgegebenen Sequenzen bei bestimmten Positionen auf einem Feststoff- oder semi-Feststoffträger immobilisiert. Bei erfindungsgemäßer Verwendung ist die Sequenz jedes immobilisierten Polymers, das das Array enthält, komplementär zu der Sequenz eines Mitglieds des Polymerpools. Mit Zielnucleinsäuren hybridisierende Elemente des Polymerpools können nach der Trennung von Zielnucleinsäuren durch Rehybridisierung mit immobilisierten Polymeren identifiziert werden, welche das Array bilden. Die Identität des Polymers wird durch die Position der Hybridisierung auf dem Array bestimmt. Siehe US-Patent Nr. 5,202,231 und WO 8910977.
Andere Permutationen und Möglichkeiten sind für den Durchschnittsfachmann leicht zu erkennen und werden in dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung als äquivalent angesehen.
Insbesondere ist bei einer Ausführungsform das getrennte Polymer unmittelbar der Sequenzierung unter Verwendung eines chemischen Standardverfahrens ausgesetzt (z. B. Maxim-Gilbert sequencing, Maxam and Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 560). Dieses Verfahren ist insbesondere dann anwendbar, wenn zufällig permutierte Mischungen von Polymeren verwendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform werden die getrennten Polymere durch enzymatische Sequenzierung identifiziert (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463). In diesem Falle werden Oligonucleotide synthetisiert, welche zu den Polymeren komplementäre Sequenzen und zusätzlich vorher bestimmte und colineare Sequenzen aufweisen, welche als Sequenz-"Marken" wirken (siehe unten stehendes Beispiel 4). Die Trennung der Polymere von den Zielnucleinsäuren wird in Gegenwart einer Mischung dieser komplementären "markierten" (tagged) Oligonucleotide ausgeführt. Beim Inkubieren unter Sanger-Sequenzierungsbedingungen (siehe z. B. untenstehendes Beispiel 5) hybridisieren die getrennten Polymere mit ihren komplementären Sequenzen und wirken als Primer für die Sequenzierungsreaktion. Die Bestimmung der resultierenden geprimten Sequenz"Markierung" identifiziert dann das/die bei der Reaktion vorhandenen Polymere.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden die eluierten getrennten Polymere mit komplementären Oligonucleotiden inkubiert, welche universelle Primer-Sequenzen und/oder eine Sequenzierungs-Primer-Sequenz mit oder ohne einer zusätzlichen "Markierungs"-Sequenz enthalten können (siehe unten stehendes Beispiel 4). In beiden Fällen erlaubt es die anfängliche Hybridisierung eines Polymers mit dessen komplementärem Oligonucleotid dem Polymer, als der anfängliche Primer bei einer einzelnen Extensions-Reaktion zu dienen. Bei einem Fall wird das Extensions-Produkt dann direkt als Templat in einer zyklischen Sequenzierungsreaktion verwendet. Zyklische Sequenzierung der Extensions-Produkte führt zu einer Verstärkung der Sequenzierungsprodukte. Beim Aufbau (design) der komplementären Oligonucleotide wird der Sequenzierungs-Primer so ausgerichtet, dass die Sequenzierung durch das Polymer selbst weiterläuft, oder alternativ durch die "Markierungs"-Sequenz.
Beim zweiten Fall enthält das Extensions-Produkt eine universale Primer-Sequenz und eine Sequenzierungs-Primer-Sequenz. Das Extensions-Produkt wird dann in Gegenwart des universalen Primers zu einer linearen PCR-Reaktion hinzugefügt. Die Oligonucleotide mit komplementären Sequenzen zum binden von Polymeren werden folglich selektiv verstärkt. Bei einem zweiten Schritt werden diese verstärkten Sequenzen unter Verwendung der eingebauten Sequenzierungs-Primer-Sequenz der Sanger-Sequenzierung unterzogen. In diesem Falle wird der Sequenzierungs-Primer unmittelbar aufwärts einer der oben beschriebenen "Markierungs"-Sequenzen angeordnet. So identifiziert die Bestimmung der "Markierungs"-Sequenz die colineare Polymersequenz.
Bei der Anwendung der Erfindung ist die Bestimmung der gesamten Sequenz des Polymers oder der komplementären markierten Oligonucleotide nicht erforderlich. Es wird angenommen, dass eine, zwei oder drei Sequenzierungsreaktionen (statt der zum Erhalten einer kompletten Sequenz notwendigen vier) bei der Herstellung charakteristischer Muster (ähnlich "bar codes") ausreichen, um die einzelnen Polymere sofort zu identifizieren. Dieser Ansatz ist sowohl auf manuelle Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von radioaktiv markierter Polymere anwendbar, die analoge oder digitalisierte Audioradiogramme hervorbringen, als auch auf automatisierte Sequenzierungsverfahren unter Verwendung von nicht radioaktiven Reporter-Moleküle, die digitalisierte Muster erzeugen. In jedem Fall können Vergleiche mit einer vorhandenen Datenbasis elektronisch ausgeführt werden. Durch Verringerung der Anzahl von erforderlichen Sequenzierungsreaktionen erleichtert das erfindungsgemäße Verfahren die ökonomische Analyse einer Mehrzahl von Proben und von einer Mehrzahl von Nucleinsäuresequenzen oder genetischen Alterationen in jeder Probe.
Die vorliegende Erfindung umfasst das gleichzeitige Screening einer großen Anzahl von potentiellen Polymeren in einer einzelnen Reaktion. In der Praxis wird die tatsächliche Anzahl von Polymeren, die für die gleichzeitige Hybridisierung gepoolt werden, gemäß den Diagnostikbedürfnissen bestimmt. Beispielsweise macht bei der Mukoviszidose (CF) eine bestimmte Mutation (Δ508) mehr als 70% der CF-Fälle aus. Eine Vorab-Hybridisierung mit einem gelabelten oder markierten Δ508-spezifischen Polymer gemäß der vorliegenden Verfahren, gefolgt von der Detektion des gebundenen Polymers, wird Δ508-Allele identifizieren und entfernen. Bei einer zweiten ("Phase 2") Hybridisierung wird eine große Anzahl von Polymeren, die andere und weniger häufige CF-Allele kodieren verwendet, gefolgt von der oben beschriebenen Trennung und Sequenzierung.
Bei anderen klinischen Situationen gibt es jedoch keine einzelne Mutation, die mit solch großer Häufigkeit wie die Δ508-Mutation bei CF vorkommt. Daher werden die Poole der Polymere nur durch die Anzahl von unabhängigen Hybridisierungen bestimmt, die bei einer Phase-2-Analyse einer Pool-Positiv-Probe benötigt würden.
Zusätzlich werden in der aktuellen klinischen Praxis verschiedene klinische Syndrome, wie z. B. Mukoviszidose, Thalassemia und die Gaucher-Krankheit unabhängig voneinander gescreent. Im Gegensatz dazu ermöglicht die vorliegende Erfindung das gleichzeitige Screening einer großen Anzahl von Nucleinsäureproben von verschiedenen Quellen, einschließlich verschiedenen Säugetieren, mit einer großen Anzahl von Polymeren, die komplementär zu Mutationen in mehr als einem potentiell krankheitsverursachenden Gen sind.
In gleicher Weise ermöglicht die vorliegende Erfindung ein gleichzeitiges Screening nach einer großen Anzahl von potentiellen fremdartigen Nucleinsäuren, wenn klinische Indikatoren die Infektion durch ein fremdes Agens oder einen fremdartigen Mikroorganismus nahelegen. Ferner können bestimmte Stränge, Varianten, Mutationen und Ähnliches von einem oder mehreren Mikroorganismen ebenfalls durch Verwendung von geeigneten Polymeren bei dem ersten Screening unterschieden werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen es ebenfalls, potentiell neue Mutations-Allele, die in der Nucleinsäure eines Patienten enthalten sind, oder einen eindringenden Mikro- Organismus zu bestimmen, indem zufällig permutierte Polymere in Phase 1 oder Phase 2 des Screening verwendet werden. Bei diesem Ausführungsbeispiel offenbart die Trennung der gebundenen Polymere, gefolgt von Sequenzierung, die genaue Mutations-Sequenz.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen, ohne diese jedoch einzuschränken.
Beispiel 1: Vorbereitung von Ziel-DNA
A) Vorbereitung von Proben-DNA aus Blut
Die gesamten Blutproben, die in Hoch-Glucose ACD Vacutainern (TM) genommen wurden, wurden zentrifugiert und die Leukozyten- und Thrombozytenschicht wurde gesammelt. Die weißen Blutkörperchen wurden mit zwei Waschungen gelöst, mit 10 : 1 Komponenten und Enzymen und Reagenzien, die für die Polymersequenzbestimmung erforderlich sind. – (v/v) Mischung von 14 mM NH₄Cl und 1 mM NaHCO₃, ihre Nucleine wurden wieder in Nuclein-Lysis-Puffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% SDS, 500 ug/ml proteinase K) suspendiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Proben wurden dann mit einem Viertel volumen gesättigter NaCl extrahiert und die DNA wurde in Ethanol abgeschieden. Die DNA wurde dann mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) gelöst.
B) Vorbereitung von Proben-DNA von buccalen Zellen
Die buccalen Zellen wurden mit einem sterilen zytologischen Pinsel (Scientific Products) oder einem (female) Dacron-Tupfer (Medical Packaging Corp.) gesammelt, indem der Pinsel oder Tupfer für 30 Sekunden an der inneren Wange gedreht wurde. Die DNA unmittelbar nach der Einlagerung bei Raumtemperatur oder bei 4°C wurde wie nachfolgend vorbereitet. Der Pinsel oder Tupfer wurde in 600 μl einer 50 mM NaOH eingetaucht, die in einer Polypropylen-Mikrozentrifugenröhre enthalten war und vortexiert. Die Röhre, weiter den Pinsel oder Abstrichtupfer enthaltend, wurde 5 Minuten auf 95°C erhitzt, wonach der Pinsel oder Tupfer vorsichtig entfernt wurde. Die Lösung mit der DNA wurde dann mit 60 μl 1 M Tris, pH 8.0, neutralisiert und wieder vortexiert (Mayall et al., J. Med. Genet. 27: 658, 1990). Die DNA wurde bei 4°C gelagert.
C) Verstärkung der Ziel-DNA vor der Hybridisierung
Die DNA von Patienten mit Mukoviszidose wurde durch PCR in einem Perkin-Elmer Cetus 9600 Thermocycler verstärkt. Fünf Primer-Sätze wurden verwendet, um gleichzeitig relevante Bereiche der Exons 4, 10, 20, und 21 des Mukoviszidose-Transmembran-Durchleitungsregulator-(CFTR)-Gens zu verstärken (Richards et al., Human Mol. Gen. 2: 159, 1993). Die 50 μl PCR-Reaktionsmischung enthielt die nachfolgenden Bestandteile: 0.2-1-μg CF-Patienten-DNA, 10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% (w/v) Gelatine, 200 μM jedes Desoxyribonncleotid-Triphosphats, 0.4 μM jedes Verstärkungs-Primers und 2.5 Einheiten von Taq-Polymerase. Eine anfängliche Denaturierung wurde durch Inkubation bei 94°C für 20 Sekunden durchgeführt, gefolgt von 28 Zyklen der Verstärkung, jeder bestehend aus 10 Sekunden bei 94°C, 10 Sekunden bei 55°C, 10 Sekunden bei 74°C und einem abschließenden Einweichen bei 74°C für 5 Minuten. Nach der Verstärkung wurden 8 μl der PCR-Produkte in einem 2% Agarose-Gel zur Überprüfung des Vorliegens aller fünf Produkte einer Elektrophorese unterzogen.
D) Binden der DNA an eine feste Matrix:
8 μl der verstärkten gemäß c) zubereiteten DNA-Lösung wurden zu 50 μl einer Denaturierungslösung (0.5 mM NaOH, 2.0 M NaCl, 25 mM EDTA) gegeben und auf Nylon-Membranfilter (INC Biotrans) getropft (gespottet). Die DNA wurde dann an den Membranen durch Heizen der Filter bei 80°C für 15 Minuten in Vakuum fixiert.
Beispiel 2: Hybridisierung mit allele-spezifischen Oligonucleotiden
Die in Tabelle 1 gezeigten Oligonucleotide stellen die bekannten Mukoviszidose (CF)-Allele dar.
Tabelle 1 Mutante ASO-Sequenzen
Normale ASO-Sequenzen
A) Hybridisierungen:
Die in Tabelle 1 aufgeführten Oligonucleotide wurden chemisch unter Verwendung eines automatischen Synthetisierers synthetisiert und mit ³²P mit Polynucleotid-Kinase unter Verwendung von technischen Standardverfahren radioaktiv markiert.
Die Hybridisierungen wurden in Plastiktaschen durchgeführt, die die im obigen Beispiel 1D vorbereiteten Filter enthielten, zu denen die gepoolten und radioaktiv markierten ASOs in einem TMAC-Hybridisierungspuffer (3.0 M TMAC, 0.6% SDS, 1 mM EDTA, 10 mM Natriumphosphat pH 6.8, 5X Denhardt's Lösung und 40 μg/ml Hefe-RNA) hinzμgefügt wurden. Die Konzentrationen der ASOs in den Pools reichten von 0.03 bis 0.15 pmol/ml Hybridisierungslösung.
Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 52°C unter Bewegung weiterlaufen gelassen. Die Membranen wurde dann aus den Taschen entfernt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer (3.0 TMAC, 0.6% SDS, 1 mM EDTA, 10 mM Natriumphosphat pH 6.8) gewaschen, gefolgt von einer zweiten Waschung in dem gleichen Puffer für 20 Minuten bei 52°C. Die Membranen wurden dann getrocknet und auf Kodak X-OMAT-Film belichtet.
B) Ergebnisse:
Die Spezifität der Hybridisierung unter Verwendung der in A) beschriebenen Bedingungen wurde durch Prüfen der verstärkten Proben von Individuen eines bekannten Genotyps mit 11 der oben beschriebenen ASOs (Tabelle 1) ausgewertet. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Jedes ASO hybridisierte spezifisch nur mit solchen Proben, die die komplementäre Mutationssequenz (in jedem Fall Bahn 1) trμgen und nicht mit Proben, die die Sequenz nicht enthielten (wie in den Bahnen 2 bis 6, welche die Wildtyp-"normal"-Sequenzen enthielten).
Wenn Poole von ASOs verwendet wurden, wurden die gleichen Ergebnisse beobachtet (2). Bei diesem Experiment wurden vier einzelne Hybridisierungen ausgeführt, welche die ASOs aus Tabelle 1 enthielten. In diesem Fall waren die in den Bahnen 1 bis 12, Reihen B und C aufgetropften (spotted) Proben für alle Mutationen negativ (die unteren drei Felder), jedoch für die Wildtyp/Δ508-Sequenz positiv (oberes Feld). Im Gegensatz dazu waren die in Bahn 6, Reihen D und E aufgebrachten Proben für die Δ508-Mutation positiv und für die Wildtyp-Sequenz negativ, was anzeigt, dass dieser Patient homozygot für das Δ508-Allel war. Entsprechend war die Probe in Bahn 4, Reihen D und E, Pool-1-positiv, während die Proben in den Bahnen 3 und 5, Reihen D und E, Pool-2-positiv waren. Aufeinanderfolgende einzelne Hybridisierungen der letztgenannten Proben mit jeder Probe in Pool 1 und Pool 2 verifizierten, dass die Pool-positiven Hybridisierungen tatsächlich durch Hybridisierung mit einem einzelnen Element des Pools stattfanden (3). Das heißt, dass gezeigt wurde, dass die Probe von Bahn 4, Reihen D und E aus 2, spezifisch mit dem R553X ASO hybridisiert, während die Proben in den Bahnen 3 und 5, D und E aus 2, spezifisch mit der R117H ASO hybridisierten.
Beispiel 3: Trennung von gebundenen ASOs
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Hybridisierung einer großen Anzahl von potentiellen Polymeren an die Patienten-DNA in einer einzelnen Hybridisierungsreaktion. Bei einem nachfolgenden Schritt werden die Polymere, die an die Ziel-DNA gebunden wurden, getrennt und identifiziert, mit oder ohne vorherige Verstärkung.
Pool-positive Proben von den gemäß Beispiel 2 durchgeführten Hybridisierungen werden wie folgt behandelt: Positive Spots werden unter Verwendung eines Standard-Einzelloch-Stanzers in der Form von Scheiben aus der Nylonmembran herausgeschnitten. Jede der ausgestanzten Membranscheiben wird dann in einer separaten 31.5 ml Mikrozentrifμgenröhre mit 100 μl sterilen Wassers eingebracht und die Röhren werden bei 100°C für 15 Minuten inkubiert (4).
Beispiel 4: Gestaltung von komplementären Oligonucleotiden zur Identifizierung von gebundenen ASOs
Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung kann die Sequenz der getrennten Polymere direkt unter Verwendung chemischer Sequenzierung bestimmt werden. Alternativ können die eluierten Polymere zusammen mit komplementären Oligonucleotiden verwendet werden, welche zusätzlich zu den zu den Polyme ren komplementären Sequenzen andere Sequenzen enthalten. In diesen Fällen dienen die eluierten Polymere als Primer, um Extensionsprodukte zu bilden, welche die zusätzlichen Sequenzen enthalten, und die Extensions-Produkte werden einer DNA-Sequenzierung unterzogen.
Nachfolgend sind mehrere Ausführungsbeispiele komplementärer Oligonucleotide angegeben, welche das Komplement der R334W CF mutationsspezifischen ASO (Tabelle 1) enthalten.
Version 1: Herausgewaschene ASO als Sequenzierungs-Primer
Bei diesen Ausführungsbeispiel wird die getrennte ASO mit dem komplementären Oligonucleotid in einer Sanger-Sequenzierungsreaktion inkubiert und die Sequenz wird direkt bestimmt.
Version 2: Zyklische Sequenzierung von herausgewaschener ASO
Bei diesem Ausführungsbeispiel dient die getrennte ASO als Primer für eine einzelne Extensions-Reaktion. Das Extensions-Produkt wird dann, unter Verwendung eines allgemeinen Primers, der zyklischen Sequenzierung unterzogen, um die Sequenzierungsreaktion zu primen (siehe unten stehendes Beispiel 5)
Version 3: Verstärkung von komplementären Oligonucleotiden für die Sanger-Sequenzierung
Bei diesem Ausführungsbeispiel dient die getrennte ASO als Primer für eine einzelne Extensions-Reaktion. Das Extensions-Produkt wird dann unter Verwendung der universalen Primer-Sequenz und der getrennten ASO als Verstärkungs-Primer verstärkt. Schließlich werden die Verstärkungsprodukte einer Sanger-Sequenzierung unter Verwendung eines dem Sequenzierungs-Ziel entsprechenden Oligonucleotids als Primer unterzogen (siehe untenstehendes Beispiel 6).
Beispiel 5: Zyklische Sequenzierung getrennter ASOs
A) Aufbaureaktion
Ein getrenntes mutationsspezifisches Oligonucleotid, bezeichnet als R334W und mit der Sequenz 5'TTCCAGAGGATGATTCC-3' SEQ-ID-Nr.: 65, wird zu einer Reaktionsmischung hinzμgefügt, welche die für einen einzelnen Durchgang der Extension erforderlichen Reaktionskomponenten enthält. Das komplementäre Oligonucleotid (Version 2 bei obenstehendem Beispiel 4) enthält eine universale Primer-Sequenz an seinem 5'-Ende, getrennt durch 25 bis 30 Basen von dem Komplement zu R334W an seinem 3'-Ende. Die Extensions-Reaktion enthält die nachfolgendenn Bestandteile:
25 μl getrennte ASO
5 μ 10X Puffer (0.5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol)
1 μl dNTPs (jeweils 2.5 mM)
1 μl komplementäre Oligonucleotide (100 ng/ml)
13 μl H₂O
1 μl Klenow-Fragment von DNA-Polymerase (10 U/μl)
Die Reaktion wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen gelassen.
B) Zyklische Sequenzierung:
Ein Aliquot der obigen Reaktion wird zu einer PCR-Reaktionsmischung mit zwei oder mehr Dideoyxnucleotid-Analoga (ddNTPs), gemäß dem nachfolgenden Protokoll hinzμgefügt:
10 μl Extensions-Produkte
5 μl 10X Puffer (300 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM MgCl₂, 300 mM KCl)
5 μl universaler Primer (1 pmole)
10 μl 2 mM ddATP, ddCTP, ddGTP; 100 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
19 μl H₂O
1 μl Taq-Polymerase (10 U/μl)
30 Verstärkungszyklen werden durchgeführt, wobei eine heterogene Population von zufällig terminierten Produkten erzeμgt-wird, die an Stellen terminieren, welche Nucleotiden abwärts von der universalen Primer-Sequenz entsprechen. Die Produkte der PCR-Reaktion werden dann in einem denaturisierenden Polyacrylamidgel getrennt, wobei ein Bandenmuster erzeμgt wird, das für diese ASO spezifisch ist. Das elektrophoretische Muster wird durch Autoradiographie oder Fluorimetrie untersucht.
Beispiel 6: Verstärkung und Sequenzierung von komplementären Oligonucleotiden
Ein getrenntes mutationsspezifisches Oligonucleotid, bezeichnet als R334W und mit der Sequenz 5'TTCCAGAGGATGATTCC-3', wird zu einer Reaktionsmischung hinzμgefügt, welche die Reaktionsbestandteile für die Extension nach Beispiel 5, Schritt A enthält. Das komplementäre Oligonucleotid (Version 3 aus dem obigen Beispiel 4) enthält eine universale Primer-Sequenz an seinem 5'-Ende, eine "Markierungs"-Sequenz, eine "Sequenzierungs-Ziel"-Sequenz gefolgt von dem Komplement zu R334W an seinem 3'-Ende. Nach der Extensions-Reaktion wird ein Aliquot der Reaktion zu einer Verstärkungsmischung mit den nachfolgenden Bestandteilen hinzμgefügt:
3 μl Extensions-Produkt
1 μl universaler Verstärkungs-Primer (10 μM)
2.5 μl dATP, dTTP, dCTP, dGTP (jeweils 2 mM) 2 μl 40 mM MgCl₂
5 μl 100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl
26.4 μl H₂O
0.1 μl Amphitaq-DNA-Polymerase (5 U/ml).
Die Reaktion wird dann unter Verwendung eines GeneAmp PCR-Systems 9600 Thermocyclers 35 Zyklen der Verstärkung ausgesetzt. 2 μl der Verstärkungsprodukte werden dann entfernt und einer Sanger-Sequenzierung unter Verwendung des Sanger-Sequenzierungs-Primers unterzogen.
Beispiel 7: Entsprechend RNA als Ziel-Nucleinsäure
Beispiel 1, welches DNA als Ziel-Nucleinsäure beschreibt, kann auch RNA als Zielnucleinsäure verwendet werden.
A) Vorbereitung von RNA aus Ziel-Zellen
Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und die überstehende Flüssigkeit wird entfernt. Das Zellen-Pellet wird in kaltem Lyse-Puffer (140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1.0 mM Tris-Cl, pH 8.5, 0.5% NP-40, und RNasin^® (Promega, Inc.) suspendiert. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugieren für 5 Minuten bei 4°C bei 5000 × g pelletisiert. Die überstehende Flüssigkeit wird in eine frische Röhre transferiert und die EDTA-Konzentration auf 10 mM gebracht. Proteine werden durch Extraktion mit Phenol Chloroform, gesättigt mit wässriger 10 mM Tris, pH 8.5, entfernt. Die wässrige Phase wird mit Natriumacetat, pH 5.2, und 2.5 Volumina eiskalten Ethanols ausgefällt und bei 10°C wird die RNA durch Zentrifugieren bei 10,000 × g bei 4°C für 30 Minuten gesammelt.
B) Umwandeln von RNA zu cDNA vor der Verstärkung
Die RNA kann unmittelbar in der Weise der vorliegenden Erfindung verwendet oder über ein umgekehrtes Transkriptions PCR-Protokoll zu verstärkter DNA umgewandelt werden. Gemäß diesem Protokoll wird 1 μg der RNA mit 100 pmol geeigneter Primer, 1 mM dNTPs, 1 U/μl RNasin^® in 20 μl PCR Puffer (50 mM KCl, 20 mM Tris, pH 8.4, 2.5 mM MgCl₂) und 200 U Revertase gemischt. Die Mischung wird bei 23°C für 10 Minuten inkubiert, dann bei 42°C für 45 Minuten, dann bei 95°C für 5 Minuten und dann rasch abgekühlt. Übliche PCR-Protokolle, ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen, können zur Verstärkung der resultierenden cDNA verwendet werden.

Claims

Ein Verfahren zum Screening von Nukleinsäureproben mit hohem Durchsatz, um (a) eine oder mehrere genetische Alteration(en) bei einer oder mehreren Zielsequenz(en); (b) eine oder mehrere Zielnukleinsäuresequenz(en); oder (c) zufällig permutierte Alterationen bei einer in den Proben enthaltenen Zielnukleinsäuresequenz zu identifizieren, umfassend die Schritte des: (i) Immobilisierens einer Mehrzahl der Nukleinsäureproben auf einem Träger; (ii) Bereitstellens einer Vielzahl von Purin und Pyrimidin enthaltende Polymere; (iii) im wesentlichen gleichzeitigen Hybridisierens der immobilisierten Proben mit der Vielzahl von Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren; (iv) Entfernens der Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere, die nicht mit den immobilisierten Proben hybridisieren; (v) Separierens der hybridisierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere aus den immobilisierten Proben; und (vi) Identifizierens der separierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere, wobei der Schritt des Identifizierens ein Bestimmen der Sequenz der separierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere umfaßt, und wobei die Identifikation der separierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere identifiziert: (a) die eine oder die mehreren genetische(n) Alteration(en); (b) die Zielnukleinsäuresequenz; bzw. (c) die zufällig permutierten Alterationen in der Zielnukleinsäuresequenz.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäureprobe aus einem Patienten gewonnen wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zielnukleinsäuresequenz eine Viren-, Bakterien-, Pilz- oder Protozonen-Nukleinsäuresequenz ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei bei dem Schritt des Bereitstellens die Vielzahl von Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren auf zumindest zwei Gruppen aufgeteilt-wird, wobei jede Gruppe eine ausreichende Anzahl von Polymeren aufweist, um eine Hybridisierung zu ermöglichen, und wobei bei dem Schritt des Hybridisierens Mitglieder einer jeden Gruppe von Polymeren zur im wesentlichen gleichen Zeit hybridisiert werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei bei dem Schritt des Immobilisierens der Träger ein Festphasenträger oder ein Halbfestphasenträger ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Alterationen Nukleinsäureeinfügungen, -löschungen oder -ersetzungen umfassen.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäureproben aus Menschen gewonnen werden, die an einer genetisch bedingten Krankheit leiden, wie beispielsweise Mukoviszidose, beta-Thalassemia, Tay-Sachs-Krankheit, Sichelzellenanämie oder Gaucher-Krankheit.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere etwa 16 bis 25 Nukleotide lang sind.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zielsequenz vor dem Schritt des Immobilisierens aus den Nukleinsäureproben amplifiziert wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 9, wobei die amplifizierte Sequenz etwa 80 bp bis 30 kbp Nukleotide lang ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 5 oder einem der Ansprüche 6 bis 10, soweit diese von Anspruch 5 abhängig sind, wobei der Festphasenträger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nitrozellulosefilter, Nylonfilter, Glasperlen und Kunststoff.
Ein Verfahren nach Anspruch 5 oder einem der Ansprüche 6 bis 10, soweit diese von Anspruch 5 abhängig sind, wobei der Halbfestphasenträger ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Polymergel und Agarose.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei bei dem Schritt des Bereitstellens die Purine und Pyrimidine enthaltenden Polymere von gleicher Länge sind und der Schritt des Hybridisierens in Gegenwart einer wirksamen Konzentration eines Mittels durchgeführt wird, das bei den Schmelztemperaturen von Hybriden vorhandene Unterschiede zwischen den Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymeren und den Nukleinsäuren beseitigt.
Ein Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Mittel ein quaternäres Ammoniumsalz ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 14, wobei das quaternäre Ammoniumsalz Tetramethylammoniumchlorid ist.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Nukleinsäureproben aus mehr als einem Säugetier gewonnen werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Sequenz durch chemisches Sequenzieren bestimmt wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Schritt des Identifizierens umfaßt: (a) In-Kontakt-Bringen der separierten Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere mit einer Vielzahl von komplementären Oligonukleotiden, die (i) zu den separierten Polymeren komplementäre Sequenzen und (ii) zusätzliche vorgegebene colineare Sequenzen einschließen; (b) Durchführen einer enzymatischen Sequenzierung, wobei die separierten Polymere als Primer und die komplementären Oligonukleotide als Template für die enzymatische Sequenzierung dienen; (c) Identifizieren der vorgegebenen colinearen Sequenzen als ein Indikator für das Vorhandensein der separierten Polymere.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Schritt des Identifizierens umfaßt: (a) In-Kontakt-Bringen der separierten Purin und Pyridin enthaltenden Polymere mit einer Vielzahl von komplementären Oligonukleotiden, die (i) zu den separierten Polymeren komplementäre Sequenzen und (ii) zusätzliche vorgegebene colineare Sequenzen einschließen; (b) Durchführen einer einzelnen Extensionsreaktion, wobei die separierten Polymere als Primer und die komplementären Oligonukleotide als Template für die Extensionsreaktion dienen; (c) Durchführen einer enzymatischen Sequenzierung der Produkte der Extensionsreaktion; und (d) Identifizieren der vorgegebenen colinearen Sequenzen als ein Indikator für das Vorhandensein der separierten Polymere.