BR112013017096A2

BR112013017096A2 - composição e métodos de indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em animal tendo tumor, de geração de anticorpos in vivo, de inibição do crescimento ou morte de célula de câncer, para tratar indivíduo com câncer, para adaptar de terapia de câncer para indivíduo com câncer e para identificar antígeno específico de tumor

Info

Publication number: BR112013017096A2
Application number: BR112013017096-4A
Authority: BR
Inventors: David Kirn; John Bell; Caroline Breitbach; Anne Moon; Tae-Ho Hwang; Yu Kyoung Lee; Mi-Kyung Kim
Original assignee: Jennerex Inc.; Sillajen, Inc.
Priority date: 2011-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2020-09-01
Also published as: CA2824277A1; EP2661278B1; CN103429258B; CA2824277C; KR101942237B1; KR20140032991A; AU2012204467B2; WO2012094386A9; US10434169B2; HK1191874A1; CN103429258A; JP6457003B2; US20150037355A1; EP2661278A4; JP2014502970A; WO2012094386A1; US9919047B2; EP2661278A1; US20180214538A1; JP2017165734A

Abstract

  COMPOSIÇÃO E MÉTODOS DE INDUÇÃO DE RESPOSTA CITOTÓXICA DEPENDENTE DE COMPLEMENTO MEDIADO POR ANTICORPO ESPECÍFICO DE TUMOR EM ANIMAL TENDO TUMOR, DE GERAÇÃO DE ANTICORPOS IN VIVO, DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO OU MORTE DE CÉLULA DE CÂNCER, PARA TRATAR INDIVÍDUO COM CÂNCER, PARA ADAPTAR DE TERAPIA DE CÂNCER PARA INDIVÍDUO COM CÂNCER E PARA IDENTIFICAR ANTÍGENO ESPECÍFICO DE TUMOR A presente invenção refere-se a métodos e composições para uso da indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em animal tendo um tumor, compreendendo administrar ao referido animal uma composição compreendendo um vírus oncolítico competente de replicação, sendo que a administração da composição induz no animal a produção de anticorpos que medeiam uma resposta de CDC específica para o referido tumor.

Description

"Composição e Métodos de Indução de Resposta Citotóxica Dependente de Complemento Mediado por Anticorpo Específico de Tumor em Animal Tendo Tumor, de Geração de Anticorpos in Wuo, de Inibição do Crescimento ou Morte de Célula de Câncer, Para Tratar Indivíduo Com Câncer, Para Adaptar de Terapia de Câncer Para Indivíduo com Câncer e Para Identificar Antígeno Especifico de Tumor" Relatório Descritivo

PEDIDOS RELACIONADOS [OOOl] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 61/429.622, que foi depositado em 4 de janeiro de 2011 e está incorporado aqui por referência em sua totalidade.

DESENVOLVIMENTO OU PESQUISA PATROCINADA FEDERALMENTE

[0002] Nenhum

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se refere a novos mecanismos de ação para intervenção de terapia de cãncer, e métodos e composições desenvolvidos para terapias de câncer que dependem de tais novos mecanismos de ação.

%

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Novas terapias de câncer com novos mecanismos de ação (MOA) são necessários. As terapias atuais geralmente têm eficácia limitada quando usadas como agentes únicos, assim, na prática, são usadas em 5 combinação para efeito máximo. Novos agentes devem idealmente não ter resistência cruzada com terapias aprovadas, e devem ter múltiplos MOA1-4 complementares. Os vírus construídos foram desenvolvidos para o tratamento de câncer usando diferentes metodologias, incluindo '"terapia de gene" (transferência de transgene terapêutica em um vírus 10 incompetente de replicação)5-7 e vacinas de cãncer (expressão de antígenos de tumor, moléculas co-estimuladoras e/ou citocinas)8-l0, Entretanto, a terapia de gene falhou até agora em pacientes devido a liberação ineficiente para números suficientes de células de câncer localmente e sistemicamente. Em contraste, as vacinas de câncer com 15 base em virus foram limitadas por evasão imune de tumor e dependência exclusiva de fatores hospedeiros quanto à eficá.cia em pacientes com cânceres volumosos avançados. A evasão imune é mais provável com metodologias de vacina que dependem da expressão de um único antígeno de tumor e/ou uma única citocina. As vacinas 20 contra cãncer terapêuticas de base ampla são necessárias para expressar múltiplos antígenos de tumor, citocinas, ativação e recrutamento de célula imune, e sinais de perigo da resposta imune.

[0005] Em contraste, os virus oncolíticos foram desenvolvidos para aproveitar a vantagem da capacidade natural dos vims de infectar, 25 multiplicar dentro e subsequentemente lisar as células de câncerl.l-14. Os vírus oncoliticos de primeira geração foram inerentemente seletivos de câncer (por exemplo, reovírusl5-16, VSV17-l8) ao passo que agentes de segunda geração foram construídos para seletividade de câncer (por exemplo, mutantes de deleção de adenovirus19"20 e vírus de herpes

" m 3/59 n simples2I-22). Os dados de experiência clinica com esses agentes demonstraram segurança e seletividade de câncer, porém, a potência terapêutica foi limitada tanto após a injeção intravenosa quanto intratumoral direta23; a dispersão sistêmica e/ou a liberação 5 reproduzível para tumores distantes foram limitadas, entretanto. A potência anticâncer sistêmica e a liberação originada do sangue para tumores metastáticos, portanto, tiveram que ser melhoradas.

[0006] Determinado tanto o potencial quanto as limitações com cada dessas três metodologias com base em virus individual, nós 10 perguntamos se foi possível combinar e otimizar os melhores atributos de cada em um único agente terapêutico. O poxvirus oncolítico ramificado e alvejado tem o potencial de fazê-lo. JX-594 é um terapêutico de poxvirus oncolitico de ¥ geração designado para ter três MOA complementares incluindo: 1) oncólise mediada por replicação 15 direta, e 2) vacinação de câncer ativa. JX-594 é um oncolitico do virus da vacínia derivado de vacínia Wyeth com o rompimento do gene de timidina cinase viral e expressão do fator de estimulação de colônia de granulócito-monócito humano (hGM-CSF) e transgenes de B- galactosidase sob controle dos promotores p7.5 e de inicio tardio 20 sintéticos, respectivamente24. A vacínia foi usada como o esqueleto do vírus por causa de sua estabilidade no sangue para liberação pelo sangue aos tumores25, JX-594 é designado induzir a vacinação contra câncer através de lise de célula de câncer simultânea e liberação de antígeno de tumor endógeno, expressão de hGM-CSF para suportar a 25 ativação de célula de apresentação de antígeno, recrutamento de células efetoras imunes e indução de citocina proinflamatória. A depuração da vacínia propriamente dita é principalmente através da depuração da célula infectada através de mecanismos imunes mediados por célula.

[0007] Os inventores agora descobriram um novo método de tratamento

¥ de câncer usando vírus oncolíticos para atender à necessidade na técnica de novas terapias de câncer.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [OOOB] A presente invenção se refere aos métodos e composições para 5 uso na indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo especifico de tumor em um animal tendo um tumor compreendendo administrar ao animal uma composição compreendendo um virus oncolítico competente de replicação sendo que a administração da composição induz a produção animal de anticorpos lO que mediam uma resposta de CDC específica ao tumor.

[0009] Em modalidades específicas, a invenção fornece métodos de indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em um animal tendo um tumor compreendendo administrar ao animal uma composição 15 compreendendo um virus oncolitico competente de replicação sendo que a administração da composição induz anticorpos no animal que media uma resposta de CDC específíca ao tumor. Mais particularmente, a administração do vírus oncolítico não induz a resposta de CDC em um animal que não tenha um tumor.

20 [OOlO] O vírus oncolítico pode ser qualquer vírus oncolitico. Os exemplos de tais vírus podem ser selecionados do grupo consistindo em um poxvirus, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus de herpes simples, vírus da doença de Newcastle, virus de estomatite vesicular, vírus da caxumba, vírus da influenza, Parvovírus, vírus do sarampo, 25 hantavírus humano, vírus mixoma, citomegalovírus (CMV), lentivírus, Coxsackievírus, Echovirus, Vírus Seneca Valley e Vírus Sindbis. Em modalidades especificas, o vírus oncolítico é um poxvírus oncoiitico. Os exemplos específicos de víms oncolíticos que podem ser usados incluem, por exemplo, víms da vacinia mutado expressando GM-CSF, vírus expressando p53, virus de estomatite vesicular (VSV), ONYX-15, Delta24, adenovírus mutado na região VAl, víms da vacinia mutado na região K3L ou E3L, Telomelisina, Telomelisina-GFP, parapoxvírus de víms mutado no gene OV20.OL, Geneiuxvírus, e virus da herpes mutado no gene gama (1)34.5. Em uma modalidade exemplifícativa especifica, o poxvírus oncolítico é JX-594. O vírus oncolítico pode compreender terapêutico ou outro transgene. Por exemplo, o transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica GM- io CSF, ou outra citocina, quimiocina, gene marcador e/ ou de imageamento, gene suicida, genes de enzima de profármaco carboxil esterase e citosina deaminase, gene supressor de tumor e similares.

[0011] O t'umor contra o qual os anticorpos são criados pode ser qualquer tumor, incluindo, porém, sem limitação, um tumor selecionado do grupo consistindo em astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosqarcoIna, neuroblastoma, adenoma pituitário, meduloblas- toma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, carcinoma de próstata, carcinoma de célula renal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de colo, câncer gástrico, câncer da bexiga, cãncer do íígado, câncer ósseo, cãncer retal, câncer ovariano, sarcoma, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer cervical, fíbrossarcoma, carcinoma de célula escamosa, neurectodermal, tumor da tiróide, Linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, hepatoma, mesotelioma, carcinoma epidermóide, e doenças tumorigênicas do sangue.

[0012] Também incluído é um método de geração de anticorpos in ÜiÜo que mediam uma resposta cle CDC anti-tumor compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo um vÍi113 oncolítico competente d.e replicaç"to sendo que a administração da composição induz anticorpos que medeiam uma resposta de CDC específica ao tumor. O método pode também compreender colher sangue do individuo após a administração e isolar anticorpos de produção de resposta de CDC do sangue.

[0013] Também é contemplada uma composição que compreende anticorpos de produção de resposta de CDC isolados do sangue de um indivíduo que foi tratado com um virus oncolítico competente de replicação em uma quantidade e de modo eficaz para induzir anticorpos que mediam uma resposta de resposta de CDC específica a um tumor.

Em modalidades específicas, a composição é soro coletado do indivíduo.

[0014] Também contemplado é um método para inibir o crescimento de ou morte de uma célula de cãncer compreendendo contatar a célula de cãncer com uma composição da invenção. Em modalidades específicas, o contato compreende contatar as células de cãncer in Uitro com a composiç.ão. Em outras modalidades, o contato compreende infundir um individuo tendo câncer com uma composição compreendendo anticorpos colhidos, células B coIhidas, anticorpos produzidos pelas células B colhidas ou uma combinação dos mesmos. Nos métodos de tratamento da invenção, a célula de câncer pode ser in Úit'o em um individuo e o contato compreendendo administrar um medicamento compreendendo a composição. Em modalidades adicionais, os métodos de tratamento pode também compreender a administração ao indivíduo um agente terapêutico anticâncer adicional.

[0015] A invenção também compreende métodos para tratar um indivíduo com câncer compreendendo administrar ao indivíduo a com- posição compreendendo uma composição da invenção que compreende anticorpos de produção de resposta de CDC isolado do sangue de um indivíduo que foi tratado com um vírus oncolítico competente de replicação em uma quantidade e maneira eficaz para induzir anticQrRQ$ que mediam a resposta de CDC específica a um tumor. Em algumas modalidades, a composição é autóloga ao paciente e é isolada do paciente com câncer e novamente infundida no paciente com câncer. Em outras modalidades, a composição que é heteróloga ao paciente com cãncer é isolada de um paciente com câncer que é diferente do paciente com câncer sendo tratado com a composição. Em qualquer dos casos, o indivíduo pode ser tratado com um agente terapêutico anticâncer adicional.

[0016] Nos métodos de tratamento da invenção, o indivíduo com cãncer pode ter um tumor sólido e a composição é administrada intratumoral, intravenosa, intraperitonealmente ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, o indivíduo com cãncer tem um tumor sólido que é excisado antes, concorrentemente ou subsequente à administração da composição da invenção. Em algumas modalidades, o indivíduo com cãncer tem um tumor sólido e a composição reduz o tamanho do tumor. Em outras modalidades, o indivíduo com câncer tem um tumor sólido e a administração reduz a dispersão metastática do tumor sólido. Nos métodos de tratamento, o cãncer pode ser selecionado do grupo consistindo em astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrossarcoma, neuroblastoma, adenoma pituitário, meduloblasto- ma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, carcinoma de próstata, carcinoma de célúla renal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de colo, câncer gástrico, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer ósseo, câncer retal, cãncer ovariano, sarcoma, cãncer gástrico, cãncer esofágico, cãncer cervical, fibrossarcoma, carcinoma de célula escamosa, neurectodermal, tumor da tiróide, Linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, hepatoma, mesotelioma, carcinoma epidermóide, e doenças tumorigênicas do sangue.

[0017] A invenção também fornece um ensinamento de métodos para adaptar uma terapia de câncer a um indivíduo tendo câncer compreen- dendo: a) administrar ao indivíduo uma composição compreendendo um vírus oncolítico competente de replicação sendo que administração da composição induz no indivíduo a produção de anticorpos que mediam uma resposta de CDC específica ao câncer no indivíduo; b) isolar o sangue do indivíduo sendo que o sangue compreende anticorpos colhidos, células B colhidas contra o câncer; c) expandir ou isolar os anticorpos ou produzir anticorpos das células B; para produzir uma composição de imun.oterapia especifíca para o individuo e d) administrar o indivíduo com a composição de imunoterapia da etapa (C). Em tais métodos, a composição de imunoterapia pode ser administrada imediatamente ao isolar os anticorpos. Altemativamente, a composição de imunoterapia é armazenada para tratamento terapêutico adicional do indivíduo.

{0018] Um aspecto adicional da invenção se refere a um método para identificar um antígeno especifico de tumor cornpreendendo clonar uma biblioteca de CDNA preparada de uma célula de cãncer em u.m vetor de expressão; realizar uma imunoavaliação primária contatando-se o vetor de expressão com soro de um indivíduo que foi tratado com aquele que foi tratado com um vírus oncolítico competente de replicação em uma quantidade e maneira eficaz para induzir anticorpos que mediam a resposta de CDC específica a um tumor sendo que o soro é isolado do indivíduo após a administração do vírus oncolítico e geração da resposta especifica de CDC; e isolar os antigenos da biblioteca de cDNA aw que são reconhecidos pelo soro.

BREVE DESCRIÇÃO DE VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS

[0019] Para um entendimento mais completo da presente invenção, referência agora é feita às seguintes descrições tomadas em conjunto com os seguintes desenhos acompanhantes.

[0020] Figura 1: Efeito do soro de JX-594 injetado em coelho portador de tumor VX2. O soro foi coletado em valor de referência, 3 semanas e 6 semanas após o tratamento de JX-594 ou PBS. VX2 foi isolado de tecidos VX2 enzimaticamente e mantido in Uitro com meio de Eagle modificado de Dulbecoo (DMEM) com 0°/0 de FBS durante 8 passagens. Figura IA, Morte de célula de tumor VX2 isolada, porém, não de PBMC de coelho por JX-594 injetado, porém, não por soro injetado de PBS em coelho portador de VX2, porém, não em coelho normal. 3°/0 de Soro obtido de JX594 injetado em (coelho normal vs. portador de VX2) ou PBS injetado em coelho portador de VX2 foram tratados (cada animal (n=3 para cada condição, triplicatos de cada amostra de soro significando a reação NO.=9 para cada) em células VX2 isoladas ou PBMC de coelho. Figura 2B, efeito antitumoral dependente do tempo de soro contra células de VX2 isoladas após injeção de JX-594 em coelho portador de VX2. JX-594 {1O9pfu para cada coelho) foi injetado no dia 0 e dia 7 e o soro foi em série obtido em cada ponto. Figura 2C, Efeito antitumoral dependente da dose de soro contra células VX2 isoladas após injeção de JX-594 em coelho portador de VX2. Figura 2D, manchamento do Oeste de soro injetado de JX-594.

[0021] Figura 2A. Microscopia confocal representativa de linhagem celular de RCC SNU349 humana após tratamento de soro humano injetado de JX-594 (no dia 92 após quatro ciclos de injeção de JX-594 em paciente de carcinoma celular renal #301), a, d - antes da adição de soro (5°6); b, e -10 min após a adição de soro (5%), c, f - 30 min após a adição de soro (5%) (não fluorescente em 30 minutos, não exibido); g _ ampliada da área amarela ern a, h - visão ampliada da área verme'lha em b (observar a lise celular através formação de ataque de Membrana (MAF) que é típico do efeito CDC; setas vermelhas).

[0022] Figura 2B. Alteração na viabilidade celular de diferentes tipos de linhagens de célula de carcinoma celular renal humana (RCC) após 5% de soro obtido de paciente de RCC #301 (no dia 92 após quatro ciclos de injeção de JX-594). Asterisco indica cada injeção de JX-594.

[0023] Figura 2C. Alteração na viabilidade celular de diferentes tipos de linhagens de célula de câncer de pulmão após 5% de soro obtida de paciente de câncer pulmonar #103 (no dia 92 após quatro ciclos de injeção de JX-594). O asterisco indica cada injeção de JX-594.

[0024] Figura 3. Evidência para a geração de citólise de célula de câ-ncer dependente de complemento mediado por anticorpo após tratamento múltiplo de JX-594 em pacientes de tumor sólido refratários ao tratamento. A. Diagrama para mostrar diferentes tipos de soro do mesmo paciente, (a) Soro sem tratamento prévio de linha de base antes do tratamento com JX-594 (designado como um soro A); (b) Soro obtido no dia 92 pós tratamento JX-S94 (designado como soro B); (c) soro B foi tratado a 56°C durante 30 minutos para inativação térmica do complemento (designado como soro C); (d) 50% de soro A foi adicionado em 50% de soro C (designado como soro D). Figura 3B o soro foi tratado por coluna de resina de remoção de Ig (ProreoExtract®Albumin/lg Kit, Calbiochem) (designado como soro E).

[0025] Figura 3C. Microscopia óptica representativa de linhagem de célula de cãncer huínana após tratamento de soro B, C ou D (5% para cada). Fotomicroscopia foi tomada em 4 horas pós tratamento de soro

B, C ou D obtido de paciente de RCC #301 em linhagem celular de RCC SNU349.

[0026] Figura 3D. Efeito da duração de tratamento térmico em perda de capacidade de morte de célula de câncer, (a) Após a adição do mesmo volume de soro sem tratamento prévio (soro A) em soro C termicamente inativo, esta mistura de soro foi adicionada em células A2790 ou SNU349 cultivadas. O efeito de morte de soro foi significativamente recuperado sugerindo a adição de complemento em soro B contendo anticorpo específico de câncer. Em CDC, o complexo de antígen.o-anticorpo é o ativador principal de complemento. O anticorpo determina a especificidade alvo ao mesmo tempo em que a ativação de complemento induz a lise celular através da formação de complexo de ataque de membrana (MAC), (b) Finalmente soro B foi eluído por coluna de remoção de IgG (ProreoExtract®Albumin/lg Kit, Calbiochem) que causou a perda de atividade de morte sugerindo que IgG pode ser critico para CDC.

[0027] Figura 4. Perfil de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) para pacientes tratados com JX-594 selecionados em diferentes tipos de linhagens de célula de câncer humana. A atividade de CDC foi exibida como relação reversa de viabilidade celular em 5°/, de soro (amostras de arquivamento do dia 42-92 e dia 56 pós tratamento com JX-594 para os pacientes da fase 1 e para pacientes da fase 2 foram usadas) para em 5°/0 de soro sem tratamento prévio de valor de referência de cada paciente, a-d. O perfil da atividade de CDC em diferentes linhagens de célula de câncer humana e linhagens de célula normal por soro de pacientes de RCC #301 tratado com JX-594 (a), melanoma #304 (b), HCC #1702 (C), e HCC # 705 (d).

[0028] Figura 5. Análise total de atividade de CDC após tratamento com JX-594 em pacientes inscritos na Fase 1 (massa hepática metastá-

tica e primária) e experiência clínica de JX-594 de Fase 2 (carcinoma Hepatocelúlar). Figura 5A. Pacientes da Fase 1: Sobrevivência vs. reverso da atividade de CDC em células A2780. Figura 5B. Alteração de CDC dependente do tempo de pacientes da Fase 2 (n=18) em diferentes linhagens de célula HCC. Figura 5C - 5E. Perfil de CDC de soro de pacientes respondedores a CDC em diferentes linhagens de célula de HCC humana SUN739 (C), SNU475 (D) ou SNU449 (E). Respondedor foi designado <80% de viabilidade de célula no Dia 56 pós tratamento com JX-594.

[0029] Figura 6. Manchamento do oeste de soro humano obtido de pacientes injetados com JX-594.

[0030] Figura 7. Sinergismo de sorafenib e sunitib in uitro e in ÚiÜo com soro injetado com JX-594.

[0031] Figura 8. Avaliação do Método para Serex.

[0032] Figura 9. Efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e reovírus na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC. Esta figura mostra o °/) de viabilidade celular de A2780 quando comparado com o controle de pré-tratam.ento seguinte 3 horas de incubação com as concentrações de soro indicadas. O soro coletado de coelhos portadores de tumor VX2 tratados intravenosamente com as intervenções indicadas.

[0033] Figura 10. Efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e VSV na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer humano. Esta figura mostra o °/) de viabilidade de célula A2780 quando comparado com o controle de pré-tratamento seguinte às 3 horas de incubação com as concentrações de soro indicadas. O soro coletado de coelhos portadores de tumor VX2 tratados intravenosamen-

13,(59 te com as interven'ções indic'ad'as.

[0034] Figura 11. Efeitos de HSV oncolitico e VSV-GM-CSF na indução de anticorpos especificos de tumor mediando CDC em células de câncer humano. Esta figura mostra °/0 de viabilidade celular de A2780 quando comparado com o controle de pré-tratamento seguinte às 3 horas de incubação com as concentrações d soro indicadas. O soro coletado de coelhos portadores de tumor VX2 tratados intravenosamente com as intervenções indicadas.

[0035] Figura 12. Efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e VSV na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer de coelho derivadas do tumor alvo in ÚiÜo. Esta figura mostra o °/) de viabilidade celular de VX2 quando comparada com o controle de pré-tratamento seguinte às 24 horas de incubação com 3°6 de soro pós- tratamento reforçado com 7°/0 de soro coletado antes da implantação de VX2. O soro coletado de coelhos portadores de tumor VX2 tratados intravenosamente com os vírus oncolíticos é indicado no eixo x.

[0036] Figura 13. Vacínia oncolitica e expressão de GM-CSF de murino mediam a indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em um modelo de tumor de murino. Esta figura mostra o °/) de viabilidade celular A2780 quando comparada com o controle de pré- tratamento seguinte às 24 horas de incubação com 5°/0 de soro pós- tratamento. O soro coletado de camundongos portadores de tumor CT26 tratados intravenosamente com os vírus oncolíticos é indicado no eixo x.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] Os vírus oncolíticos causam citólise de câncer dependente de replicação viral como seu mecanismo primário de ação, contudo, a

14j59 indução de imunidade específica de câncer pode ser um mediador de eficácia principal em modelos pré-clínicos também. Entretanto, a indução de imunidade anticâncer funcional não tem sido demonstrada em pacientes com cãncer até hoje. JX-594 é um vírus de vacínia oncolitica alvejado construído para expressar o fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago humano (GM-CSF) para aumentar a indução de imunidade anticãncer. JX-594 demonstrou a replicação e expressão de GM-CSF, associados com as respostas de tumor em pacientes em experiências clínicas.

[0038] Na presente invenção, os inventores descobriram que a indução mediada por JX-594 de imunidade anti-tumoral, funcional, tanto em coelhos quanto subsequentemente em pacientes com tumores hepáticos metastáticos ou primários. A c'itotoxicidade de célula de câncer (CDC) dependente de complemento mediado por anticorpo foi induzida por tratamento de JX-594 em coelhos e pacientes com disposição diversificada de tipos de tumor em uma experiência de Fase 1. A indução de CDC foi subsequentemente confirmada em pacientes em uma experiência da Fase 2 em carcinoma hepatoceluar. CDC significante esteve ainda e'vidente mesmo em 1-5% de soro em muitos casos. As respostas CDC foram mais comuns contra as linhagens de célula de tumor da mesrna histologia como aquela do paciente. As células normais foram resistentes aos efeitos de CDC. Os pacientes com a duração de sobrevivência mais longa tiveram a atividade de CDC superior. Para nosso con.hecimento, isto é a primeira prova de 1) indução de imunidade anticâncer funcional por um vírus oncolitico em pacientes, 2) indução de CDC por um virus terapêutico em pacientes com câncer, e 3) da capacidade de um produto de vacinar pacientes com uma disposição diversificada de tipos de turrior e sem depender da expressão de um antígeno alvo definido.

[0039] Além disso, os inventores realizaram uma avaliação SEREX que foi realizada para identificar os antígenos alvos reconhecidos por anticorpos policlonais induzidos por tratamento de JX-594. Além disso, para direcionar um efeito citolítico, o tratamento de JX-594 resulta na indução de antico'rpos de alvejamento de cãncer sistêmico funcional e CDC em pacientes de tumor sólido. Além disso, o tratamento com JX- 594 pode ser usado como um método para identificar antígenos de tumor relevantes em pacientes com vários tipos de câncer.

[0040] Para também descrever brevemente as constatções nas quais a io presente invenção é baseada, os inventores apuraram que, na experiência clínica da Fase 1 em pacientes com tumores do fígado refratários ao tratamento, JX-594 demonstrou replicação específica de cãncer, expressão de GM-CSF, estimulação de glóbulos brancos (neutrófilos, eosinófilos e monóci.tos) e respostas de câncer objetivas após injeções intratumorais (2-8 total, a cada três semanas); infecção e eficácia contra tumores não injetados foram também demonstrados26, Uma experiência de Fase 2 foi iniciada para avaliar três injeções intratumorais quinzenalmente em pacientes com carcinoma hepatocelular (HCC); atividade anti-tumoral preliminar também foi observada na experiência de Fase 2. A segurança tem sido aceitável até hoje, com sintomas da gripe transitórios sendo os efeitos colaterais mais comuns. Um mutante de deleção de HSV expressando hGM- CSF2'demonstrou respostas de tumor a melanoma em uma experiência clínica de Fase 2.

[0041] Ao mesmo tempo em que a replicação de vírus e a expressão de transgene foram reproduzivelmente demonstradas ern experiências clínicas, a indução de imunidade anticâncer sistêmica estásomente começando a ser investigada28. Entretanto, os mecanismos imunes diretamente funcionais não foram demonstrados. A utilidade de JX-594 e outros vírus imunoestimuladores e o desígnio de futuros produtos oncolíticos, seriam melhorados dramaticamente se as respostas imunes anticâncer em pacientes tratados pudessem ser elucidadas. Os inventores, portanto, procuram avaliar a imunidade anticãncer durante e após a terapia de JX-594.

[0042] Os inventores adicionalmente avaliaram a indução de imunidade em modelos pré-clínicos e subsequentemente em pacientes com tumores do fígado em ambas as experiências de Fase 1 e 2. As amostras de soro do arquivo obtidas em valor de referência e eom o passar do tempo seguinte á terapia de JX-594 estavam disponíveis para avaliação. A citotoxicidade dependente de complemento (CDC) rnediada por anticorpo é um potente mecanismo de morte de célula30 e atividade de CDC contra as linhagens de célula de tumor é uma medição direta de imunidade anticãncer sistêmica funcional. Os inventores também avaliaram o impacto de JX-594 na indução CDC mediado por anticorpo no sangue do paciente contra um painel de linhagens de célula de tumor de diferentes histologias com o passar do tempo. A data apresentada aqui fornece a primeira demonstração clara de 1) indução de imunidade anticãncer funcional por um vírus oncolítico nos pacientes, 2) indução de CDC por um vírus terapêutico em pacientes com câncer, e 3) da capacidade de um produto vacinar pacientes com uma disposição diversificada de tipos de tumor e sem depender da expressão de um antígeno alvo definido.

[0043] Esta invenção é corn base na descoberta que os vírus oncolíticos podem produzir uma resposta CDC específica de tumor mediada por anticorpo. Em modalidades específicas, é contemplado que os virus oncolíticos recombinantes tendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos imunomoduladores, tais como polipeptídeos que atenuam a resposta imune inata ou resposta inflamatória.

[0044] Em estudos específicos realizados com vírus oncolíticos, os inventores demonstraram que a replicação de víms é importante na indução de anticorpos anti-tumor mediando CDC. Numerosos experiinentos (veja, Figuras 9- 13, por exemplo) demonstraram a falta de indução de CDC em soro coletado de animais tratados com vírus de controle inativado por UV. Dos vários virus oncolíticos usados, foi observado que o virus da vacinia é melhor de induzir os anticorpos anti- tumor mediando CDC, entretanto HSV e VSV também são eficazes.

Especificamente, HSV em seguida VSV têm um fenótipo intermediário, porém, reovírus não foi mostrado ser capaz de induzir CDC nos modelos testados.

[0045] Com base na biologia de vírus, níveis diferentes de resposta de CDC podem ser observados; e a partir das observações dos dados, pode ser postulado que (envelopado) os virus de dsDNA são mais potentes na indução de anticorpos anti-tumor que mediam CDC.

[0046] Além disso, os estudos mostraram que a expressão de GM-CSF de vírus oncolíticos pode potencializar a capacidade do vírus de induzir anticorpos anti-tumor mediando CDC. Esses estudos mostram em princípio que as citocinas imunoestimuladoras, das quais GM-CSF pode ser usado como um exemplo, expressas em replicação oncolítica de vírus oncolítico podem ser usadas para aumentar a capacidade de tais víms oncolíticos induzir os anticorpos anti-tumor mediando CDC.

[0047] O vírus oncolítico pode ser selecionado do grupo consistindo em vírus de estomatite vesicular (VSV), vírus da doença de Newcastle (NDV), retrovíms, vírus do sarampo, vírus Sinbis, virus da iníluenza, vírus de herpes simples, vírus da vacínia, e adenovíms, ou similares, ou um variante recombinante do mesmo. Os vírus oncoliticos exemplificativos que podem ser úteis incluem vírus oncolitico selecionado do grupo consistindo em JX-594, vírus expressando p53, reovírus, vírus de estomatite vesicular (VSV), ONYX- lS, Delta24, adenovírus mutado na região VAl, virus da vacínia mutado na região K3L ou E3L, Telomelisina, Telomelisina-GFP, parapoxvíms de víms mutado no gene OV20.OL, e vírus da herpes mutado no gene d 34.5. Em modalidades exemplificativas específicas o vírus oncolítico é JX-

594.

[0048] A sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser qualquer proteína terapêutica que deve ser liberada pelo virus oncolítico.

[0049] Em ainda outra modalidade, o vírus oncolítico recombinante também compreende um ou mais sítios de entrada de ribossomo intcrno viral heterólogo (IRES) que são neuronalmente silenciosos e operavelmente ligados a pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptideo de virus oncolitico necessário para expressão, replicação ou propagação de gene de vírus, tal como uma polimerase (por exemplo, DNA polimerase ou RNA polimerase dependente de RNA viral); uma proteína estrutural (por exemplo, proteína de nucleocapsídeo, fosfoproteína, ou proteína matriz); ou uma glicoproteina (por exemplo, proteína envelope). Em uma outra modalidade, o vírus oncolítico recombinante tem dois ou três IRESS e cada é operavelmente ligado a uma sequência de ácido nucleico diferente que codifica um polipeptídeo de vírus oncolítico. Por exemplo, um IRES pode ser ligado a um virus oncolitico polimerase e um segundo IRES pode ser ligado a uma proteina estrutural ou uma glicoproteína. Em ainda uma outra modalidade, o virus oncolítico recombinante tem um primeiro IRES operavelmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um vírus oncolitico polimerase; um segundo IRES operavelmente ligado a uma sequência de ácido i9/s9' nucleico que codifica uma glicoproteina de víms oncolítico; e um terceiro IRES operavelmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteina es"trutural de vírus oncolítico. Em outra modalidade, o IRES é um picornavíms IRES, tal como um IRES tipo I de um Rhinovirus, tal como um Rhinovírus 2 humano, ou um vírus de Doença da Febre Aftosa ou qualquer combinação dos mesmos.

[0050] Em aspectos específicos da presente invenção, o virus oncolítico é usado para induzir uma resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em um animal tendo um tumor cornpreendendo administrar ao referido animal uma composição compreendendo um virus oncolitico competente de replicação sendo que a administração da referida composição produz anticorpos que mediam a resposta de CDC específica ao referido tumor. Ao fazê-lo o virus oncolítico pode ser usado para inibir o crescimento ou promover a morte de uma célula de tumor.

[0051] Os métodos geralmente compreenderão administrar o vírus oncolitico recombinante em uma multiplicidade de infecção suficiente para induzir uma resposta de CDC mediada por anticorpo especifico de tumor no animal ao qual é administrado. A célula de tumor pode ser qualquer célula de tumor contra a qual uma resposta anti-tumor é desejada. A célula pod.e ser contatada com o virus oncolítico in ÜiÜo, ex uiuo, ou in uitro.

[0052] Em algumas modalidades, o vírus oncolítico é administrado a um animal in ÜiÚo. A administração pode ser intravascularmente em uma veia ou uma artéria. Por exemplo, no caso de um tumor hepático, o vírus oncolítico pode ser administrado a uma artéria hepática através de um dispositivo médico de longa duração tal como um cateter. Em out.ras modalidades, o virus oncolítico recombinante pode ser administrado intravascular, intratumoral ou intraperi"tonealmente.

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[0053] Em modalidades específícas, os métodos da invenção se referem ao tratamento de um câncer em um paciente humano gerando-se no referido humano uma resposta d.e CDC mediada por anticorpo específico de tumor contra o tumor específico experimentado pelo 5 referido humano. Por exemplo, tais métodos compreendem a etapa de administrar um ou mais virus oncolitico como descrito aqui em um MOI que é suficiente para produzir uma resposta de CDC mediada por anticorpo específico de tumor. É contemplado que esta resposta seja suficiente para retardar o crescimento de e/ou morte de uma célula de 10 tumor no paciente humano. Em algumas modalidades, a resposta será útil no tratamento de um tumor in situ diretamente administran.do-se ao paciente o vírus oncolítico. Em outras modalidades, é contemplado que as células de tumor do indivíduo são removidas e uma resposta de CDC mediada por anticorpo específico de tumor é gerada contra as 15 referidas células de tumor ex uiuo. Os a.nticorpos produzidos nesta resposta ex ÜiÜo são então administrados ao paciente com tumor em uma terapia autóloga para câncer no indivíduo. Alternativamente, os anticorpos produzidos podem ser administrados a um indivíduo diferente do que o indivíduo de quem as células de tumor são 20 inicialmente obtidas.

[0054] Deve ser entendido que o uso de virus oncoliticos descritos aqui para gerar uma resposta de CDC mediada por anticorpo específico de tumor encontrará utilidade no tratamento de uma ampla gama de células de tumor ou cânceres in.cluindo, por exemplo, câncer de mama 25 (por exemplo, carcinoma de célula de mama), câncer ovariano (por exemplo, carcinoma de célula ovariana), carcinoma de célula renal (RCC), melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), cãncer de próstata, câncer de colo, cãncer de pulmão {incluindo, cãncer de pulmão de célula pequena e câncer de pulmão de célula não pequena), 30 câncer ósseo, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma,

condrossarcoma, câncer pancreático, câncer de pele, fibrossarcoma, leucemia crônica ou aguda incluindo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crônica, linfangiossarcoma, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e linfoma de não Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma de CNS primário,

linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplásicos (ALCL), linfornas de célula T cutãneos, linfomas de célula clivad.a pequena nodular, linfomas de célula T periférica, linfomas de

Lennert, linfomas imunoblásicos, linfomas/leucemia de célula T (ATLL), cãnceres de linfomas foliculares entroblásicos/centrociticos (cb/cc),

linfomas de célula grande difusa de linhagem B, linfoma de célula T semelhante à linfadenopatia angioimunoblásica (AILD) e linfomonas com base na cavidade corpórea associada ao HIV), doença de

Castleman, Sarcoma de Kaposi, hemangiossarcoma, mielomas múltiplos, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de célula B, carcinomas nasofaringeo, câncer de cabeça ou pescoço,

mixossarcoma, lipossarcoma, melanoma maligno cutãneo ou intraocular, cãncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, ca.rcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulvar, carcinoma da célula transitória, câncer esofágico, gastrinoma maligno, cãncer do intestino delgado, carcinoma colangiocelular, adenocarcinoma, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tiroide, câncer da glãndula paratiróide, cãncer da glândula adrenal, sarcoma do tecido macio, 'uretral, cãncer do pênis, câncer testicular, teratoma maligno, tumores sólidos infantis, câncer da bexiga,

câncer do rim ou ureter, carcinoma da pelve renal, meningioma maligno, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), angiogênese do tumor, tumor eixo espinaj, adenoma pituitário, câncer epi.dermóide, câncer de célula escamosa, cã.nceres ambientalmente induzidos m '4' 22/59

W " G incluindo aqueles induzidos por asbestos, por exemplo, mesotelioma, e combinações desses cânceres.

[0055] Também seria entendido que o vírus oncolítico pode compreender qualquer ácido nucleico heterólogo que pode necessitar

5. ser liberado ao indivíduo.

[0056] O termo "quantidade terapeuticamente efícaz" ou "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade de uma composição de virus oncolítico recombinante suficiente para reduzir, inibir, ou anular o crescimento de célula de tumor, ou in Uitro ou em um indivíduo (por 10 exemplo, um humano, primata, cachorro, porco ou vaca). Como notado aqui, a redução, inibição, anulação de crescimento de célula de tumor pode ser o resultado de necrose, apoptose, ou uma resposta imune. A quantidade de uma composição de vírus oncolítico recombinante que é terapeuticamente eficaz pode variar dependendo do virus oncolítico 15 particular usado na composição, da idade e da condição do individuo sendo tratado, ou da extensão da formação de tumor, e similares.

[0057] O vírus oncolítico recombinante a ser usado nos métodos da invenção pode ser administrado de uma maneira convencional tal como pelas rotinas oral, intravenosa, intraarterial, intra-tumoral, 20 intramuscular, subcutânea, intranasal, intradérmica, ou supositório ou por implantação (por exemplo, usando moléculas de liberação lenta). Dependendo da rotina de administração de uma terapia adjuvante, semelhante a um agente imunoterapêutico, os agentes contidos nele podem ser requeridos para serem revestidos em um material para 25 protegê-los da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que de outro modo podem inativar os agentes. Para administrar a composição por outra que não seja a administração parenteral, os agentes serão revestidos por, ou administrados com, um material para prevenir a inativação.

L 23/59 b ' %

[0058] O víms oncolítico recombinante da presente invenção também pode ser administrado parenteralmente ou intraperitonealmente. As dispersões do componente de virus oncolitico recombinante também podem ser preparadas em, incluindo, porém, não limitado a, glicerol, 5 polietileno glicóis liquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições ordinárias de armazenamento e uso, essas preparações podem conter um preservativo para prevenir o crescimento de microrganismos, tal como um antibiótico semelhante à gentamicina.

[0059] Como usado aqui "diluente e/ou veículo farmaceuticamente 10 aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retarda-mento de absorção e isotônico e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias biologicamente ativas é bem conhecido na técnica. Os ingredientes ativos suplementares, tais como antimicrobia- l5 nos, também podem ser incorporados nas Composições.

[0060] O veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), as misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por 20 exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela conservação do tamanho de particula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e 25 similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes de retardamento da absorção, por exemplo, monoestearato de aluminio e gelatina.

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[0061] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando-se os vírus oncolíticos recombinantes da presente descrição na quantidade requerida do solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados nelas, como requerido, seguido por meios de esterilização 5 adequados. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso do pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são 10 secagem a vácuo e técnicas de liofilização, que produzem um pó do virus oncolítico recombinante mais qualquer ingrediente desejado adi- cional de uma solução previamente filtrada de forma estéril do mesmo.

[0062] Pode ser vantajoso formular composições parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade 15 de dosagem. A for'ma de unidade de dosagem como usada aqui se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para individuos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o 20 requerido veiculo veterinário ou farmaceuticamente aceitável.

[0063] As composições farmacê'uticas compreendendo o vírus oncolítico recombinante desta descrição podem ser fabricadas por meios de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levi,gação, emulsificação, encapsulação, captura ou liofiliza- 25 ção. As composições virais farma.cêuticas podem ser formuladas de maneira convencional usando um o'u mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam a formulação de vírus oncolítico recombinante ativo nas preparações que podem ser usadas biologica ou farmaceuticamente. As composições de víms oncolítico recombinante podem ser combinadas com um ou mais agentes biologicamente ativos e podem ser formuladas com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável para gerar composições farmacêuticas ou veterinárias da presente descrição.

[0064] Veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos aqui e, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, ed., 18a. Edição (1990)) e em CRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S. C. Smolinski, ed. (1992)). Em certas modalidades, as composições de virus oncolitico recombinante podem ser formuladas com um veículo, diluente ou excipiente veterinário ou farmaceuticamen- te aceitável que seja aquoso, tal como água ou uma solução de manitol (por exemplo, cerca de 196 a cerca de 2Õ°/o), solução hidrofóbica (por exemplo, óleo ou lipideo), ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, emulsões de óleo e água). Em certas modalidades, qualquer das composições biológica ou farmacêutica descritas aqui tem um preservativo ou estabilizador (por exemplo, um antibiótico) ou são estéreis.

[0065] As composições biológicas ou f.ármacêuticas da presente descrição podem ser formuladas para permitir que o virus oncolítico recombinante contido nelas esteja biodisponível erri administração da composição a um indivíduo. O nível de virus oncolí'tico recombinante no soro, tumores, e outros tecidos após a administração pode ser monitorado por várias técnicas bem estabelecidas, tais como ensaios com base em anticorpo (por exemplo, ELISA). Em certas modalidades, as composições de vírus oncolitico recombinante são formuladas para administração parenteral a um individuo em necessidade das mesmas (por exemplo, uin indivíduo tendo um tumor), tal como um animal humano ou não humano. As rotinas preferidas de administração incluem intravenosa, intra-arterial, subcutãnea, intratumoral, ou intramuscular.

[0066] A forrnulação apropriada é dependente da rotina de administração escolhida, como é conhecido na técnica. Por exemplo, as formulações sistêmicas são uma modalidade que inclui aquelas designadas para administração por mjeção, por exemplo, injeção subcutânea, intra-arterial, intravenosa, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal, bem como aquelas designadas para administração lO intratumoral, transdérmica, transmucosal, oral, intranasal ou pulmo- nar. Em uma modalidade, a formulação sistêmica ou intratumoral é estéril. Nas modalidades para injeção, as composições de vírus oncolítico recombinante da presente descrição podem ser formuladas em soluções aquosas, ou em tampões ou soluções fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, soluções de manitol ou tampão de salina fisiológica. Em certas modalidades, quaisquer das composições de vírus oncolítico recombinante descritas aqui podem conter agentes formuladores, tais como agentes de suspensão, estabilizantes ou dispersantes. Em modalidades para administração transmucosal, penetrantes, solubilizantes ou emolientes apropriados para a barreira a ser permeada podem ser usados na formulação. Por exemplo, l-dodecüexaidro-2H-azepin-2-ona (Azon®), ãcido oleico, propileno glicol, mentol, dietilenoglocol etoxiglicol éter de monoetila (Transcutol®), monolaurato de polietilenossorbitano, polissorbato (Tween®-20), e o fármaco 7-cloro-1-metil-5-fenil-3H-1,4- benzodiazepin-2-ona (Diazepam), miristato isopropilico, e outros tais penetrantes, solubilizantes ou emolientes geralmente conhecidos na técnica podem ser usados em quaisquer das composições da presente descrição.

[0067] A administração pode ser obtida usando uma combinação de rotinas, por exemplo, a primeira administração usando uma rotina intra-arterial e administração subsequente através de uma rotina intravenosa ou intratumoral, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0068] Em modalidades específicas, a presente descrição fornece os métodos para a geração de anticorpos in uiuo que mediam uma resposta de CDC anti-tumor compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo um vírus oncolitico competente de replicação sendo que a administração da referida composição produz anticorpos que mediam a resposta de CDC específica ao tumor. Foi mostrado pelos inventores que a resposta de CDC anti-tumor mediada por anticorpo especifico de tu'mor gerada por administração de vírus oncolítico competente de replicação pode ser usada para inibir o crescimento ou ainda a morte das células de câncer. Desse modo, administrando-se um vírus oncolítico recombinante de acordo com a presente descrição em uma multiplicidade de infecção suficiente para gerar uma resposta de CDC específica de tumor no animal inibirá o crescimento de uma célula de tumor o'u matar uma célula de tumor. Em certas modalidades, o vírus oncolitico recombinante é administra.do mais de uma vez, preferivelmente duas vezes, três vezes, ou até 10 vezes. Em certas outras modalidades, a célula de tumor é tratada in oiuo, ex Úii'o, ou in uitro.

[0069] Os exemplos de células de tumor ou cânceres que podem ser tratados usando os métodos desta descrição incluem carcinoma de célula hepática, câncer de mama (por exemplo, carcinoma de célula da mama), câncer ovariano (por exemplo, carcinoma de célula ovariana), carcinoma de célula renal (RCC), melanoma (por exemplo, melanoma naligni metastático), câncer de próstata, câncer de colo, câncer de pulmão (incluindo cãncer de pulmão de célula pequena e câncer de pulmão de célula não pequena), câncer ósseo, osteossarcoma, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma, condrossarcoma, cãncer pancreático, câncer de pele, fibrossarcoma, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de célula T adulta (T-ALL), leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblásica aguda, leucemia linfocitica crônica, linfangiossarcoma, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primário, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplásica (ALCL),

linfomas de célula T cutâneos, linfomas de célula clivada pequena nodular, linfomas de célula T periféricos, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásicos, leucemia/linfomas de célula T (ATLL), cânceres de linfoma folicular entroblásico/centrocítico (cb/cc), linfomas de célula grande difusa de linhagem B, linfoma de célula T semelhante à linfadenopatia angioimunoblásica (AILD) e linfornas com base na cavidade corpórea associada ao HIV), doença de Castleman, Sarcoma Kaposi, hemangiossarcoma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de

Waldenstrom e outros linfomas de célula B, carcinomas nasofaringeos,

cãncer de cabeça e pescoço, mixossarcoma, lipossarcoma, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, cãncer uterino, cãncer retal, cãncer da região anal, cãncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma cervical, carcinoma vaginal, carcinoma vulvar, carcinoma de célula transitória, c'mcer e-sofágico, gastrinoma maligno, câncer do intestino delgado, carcinoma colangiocelular, adenocarcinoma, cãncer do sistema endócrino, câncer da glãndula tiróide, câncer da glândula paratiróide, câncer da glândula adrenal, sarcoma do tecido mole, uretral, câncer de pênis, câncer testicular, teratoma maligno, tumores sólidos de criança, câncer da bexiga, câncer de rim ou urcter, carcinoma da pélvis renal,

meningioma maligno, neoplasma do sistema nervoso central (CNS), angiogênese de tumor, tumor do eixo da coluna vertebral, adenoma

G : E - 29/59 % ,. X , pituitário, câncer epidermóide, câncer da célula escamosa, cânceres ambientalmente induzidos incluindo aqueles ind'uzidos por asbestos, por exemplo, mesotelioma, e combinações desses cânceres.

[0070] Determinado que a invenção mostra que é possível aumentar 5 uma resposta de CDC especifíca de tumor mediada por anticorpo em pacientes com câncer tratando-se o paciente com um vírus oncolítico competente de replicação, os inventores descobriram que será possivel especificamente adaptar uma terapia de câncer para um indivíduo tendo câncer compreendendo administrar ao individuo uma composição 10 que compreenda o vírus oncolítico competente de replicação para produzir a.nticorpos que mediam a resposta de CDC específica ao referido câncer no referido indivíduo. Uma vez que esta resposta é gerada o soro contendo as células B e anticorpos específicos de tumor contra o câncer são colhidos do individuo e expandidos ex ÜiÜo. Esta 15 população expandida de anticorpos e/ou células B coihidas produzindo estes anticorpos são usados como uma composição de imunoterapia que é específica para o paciente com câncer. Como tal, esta imunoterapia pode ser administrada ao indivíduo para produzir um efeito anticâncer. A composição de imunoterapia pode ser preparada e 20 administrada ao indivíduo imediatamente ao isolar os anticorpos ou pode ser armazenada para tratamento adicional em um estágio posterior na terapia do individuo.

[0071] Os métodos de cxpansão ex ÚiÚo de células B e anticorpos são bem conhecidos por aqueles de experiência na técnica e simplesmente 25 envolvem o crescimento das célúlas de produção de anticorpo na cultura e colheita dos anticorpos usando as técnicas de purincação de proteina padrão.

[0072] Em ainda outra modalidade, os métodos envolvem a administração parenteral de um virus oncolítico recombinante, de pre-

ferência através de uma artéria ou através de um dispositivo médico de permanência. Como notado acima, o virus oncolitico recombinante pode ser administrado com um agente imunoterapêutico ou imunomodulador, tal como um anticorpo que se liga a um antígeno específico de tumor (por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos, humanizados ou humanos). Em outra modalidade, o tratamento com víms oncolitico recombinante pode ser combinado com cirurgia (por exemplo, ressecção / excisão de tumor), terapia de radiação, quimioterapia ou imunoterapia e pode ser administrado antes, durante lO ou apõs um tratamento complementar.

jo073] Por exemplo, é contemplado que os métodos da invenção compreendem a geração de uma resposta de CDC especifica de tumor mediada por anticorpo administrando-se, um vírus oncolítico ao indivíduo sendo que em combinação com a administração do vírus oncolitico o indivíduo é tratado com uma terapia de câncer adicional ao humano. Em uma modalidade específica, a terapia de câncer adicional é quimioterapia, radiação, cirurgia, imunoterapia, terapia de gene, ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, a célula de cãncer está em um humano e/ou a etapa de introdução é também definida como administração de pelo menos cerca de 1 x jQ9 unidades de formação de placa {pfu) do víms oncolítico ao humano.

[0074] Foi estimado que aproximadamente 6Õ°/o de pessoas com câncer passarão por cirurgia de algum tipo, a qual inclui cirurgia preventiva, diagnóstica ou preparação, curativa, e paliativa. A cirurgia curativa é um tratamento contra câncer que pode ser usado em conjunto com outras terapias, tais como o tratamento da presente invenção, quimiote- rapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia de gene, imunoterapia e/ou terapias alternativas,

[0075] A cirurgia curativa inclui ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, excisado, e/ou destruído. Ressecção de tumor se refere a remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocimrgia, e cimrgia miscopicamente controlada (cirurgia de Mohs). É também contemplado que a presente invenção pode ser usada em conjunto com a remoção de cânceres superficiais, pré-cãnceres ou quantidades incidentais de tecido normal.

[0076] Ao excisar parte ou toda a células cancerosas, tecido ou tumor, uma cavidade pode ser formada no corpo. O tratamento pode ser realizado por perfusão, injeção direta, ou aplicação local da área com uma terapia anticâncer adicional tal como administração dos virus oncolíticos descritos aqui. Tal tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4, e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Esses tratamentos podem ser de dosagens variadas,

[0077] Nos métodos terapêuticos da invenção o vírus oncolitico é usado para produzir uma resposta mediada por anticorpo a um tumor ou câncer em um indivíduo. A resposta é suficiente para produzir o tratamento do cãncer ou tumor, por exemplo, matando-se as células de câncer, induzindo apoptose nas células de câncer, reduzindo a taxa de crescimento das células de cãncer, reduzindo as incidências ou número de metástases, reduzindo o tamanho do tumor, inibindo o crescimento do tumor, reduzindo o fornecimento de sangue a um tumor ou células de câncer, promovendo uma resposta imune contra as células de câncer ou um tumor, prevenindo ou inibindo a progressão do cãncer, ou aumentando o período de vida de um individuo com câncer. Mais geralmente, os anticorpos ou células B produzindo os anticorpos podem ser usados em combinação com terapias anticâncer convencionais para fornecer um efeito combinado para matar ou inibir a proliferação da célula.

[0078] Os seguintes exemplos não limitantes são fornecidos para ilustrar vários aspectos da presente descrição. Todas as referências, patentes, pedidos de patente, pedidos de patente publicados, e similares estão incorporados por referência em suas totalidades aqui.

[0079] EXEMPLOS

[0080] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as preferidas modalidades da invenção. Deve ser apreciado por aqueles de experiência na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam as técnicas descritas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção, e desse modo podem ser consideradas constituir os modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica, na luz da presente descrição, devem apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades especificas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem afastar-se do espirito e escopo da invenção.

[0081] Exemplo 1: Métodos

[0082] Vírus e Linhagens de Célula: JX-594, virus da vacínia de cepa de Wyeth (inativado por timidina cinase jTK], ex'pressando hGM-CSF) foi usado em todo este estudo e foi preparado como publicado previamente24. SNU349, SUN482 e SNU267 (carcinoma de célula renal humana; obtido do Banco de Linhagem Celular da Coréia [KCLB]) e SNU475 & SNU398 (carcinoma hepatocelua.r huma.no; obtido de KCLB), foram cultivados em RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 1O°/o de FBS (Hyclone) com penicilina e estreptomicina. HOP62, H157, H460 e PClO (carcinoma pulmonar humano; obtido de Coleção de Cultura do Tipo Americano [ATCC]), HepG2 (carcinoma hepatoceluar humano; obtido de

ATCC), SF-295 (câncer da vesicula biliar humana; obtido de ATCC), PC- 3 (câncer de próstata humano; obtido de ATCC), PANC-I (câncer pancreático humano; ATCC), MCF-7 (câncer de mama humano; ATCC) foram cultivados em meio DMEM contendo 1O°/o de FBS com penicilina e estreptomicina. As células não transformadas MRC-5 (fi'broblasto pulmonar; ATCC) e HUVEC (células endoteliais; ATCC) MRC-5 foram cultivados em meio de célula endotelial EBM-2 (Lonza, MD, USA) suplementado com 2°/0 de soro bovino fetal (FBS) com penicilina e estreptomicina.

[0083] Modelo de tumor VX2 de coelho e isolamento de células VX2: Os tumores VX2 foram crescidos e mantidos no músculo de coelho branco da Nova Zelândia consanguíneo (Samtako, Oh-San, Korea). JX-594 (1 x jQ9 pfu) ou Salina tamponada por fosfato (PBS) foi injetada em 3 semanas e 4 semanas após a implantação do fragmento VX2 no músculo esquelético. O soro foi coletado em valor de referência, 3 semanas e 6 semanas após tratamento com JX-594 ou PBS. VX2 foi isolado como descrito previamente3l, Em resumo, as células VX2 foram isoladas de tecidos VX2 enzimaticamente (colagenase a 0,01%, protease a O,1°/o durante a noite a 4°C), e mantidas in Uitro com meio de Eagle modificado de Dulbecco {DMEM) com 1O°/j de soro bovino fetal (FBS) pa.ra 8 passagens. As células VX2 frescas foram usadas para cada teste de viabilidade de célula. Em um estudo paralelo, JX-594 foi injetado em um coelho não portador de tumor, normal, e o soro foi obtido.

[0084] Viabilidade celular & ensaio CDC: A viabilidade celular foi diminuída quando o soro foi adicionado (nenhum tratamento térmico). A atividade de CDC foi avaliada medindo-se a viabilidade celular sob incubação com 5% de soro em placas de 96 cavidades. A viabilidade celular no soro após a administração de JX-594 foi normalizada para a viabilidade celular de soro de coelho ou paciente no valor de referência

(antes do tratamento com JX-594). Cada linhagem celular foi semeada em placas de 96 cavidades e incubada durante a noite. As células foram subsequentemente incubadas com DMEM (nenhum FBS) e a amostra de soro a 37°C durante 4 horas. As células foram subsequentemente expostas a PBS e 10 µ1 de solução de kit-8 (CCK-8) de contagem de célula (CCK-8 kit, Dojindo, Inc., Kumamoto, Japan) e incubadas a 37°C durante 2 horas. A viabilidade celular foi medida por densidade óptica em 450 nm.

[0085] Manchamento do Oeste: As células VX2, células mononucleares de sangue periférico de coelho, células SNU349 ou SNU739 foram lisadas em - IxICF células/mL em solução de extração de proteína PRO- PREP'" (iNtRON Biotechology, Korea) em gelo durante 30 minutos. Após a centrifugação, 50 µg de proteina foram separados usando os géis SDS-PAGE e transferidos para a membrana PVDF (Immunobilon-P; Millipore, Billerica, MA). Os soros foram diluídos 1/ 100 em 0,1% de TBST (5% de leite em pó desnatado; 0,1% de Tween 20; 50 mmol/ L de Tris; 150 mmol/L de NaCl) e incubados em membranas de PVDF durante 90 minutos em temperatura am"biente. A membrana foi em seguida incubada durante 1 hora em temperatura ambiente com IgG anti-coelho de cabra conjugado por rábano picante peroxidase (Stanta Cruz) diluída 1/ 10.00 em O,i°/o de TBST (soro de coelho primário) ou IgG anti-humano (Sigma #A1543, 1:5.000) (soro humano primário) e visualizada por quimioluminescência aumentada (ECL kit; Pierce, Rockford, IL).

[0086] Microscopia de Fluorescência & Confocal: Cada linhagem celular foi semeada em placas de 96 cavidades e as células foram incubadas durante 24 horas para alcançar 1OO°/o de densidade celular. Para manchamento de fluorescência, as células SNU349 foram semeadas em prato com fundo de laminula a 3 x jç)5 células e deixadas durante a noite. O éster de sucinimidila de carboxifluoresceína (CSFE) e 7-amino- actinomicina D (7-AAD) (ACT 1"" Assay for CytoToxic'ity, Cell TechnoloW) foram adicionados para manchar as células viáveis e mortas, respectivamente. Em células vivas, CSFE (fluorescência verde em células totais) pode ser detectado ao mesmo tempo em que a fluorescência vermelha pode ser detectada no núcleo das células mortas.

[0087] Estudo de SEREX: Uma biblioteca de CDNA foi construida de mRNA extraida de SNU449, uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano (HCC). A biblioteca de cDNA foi clonada em um vetor de expressão À ZAP (Kit ZAP-CDNA Syhthesis, [Stratagene CA]). O título de biblioteca amplificada foi 1 x109 pfu/ml, e 5x105 pfu foi usado para imunoavaliação primária contra soro humana. As placas de fago apareceram após 6-8h incubação a 42"C e em seguida transferidas para dentro de membranas de nitrocelulose de 132mm (Millipore, Bedford) que foram embebidas em IPTG a 10 mM (Sigma-Aldrich, USA) durante 30 minutos previamente. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com 5°/0 de BSA (Santa Cruz, USA). O soro agrupado de pacientes com HCC tratados com JX-594 (D57 após a injeção de JX- 594) foi usado para avaliação primária e secundária. O soro de pacientes com a atividade CDC superior foi agrupado para este estudo (pacientes #1702, #1703, #1704, #1705, #1712, #1713 e #1715). O soro agrupado foi adicionado (6 ml de 1:100 de soro di'luido) para avaliação primária de anticorpo, anticorpo ligado detectado com 1:5000 de IgG anti-humano de cabra rotulado com dcalina fosfatase diluída (Sigma-Aldrich, USA) e em seguida a membrana foi desenvolvida com solução de BCIP/NBT, pré-misturada (Sigma-Aldrich, USA). As placas azuis foram nucleadas da placa de ágar correspondendo às membranas e colocadas em tampão SM de NaCl a 1OOmM, THs-HCI a 50mM (pH7,5), MgSO4 a 1OmM) contendo 20 µI de clorofórmio. Em seguida 70 placas foram avaliadas (5 placas durante 1 rodadá), nós isolamos 70 placas positivas. Apõs uma segunda rodada de avaliação (placa de 82 mm), 11 placas foram purificadas para monoclonalidade (> 90% de fagos positivos com densidade elevada). Após a extração de DNA de cada clone, o DNA foi sequenciado.

[0088] Manchamento com ponto: O lisado de fago de E. coli pa.ra cada clone positivo foi diluido 5 vezes em tampão SM e 1 µL de lisado diluído foi manchado com a tira de teste da membrana de Whartman (Whartman, Alemanha). Após secagern por ar durante 5 minutos, todas as tiras de teste foram imersas na solução de bloqueio durante 1 hora. As membranas foram incubadas em 1:50 de soro humano de JX-594 préAnjetado (0 semana, 2 semana, 4 semana) ou pós-injetado (D57) durante 1 hora. O anticorpo ligado foi detectado com 1:2500 de IgG anti-humano de cabra rotulado de alcalina fosfatase diluida (Sigma- Aldric.h, USA) e desenvolvido com a solução de BCIP/NBT.

[0089] Exemplo 2: CDC é Induzido Tanto nos Modelos Animais quanto nos Pacientes Humanos

[0090] Viabilidade celular diminuída observada sob incubação de células de tumor com soro de coelhos tratados com JX-594, portadores de tumor. Para investigar a indução de CDC em um modelo de coelho, o soro foi coletado de coelhos portadores do adenocarcinoma VX2 implantado em músculo tratado com JX-594 ou controle de PBS. O soro coletado no dia 28 após a injeção foi adicionado às céhilas VX2 ou células mononucleares d.e sangue periférico de coelho (PBMCs) in uitro em uma concentração de 3°/0. Uma diminuição significante (aproximadamente 90%) em viabilidade celular foi somente observada em células incubadas com soro de coelhos portadores de tumor VX2, tratados com JX-594 (Figura la). A incubação de células VX2 com soro de coelhos portadores de tumor VX2 tratados com PBS ou coelhos não

% 0' portadores de tumor tratados com JX-594 não exibiram viabilidade celular diminuída. Além disso, a viabilidade de PBMC não diminuiu significativamente sob incubação com soro de qualquer gmpo de tratamento. A viabilidade celular de VX2 foi subsequentemente avaliada sob incubação com o soro coletado em vários pontos de tempo após a injeção de JX-594 (ou PBS). A viabilidade celular de VX2 diminuída sob incubação com soro coletado do Dia 18 para adiante nos coelhos tratados com JX-594, portador de tumor VX2 (Figura 1 b). A concentração aumentada de soro (até 2%) resultou em diminuições IO dependentes de dose em viabilidade celular de VX2 (Figura lc). A incubação de células com 2% de soro resultou em aproximadamente 20% de viabilidade celular de VX2 quando comparado com o tratamento com controle de soro de coelho normal. Para avaliar se o soro de coelhos tratados com JX-594, portadores de VX2 se liga aos novos antígenos, uma mancha do oeste foi realizada em lisados de célula VX2 e PBMC com soro de coelhos sem tratamento prévio e coelhos portadores de tumor tratados com JX-594. A forte reatividade aos novos antígenos foi somente observada no lisado de linhagem celular VX2 e múltiplas novas faixas foram reconhecidas sob tratamento de JX- 594 de coelhos portadores de tumor VX2, indicando uma indução de anticorpos policlonais aos antígenos de tumor VX2 (Figura ld).

[0091] Evidência de viabilidade celular diminuída sob incubação de linhagens de célula de cãncer humana com soro de pacientes tratados com JX-594. Ao detectar as diminuições significantes em viabilidade celular ativada por incubação com soro de coelho de coelhos portadores de tumor, tratados com JX-594, nós procuramos identificar se uma atividade similar pode ser observada no soro coletado de pacientes tratados com JX-594. Os inventores começaram testando soro de dois pacientes tratados na experiência de tumor de figado de Fase 1 que tiveram respostas significantes e sobrevivência por tempo prolongado após terapia de JX-594 (paciente 103: câncer de pulmão, 24,5 meses de sobrevivência; paciente 301: câncer da célula renal, 44,1 + meses de sobrevivência)26, Além disso, similar a observação no modelo pré-clinico 1, a incubação de linhagens de célula de câncer com soro de paciente tratado com JX-594 (5%) resultou em diminuições significantes em viabilidade cehilar (Figura 2a). As linhagens de célula de câncer da mesma origem como o câncer do paciente foram testados e uma diminuição dependente do tempo na viabilidade celular foi observada na maioria das linhagens de célula. A visualização das células sob microscopia de campo brilhoso revelou formação de complexo de ataque de membranas (MAC), que indicou a diminuição da viabilidade celular é ativada por CDC (Figura 2b). As tintas CSFE e 7-AAD foram usadas para manchar as células vivas e mortas, respectivamente. O manchamento com 7-AAD demonstra que as células tratadas com soro de pacientes imunes de 594 estão passando por morte de célula.

[0092] Exemplo 3: Viabilidade celular diminuída é devido a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por anticorpo

[0093] Em seguida, testamos a contribuição de anticorpos e comple- mento para avaliar o mecanismo pelo qual o soro de pacientes tratados com JX-594 media a citotoxicidade de célula de câncer. O soro de pacientes tratados com JX-594 foi termicamente inativado para inibir qualquer atividade de cornplemento. Uma coluna que liga IgG foi usada para remover os anticorpos de soro (refere-se ao experimento descrito na Figura 3a). O soro de valor de referência (antes do tratamento com JX-594, Soro A), soro obtido 92 dias após o tratamento com JX-594 (Soro B), Soro B termicamente inativado (Soro C) e Soro B que foi passado através da resina de IgG (Soro E) foram adicionados às 'monocamadas de linhagem de célula de câncer a uma concentração de

5%. O soro coletado em valor de referência não resultou na viabilidade celular diminuída ao mesmo tempo em que o soro coletado 92 dias após o inicio do tratamento com JX-594 exibiu atividade anti-tumoral potente. Entretanto, as células permaneceram viáveis sob inativação térmica ou depleção de IgG. Além disso, a restauração de complemento funcional no Soro C (por adição de Soro A coletado no valor de referência e não exibindo viabilidade celular diminuída isoladamente) resultou na restauração da atividade anti-tumoral. Observações similares foram feitas com amostras de soro de um total de três pacientes tratados no estudo de Fase 1 (301 - câncer renal; 103 - câncer de pulmão; 304 -melanoma) nas linhagens de célula correspondendo aos tipos de tumor do paciente (Figura 3b). As imagens de campo brilhoso de linhagens de célula após a incubação e soro (paciente 30 1) são apresentadas na Figura 3c. Finalmente, um aumento dependente do tempo na viabilidade celular foi o'bservado com respeito à duração da inativação térmica (Figura 3d).

[0094] Atividade de CDC específica às células de tumor e mais eficazes em células do mesmo tipo de tumor. Em seguida investigamos se o soro de pacientes tratados com JX-594 foi capaz de causar a toxicidade às células humanas normais ex Üii'o. As células endoteliais HUVEC e células de fibroblasto de pulmão RC-5 não exibiram viabilidade celular diminuída significante quando incubadas com soro de quaisquer dos cinco pacientes testados. Geralmente, viabilidade celular diminuída foi observada em células cuja origem correspondeu ao tipo de tumor do paciente (câncer renal, melanoma e HCC) (Figura 4 a-d). Sobrevivênci.a versus Fase 1 de CDC.

[0095] A indução de CDC avaliada na indução de CDC de experiência de Fase 2 randomizada foi analisada em pacientes de HCC tratados em uma experiência de Fase 2 randomizada contínua. A viabilidade celular diminuída foi observada em linhagens de célula de HCC sob incubação com soro de pacientes tratados com JX-594. A atividade de CDC aumentou com o passar do tempo (Figura 4b sumário, Figura c-e linhagens d célula individuais).

[0096] Exemplo 4: Avaliação de SEREX resulta na identificação de antígenos de tumor endógenos, novos

[0097] Para avaliar se o soro do paciente se liga aos novos antígenos, as manchas do oeste foram realizadas usando os lisados de célula de linhagens de célula de câncer da mesma origem de tecido como o soro do paciente e tumores do paciente (de pacientes nas experiências de Fase 1 e 2 exibindo CDC significante). A reatividade forte a novos antígenos foi observada no soro após tratamento com JX-594, sugestivo da indução de anticorpos policlonais aos antígenos de tumor endógeno dos pacientes (Figura 6). Para identificar novos antíogenos alvo uma avaliação de SEREX foi realizada usando o soro agrupado de pacientes com HCC com atividade de CDC forte em uma biblioteca de cDNA gerada de uma linhagem de célula HCC humana (SNU449). Após duas rodadas de avaliação, 17 antígenos candidatos foram identificados (Figura 7, Tabela 1). Um subconjunto de antígenos, por exemplo, semelhante à proteina RecQ (semelhante ao DNA helicase Ql) (RECQL) e receptor de leptina (LEPR) foi previamente identificado como alvos para HCC ou outros cãnceres, ao mesmo tempo em que outros [inibidor de incluindo inibidor 1 de realimentação de receptor ERBB (ERRFII ), transmembrana de proteína lisossômica 4 alfa (LAPTM4A) e familia de oncogene RAS (RABI B)] são antigenos HCC p'utativos e representam alvos potenciahnente novos em HCC. A reatividade do soro de paciente coletado antes do tratamento com JX-594 foi testado quanto à reatividade contra os antígenos identificados 1. Os anticorpos contra um subconjunto de antigenos existiram antes do tratamento com JX-

594, entretanto geralmente a reatividade foi mais forte após a terapia com JX-594, sugerindo que o tratamento com um poxvírus competente de replicação induz anticorpos policlonais reconhecendo os antigenos de tumor.

[0098] Exemplo 5: Discussão

[0099] A aprovação da primeira imunoterapia para câncer (Provenge, Dendreon, Seattle WA) validou esta nova metodologia para terapia de cãncer. As populações de célula dendítrica autóloga são expostas a um antígeno de câncer de próstata fundido ao GM-CSF antes da re- infusão no paciente e esta metodologia foi demonstrada para melhorar a sobrevivência de pacientes com câncer de próstata resistente à castração32. As metodologias imunoestimuladoras não específicas também foram avaliadas como imunoterapia de câncer, incluindo tratamento com citocinas imuno-estimuladoras, por exemplo, IL-2.

Muitas vacinas virais incompetentes de replicação expressando antígenos de tumor no contexto de citocinas imunoestimuladoras ou moléculas co-estimuladoras foram avaliadas como vacinas de tumor. Embora eficazes na indução de uma resposta imune específica de tumor, essas estratégias não resultaram em benefício de sobrevivência significante aos pacientes e nenhuma vacina de cãncer viral foi ainda aprovada pelas agéncias reguladoras. Embora a indução generalizada de anticorpos aos antígenos de tumor tenha sido observada9. 33, é desconhecido se esses anticorpos são funcionais, por exemplo, se eles mediam CDC.

[OOlOO] Ao mesmo tempo em que a replicação de virus oncolítico e expressão de transgene foram reproduzivelmente demonstradas em experiências clínicas, a indução de imunidade anticâncer sistêmica funcional não foi sistematicamente avaliada em qualquer experiência com JX-594 ou outros víms oncolíticos até hoje. a indução generalizada de linfócitos CD3+CD4+ e CD3+CD8+, células matadoras naturais e várias citocinas inflamatórias foram demonstradas26, Em uma experiência clínica de melanoma com HSV-hGM-CSF (Oncovex, Biovex, Cambridge MA), a análise fenotípica de células T derivadas de amostras de tumor sugeriu diferenças distintas de células T do sangue periférico. Comparado com as células T derivadas de pacientes de controle não tratados, houve um aumento no antígeno associado ao melanoma reconhecido por células T específicas de célula T (MART-I) em tumores passando por regressão após a vacinação; a imunidade anti-tumoral funcional não foi avaliada28. Os estudos pré-clínicos demonstraram que os vírus oncolíticos podem induzir a imunidade funcional específica de câncer, porém, os dados clinicos foram perdidos24, 34"38,

[00101] O sistema de complemento é compreendido de uma série de proteinas de soro que são uma parte do sistema imune congênito. O sistema de complemento age na defesa contra infecção (por exemplo, opondo-se ou diretamente lisando as bactérias invasivas) e também forma uma ligação entre a imunidade congênita e adaptável30, Em particular, as proteínas de complemento têm o potencial de lisar as células opostas por anticorpos que foram induzidos em resposta a um antigeno estrangeiro. Além disso, a citotoxicidade mediada por complemento (CDC) é um dos sistemas de morte celular mais potentes30. A atividade de CDC é colhida por anticorpos monoclonais (mAb) atualmente usados no tratamento de malignidades. A contribuição de CDC com a eficácia anti-tumoral de rituximab (um mAb específico de CD20) foi avaliada extensivamente pré-clinicamente39-4I. Além disso, o envolvimento do sistema de complemento em terapia de rituximab em pacientes com linfoma folicular é suportado pela observação que pacientes com um polimorfismo no gene de cascata de complemento Cl q teve um tempo aumentado para progressão42.

Outros anticorpos foram mostrados mediar CDC em amostras de pacientes ou linhagens de célula. de câncer, incluindo alemtuzumab para leucemia linfocítica crõnica 43 e panitumumab e cetuximab para linhagens de célula de câncer de diferentes origens44, Essas observações levaram ao desenvolvimento de estratégias para melhorar a atividade de CDC inerente de mAbs alvejado pelo tumor45-47 bem como terapias de combinação com os agentes que melhoram a atividade de CDC48. Entretanto, há alguma relação com outro aumento da atividade de CDC com um terapêutico que não seja específico de câncer, tal como io rituximab, uma vez que a potenciação de citotoxicidade versus PBMCS expressa.ndo CD20 normais pode ser observada48.

[00102] Virus da vacínia foram mostrados serem resistentes a neutralização mediada por complemento para facilitar a dispersão sistêmica do vírus. Isto é atribuído à inclusão de proteínas reguladoras competentes no rcvestimento externo da forma de virus envelopado extracelular (EEV) de vacínia49, Entretanto, foi demonstrado que as células de tumor infectadas com vírus da vacínia podem ser mais susceptíveis a neutralização mediada por complemento devido á depleção da proteína reguladora de complemento para incorporação no envelope de virions 1iberados49-50, A expressão de GM-CSF de células infectadas com JX-594 no microambiente de tumor pode potencializar a morte mediada por CDC através da estimulação e expansão de célula NK e macrófagos5l. Na realidade, a replicação de JX-594 pode ativar a inflamação em tumores e infiltrados inflamatórios foram detectados em lesões de melanoma tratadas intratumoralmente com jX-59429.

[00103] Aqui demonstramos a primeira evidência de indução de imuni- dade anti-tum.oral funcional em pacientes tratados com um vírus oncolitico. JX-594 induz CDC dependente de anticorpo de células de tumor ex ÜiÚo como demonstrado no soro obtido tanto de coelhos portadores de tumor bem como pacien.tes com vários tumores refratários ao tratamento, avançados. O uso de poxvírus oncolíticos competentes de replicação como uma imunoterapia anti-câncer tem as vantagens principais sobre outras estratégias imunoterapêuticas: 1) Indução de respostas imunes anticâncer representa um meca'nismo de ação da terapia; outros incluem a infecção direta e lise de células de tumor e paralização vascular de tumor agudo; 2) infecção de poxvíms oncolítico ativa uma resposta imune adaptada/específica do paciente; 3) nenhuma etapa de manipulação ex uiuo é requerida para a terapia (embora eficaz, a metodologia Provenge clinicamente validada é Iaboriosa, requerendo manipulação ex oiÚo de cada célula imune do paciente) e 4) a estimulação imune é ativada por infecção de vírus ativo de células de tumor que ativam uma reação inflamatória no microambiente do tumor. Um obstáculo principal no campo de imunoterapia é para as células efetoras imunes ativadas serem recrutadas e ativadas no tumor. Poxvims oncolíticos representam um veiculo ideal pelo qual estimulam a indu.ção de uma resposta imune adaptável ao mesmo tempo cm que simultaneamente ativando a indução de citocinas pró-inflamatórias e uma resposta inflamatória local no microambiente de tumorque garante o recrutamento e ativação de células imunes no tumor.

[00104] O sistema descrito aqui rejpresenta urn mecanismo pelo qual novos antigenos de tumor endógenos do paciente podem ser identificados. Uma avaliação SEREX identificada previamente caracterizou antígenos de tumor, validando a metodologia corrente, bem como novos antígenos associados ao tumor que representam novos alvos potenciais para o tratamento de HCC. O desígnio experimental descrito aqui que envolve (1) tratamento de um paciente com um poxvírus oncolítico competente de replicação, (2) medição de imunidade anti-tumoral funcional (ensaio CDC) ex ÜiÜo e (3) realizar uma avaliação

SEREX no soro do paciente com atividade de CDC elevada para identificar os antigenos alvo, representa uma nova metodologia para a descoberta de novos antigenos de tumor. Este método perrnite a identificação de múltiplos an"tígenos relevantes (antígenos endógenos do paciente capazes de ser reconhecidos por anticorpos) para os quais a geração de anticorpos é segura (como os an.ticorpos foram gerados em humanos com nenhum efeito prejudicial). Aqui nós demonstramos uma prova de conceito para este método em pacientes com HCC, entretanto esta metodologia pode similarmente ser usada para qualquer outro tipo de tumor.

[00105] Além disso, a indução de linfócitos T citotóxicos para antígenos de tumor, vírus da vacinia bem como o transgene f3-galactosidase de JX-594 em pacientes tratados com JX-594 está sendo atualmente avaliada. O efeito de terapia de combinação com anti-angiogênicos, incluindo sorafenib (um regime sendo testado nas experiências da Fase 2) em CDC induzido por JX-594 está sendo investigado.

[00106] Exemplo 6: Efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e reovírus na indução de anticorpos específicos de tumor mediando

CDC

[00107] Os estudos foram designados para mostrar que os vírus oncolíticos competentes de replicação diferencialmente induzem anticorpos específicos de tumor mediando CDC. A indução de anticorpo pode ser reforçada por expressão de citocinas imunoestimuladoras. No primeiro desses efeitos de vacínia oncolitica, GM-CSF e reovírus na indução de anticorpos específicos de tumor mediando a resposta de CDC foi avaliado e os dados são mostrados na Figura 9.

[00108] Coelhos portadores de tumor VX2 foram tratados com duas infusões intravenosas semanalmente de PBS, JX-594 inativado por UV expressando GM-CSF humano, JX-594 expressando GM-CSF humano, JX-594 expressando JX-594 de murino, JX-963 ou reovírus (n=2). Os vírus foram administrados em uma dose de 1 x 109pfu. O soro foi coletado em valor de referência e 3 semanas após o inicio do tratamento. O soro de coelho foi incubado com as células A2780 in Uitro nas concentrações indicadas durante 3 horas. A viabilidade celular relativa à viabilidade de células A2780 incubadas com soro de pré-tratamento foi avaliada usando o kit CCK-8.

[00109] A partir desses estudos pode ser observado que JX-594 expressando GM-CSF humano (uma citocina que é biologicamente ativa em coelhos) induziu o inicio de CDC em uma concentração de soro de 2,5%. A atividade de CDC completa foi alcançada em S°/o de concentração de soro. De modo semelhante, CDC induzido por JX-963 em 2,5% de concentração de soro, com CDC máximo alcançado em 5°/, de concentração de soro. A indução de anticorpos mediando CDC foi dependente da replicação da vacínia oncolítica em coelhos como incubação de A2780 com o soro coletado de coelhos tratados com JX- 594 inativado por UV expressando GM-CSF humano (transformado em incompetente de replicação) ou PBS não induziu CDC em qualquer concentração testada. De modo semelhante, o soro coletado de coelhos tratados com reovírus e vírus de RNA de filamento duplo cjue está atualmente em desenvolvimento clínico como um agente oncolítico, não induziu CDC em qualquer concentração testada. Finalmente, o tratamento com JX-594 expressando GM-CSF de murino (que não é tão biologicamente ativo em coelhos como GM-CSF humano) induziu CDC somente em concentrações mais elevadas do soro. Esses resultados indicam que a expressão da citocina imunoestimuladora GM-CSF pode potencializar a indução de anticorpos antitumor mediando CDC.

[OO11O] Exemplo 7: Vacínia Oncolítica. Os efeitos de GM-CSF e VSV na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer humano

[00111] No próximo conjunto de estudos, os efeitos da vacínia oncolitica. GM-CSF e VSV na indução de anticorpos especificos de tumor mediando a resposta de CDC foi avaliado e os dados são mostrados na Figura 10.

[00112] Para esses experimentos, os coelhos portadores de tumor VX2 foram tratados com duas infusões intravenosas semanalmente de JX- lO 594 expressando GM-CSF humano (1 x jQ9 pfu), JX-594 expressando JX-594 de murino (1 x j(j)9 pfu), vacínia de Westem reserve (1 x jQ9 pfu), Virus de estomatite vesicular (VSV) ( 6 x 10' pfu) ou VSV expressando GM-CSF de murino { 6 x q9 pfu) (n=2). O soro foi coletado em valor de referência e 3 semanas após o início do tratamento. O soro de coelho foi incubado com as células A2780 in Uitro nas concentrações indicadas durante 3 horas. A viabilidade celular relativa à via'bilidade de células A2780 incubadas com soro de pré-tratamento foi avaliada usando o kit CCK-8.

[00113] Neste experimento, JX-594 expressando GM-CSF humano (JX- 594) foi mais eficiente na indução de CDC mediando anticorpos, com uma diminuição na viabilidade celular aparente após a incubação com 1,25°6 e 2,5% de soro. Em contraste, o tratamento com JX-594 expressando GM-CSF de murino (que não é tão biologicamente ativo em coelhos como GM-CSF humano) induziu CDC somente em concentrações mais elevadas de soro (observe: como um controle adicional, VSV expressando GM-CSF de murino não induz CDC em qualquer concentração testada). Além disso, o tratamento de coelhos com a cepa de westem resewe do tipo selvagem de vacmia (que não codifíca GM-CSF) foi menos eficiente na indução de anticorpos mediando CDC. Finalmente o tratamento com o vírus de RNA de sentido negativo de filamento único VSV induziu anticorpos de mediação de CDC somente na concentração de soro mais elevada testada (10%). Esses resultados sugerem que dependendo da biologia do virus oncolítico, níveis diferentes de resposta de CDC podem ser observados.

[00114] Exemplo 8: Efeitos de VSV-GM-CSF e HSV Oncolítico and na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer humano

[00115] Neste conjunto de experimentos, o VSV-GM-CSF e HSV oncolítico na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer humano foi avaliado e os dados são mostrados na Figura 11.

[00116] Os coelhos portadores de tumor VX2 foram tratados com duas infusões intravenosas semanalmente de VSV expressando GM-CSF de murino (6 x jQ8 pfu) ou Vírus de herpes simples (HSV) (1 x jQ9 pfu) (n=2). O soro foi coletado em valor de referência e 3 semanas após o início do tratamento. O soro de coelho foi incubado com células A2780 in Uitro nas concentrações indicadas durante 3 horas. A viabilidade celular relativa à viabilidade de células A2780 incubadas com soro de pré-tratamento foi avaliada usando o ki't CCK-8.

[00117] Neste experimento, HSV foi mais eíiciente na indução de CDC mediando anticorpos, com uma diminuição da viabilidade celular aparente após a incubação com S°/o e 1O°/j de soro. VSV expressando GM-CSF não induziu CDC neste experimento (embora alta variabilidade tenha sido observada na condição de soro a 1O°/o).

[00118] Exemplo 9: Efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e VSV na indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em células de câncer de coelho derivadas do tumor alvo in ÜiÜo.

[00119] Neste conjunto de experimentos, os efeitos de vacínia oncolítica, GM-CSF e VSV na indução de anticorpos especificos de tumor mediando CDC nas células de cãncer cle coelho de um tumor alvo in uiuo foram avaliados e os dados são mostrados na Figura 12.

[00120] Os coelhos portadores de tumor VX2 foram tratados com duas infusões intravenosas semanalmente de JX-594 expressando GM-CSF human.o (1 x jç)9 pfu), JX-594 expressando JX-594 murino (1 x jQ9 pfu), Vacínia. Westem reserue (1 x jQ9 pfu), Víms de estomatite vesicular (VSV) ( 6 x jQ8 pfu) ou VSV expressando GM-CSF de murino (6 x jQ8 pfu) ou JX-594 inativado por UV expressando GM-CSF humano {n=2). O soro foi coletado em valor de referência e 3 semanas após o início do tratamento. O soro de coelho foi incubado com as células VX2 in uitro durante 24 horas. A viabilidade celular relativa à viabilidade de células VX2 incubadas com soro de pré-tratamento foi avaliada usando o kit CCK-8.

[00121] Para induzir CDC nas células alvo VX2, complemento adicional contido no soro coletado antes da administração do vírus oncolítico foi aumentado em 3°/0 de soro pós-t.ratamento. Como nos experimentos anteriores, JX-594 inativado por UV não foi capaz de induzir os anticorpos mediando CDC neste ambiente. JX-594 expressando GM- CSF humano, JX-594 expressando GM-CSF de murino e vacínia westem reserue todos induziram CDC neste ensaio, suportando a capacidade dos vírus da vacínia competentes de replicação induzir anticorpos anti-tumor mediando CDC (neste ambiente as células alvo foram derivadas do tumor contra o qual os anticorpos foram aumentados nos coelhos tratados com virus oncolitico). VSV (+/-GM- CSF de murino) não foi tão eficiente como indução de anticorpos anti-

tumor quanto quaisquer dos vírus de vacínia oncolíticos testados.

[00122] Exemplo 10: Expressão de GM-CSF de murino e a vacínia oncólvica mediam a indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em um modelo de tumor de murino

[00123] Neste exemplo, os efeitos da vacínia oncolítica e GM-CSF de murino mediam a indução de anticorpos específicos de tumor mediando CDC em modelo de tumor de murino, foram avaliados e os dados são mostrados na Figura 13.

[00124] Os camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados com quatro infusões intravenosas semanalmente de JX-594 expressando GM-CSF humano, JX-594 expressando JX-594 de murino, PBS ou JX-594 inativado por UV expressando GM-CSF humano (n=3). Os vírus foram administrados em uma dose de 1 x jQ7 pfu. O soro foi coletado no valor de rcferência e 4 semanas após o inicio do tratamento.

O soro de camundongo foi incubado com as células A2780 in uitro durante 24 horas. A viabilidade celular relativa à viabilidade de células A2780 incubadas com o soro de pré-tratamento foi avaliada usando o kit CCK-8.

[00125] Os experimentos de CDC foram repetidos em um modelo de camundongo singênico (camundongo Ba1b/ C portador de tumores CT28 subcutâneos). JX-594 expressando GM-CSF de murino foi mais potente na indução de anticorpos anti-tumor mediando CDC. Tanto JX-594 expressando GM-CSF humano (jX-594; GM-CSF humano é conhecido por não ser ativo em roedores) bem como JX-594 inativado por UV expressando GM-CSF de murino tivera'm um efeito intermediário na indução de CDC (quando comparando com PBS e JX- 594 expressando GM-CSF de murino). Isto pode indicar que neste modelo de camundongo tanto a replicação bem como a expressão de

GM-CSF de murino de alto nivel (que somente ocorre sob tratamento com o esqueleto de vacínia competente de replicação) é necessário para induzir os anticorpos anti-tumor de título elevado que mediam CDC in uitro.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1 - Composição, caracterizada por que compreende um vírus oncolíti- co competente de replicação para utilização num método de tratamento de tumor por indução de uma resposta citotóxica (CDC) dependente de complemento mediada por anticorpo específico para um tumor, com- preendendo o método: (a) administrar uma quantidade eficaz da referida composição para induzir anticorpos no referido animal uma resposta que medeiam uma resposta CDC específica para o referido tumor e, em seguida, (b) obter uma amostra de sangue do animal, compreendendo os referidos anticorpos e / ou células B que produzem ditos anticorpos e (c) confirmar a presença dos referidos anticorpos e / ou células B que produzem os citados anticorpos na dita amostra de sangue.
2 - Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o referido vírus oncolítico é selecionado a partir do grupo que consiste em vírus vaccinia, vírus da estomatite vesicular e vírus do herpes simplex.
3 - Composição, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por que o vírus é o vírus vaccinia.
4 - Composição, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por que o referido vírus oncolítico é JX-594.
- Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o referido vírus oncolítico compreende um ácido nucleico heterólo- go, a citada sequência de ácido nucleico heterólogo codifica GM-CSF, a citosina-desaminase, a carboxil-esterase, NIS ou o receptor da estoma- tostatina.
6 - Composição, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizada por que a referida sequência de ácido nucleico heterólogo codifica GM-CSF.
Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por o referido tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblas- toma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosarcoma, neuroblastoma, adenoma pituitário, meduloblastoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, carcinoma da próstata, carcinoma das células renais, câncer do pâncreas, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer ósseo, câncer retal, câncer do ovário, sarcoma, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer cervical, fibrossarcoma, carcinoma das células escamo- sas, neurectodermal, tumor da tireóide, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, hepatoma, mesotelioma, carcinoma epidermóide e doen- ças tumorais do sangue.
8 - Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o método compreende ainda o isolamento de anticorpos que produ- zem resposta CDC a partir do referido sangue.
9 - Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o método compreende ainda a expansão ou o isolamento dos cita- dos anticorpos e / ou a produção de anticorpos a partir das referidas células B para a produção de um medicamento de imunoterapia e a administração do medicamento ao dito animal.
- Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que o método compreende ainda expandir ou isolar os ditos anticorpos e / ou a produção de anticorpos a partir das referidas células B para a produção de um medicamento de imunoterapia e administrar o medi- camento a um animal diferente tendo o mesmo câncer.
11 - Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 9 e 10, caracterizada por que no método o referido animal é tratado com agente terapéutico anticancerígeno adicional.
12 - Composição, de acordo com a Reivindicação 9 ou a Reivindicação 10, caracterizada por que o referido animal ou dito animal diferente tem um tumor sólido e o referido medicamento de imunoterapia é administrado de modo intratumoral, intravenoso, intraperitoneal ou uma combinação dos mesmos, sendo o referido tumor sólido opcional- mente ressecado antes, concorrente ou subsequentemente à adminis- tração do citado medicamento de imunoterapia.
13 - Composição, de acordo com a Reivindicação 9 ou a Reivindicação 10, caracterizada por que o citado animal ou dito animal diferente tem um tumor sólido e a citada administração reduz a dimensão do referido tumor e/ou reduz a propagação metastática do dito tumor sólido.
14 - Composição, de acordo com a Reivindicação 9 ou a Reivindicação 10, caracterizada por que o referido cãncer é selecionado a partir do grupo que consiste em astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibros- sarcoma, neuroblastoma, adenoma hipofisário, meduloblastoma, cãncer de cabeça e pescoço, melanoma, carcinoma da próstata, carcinoma das células renais, câncer do pâncreas, câncer da mama, câncer do pulmão, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer ósseo, câncer retal, câncer, sarcoma, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer cervical, fibrossarcoma, carcinoma das células escamo- sas, neurectodermal, tumor da tireóide, linfoma de Hodgkin do ovário, linfoma, hepatoma, mesotelioma não -Hodgkin, carcinoma epidermóide e doenças tumorais do sangue.
- Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que, no método, o soro obtido a partir da amostra de sangue da etapa (b) é contatado com um vetor de expressão, compreendendo o vetor de expressão uma biblioteca de cDNA preparada a partir de uma célula de câncer e são identificados um ou mais antígenos que são reconhecidos pelo referido soro.
16 - Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 15, caracterizada por que o animal é um ser humano.
17 — Composição, caracterizada por que compreende anticorpos isolados de produção de resposta CDC, conforme definidos na Reivindi- cação 8, sendo a composição de preferência soro coletado a partir do referido animal.