JP6457003B2 - 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与による腫瘍抗原に対する抗体の生成および腫瘍特異的補体依存性細胞傷害の生成 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１１年１月４日出願の、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／４２９６２２号の優先権の利益を主張するものである。

連邦政府資金による研究開発
本発明は、「腫瘍溶解性ウイルスに関する研究；トランスレーショナルリサーチおよび臨床的応用」と題された、韓国ヘルステクノロジーR&Dプロジェクト、大韓民国、厚生家族省（Ministry for Health, Welfare, and Family Affairs）によって認められたGrant No. A060001（ホスト組織 プサン大学校、研究期間 2001年3月から2009年6月）の下、韓国政府の支援によってなされた。

発明の分野
本発明は、癌治療の介入のための新たな作用機序、ならびにこのような新たな作用機序に基づく癌治療のために考案された方法および組成物に関する。

発明の背景
新規な作用機序（ＭＯＡ）を用いた新たな癌治療が必要とされている。現在の治療は、通常、単一薬剤として使用すると限られた有効性しか有さないので、実務上は最大効果のために組み合わせて使用されている。新規な薬剤は、理想的には承認された療法との交差耐性がなく、複数の相補的ＭＯＡを有するべきである^１〜４。「遺伝子治療」（複製不全ウイルスへの治療用導入遺伝子の導入）^５〜７および癌ワクチン（腫瘍抗原、同時刺激分子および／またはサイトカインの発現）^８〜１０を含む、異なるアプローチを用いる癌治療のための遺伝子組換えウイルスが開発されてきた。しかしながら、遺伝子治療は、十分な数の癌細胞への局所的および全身的な送達が非効率的であるために、現在まで患者では失敗している。対照的に、ウイルスに基づく癌ワクチンは、腫瘍免疫回避および進行した巨大な癌を有する患者における効果に関して宿主因子への排他的依存により限定されている。免疫回避は、単一腫瘍抗原および／または単一サイトカインの発現に依存するワクチンアプローチで最も可能性が高い。広範な治療用癌ワクチンは、複数の腫瘍抗原、サイトカイン、免疫細胞の動員と活性化、および免疫応答の危険信号を発現させるために必要とされる。

対照的に、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を感染させて、細胞内で増殖し、その後溶解するウイルスの天然の能力を利用するために開発された^{１１〜１４}。第一世代の腫瘍溶解性ウイルスは、本質的に癌選択的であった（例えばレオウイルス^{１５〜１６}、ＶＳＶ^{１７〜１８}）が、第二世代のウイルスは、癌選択性のために設計された（例えばアデノウイルス^{１９〜２０}および単純ヘルペスウイルス^{２１〜２２}欠失変異体）。これらの薬剤による臨床試験データは、安全性と癌選択性を示したが、治療効果は腫瘍内直接注射後または静脈注射後の両方で限定され^２３；しかし全身拡散および／または遠隔腫瘍への再現可能な送達は限定された。したがって、全身的な抗癌効果および転移性腫瘍への血液伝播の送達は、改善される必要があった。

これら３つのウイルスに基づく個々の方法それぞれの可能性と限界の両方を考慮に入れ、各々の最良の特質を組み合わせて、単一の治療薬に最適化することが可能かどうかを本発明者らは検討した。標的化および武装した腫瘍溶解性ポックスウイルスには、それを実現する可能性がある。ＪＸ−５９４は、１）直接の複製によって媒介される腫瘍溶解性および２）有効な癌ワクチン接種を含む、３つの相補的ＭＯＡを持つように設計された第三世代腫瘍溶解性ポックスウイルス治療薬である。ＪＸ−５９４は、合成初期−後期プロモーターおよびｐ７．５プロモーターの制御下で、腫瘍ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の破損と、それぞれヒト顆粒球−単球コロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）およびβ−ガラクトシダーゼ導入遺伝子の発現とを有するＷｙｅｔｈワクシニアウイルスワクチン由来の腫瘍溶解性を有する^２４。ワクシニアは、腫瘍への血液伝播送達に関して、血中で安定なために、ウイルス骨格として用いた^２５。ＪＸ−５９４は、同時の癌細胞溶解と内在性腫瘍抗原放出、抗原提示細胞の活性化を支持するｈＧＭ−ＣＳＦの発現、免疫エフェクター細胞の動員、および炎症性サイトカインの誘発を経て癌ワクチン接種を誘導するように設計されている。ワクシニア自体のクリアランスは、主に、細胞性免疫機序を介する感染細胞のクリアランスによる。

本発明者らは、目下、本技術分野で必要とされている新しい癌療法に取り組むための腫瘍溶解性ウイルスを用いる癌の治療法を見出した。

本発明は、以下の工程を含む、腫瘍を有する動物において腫瘍特異的抗体に媒介される補体依存性細胞傷害応答を誘導するのに用いる方法および組成物に関する：複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該動物に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体の産生が該動物において誘導される、工程。

特定の実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、腫瘍を有する動物において腫瘍特異的抗体に媒介される補体依存性細胞傷害応答を誘導する方法を提供する：複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該動物に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体が該動物において誘導される、工程。より具体的には、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、腫瘍を有さない動物においてはＣＤＣ応答を誘導しない。

腫瘍溶解性ウイルスは、任意の腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。典型的なそのようなウイルスは、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、インフルエンザウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、ヒトハンタウイルス、粘液腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス類、セネカバレーウイルスおよびシンドビスウイルスからなる群から選択されてもよい。特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ポックスウイルスである。使用され得る腫瘍溶解性ウイルスの特定の例としては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現する変異型ワクシニアウイルス、ｐ５３発現ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＯＮＹＸ−１５、Ｄｅｌｔａ２４、ＶＡ１領域に変異を有するアデノウイルス、Ｋ３ＬまたはＥ３Ｌ領域に変異を有するワクシニアウイルス、テロメライシン、テロメライシン−ＧＦＰ、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子に変異を有するパラポックスウイルスｏｒｆウイルス、Ｇｅｎｅｌｕｘウイルス、およびγ（１）３４．５遺伝子に変異を有するヘルペスウイルスが挙げられる。特定の典型的な実施形態において、腫瘍溶解性ポックスウイルスは、ＪＸ−５９４である。腫瘍溶解性ウイルスは、治療導入遺伝子または他の導入遺伝子を含むことも。例えば、この導入遺伝子は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする異種核酸配列、または他のサイトカイン、ケモカイン、マーカーおよび／もしくはイメージング遺伝子、自殺遺伝子、プロドラッグ酵素遺伝子カルボキシルエステラーゼとシトシンデアミナーゼ、腫瘍抑制遺伝子等であってもよい。

抗体が産生される腫瘍には、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、上衣細胞腫、シュワン腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭頚部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直腸癌、卵巣癌、肉腫、胃癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉性腫瘍、甲状腺腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、中皮腫、類表皮癌、および血液の腫瘍化疾患からなる群から選択される腫瘍を含むが、これらに限定されない任意の腫瘍であり得る。

また、以下の工程を含む、抗腫瘍ＣＤＣ応答を媒介する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法も含まれる：複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を患者に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体が誘導される、工程。該方法は、投与後に患者から血液を採取する工程、およびＣＤＣ応答を生ずる抗体を該血液から単離する工程をさらに含んでもよい。

また、ある腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体を誘導するのに有効な量と様式で複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを用いて治療された患者の血液から単離されたＣＤＣ応答を生ずる抗体を含む組成物も意図される。特定の実施形態において、組成物は患者から収集した血清である。

また、癌細胞を本発明の組成物と接触させる工程を含む、癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を殺傷する方法も意図される。特定の実施形態において、該接触させる工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで癌細胞を該組成物と接触させることを含む。別の実施形態において、該接触させる工程は、収集した抗体、収集したＢ細胞、収集したＢ細胞が産生した抗体、またはそれらの組み合わせを含む組成物を、癌を有する患者に注入することを含む。本発明の治療方法では、癌細胞は患者の体内にあり得、該接触させる工程は、該組成物を含む薬物を投与することを含む。さらなる実施形態において、治療方法は、患者にさらに抗癌治療薬を投与する工程をさらに含み得る。

本発明は、癌患者を治療する方法をさらに含み、該方法は、ある腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体を誘導するのに有効な量と様式で複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを用いて治療された患者の血液から単離されたＣＤＣ応答を生ずる抗体を含む本発明の組成物を含有する組成物を、該患者に投与する工程を含む。一部の実施形態において、組成物は患者にとって自己由来であり、かつ該癌患者から単離されて、該癌患者に再注入される。別の実施形態において、組成物は、癌患者にとって異種であり、該組成物を用いて治療される該癌患者とは異なる癌患者から単離される。いずれにしても、患者はさらなる抗癌治療薬で治療され得る。

本発明の治療方法において、癌患者は固形腫瘍を有することもあり、かつ組成物は、腫瘍内、静脈内、腹膜内にまたはそれらの組み合わせで投与される。特定の実施形態において、癌患者は、本発明の組成物の投与の前に、投与と同時にまたは投与に続いて切除される、固形腫瘍を有する。一部の実施形態において、癌患者は固形腫瘍を有し、組成物は該腫瘍の大きさを低下させる。別の実施形態において、癌患者は固形腫瘍を有し、該投与は固形腫瘍の転移拡散を減少させる。本治療方法では、癌は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣細胞腫、シュワン腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭頚部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直腸癌、卵巣癌、肉腫、胃癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉腫瘍、甲状腺腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、中皮腫、類表皮癌および血液の腫瘍化疾患からなる群から選択され得る。

本発明は、以下を含む癌療法を癌患者に適合させる方法の教示を提供する：
（ａ）複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該患者に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該患者内で該癌に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体の産生が該患者において誘導される、工程；
（ｂ）該患者から血液を単離する工程であって、該血液が、該癌に対する収集した抗体、収集したＢ細胞を含む、工程；
（ｃ）該患者に特異的な免疫療法組成物を生成するために、該抗体を増大させるもしくは単離する工程、または該Ｂ細胞から抗体を産生する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の免疫療法組成物を該患者に投与する工程。
このような方法では、免疫療法組成物は、抗体の単離後直ちに投与されてもよい。あるいは、免疫療法組成物は、該患者のさらなる治療的処置用に保管される。

本発明のさらなる態様は、腫瘍特異抗原を同定する方法に関し、該方法は、癌細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターにクローニングする工程；ある腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体を誘導するのに有効な量と様式で複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを用いて治療された患者に由来する血清と該発現ベクターを接触させることによって一次免疫スクリーニングを行う工程であって、該血清が該腫瘍溶解性ウイルスの投与および該ＣＤＣ特異的応答の生成の後に該患者から単離される、工程；ならびに、該血清によって認識される該ｃＤＮＡライブラリーから抗原を単離する工程を含む。
[本発明1001]
以下の工程を含む、腫瘍を有する動物において腫瘍特異的抗体に媒介される補体依存性細胞傷害応答を誘導する方法：
複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該動物に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体が該動物において誘導される、工程。
[本発明1002]
前記腫瘍溶解性ウイルスの投与が、腫瘍を有さない動物においてはＣＤＣ応答を誘導しない、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、インフルエンザウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、ヒトハンタウイルス、粘液腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス類、セネカバレーウイルスおよびシンドビスウイルスからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性ポックスウイルスである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ＪＸ−594、ｐ53発現ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＯＮＹＸ−15、Ｄｅｌｔａ24、ＶＡ1領域に変異を有するアデノウイルス、Ｋ3ＬまたはＥ3Ｌ領域に変異を有するワクシニアウイルス、テロメライシン、テロメライシン−ＧＦＰ、ＯＶ20．0Ｌ遺伝子に変異を有するパラポックスウイルスｏｒｆウイルス、Ｇｅｎｅｌｕｘウイルス、およびγ（1）34．5遺伝子に変異を有するヘルペスウイルスからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記腫瘍溶解性ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記腫瘍溶解性ウイルスがＪＸ−594である、本発明1004の方法。
[本発明1008]
前記腫瘍溶解性ウイルスが導入遺伝子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
異種核酸配列がＧＭ−ＣＳＦ、シトシンデアミナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ＮＩＳ、ソマトスタチン受容体をコードする、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記腫瘍が、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣細胞腫、シュワン腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭頚部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直腸癌、卵巣癌、肉腫、胃癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉腫瘍、甲状腺腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、中皮腫、類表皮癌および血液の腫瘍化疾患からなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
以下の工程を含む、抗腫瘍ＣＤＣ応答を媒介する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法：
複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を患者に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体の産生が誘導される、工程。
[本発明1012]
前記投与の後、前記患者から血液を採取する工程、および、ＣＤＣ応答を生ずる抗体を該血液から単離する工程をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
本発明1012の方法によって単離されたＣＤＣ応答を生ずる抗体を含む、組成物。
[本発明1014]
前記組成物が前記患者から収集された血清である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を殺傷する方法であって、該癌細胞を本発明1013の組成物と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1016]
前記接触させる工程が、癌細胞を前記組成物とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることを含む、 本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記接触させる工程が、癌患者に、収集した抗体、収集したＢ細胞、該収集したＢ細胞が産生した抗体、またはそれらの組み合わせを含む組成物を注入することを含む、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記癌細胞がｉｎ ｖｉｖｏで患者の体内にあり、前記接触させる工程が、前記組成物を含む薬物を投与することを含む、本発明1015の方法。
[本発明1019]
前記患者にさらなる抗癌治療薬を投与する工程をさらに含む、本発明1001、1011または1015の方法。
[本発明1020]
癌患者を治療する方法であって、本発明1013の組成物を含む組成物を該患者に投与する工程を含む、方法。
[本発明1021]
前記組成物が、前記患者にとって自己由来であり、かつ前記癌患者から単離されて、該癌患者に再注入される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記癌患者にとって異種である前記組成物が、該組成物を用いて治療される該癌患者とは異なる癌患者から単離される、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記患者が、さらなる抗癌治療薬を用いて治療される、本発明1020の方法。
[本発明1024]
前記癌患者が固形腫瘍を有し、前記組成物が、腫瘍内に、静脈内に、腹膜内に、またはそれらの組み合わせで投与される、本発明1020の方法。
[本発明1025]
前記癌患者が、本発明1012の組成物の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に切除される固形腫瘍を有する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記癌患者が固形腫瘍を有し、前記組成物が該腫瘍の大きさを低下させる、本発明1020の方法。
[本発明1027]
前記癌患者が固形腫瘍を有し、前記投与によって該固形腫瘍の転移拡散が減少する、本発明1020の方法。
[本発明1028]
前記癌が、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣細胞腫、シュワン腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭頚部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直腸癌、卵巣癌、肉腫、胃癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉腫瘍、甲状腺腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、中皮腫、類表皮癌および血液の腫瘍化疾患からなる群から選択される、本発明1020の方法。
[本発明1029]
以下の工程を含む、癌療法を癌患者に適合させる方法：
（ａ）複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該患者に投与する工程であって、該組成物の投与によって、該患者内で該癌に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体の産生が該患者において誘導される、工程；
（ｂ）該患者から血液を単離する工程であって、該血液が、該癌に対する収集した抗体、収集したＢ細胞を含む、工程；
（ｃ）該患者に特異的な免疫療法組成物を生成するために、該抗体を増大させるもしくは単離する工程、または該Ｂ細胞から抗体を産生する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の免疫療法組成物を該患者に投与する工程。
[本発明1030]
前記免疫療法組成物が、前記抗体の単離後直ちに投与される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記免疫療法組成物が、前記患者のさらなる治療的処置用に保管される、本発明1029の方法。
[本発明1032]
以下の工程を含む、腫瘍特異抗原を同定する方法：
（ａ）癌細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターにクローニングする工程；
（ｂ）本発明1011の患者に由来する血清と該発現ベクターを接触させることによって一次免疫スクリーニングを行う工程であって、該血清が該腫瘍溶解性ウイルスの投与後に該患者から単離される、工程；および
（ｃ）該血清によって認識される該ｃＤＮＡライブラリーから抗原を単離する工程。

本発明をより完全に理解するために、ここで、添付の図面と組み合わせて以下の説明を参照する。
ＶＸ２腫瘍を有するウサギに注射したＪＸ−５９４の血清効果を示す。血清は、ベースライン、ＪＸ−５９４またはＰＢＳの処置から３週後および６週後に収集した。ＶＸ２は、酵素処理によってＶＸ２組織から単離され、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でｉｎ ｖｉｔｒｏで８継代、維持された。図１Ａにおいて、単離したＶＸ２腫瘍細胞は、ＪＸ−５９４を注射したＶＸ２を有するウサギ由来の血清によって殺傷されたが、ウサギＰＢＭＣは殺傷されず、ＰＢＳを注射したＶＸ２を有するウサギ由来の血清によって殺傷されず、ＪＸ−５９４を注射した正常なウサギの血清によって殺傷されなかった。（正常なウサギとＶＸ２を有するウサギに）注射したＪＸ５９４から、またはＶＸ２を有するウサギに注射したＰＢＳから得た３％血清は、単離したＶＸ２細胞またはウサギＰＢＭＣ中で処置された（各動物（各条件に対してｎ＝３）の各血清試料を３通作成し、各動物に対する反応数＝９を意味する）。図２Ｂは、ＶＸ２を有するウサギへのＪＸ−５９４注射後の血清の、単離したＶＸ２細胞に対する時間依存的抗腫瘍効果を示す。ＪＸ−５９４（各ウサギに対して１０^９ｐｆｕ）を試験当日と７日目に注射し、血清を各時点で連続的に得た。図２Ｃは、ＶＸ２を有するウサギへのＪＸ−５９４注射後の血清の、単離したＶＸ２細胞に対する用量依存的抗腫瘍効果を示す。図２Ｄは、ＪＸ−５９４を注射した血清のウエスタンブロット分析を示す。 図２Ａは、ヒト血清を注射したＪＸ−５９４の処置後（＃３０１腎細胞癌患者への４サイクルのＪＸ−５９４注射から９２日目）の、ヒトＲＣＣ ＳＮＵ３４９細胞系の代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。ａ、ｄ−血清（５％）を添加する前；ｂ、ｅ−血清（５％）の添加から１０分後；ｃ、ｆ−血清（５％）の添加から３０分後（３０分の時点で蛍光が表示されなかった）；ｇ−ａ画像内の黄色領域の拡大図；ｈ−ｂ画像内の赤色領域の拡大図（ＣＤＣ作用の典型である、膜侵襲形成（ＭＡＦ）による細胞溶解（赤色の矢印）に注目されたい）。図２Ｂは、＃３０１腎細胞癌（ＲＣＣ）患者から得た５％血清（４サイクルのＪＸ−５９４注射から９２日目）の添加後の、異なる種類のヒトＲＣＣ細胞系の細胞生存率の変化を示す。星印は、各ＪＸ−５９４注射を示す。図２Ｃは、＃１０３肺癌患者から得た５％血清（４サイクルのＪＸ−５９４注射から９２日目）の添加後の、異なる種類の肺癌細胞系の細胞生存率の変化を示す。星印は、各ＪＸ−５９４注射を示す。 難治性固形癌患者におけるＪＸ−５９４での複数回処置後に、抗体に媒介される補体依存性癌細胞細胞溶解が生じたエビデンスを示す。図３Ａは、同一患者由来の異なる種類の血清を図示する。（ａ）ＪＸ−５９４処置前のベースラインの未処置血清（血清Ａと名付ける）；（ｂ）ＪＸ−５９４処置後９２日目に得た血清（血清Ｂと名付ける）；（ｃ）補体熱不活化のために、血清Ｂを５６℃で３０分間処置した（血清Ｃと名付ける）；（ｄ）５０％血清Ａを５０％血清Ｃに添加した（血清Ｄと名付ける）。図３Ｂにおいて、Ｉｇ除去樹脂（ＰｒｏｒｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）アルブミン／Ｉｇキット、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カラムで血清を処置した（血清Ｅと名付ける）。図３Ｃは、血清Ｂ、ＣまたはＤ（各々５％）の処置後、ヒト癌細胞系の代表的な光学顕微鏡観察の画像を示す。顕微鏡撮影は、＃３０１ ＲＣＣ患者から得た血清Ｂ、ＣまたはＤをＳＮＵ３４９ ＲＣＣ細胞系中で処置してから４時間後に行った。図３Ｄは、癌細胞殺傷能力が喪失した状態での熱処置持続の影響を示す。（ａ）熱不活化した血清Ｃに同量の未処置血清（血清Ａ）を添加した後、この混合血清を培養したＡ２７９０細胞またはＳＮＵ３４９細胞に添加した。血清の殺傷作用は有意に回復し、血清Ｂを含んでいる癌特異的抗体への補体の添加を示唆した。ＣＤＣにおいて、抗原抗体複合体は、補体の主要な活性化剤である。抗体は標的特異性を決定するが、補体の活性化は膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成による細胞溶解を誘導する。（ｂ）最終的に、殺傷活性の喪失を引き起こしていた血清ＢをＩｇＧ除去カラム（ＰｒｏｒｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）アルブミン／Ｉｇキット、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で溶出し、ＩｇＧがＣＤＣにとって重要であり得ることを示唆した。 異なる種類のヒト癌細胞系において選択されたＪＸ−５９４治療患者の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のプロファイルを示す。５％血清による細胞存在率（第１相患者および第２相患者に対するＪＸ−５９４処置から４２〜９２日目と５６日目の保存試料を用いた）対各患者（図４Ａ〜４Ｄ）に由来するベースライン未処置５％血清による細胞存在率の逆の比率として、ＣＤＣ活性が示された。異なるヒト癌細胞系および正常細胞系において、ＪＸ−５９４で処置された＃３０１ ＲＣＣ患者（図４Ａ）、＃３０４黒色腫患者（図４Ｂ）、＃１７０２ ＨＣＣ患者（図４Ｃ）および＃１７０５ ＨＣＣ患者（図４Ｄ）に由来する血清によるＣＤＣ活性のプロファイルを示す。 第１相（原発性および転移性肝臓瘤）ならびに第２相ＪＸ−５９４臨床試験（肝細胞癌）に登録した患者におけるＪＸ−５９４処置後のＣＤＣの総合分析を示す。図５Ａは、第１相患者：Ａ２７８０細胞での生存時間対ＣＤＣ活性の逆転を示す。図５Ｂは、異なるＨＣＣ細胞系における第２相患者（ｎ＝１８）のＣＤＣ時間依存的変化を示す。図５Ｃ〜５Ｅは、異なるＨＣＣ細胞系、ＳＵＮ７３９（図５Ｃ）、ＳＮＵ４７５（図５Ｄ）またはＳＮＵ４４９（図５Ｅ）、におけるＣＤＣ応答患者に由来する血清のＣＤＣプロファイルを示す。ＪＸ−５９４処置後５６日目での＜８０％細胞生存率を応答者と指定した。 ＪＸ−５９４を注射した患者から得たヒト血清についてのウエスタンブロット分析を示す。 ＪＸ−５９４を注射した血清によるスニチニブのｉｎ ｖｉｔｒｏでの相乗作用を示す。 ＪＸ−５９４を注射した血清によるソラフェニブのｉｎ ｖｉｔｒｏでの相乗作用を示す。 ＪＸ−５９４を注射した血清によるソラフェニブのｉｎ ｖｉｖｏでの相乗作用を示す。 Ｓｅｒｅｘに関する方法の概要を示す。 ＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびレオウイルスの効果を示す。この図は、表示した血清濃度での３時間のインキュベーション後に処置前の対照と比べたＡ２７８０の細胞生存率を示す。血清は、表示した介入により静脈内処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギから収集した。 ヒト癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果を示す。この図は、表示した血清濃度での３時間のインキュベーション後に処置前の対照と比べたＡ２７８０の細胞生存率を示す。血清は、表示した介入により静脈内処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギから収集した。 ヒト癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ＨＳＶおよびＶＳＶ−ＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。この図は、表示した血清濃度での３時間のインキュベーション後に処置前の対照と比べたＡ２７８０の細胞生存率を示す。血清は、表示した介入により静脈内処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギから収集した。 ｉｎ ｖｉｖｏ標的腫瘍由来のウサギ癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果を示す。この図は、ＶＸ２移植前に収集した７％血清を添加した処置後の３％血清ともに２４時間インキュベーションした後に、処置前の対照と比べたＶＸ２の細胞生存率を示す。腫瘍溶解性ウイルスを用いて静脈内処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギから収集した血清をＸ軸に示す。 腫瘍溶解性ワクシニアおよびマウスＧＭ−ＣＳＦの発現は、マウス腫瘍モデルにおいてＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導を媒介する。この図は、処置後の５％血清とともに２４時間インキュベーションした後に、処置前の対照と比べたＡ２７８０の細胞生存率を示す。腫瘍溶解性ウイルスを用いて静脈内処置したＣＴ２６腫瘍を有するウサギから収集した血清をＸ軸に示す。

発明の詳細な説明
腫瘍溶解性ウイルスは、それらの作用の一次機序としてウイルス複製に依存する癌細胞溶解を引き起こすが、この癌特異的免疫の誘導は、前臨床モデルにおいても主要な活性メディエーターになり得る。しかし、抗癌免疫の機能的誘導は、これまで癌患者において示されなかった。ＪＸ−５９４は、抗癌免疫の誘導を増大させるためにヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように設計された標的化腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ＪＸ−５９４は、臨床試験に参加した患者において腫瘍反応と関連した複製およびＧＭ−ＣＳＦ発現を示した。

本発明において、ウサギと、続いて原発性または転移性の肝腫瘍の患者の両方において、ＪＸ５９４が抗腫瘍免疫の機能的誘導を媒介することを本発明者らは見出した。抗体に媒介される補体依存性癌細胞細胞傷害（ＣＤＣ）は、ウサギと、第１相試験で腫瘍型の多様な多数のアレイを有する患者において、ＪＸ−５９４処置によって誘導された。続いて、ＣＤＣ誘導は、肝細胞癌の第２相試験に参加した患者において確認された。多くの場合、１〜５％の血清においてさえ、有意なＣＤＣが明白でありつづけた。ＣＤＣ応答は、患者のそれと同じ細胞組織学の腫瘍細胞系に対して、より共通して見られた。正常な細胞は、ＣＤＣ作用に抵抗性であった。最も長い生存期間を有する患者は、ＣＤＣ活性が最も高かった。本発明者らが知る限り、これは、以下のことを初めて証明するものである：１）患者での腫瘍溶解性ウイルスによる機能的抗癌免疫の誘導、２）癌患者での治療ウイルスによるＣＤＣの誘導、および３）生成物が腫瘍型の多様なアレイによって、かつ所定の標的抗原の発現に依存することなく、患者にワクチン接種する能力。

加えて、本発明者らは、ＪＸ−５９４処置によって誘導されたポリクローナル抗体によって認識される標的抗原を同定するために、ＳＥＲＥＸスクリーニングを行った。細胞溶解の直接効果に加えて、ＪＸ−５９４処置は、固形腫瘍を有する患者において機能的全身性癌標的抗体およびＣＤＣの誘導をもたらす。さらに、ＪＸ−５９４による処置を方法として用いて、種々の癌型の患者において関連する腫瘍抗原を同定することができる。

本発明が基づいている知見をさらに概説すると、本発明者らが見出したことは、難治性肝癌の患者での第１相臨床試験においてＪＸ−５９４が癌特異的複製、ＧＭ−ＣＳＦ発現、白血球刺激（好中球、好酸球および単球）ならびに、腫瘍内投与（３週ごとに１回、計２〜８回）後の客観的な癌応答を実証したこと；非注射腫瘍に対する感染および有効性も実証したことである^２６。肝細胞癌（ＨＣＣ）患者において隔週３回の腫瘍内投与を評価するために、第２相試験が開始され、予備的な抗腫瘍活性は、第２相試験でも観察された。今日まで安全性は容認されてきており、最もよく見られる副作用は一過性インフルエンザ様症状である。ｈＧＭ−ＣＳＦを発現するＨＳＶ欠失変異体^２７は、第２相臨床試験で黒色腫に対して腫瘍応答を示した。

ウイルス複製および導入遺伝子発現は、臨床試験で再現的に示されているが、全身性抗癌免疫誘導は、検討が始まったばかりである^２８。しかし、機能性免疫機序は、直接示されなかった。治療された患者において抗癌免疫応答を明らかにすることができれば、ＪＸ−５９４と他の免疫賦活ウイルスの有用性および将来の腫瘍溶解生成物の設計は劇的に改善されるであろう。したがって、本発明者らは、ＪＸ−５９４治療の間および治療後の抗癌免疫を評価しようと努めた。

本発明者らは、前臨床モデルで、続いて第１相および第２相の試験において肝腫瘍を有する患者で、さらに免疫誘導を評価した。ベースラインおよびＪＸ−５９４治療に続いて経時的に得た保存血清試料は、評価のために利用した。抗体に媒介される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、細胞殺傷の強力な機序であり^３０、および腫瘍細胞系に対するＣＤＣ活性は、機能的全身性抗癌免疫の直接的尺度である。また、本発明者らは、異なる組織構造からなる腫瘍細胞系パネルに対する患者の血液中での抗体に媒介されるＣＤＣの誘導に与えるＪＸ−５９４の影響も、経時的に評価した。本明細書に提示した日付は、１）患者での腫瘍溶解性ウイルスによる機能的抗癌免疫の誘導、２）癌患者での治療ウイルスによるＣＤＣの誘導、および３）生成物が腫瘍型の多様なアレイによって、かつ所定の標的抗原の発現に依存することなく、患者にワクチン接種する能力について、初めて明確に実証するものであることを示している。

本発明は、腫瘍溶解性ウイルスが、抗体に媒介される腫瘍特異的ＣＤＣ応答をもたらすことができるという発見に基づいている。特定の実施形態において、ポリペプチドなどの免疫調節ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列を有する組換え腫瘍溶解性ウイルスが、自然免疫応答または炎症反応を減弱すると意図される。

腫瘍溶解性ウイルスを用いて行った特定の試験では、本発明者らは、ウイルス複製がＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導する際に重要であることを示した。多数の実験（例えば、図９〜１３を参照されたい）では、ＵＶ不活化対照ウイルスで処置された動物から収集した血清でのＣＤＣ誘導の欠如を実証した。使用した種々の腫瘍溶解性ウイルスのうち、ＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導することでワクシニアウイルスが最良であるが、しかしＨＳＶおよびＶＳＶも有効であることが判明した。具体的には、ＨＳＶ、次いでＶＳＶは中間表現型を有するが、レオウイルスは試験したモデルにおいてＣＤＣを誘導できることを示さなかった。

ウイルス生物学に基づいて、異なるレベルのＣＤＣ応答が観察でき、およびそのデータ観察から、（エンベロープ）ｄｓＤＮＡウイルスは、ＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導するときに最も強力であるとみなすことが可能である。

加えて、この試験は、腫瘍溶解性ウイルスからのＧＭ−ＣＳＦ発現がＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導するウイルスの能力を増強し得ることを示した。これらの試験は、そのうちのＧＭ−ＣＳＦを一例として用いることができる、腫瘍溶解性ウイルス複製中に発現される免疫賦活サイトカインを用いて、ＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導するそのような腫瘍溶解性ウイルスの能力を増強することができ得ることを原理的に示している。

腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、レトロウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスとアデノウイルス、もしくは同種のもの、またはそれらの組換え変異体からなる群から選択されてもよい。有用であり得る典型的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、ＪＸ−５９４、ウイルスを発現するｐ５３、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＯＮＹＸ−１５、Ｄｅｌｔａ２４、ＶＡ１領域に変異を有するアデノウイルス、Ｋ３ＬまたはＥ３Ｌ領域に変異を有するワクシニアウイルス、テロメライシン、テロメライシン−ＧＦＰ、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子に変異を有するパラポックスウイルスｏｒｆウイルス、および□１３４．５遺伝子に変異を有するヘルペスウイルスからなる群から選択される腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。特定の典型的な実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスはＪＸ−５９４である。

異種核酸配列は、腫瘍溶解性ウイルスによって送達されることになるいずれの治療用タンパク質であってもよい。

さらに別の実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ニューロンがサイレント状態であり、およびポリメラーゼ（例えば、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼ）；または構造タンパク質（例えば、ヌクレオカプシドタンパク質、リン酸化タンパク質または基質タンパク質）；または糖タンパク質（例えば、外被タンパク質）などのウイルス遺伝子の発現、複製または増大に必要とされる腫瘍溶解性ウイルスポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に結合した１つまたは複数の異種ウイルス配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。さらなる実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＲＥＳを２つまたは３つ有し、各ＩＲＥＳは、腫瘍溶解性ウイルスポリペプチドをコードする異なる核酸配列に機能的に結合する。例えば、第１のＩＲＥＳは、腫瘍溶解性ウイルスポリペプチドに結合してもよく、および第２のＩＲＥＳは構造タンパク質または糖タンパク質に結合してもよい。さらなる実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合した第１のＩＲＥＳと、腫瘍溶解性ウイルス糖タンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合した第２のＩＲＥＳと、腫瘍溶解性ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合した第３のＩＲＥＳとを有する。別の実施形態では、ＩＲＥＳは、ヒトライノウイルス２などのライノウイルスからのＩ型ＩＲＥＳなどのピコルナウイルスＩＲＥＳ、もしくは口蹄病ウイルスまたはその任意の組み合わせである。

本発明の特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスを用いて、腫瘍を有する動物において腫瘍特異的抗体に媒介される補体依存性細胞傷害応答を誘導し、該態様は、複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を該動物に投与することを含み、該組成物の投与によって、該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体が産生される。その際に、腫瘍細胞の増殖を阻害し、または腫瘍細胞の殺傷を促進するために、腫瘍溶解性ウイルスを用いてもよい。

該方法は、通常、それが投与される動物において腫瘍特異的抗体に媒介されるＣＤＣを誘導するのに十分な感染多重度で組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含むことになる。腫瘍細胞は、それに対して抗腫瘍応答が所望されるいずれの腫瘍細胞であってもよい。腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍溶解性ウイルスと接触させることもある。

一部の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは動物にｉｎ ｖｉｖｏで投与される。該投与は、静脈または動脈への血管内投与であってもよい。例えば、肝腫瘍の場合、腫瘍溶解性ウイルスはカテーテルなどの留置型医療装置を経て肝動脈に投与されてもよい。別の実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、血管内、腫瘍内、または腹膜内に投与されてもよい。

特定の実施形態において、本発明の方法は、ヒト患者が有する特異的腫瘍に対する、腫瘍特異的抗体に媒介されるＣＤＣ応答を該ヒト内で産生することによる、ヒト患者における癌の治療に関する。例えばそのような方法は、腫瘍特異的抗体に媒介されるＣＤＣ応答を産生するのに十分なＭＯＩで、本明細書に記述する１種または複数種の腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む。この応答は、ヒト患者内で腫瘍細胞の増殖を遅らせるおよび／または腫瘍細胞を殺傷するのに十分であることが意図される。一部の実施形態において、この応答は、患者に腫瘍溶解性ウイルスを直接投与することによってｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍を治療するのに有用であろう。別の実施形態において、患者の腫瘍細胞が摘出されて、腫瘍特異的抗体に媒介されるＣＤＣ応答が該腫瘍細胞に対してｅｘ ｖｉｖｏで生成される。次いで、このｅｘ ｖｉｖｏ応答で産生された抗体は、患者内の癌に対する自己由来の抗体療法で腫瘍を有する患者に投与される。あるいは、産生された抗体は、該腫瘍細胞を最初に得た個人と異なる患者に投与されることもある。

腫瘍特異的抗体に媒介されるＣＤＣ応答を生成するための本明細書に記述する腫瘍溶解性ウイルスの使用は、例えば、乳癌（例えば乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば卵巣細胞腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌（肺小細胞癌と非肺小細胞癌を含む）、骨癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、膵癌、皮膚癌、線維肉腫、慢性または急性白血病（急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ管肉腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、結節性小分割細胞型リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞系のびまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫とＨＩＶ関連体腔リンパ腫を含む）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、血管内皮腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症と他のＢ細胞性リンパ腫、上喉頭癌、頭部または頸部癌、粘液肉腫、脂肪肉腫、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰部癌、移行上皮癌、食道癌、悪性ガストリン産生腫瘍、小腸癌、胆管細胞癌、腺癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道、陰茎癌、精巣癌、悪性奇形腫、小児期固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盤癌、悪性髄膜腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘導されたもの、例えば中皮腫を含む、環境誘導の癌、およびこれらの癌の組み合わせを含む、広範な腫瘍細胞または癌の治療に有用であり得ることを理解されたい。

腫瘍溶解性ウイルスは患者に送達される必要があり得るいかなる異種核酸を含んでもよいとさらに理解されたい。

用語「治療的有効量」または「有効量」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは患者（例えばヒト、霊長類、イヌ、ブタまたはウシ）内のいずれかで腫瘍細胞の増殖を減少させる、阻害する、または抑制するのに十分な組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物の量をいう。本明細書に述べたように、腫瘍細胞増殖の減少、阻害または抑制は、壊死、アポトーシスまたは免疫応答の結果であり得る。治療的に有効である組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物の量は、組成物で用いられる特定の腫瘍溶解性ウイルス、治療される患者の年齢および状態、または腫瘍形成の程度などによって変化し得る。

本発明の方法で使用される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、経口、動脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐薬の経路で、または埋め込み（例えば、緩徐解放分子を用いて）による好都合な方法で投与されてもよい。補助的療法の投与経路に応じて、免疫療法薬のような、それに含まれる薬剤は、酵素、酸および、さもないと該薬剤を不活化し得る他の天然状態の作用からそれらを保護する物質で被覆されることが必要なこともある。非経口投与以外で組成物を投与するために、薬剤は、不活化を予防する物質で被覆される、または該物質とともに投与される。

本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、非経口的に、または腹膜内に投与されてもよい。また、腫瘍溶解性ウイルス成分の分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製されてもよい。貯蔵および使用の通常の条件の下で、これらの調製物は、微生物の増殖を予防する防腐剤、例えばゲンタマイシンのような抗生物質を含んでもよい。

本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体および／または希釈液」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。生物活性物質に対して、そのような媒質および薬剤を用いることは、当分野で周知である。抗菌剤などの補充有効成分も組成物に組み込まれことができる。

担体は、例えば、水、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要とする粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって保持し得る。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによってもたらされることができる。

無菌の注射液は、本明細書に列挙した種々の他の成分とともに本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルスを必要量の適切な溶媒に取り込み、その後に必要に応じて適切な無菌化を行うことによって、調製される。一般に分散物は、塩基性分散媒と上記に列挙したものから他の必要な成分とを含む無菌溶媒に、さまざまな無菌化有効成分を取り込むことで調製される。無菌の注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技法であり、それによって、その事前に滅菌濾過した溶液から、組換え腫瘍溶解性ウイルスと任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。

投与の容易性および投与量の均一性のために用量単位の形態で非経口組成物を製剤化することは、有利になり得る。本明細書で用いる投与単位形態は、治療を受ける哺乳類患者のための統一された投与量として適している物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体と関連して所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の活性物質を含有する。

本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、ゲル状化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスの方法によって製造されてもよい。薬学的ウイルス組成物は、活性な組換え腫瘍溶解性ウイルスを生物学的にまたは薬学的に用いることができる製剤へと製剤化することを容易にする、１種または複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いる従来の様式で製剤化されてもよい。組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、本開示の薬学的組成物または獣医学用組成物を生成するために、１種または複数の生物学的に活性な薬剤と組み合わせることができ、かつ、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに製剤化されてもよい。

治療用途用の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤は、医薬分野で公知であり、本明細書および例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, ed., 18th Edition (1990)) およびCRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S. C. Smolinski, ed. (1992))に記載されている。特定の実施形態において、組換え型腫瘍溶解性ウイルス組成物は、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、希釈剤または水溶性賦形剤、例えば水もしくはマンニトール溶液（例えば、約１％〜約２０％）、疎水性溶液（例えば油もしくは脂質）またはそれらの組み合わせ（例えば油と水の乳濁液）とともに製剤化されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記述する生物学的組成物または薬学的組成物のいずれかは、防腐剤もしくは安定剤（例えば抗生物質）を有するか、または無菌である。

本開示の生物学的組成物または薬学的組成物は、該組成物が患者に投与されるとそれに含まれる組換え腫瘍溶解性ウイルスが生物学的に利用可能となるように製剤化することができる。投与後の血清、腫瘍および他の組織中の組換え腫瘍溶解性ウイルスの濃度は、抗体に基づいたアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）などの種々の確立した技術によってモニターされることができる。特定の実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、非ヒト動物またはヒトなどの、それを必要とする患者（例えば腫瘍を有する患者）への非経口投与用に製剤化される。好ましい投与経路は、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内または筋肉内経路が挙げられる。

当技術分野で知られているように、適当な製剤は、選択される投与経路に依存する。例えば、全身性製剤は、例えば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内または経肺の投与のために設計されたものを含む実施形態である。一実施形態では、全身性製剤または腫瘍内製剤は無菌である。注射のための実施形態において、本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、水溶液中で、またはハンクス液、リンゲル液、マンニトール溶液もしくは生理食塩緩衝液などの生理的に適合した溶液もしくは緩衝液中で製剤化され得る。特定の実施形態において、本明細書に記述するいずれかの組換え腫瘍溶解性ウイルス組成物は、懸濁剤、安定化剤または分散助剤などの製剤化剤を含んでもよい。経粘膜投与のための実施形態において、浸透剤、可溶化剤または浸透すべき膜に適している皮膚軟化剤を製剤で用いてもよい。例えば、１−ドデシルヘキサヒドロ−２Ｈ−アゼピン−２−オン（Ａｚｏｎ（登録商標））、オレイン酸、プロピレングリコール、メントール、ジエチレングリコールエトキシグリコールモノエチルエーテル（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標））、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）、および薬物７−クロロ−１−メチル−５−フェニル−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（Ｄｉａｚｅｐａｍ）、ミリスチン酸イソプロピル、ならびに当分野で一般的に知られている浸透剤、可溶化剤または皮膚軟化剤などのその他は、本開示のいずれの組成物で用いられてもよい。

投与は、例えば動脈内を用いる第１の投与に続いて静脈内もしくは腫瘍内経路を経る投与、またはそれらの任意の組み合わせなどの経路の組み合わせを用いて達成され得る。

特定の実施形態において、本開示は、抗腫瘍ＣＤＣ応答を媒介する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法を提供し、該方法は、複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を患者に投与する工程であって、該組成物の投与によって、腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体が産生される、工程を含む。複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスの投与によって生成される、腫瘍特異的抗体に媒介される抗腫瘍ＣＤＣ応答を用いて、癌細胞の増殖を阻害し得ることまたはさらに癌細胞を殺傷し得ることが、本発明者らによって示された。このように、本開示により、動物において腫瘍特異的ＣＤＣ応答を生成するのに十分な感染多重度で組換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することで腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または腫瘍細胞を殺傷する。特定の実施形態において、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、１回を上回って、好ましくは２回、３回または最高１０回まで投与される。特定の別の実施形態において、腫瘍細胞はｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処置される。

本開示の方法を用いて治療し得る腫瘍または癌の例としては、肝細胞癌、乳癌（例えば乳腺細胞癌）、卵巣癌（例えば卵巣細胞腫）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌（肺小細胞癌と非肺小細胞癌を含む）、骨癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟骨肉腫、膵癌、皮膚癌、線維肉腫、慢性または急性白血病（急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ管肉腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、結節性小分割細胞型リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞系のびまん性大細胞型リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫とＨＩＶ関連体腔リンパ腫を含む）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、血管内皮腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症と他のＢ細胞性リンパ腫、上喉頭癌、頭部または頸部癌、粘液肉腫、脂肪肉腫、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰部癌、移行上皮癌、食道癌、悪性ガストリン産生腫瘍、小腸癌、胆管細胞癌、腺癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道、陰茎癌、精巣癌、悪性奇形腫、小児期固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盤癌、悪性髄膜腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されたもの、例えば中皮腫を含む環境誘発の癌、およびこれらの癌の組み合わせが挙げられる。

複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスで癌患者を処置することによって該患者における抗体に媒介される腫瘍特異的ＣＤＣ応答を発生させることが可能であると本発明が示していることから、本発明者らは、複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を癌を有する患者に投与して、該患者の該癌に特異的なＣＤＣ応答を媒介する抗体を産生させることにより、癌療法を該癌患者に特異的に適合させることが可能であり得ることを見出した。一旦この応答が生じたならば、腫瘍特異的抗体および癌に対するＢ細胞を含む血清を患者から収集して、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させる。この増大した抗体集団および／または該抗体を産生する収集したＢ細胞を該癌患者に特異的である免疫療法組成物として用いる。このように、この免疫療法組成物は、患者に投与されて抗癌効果をもたらすことができる。抗体を単離した直後に免疫療法組成物を調製して患者に投与することができ、または該患者の治療におけるその後の段階でのさらなる治療に備えて保管することができる。

Ｂ細胞および抗体のｅｘ ｖｉｖｏ増大の方法は、当業者にとって公知であり、単に、抗体を産生する細胞を培養により増殖させて、標準的なタンパク質精製技術を用いて抗体を収集することを含む。

さらに別の実施形態において、該方法は、好ましくは動脈を介した、または留置型医療装置を介した、組換え腫瘍溶解性ウイルスの非経口投与を含む。上述のように、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍特異抗原に結合する抗体（例えば、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体）などの免疫療法薬または免疫調節薬とともに投与されることができる。別の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルス治療は、手術（例えば腫瘍摘出／切除）、放射線療法、化学療法または免疫療法と併用されてもよく、かつ補体治療の前後または治療の際に投与されることができる。

例えば、本発明の方法は、患者に腫瘍溶解性ウイルスを投与することによって抗体に媒介される腫瘍特異的ＣＤＣ応答を発生させる工程を含むことが意図され、ここで該患者は、腫瘍溶解性ウイルスの投与との併用で、ヒトに対するさらなる癌療法で治療される。特定の実施形態において、さらなる癌療法は、化学療法、放射線療法、手術、免疫療法、遺伝子療法またはその組み合わせである。特定の実施形態において、癌細胞はヒトの体内に存在し、および／または導入ステップは、少なくとも約１×１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の腫瘍溶解性ウイルスをヒトに投与する工程とさらに定義される。

癌を有する人々の約６０％は、予防手術、診断手術または進行度診断手術、根治的手術および緩和手術を含むいくつかの手術を受けることになると推測されている。根治的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などの他の療法と組み合わせて用いてもよい。

根治的手術は、癌組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍を少なくとも一部、物理的に除去することをいう。腫瘍切除に加えて、手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気手術および微視的に制御された手術（モース術）を含む。本発明が表在癌の除去、前癌の除去または付随的な量の正常細胞の除去と組み合わせて用いられ得ることがさらに意図される。

癌細胞、組織または腫瘍の部分切除または全切除の後に、体内に空隙が形成されることもある。本明細書に記述される腫瘍溶解性ウイルスの投与などの追加的な抗癌療法を用いて、癌領域の灌流、直接注射または局所投与によって治療が達成され得る。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１週、２週、３週、４週および５週ごとに、または１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月もしくは１２ヵ月ごとに繰り返されてもよい。これらの治療は、さまざまな投与量であってもよい。

本発明の治療法では、腫瘍溶解性ウイルスを用いて、患者内の腫瘍または癌に対する抗体媒介応答をもたらす。該応答は、例えば、癌細胞を殺傷する、癌細胞内でアポトーシスを誘導させる、癌細胞の増殖速度を減少させる、転移の発生率もしくは回数を減少させる、腫瘍の大きさを低下させる、腫瘍の増殖を阻止する、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を減少させる、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進する、癌の進行を防ぐもしくは阻止する、または癌患者の寿命を増大させることによって、癌または腫瘍の治療をもたらすのに十分である。より全般的には、抗体または抗体を産生するＢ細胞を従来の抗癌療法と併用して用いて、細胞を殺傷するまたは増殖を阻止する併用効果をもたらす。

以下の非限定的実施例は、本開示の種々の態様を例示するために提供する。すべての参考文献、特許、特許出願、公開された特許出願等は、参照によって本明細書にそれら全体を組み込まれる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明者らによって見いだされ、本発明の実行において十分に機能する技術を表し、したがって本発明を実行するための望ましい方法を構成するとみなされ得ることを当業者は認識するであろう。しかし当業者は、本開示を鑑みて、開示される特定の実施例において多数の変更がなされ得ることを認識し、かつ本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができるであろう。

実施例１：方法
ウイルスおよび細胞系：本試験全般にわたって、ＪＸ−５９４、ワイス変種ワクシニアウイルス（チミジンキナーゼ［ＴＫ］−不活化、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現）を用いて、以前に発表したように調製した^２４。ＳＮＵ３４９、ＳＵＮ４８２とＳＮＵ２６７（ヒト腎細胞癌；韓国細胞バンク［ＫＣＬＢ］から取得）およびＳＮＵ４７５とＳＮＵ３９８（ヒト幹細胞癌；ＫＣＬＢから取得）をペニシリンとストレプトマイシンとともに１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）培地で培養した。ＨＯＰ６２、Ｈ１５７、Ｈ４６０とＰＣ１０（ヒト肺癌；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ］から取得）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌；ＡＴＣＣから取得）、ＳＦ−２９５（ヒト胆嚢癌；ＡＴＣＣから取得）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌；ＡＴＣＣから取得）、ＰＡＮＣ−１（ヒト膵癌；ＡＴＣＣ）、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌；ＡＴＣＣ）をペニシリンとストレプトマイシンとともに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＭＲＣ−５非形質転換細胞（肺線維芽細胞；ＡＴＣＣ）およびＨＵＶＥＣ（内皮細胞；ＡＴＣＣ）ＭＲＣ−５をペニシリンとストレプトマイシンとともに２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した内皮細胞培地ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社，ＭＤ，ＵＳＡ）で培養した。

ウサギＶＸ２腫瘍モデルおよびＶＸ２細胞の単離：ＶＸ２腫瘍は、近交系のニュージーランドホワイトウサギ（Ｓａｍｔａｋｏ社，Ｏｈ−Ｓａｎ，Ｋｏｒｅａ）の筋肉内で増殖させて、維持した。ＶＸ２断片の骨格筋への移植から３週後および４週後に、ＪＸ−５９４（１×１０^９ｐｆｕ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。ＪＸ−５９４またはＰＢＳ処置後、血清をベースライン、３週後および６週後に収集した。以前に記述したようにＶＸ２を単離した^３１。手短に述べると、ＶＸ２細胞をＶＸ２組織から酵素で単離して（コラゲナーゼ０．０１％、プロテアーゼ０．１％を用いて、４℃で一晩）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともにダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でｉｎ ｖｉｔｒｏで８継代の間、維持した。各細胞生存度試験では、新鮮なＶＸ２細胞を使用した。並行研究では、ＪＸ−５９４を正常な腫瘍のないウサギに注射して、血清を得た。

細胞生存率およびＣＤＣ分析：血清（熱処置なし）を添加すると、細胞生存率は低下した。ＣＤＣ活性は、９６穴プレート中で５％血清とともにインキュベートした後に、細胞生存率を測定することによって評価した。ＪＸ−５９４投与後の血清中の細胞生存率を、ベースライン（ＪＸ−５９４処置の前）でのウサギまたは患者の血清の細胞生存率に対して正規化した。各細胞系を９６穴プレートに播種して、一晩インキュベートした。続いて、ＤＭＥＭ（ＦＢＳは添加せず）と血清試料とともに細胞を３７℃で４時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳと１０μＬのセルカウンティングキット−８（ＣＣＫ−８）溶液（ＣＣＫ−８キット、Ｄｏｊｉｎｄｏ社，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）に曝露し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞生存率は、４５０ｎｍでの光学密度で測定した。

ウエスタンブロット分析：ＶＸ２細胞、ウサギ末梢血単核細胞、ＳＮＵ３４９またはＳＮＵ７３９細胞を約１×１０^６細胞／ｍＬで、ＰＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）タンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｋｏｒｅａ）中、氷上で３０分間溶解した。遠心分離後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて５０μｇのタンパク質を分離し、次いでＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に転写した。血清を０．１％ＴＢＳＴ（５％スキムミルク粉末；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ；１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）で１／１００に希釈して、ＰＶＤＦ膜上で、室温で９０分間インキュベートした。次いで、０．１％ＴＢＳＴ（ウサギ一次血清）で１／１０，００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｔａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）、または抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社＃Ａ１５４３、１：５，０００）（ヒト一次血清）とともに該膜を室温で１時間インキュベートし、次いで増強化学発光（ＥＣＬキット；Ｐｉｅｒｃｅ社，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で可視化した。

蛍光および共焦点顕微鏡観察：各細胞系を６穴プレートに播種して、細胞を２４時間インキュベートし、細胞密度は１００％に達した。蛍光染色のために、ＳＮＵ３４９細胞をカバーガラス底培養皿に３×１０^５細胞で播種して、一晩放置した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）および７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（細胞毒性のためのＡＣＴ１（商標）アッセイ、Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を加えて、生存細胞および死細胞をそれぞれ染色した。生細胞においてＣＳＦＥ（全細胞中の緑色蛍光）を検出でき、赤色蛍光は死細胞の核中で検出できる。

ＳＥＲＥＸ試験：ｃＤＮＡライブラリーをＳＮＵ４４９、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞系から抽出したｍＲＮＡから構築した。このｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰ発現ベクター（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット、［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，ＣＡ］）中にクローニングした。増幅したライブラリーの力価は、１×１０^９ｐｆｕ／ｍＬであり、５×１０^５ｐｆｕをヒト血清に対する一次免疫スクリーニングで用いた。４２℃で６〜８時間のインキュベーション後に、ファージプラークが出現した。次いでそれを、予め３０分間、１０ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，ＵＳＡ）に浸しておいた１３２ｍｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｂｅｄｆｏｒｄ）に転写した。ニトロセルロース膜を、５％ＢＳＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社，ＵＳＡ）でブロックした。ＪＸ−５９４処置したＨＣＣ患者由来（Ｄ５７ ＪＸ−５９４注射後）のプールした血清を一次および二次スクリーニングで用いた。最も高いＣＤＣ活性を有する患者由来の血清をこの試験のためにプールした（患者＃１７０２、＃１７０３、＃１７０４、＃１７０５、＃１７１２、＃１７１３および＃１７１５）。プールした血清（１：１００に希釈した血清６ｍL）を一次抗体スクリーニングのために加え、１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ社，ＵＳＡ）を用いて結合抗体を検出し、次いで該膜をＢＣＩＰ／ＮＢＴプレミックス溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，ＵＳＡ）で発色させた。膜に対応する寒天プレートから青いプラークを抜き取って、クロロホルム２０μＬを含むＳＭ緩衝液（ＮａＣｌ １００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＭｇＳＯ_４ １０ｍＭ）に入れた。７０プレートをスクリーニングした（１ラウンドに対して５プレート）後、７０個の陽性プラークを単離した。第２ラウンドのスクリーニング（８２ｍｍのプレート）後、１１個のプラークを単クローンに精製した（＞９０％高密度の陽性ファージ）。各クローンからＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡの配列決定を行った。

ドットブロット分析：各陽性クローンに対して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物をＳＭ緩衝液で５倍に希釈し、希釈した溶解物１μＬをワットマン膜（Ｗｈａｒｔｍａｎ社，Ｇｅｒｍａｎｙ）の試験紙の上にスポットした。５分間風乾した後に、すべての試験紙をブロッキング溶液に１時間浸した。１：５０のＪＸ−５９４を注射する前（試験当週、２週間前、４週間前）または注射した後（Ｄ５７）のヒト血清中で、膜を１時間インキュベートした。１：２５００に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，ＵＳＡ）を用いて結合した抗体を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液で発色させた。

実施例２：ＣＤＣを動物モデルおよびヒト患者の両方で誘導させる
腫瘍を有し、ＪＸ−５９４で処置したウサギ由来の血清とともに腫瘍細胞をインキュベートした後、細胞生存率の低下が観察された。
ウサギモデルでＣＤＣの誘導を調べるために、筋肉内に移植したＶＸ２腺癌を有し、ＪＸ−５９４またはＰＢＳ対照で処置したウサギから血清を収集した。注射後２８日目に収集した血清をｉｎ ｖｉｔｒｏで３％の濃度で、ＶＸ２細胞またはウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に添加した。細胞生存率の有意な低下（約９０％）は、ＪＸ−５９４で処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギ由来の血清とともにインキュベートした細胞でのみ観察された（図１Ａ）。ＰＢＳで処置したＶＸ２腫瘍を有するウサギ由来、またはＪＸ−５９４で処置した腫瘍のないウサギ由来の血清とともにインキュベートしたＶＸ２細胞は、細胞生存率の低下を示さなかった。さらに、ＰＢＭＣでの生存率は、いずれの処置群に由来する血清とともにインキュベートしても、有意な低下を示さなかった。続いて、ＪＸ−５９４（またはＰＢＳ）での処置後の種々の時点で収集した血清とともにインキュベートして、ＶＸ２細胞生存率を評価した。ＶＸ２腫瘍を有し、ＪＸ−５９４で処置したウサギにおいて１８日目以降から収集した血清とともにインキュベートすると、ＶＸ２細胞生存率は低下した（図１Ｂ）。血清濃度を上げると（２％まで）、ＶＸ２細胞生存率の用量依存的低下を示した（図１Ｃ）。２％血清とともに細胞をインキュベートすると、対照の正常なウサギ血清による処置と比較して、約２０％のＶＸ２細胞生存率がもたらされた。ＶＸ２を有しＪＸ−５９４で処置したウサギ由来の血清が新規の抗原に結合するかどうかを評価するために、未処置ウサギおよび腫瘍を有しＪＸ−５９４で処置したウサギに由来する血清を用いて、ＶＸ２細胞溶解物およびＰＢＭＣ細胞溶解物でウエスタンブロット分析を行った。新規の抗原に対する強い反応性は、ＶＸ２細胞系の溶解物でのみ観察され、ＶＸ２腫瘍を有するウサギをＪＸ−５９４で処置すると、複数の新しいバンドが認識され、ＶＸ２腫瘍抗原に対するポリクローナル抗体が誘導されたことを示していた（図１Ｄ）。

ＪＸ−５９４で処置した患者由来の血清とともにインキュベートしたヒト癌細胞系の細胞生存率の低下のエビデンス。
腫瘍を有しＪＸ−５９４で処置したウサギ由来のウサギ血清とともにインキュベートすることでもたらされた細胞生存率の有意な低下が認められたので、ＪＸ−５９４で処置した患者から収集した血清においても同様な活性が観察されるかどうかを特定しようとした。本発明者らは、第１相の肝腫瘍試験で治療されている二人の患者由来の血清の試験を開始した。両患者は、ＪＸ−５９４処置後に有意な応答を示し、生存期間は長期であった（患者１０３：肺癌、生存期間２４．５ヵ月；患者３０１：腎細胞癌、生存期間４４．１＋ヵ月）^２６。実際に、前臨床のモデルでの観察と同様に、ＪＸ−５９４で処置した患者の血清（５％）とともにインキュベートした癌細胞系は、細胞生存率の有意な低下をもたらした（図２Ａ）。これらの患者の癌と同じ起源の癌細胞系を試験したところ、細胞生存率の時間依存的低下がほとんどの細胞系で観察された。明視野顕微鏡下で細胞を可視化することによって、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成が明らかになり、細胞生存率の低下がＣＤＣによってもたらされることを示した（図２Ｂ）。ＣＳＦＥおよび７−ＡＡＤの色素を用いて、生細胞と死細胞をそれぞれ染色した。７−ＡＡＤ染色は、ＪＸ−５９４免疫患者由来の血清で処置した細胞が細胞死を起こしていることを示している。

実施例３：細胞生存率の低下は、抗体に媒介される補体依存性細胞傷害に起因する
次に、ＪＸ−５９４で処置した患者由来の血清が癌細胞の細胞傷害性を媒介する機序を評価するために、抗体および補体の寄与を試験した。ＪＸ−５９４で処置した患者由来の血清を熱不活化させて、全ての補体活性を阻害した。ＩｇＧを結合するカラムを用いて、血清由来の抗体を除去した（図３Ａの実験概要を参照されたい）。ベースライン血清（ＪＸ−５９４処置前、血清Ａ）、ＪＸ−５９４処置後９２日目に得た血清（血清Ｂ）、血清Ｂを熱不活化させたもの（血清Ｃ）、および血清ＢをＩｇＧ樹脂に通したもの（血清Ｅ）を５％濃度で癌細胞系の単層に添加した。ベースラインで収集した血清は、細胞生存率の低下を示さなかったが、ＪＸ−５９４処置開始後９２日目で収集した血清は、強い抗腫瘍活性を示した。しかし、細胞は熱不活化またはＩｇＧ欠乏後も生存可能な状態であった。さらに、（ベースラインで収集されそれ自体は細胞生存率の低下を示さない血清Ａの添加によって）血清Ｃの機能的補体を回復させると、抗腫瘍活性の回復がもたらされた。第１相試験で治療された計３名の患者（３０１−腎細胞癌；１０３−肺癌；３０４−黒色腫）に由来する血清試料を用いて同様の観察を行った（図３Ｂ）。血清インキュベーション後の細胞系（患者３０１）の明視野像を図３Ｃに示す。最終的に、細胞生存率における時間依存的増加は、熱不活化の長さに関連して観察された（図３Ｄ）。

腫瘍細胞に特異的であり、かつ同じ腫瘍型の細胞においてより有効なＣＤＣ活性
次に、ＪＸ−５９４で処置した患者由来の血清が、ｅｘ ｖｉｖｏで正常なヒト細胞に対して細胞傷害性を引き起こすことができるかどうかを調べた。ＨＵＶＥＣ内皮細胞およびＭＲＣ−５肺線維芽細胞は、試験した５名の患者のいずれかに由来する血清とともにインキュベートした場合、細胞生存率の有意な低下を示さなかった。概して、細胞生存率の低下は、その起源が該患者の腫瘍型（腎細胞癌、黒色腫および肝細胞癌）に対応する細胞で観察された（図４Ａ〜Ｄ）。生存期間対ＣＤＣ第１相。

無作為第２相試験で評価したＣＤＣ誘導
継続中の無作為第２相試験で処置された肝細胞癌の患者でのＣＤＣ誘導を分析した。ＪＸ−５９４で処置された患者由来の血清とともにインキュベートした肝細胞癌の細胞系において細胞生存率の低下が観察された。ＣＤＣ活性は、時間とともに増加した（図４Ｂ概要、図４Ｃ〜４Ｅ個々の細胞系）。

実施例４：ＳＥＲＥＸスクリーニングは、新規の内在性腫瘍抗原の同定をもたらす
患者血清が新規の抗原を結合するかどうかを評価するために、患者の腫瘍と同じ組織起源の癌細胞系からの細胞溶解物と、患者血清（第１相および第２相試験の患者に由来するもので、有意なＣＤＣを示していた）とを用いて、ウエスタンブロット分析を行った。新規の抗原に対する強い反応性は、ＪＸ−５９４処置後の血清において観察され、患者の内在性腫瘍抗原に対するポリクローナル抗体が誘導されたことを示唆する（図６）。新規の標的抗原を同定するために、ヒト肝細胞癌の細胞系（ＳＮＵ４４９）から生成されたｃＤＮＡライブラリー上で強いＣＤＣ活性を有する肝細胞癌の患者に由来するプールした血清を用いて、ＳＥＲＥＸスクリーニングを行った。２ラウンドのスクリーニングの後、１７の候補抗原を同定した（図７、表１）。抗原のサブセット、例えば、ＲｅｃＱタンパク質様（ＤＮＡヘリカーゼＱ１様）（ＲＥＣＱＬ）およびレプチン受容体（ＬＥＰＲ）は、ＨＣＣまたは他の癌の標的として以前に同定されているが、その他［ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害因子１（ＥＲＲＦＩ１）、リソソームタンパク質膜貫通４アルファ（ＬＡＰＴＭ４Ａ）およびＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢ１Ｂ）を含む］は、推定のＨＣＣ抗原であり、ＨＣＣ中の新規の標的に潜在的に相当する。ＪＸ−５９４処置の前に収集した患者の血清の反応性を、同定した１１の抗原に対する反応性について試験した。抗原のサブセットに対する抗体は、ＪＸ−５９４処置の前に存在していたが、一般に、反応性はＪＸ−５９４治療後に強くなり、複製能を有するポックスウイルスによる処置が腫瘍抗原を認識するポリクローナル抗体を誘導することを示唆している。

実施例５：考察
癌に対する第１の癌免疫療法（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ社，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）の承認により、癌治療に対するこの新規の方法が有効となった。自己由来の樹状細胞集団は、患者に再注入する前に、ＧＭ−ＣＳＦに融合させた前立腺癌の抗原に曝露され、この方法は、去勢抵抗性前立腺癌患者の生存を向上させることが示されている^３２。非特異的な免疫賦活方法も、免疫賦活サイトカイン、例えばＩＬ−２による処置を含む癌免疫療法として評価されている。免疫賦活サイトカインまたは同時刺激分子と関連して、腫瘍抗原を発現する多くの複製不可能なウイルスワクチンが腫瘍ワクチンとして評価されている。腫瘍特異的免疫応答を誘導するのに有効ではあるが、これらの戦略が患者にとって有意な延命効果をもたらしたことはなく、ウイルスワクチンが規制機関によって承認されたことは未だない。腫瘍抗原に対する抗体の全般的な誘導は観察されているが^９、３３、これらの抗体が機能的であるかどうか、例えば該抗体がＣＤＣを媒介するかどうかは不明である。

腫瘍溶解性ウイルスの複製と導入遺伝子発現は、臨床試験で再現性よく示されているが、全身的、機能的な抗癌免疫の誘導は、現在までにＪＸ−５９４または他の腫瘍溶解性ウイルスを用いたいかなる試験でも系統的に評価されなかった。ＣＤ３＋ＣＤ４＋リンパ球とＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球、ＮＫ細胞および種々の炎症性サイトカインの全般的な誘導は実証されている^２６。ＨＳＶ−ｈＧＭ−ＣＳＦによる黒色腫の臨床試験（Ｏｎｃｏｖｅｘ，ＢｉｏＶｅｘ社，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）において、腫瘍試料に由来するＴ細胞の表現型分析は、末梢血Ｔ細胞との明白な違いを示唆した。非処置の対照患者に由来するＴ細胞と比較して、ワクチン接種後に退行が起こった腫瘍において、Ｔ細胞（ＭＡＲＴ−１）特異的Ｔ細胞によって認識される黒色腫関連の抗原が増加した。機能的抗腫瘍免疫は評価しなかった^２８。前臨床試験は、腫瘍溶解性ウイルスが機能的な癌特異的免疫を誘導することができることを実証したが、その臨床データは不足している^{２４、３４〜３８}。

補体系は、自然免疫系の一部である一連の血清タンパク質を含む。補体系は、感染に対する防御において作用し（例えば、侵入する細菌をオプソニン化するかまたは直接、溶解することによって）、また、自然免疫と適応免疫を関連付ける^３０。特に、補体タンパク質は、外来抗原に応答して誘導された抗体によってオプソニン化された細胞を溶解する可能性を有する。実際に、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、細胞を殺傷する最も強力な系の一つである^３０。ＣＤＣ活性は、悪性腫瘍の治療で現在使用されているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって利用される。リツキシマブ（ＣＤ２０に特異的なｍＡｂ）の抗腫瘍効果へのＣＤＣの寄与は、前臨床試験で広範に評価されている^{３９〜４１}。さらに、濾胞性リンパ腫患者におけるリツキシマブ治療における補体系の関与は、Ｃ１ｑ補体カスケード遺伝子に多型を有する患者での進行時間が延びたことが観察されたことによって裏付けされている^４２。他の抗体は、癌細胞系または患者の試料においてＣＤＣを媒介することが示されており、例えば、慢性リンパ性白血病用のアレムツズマブ^４３および他の起源の癌細胞系用のパニツムマブとセツキシマブが挙げられる^４４。これらの観察は、腫瘍標的化モノクローナル抗体の固有のＣＤＣ活性を向上させる戦略の開発^{４５〜４７}、ならびにＣＤＣ活性を向上させる薬剤との併用につながった^４８。しかし、ＣＤ２０を発現する正常なＰＢＭＣに対する細胞傷害性の相乗作用が観察される可能性があるため、癌特異的でない治療薬、例えばリツキシマブによるＣＤＣ活性のさらなる増強に伴ういくつかの懸念がある^４８。

ワクシニアウイルスは、ウイルスの全身伝播を容易にするために補体依存性中和に抵抗性であることが示された。これは、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）型のワクシニアの外側の被膜内に補体調節タンパク質が含まれることに起因している^４９。しかし、ワクシニアウイルスに感染した腫瘍細胞は、放出されたビリオンのエンベロープへの取り込みのための補体調節タンパク質が欠乏しているために、補体媒介中和をより受けやすい可能性があることが実証された^{４９、５０}。腫瘍微小環境内のＪＸ−５９４感染細胞からのＧＭ−ＣＳＦの発現により、ＮＫ細胞とマクロファージの刺激および増大を介してＣＤＣ媒介殺傷を増強し得る^５１。実際に、ＪＸ−５９４の複製は腫瘍内で炎症を引き起こすことができ、および炎症性浸潤物はＪＸ−５９４によって腫瘍内で処置された黒色腫の病変部で検出された^２９。

本明細書において、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスで処置された患者において機能的抗腫瘍免疫が誘導された第１のエビデンスを示す。腫瘍を有するウサギならびにさまざまに進行した難治性腫瘍を有する患者の双方から得た血清で示されたように、ＪＸ−５９４はｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の抗体依存性ＣＤＣを誘導する。抗癌免疫療法として複製能を有する腫瘍溶解性ポックスウイルスを使用することは、他の免疫療法戦略に勝る大きな利点を有する：１）抗癌免疫応答の誘導は、治療の作用機序の一つに相当し；その他には、腫瘍細胞の直接感染と溶解、および急性の腫瘍血管シャットダウンが含まれる；２）腫瘍溶解性ポックスウイルス感染は、患者特異的／テーラード免疫応答を引き起こす；３）ｅｘ ｖｉｖｏでの処置ステップは何ら治療に必要でない（有効ではあるが、臨床的に確認されたＰｒｏｖｅｎｇｅ方法は手がかかるものであり、各患者の免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ処置を必要とする）、および４）免疫賦活は腫瘍細胞の活性ウイルス感染によって引き起こされ、それによって腫瘍微小環境内で炎症反応が引き起こされる。免疫療法分野での大きな障害は、動員され腫瘍内で活性化される活性化免疫エフェクター細胞に関するものである。腫瘍溶解性ポックスウイルスは、適応免疫応答の誘導を刺激するための最適なビヒクルに相当するが、同時に腫瘍微小環境内で炎症性サイトカインおよび局所炎症応答の誘導を引き起こし、これにより、腫瘍での免疫細胞の動員および活性化を確実にする。

本明細書で概説する系は、新規の患者内在性腫瘍抗原を同定することができる機序を表す。ＳＥＲＥＸスクリーニングは、以前に特徴決定された腫瘍抗原（これにより現在の方法を確証する）、および、ＨＣＣの治療のための新規の潜在的な標的に相当する新規の腫瘍関連抗原を同定した。本明細書に概要を述べる実験計画は、（１）複製能を有する腫瘍溶解性ポックスウイルスによる患者の治療、（２）機能的抗腫瘍免疫（ＣＤＣアッセイ）のｅｘ ｖｉｖｏでの測定、および（３）標的抗原を同定するための、高いＣＤＣ活性を含む患者血清のＳＥＲＥＸスクリーニングの実施を含み、新規の腫瘍抗原の発見のための新規の方法を表す。この方法は、複数の関連抗原（抗体によって認識されることが可能な患者の内在性抗原）の同定を可能にし、該抗原に対する抗体の生成が安全である（抗体は有害効果のないヒトにおいて生成されたために）。本発明者らは、ＨＣＣ患者でのこの方法に関する概念証明を本明細書に示したが、しかしこの方法論はいずれの他の腫瘍型でも同様に用いることが可能である。

加えて、本発明者らが現在評価しているのは、ＪＸ−５９４で処置した患者における腫瘍抗原、ワクシニアウイルスならびにＪＸ−５９４導入遺伝子β−ガラクトシダーゼに対する細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導である。ＪＸ−５９４誘導ＣＤＣに関しては、ソラフェニブ（第２相試験でレジメンが試験されている）を含む抗血管新生薬との併用療法の効果を現在、調査している。

実施例６：ＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびレオウイルスの効果
複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスが、ＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体を差次的に誘導することを示すように試験を設計した。抗体誘導は、免疫賦活サイトカインの発現によって促進させることができる。これらのうちまず、第一にＣＤＣ応答を媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびレオウイルスの効果を評価し、データを図９に示す。

ＶＸ２腫瘍を有するウサギにＰＢＳ、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＵＶ不活化ＪＸ−５９４、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４、マウスＪＸ−５９４を発現するＪＸ−５９４、ＪＸ−９６３またはレオウイルスの静脈内注入の処置を週に２回施した（ｎ＝２）。各ウイルスは、１×１０^９ｐｆｕの用量で投与した。ベースライン、処置開始後３週目に血清を収集した。ウサギ血清をＡ２７８０細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで、表示した濃度で３時間インキュベートした。処置前の血清とともにインキュベートしたＡ２７８０細胞の生存と比較した細胞生存率をＣＣＫ−８キットを用いて評価した。

これらの試験から、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ウサギにおいて生物学的に活性であるサイトカイン）を発現するＪＸ−５９４が２．５％の血清濃度で開始したＣＤＣを誘導したことがわかる。ＣＤＣ活性は、５％の血清濃度で最大限に達した。同様に、ＪＸ−９６３は、２．５％の血清濃度でＣＤＣを誘導し、５％の血清濃度で最大ＣＤＣに達した。（複製不可能にさせる）ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＵＶ不活化ＪＸ−５９４で処置したウサギから収集した血清またはＰＢＳとともにインキュベートしたＡ２７８０は、試験したいずれの濃度でもＣＤＣを誘導しなかったので、ＣＤＣを媒介する抗体の誘導は、ウサギにおいて腫瘍溶解性ワクシニア複製に依存していた。同様に、現在、腫瘍溶解剤として臨床開発中である二重鎖ＲＮＡウイルスであるレオウイルスで処置したウサギから収集した血清は、試験したいずれの濃度でもＣＤＣを誘導しなかった。最終的に、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ウサギにおいてヒトＧＭ−ＣＳＦほど生物学的に活性でない）を発現するＪＸ−５９４による処置は、高濃度の血清でのみＣＤＣを誘導した。これらの結果は、免疫賦活サイトカインＧＭ−ＣＳＦの発現がＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体の誘導を増強し得ることを示している。

実施例７：ヒト癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果
次の一連の試験で、ＣＤＣ応答を媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果を評価し、そのデータを図１０に示す。

これらの実験のために、ＶＸ２腫瘍を有するウサギにヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４（１×１０^９ｐｆｕ）、マウスＪＸ−５９４を発現するＪＸ−５９４（１×１０^９ｐｆｕ）、ウエスタンリザーブワクシニア（１×１０^９ｐｆｕ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（６×１０^８ｐｆｕ）またはウサギＧＭ−ＣＳＦを発現するＶＳＶ（６×１０^８ｐｆｕ）の静脈内注入の処置を週に２回施した（ｎ＝２）。ベースラインと処置開始後３週目に血清を収集した。ウサギ血清をＡ２７８０細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで、表示した濃度で３時間、インキュベートした。処置前血清とともにインキュベートしたＡ２７８０の生存と比較した細胞生存率をＣＣＫ−８キットを用いて評価した。

この実験では、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４（ＪＸ−５９４）がＣＤＣ媒介抗体の誘導で最も有効であり、１．２５％および２．５％の血清とともにインキュベートした後に細胞生存率が明らかに低下した。対照的に、マウスＧＭ−ＣＳＦ（ウサギにおいてヒトＧＭ−ＣＳＦほど生物学的に活性でない）を発現するＪＸ−５９４で処置すると、高濃度の血清でのみＣＤＣを誘導した（さらなる対照としてのマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＶＳＶは、試験したいずれの濃度でもＣＤＣを誘導しなかったことに留意されたい）。さらに、ワクシニアの野生型ウエスタンリサーブ系統（ＧＭ−ＣＳＦをコードしない）によるウサギの処置は、ＣＤＣを媒介する抗体の誘導においてより効果がなかった。最後に、一本鎖陰性センスＲＮＡウイルスＶＳＶによる処置は、試験した最も高い血清濃度（１０％）でのみ、ＣＤＣ媒介抗体を誘導した。これらの結果は、腫瘍溶解性ウイルスの生態に応じて、異なるレベルのＣＤＣ応答が観察され得ることを示唆している。

実施例８：ヒト癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ＨＳＶおよびＶＳＶ−ＧＭ−ＣＳＦの効果
この一連の実験では、ヒト癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ＨＳＶおよびＶＳＶ−ＧＭ−ＣＳＦの効果を評価し、そのデータを図１１に示す。

ＶＸ２腫瘍を有するウサギにマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＶＳＶ（６×１０^８ｐｆｕ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（１×１０^９ｐｆｕ）の静脈内注入の処置を週に２回施した（ｎ＝２）。ベースラインと処置開始後３週目に血清を収集した。ウサギ血清をＡ２７８０細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで、表示した濃度で３時間、インキュベートした。処置前血清とともにインキュベートしたＡ２７８０の生存と比較した細胞生存率をＣＣＫ−８キットを用いて評価した。

この実験では、ＨＳＶがＣＤＣ媒介抗体の誘導で最も有効であり、５％および１０％の血清とともにインキュベートした後に細胞生存率が明らかに低下した。ＧＭ−ＣＳＦを発現するＶＳＶは、この実験においてＣＤＣを誘導しなかった（だが、１０％血清の条件では、高い可変性が観察された）。

実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏ標的腫瘍に由来するウサギ癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果
この一連の実験では、ｉｎ ｖｉｖｏ標的腫瘍由来のウサギ癌細胞におけるＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導に対する腫瘍溶解性ワクシニア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＳＶの効果を評価し、そのデータを図１２に示す。

ＶＸ２腫瘍を有するウサギにヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４（１×１０^９ｐｆｕ）、マウスＪＸ−５９４を発現するＪＸ−５９４（１×１０^９ｐｆｕ）、ウエスタンリザーブワクシニア（１×１０^９ｐｆｕ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（６×１０^８ｐｆｕ）またはウサギＧＭ−ＣＳＦを発現するＶＳＶ（６×１０^８ｐｆｕ）またはヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＵＶ不活化ＪＸ−５９４の静脈内注入の処置を週に２回施した（ｎ＝２）。ベースラインと処置開始後３週目に血清を収集した。ウサギ血清をＶＸ２細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間、インキュベートした。処置前血清とともにインキュベートしたＶＸ２の生存と比較した細胞生存率をＣＣＫ−８キットを用いて評価した。

ＶＸ２標的細胞でＣＤＣを誘導するために、腫瘍溶解性ウイルス投与の前に収集した血清中に含有されるさらなる補体を３％の処置後血清に添加した。前の実験と同様、ＵＶ不活化ＪＸ−５９４は、この設定でＣＤＣを媒介する抗体を誘導することができなかった。ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４、マウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４およびウエスタンリザーブワクシニアは、このアッセイにおいてすべてＣＤＣを誘導し、ＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体を誘導する複製能を有するワクシニアウイルスの能力を裏付けた（この設定では、標的細胞は腫瘍に由来し、腫瘍溶解性ウイルスで処置されたウサギ内で該腫瘍に対して抗体が産生された）。ＶＳＶ（±マウスＧＭ−ＣＳＦ）は、試験した全ての腫瘍溶解性ワクシニアウイルスよりも抗腫瘍抗体を誘導するのに効果的でなかった。

実施例１０：腫瘍溶解性ワクシニアおよびマウスＧＭ−ＣＳＦの発現は、マウス腫瘍モデルにおいてＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導を媒介する
本実施例において、マウス腫瘍モデルでＣＤＣを媒介する腫瘍特異的抗体の誘導を媒介した腫瘍溶解性ワクシニアおよびマウスＧＭ−ＣＳＦの効果を評価し、そのデータを図１３に示す。

ＣＴ２６腫瘍を有するマウスに、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４、マウスＪＸ−５９４を発現するＪＸ−５９４、ＰＢＳまたはヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＵＶ不活化ＪＸ−５９４の静脈内注入の処置を週４回施した（ｎ＝３）。各ウイルスを１×１０^７ｐｆｕの用量で投与した。ベースラインと処置開始後４週目に血清を収集した。マウス血清をＡ２７８０細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間、インキュベートした。処置前血清とともにインキュベートしたＡ２７８０の生存と比較した細胞生存率をＣＣＫ−８キットを用いて評価した。

ＣＤＣ実験を同種マウスモデル（ＣＴ２６皮下腫瘍を有するＢａｌｂ／Ｃマウス）で繰り返した。マウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４は、ＣＤＣを媒介する抗腫瘍抗体の誘導で最も強力であった。ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４（ＪＸ−５９４；ヒトＧＭ−ＣＳＦはげっ歯動物で活性でないことが知られている）ならびにマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＵＶ不活化ＪＸ−５９４の両方は、ＣＤＣ誘導に対して中程度の効果（ＰＢＳとマウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＪＸ−５９４に比較して）があった。これは、このマウスモデルにおいて、複製ならびに高レベルのマウスＧＭ−ＣＳＦ発現（複製能を有するワクシニア骨格による処置後のみに生じる）の両方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤＣを媒介する高力価の抗腫瘍抗体を誘導するのに必要であることを示し得る。

引用文献

Claims (10)

1. 以下の工程を含む、腫瘍特異抗原を同定する方法：
   （ａ）（ｉ）癌細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーがクローニングされた複数の発現ベクターと（ｉｉ）腫瘍を有する１または複数のヒト患者から単離された血清とを接触させる工程であって、該１または複数の患者は、該血清が単離される前に、該患者の該腫瘍に特異的なＣＤＣ応答を媒介するのに十分な量の、複製能を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが投与された患者である、工程；
   （ｂ）該血清によって認識される該ｃＤＮＡライブラリーから抗原を単離する工程。
2. 該複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスが投与された後であって、該血清と該複数の発現ベクターとを接触させる前に、ＣＤＣ応答を生ずる抗体の存在を該血清において確認する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 該抗原が、該複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスの処置によって誘導されるポリクローナル抗体によって認識される、請求項１に記載の方法。
4. 該抗原が、該複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスが投与されていない、同じ腫瘍型を有するヒト患者由来の血清によって認識されない、請求項２に記載の方法。
5. 癌細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターにクローニングする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 該腫瘍溶解性ウイルスが投与された患者から採取された血液から血清を単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 該腫瘍と癌細胞が同じ癌型である、請求項１に記載の方法。
8. 該血清が、該複製能を有する腫瘍溶解性ウイルスが投与された、同じ腫瘍型を有する複数のヒト患者由来のプールされた血清を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記腫瘍が、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣細胞腫、シュワン腫、神経線維肉腫、神経芽細胞腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭頚部癌、黒色腫、前立腺癌、腎細胞癌、膵癌、乳癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、肝癌、骨癌、直腸癌、卵巣癌、肉腫、食道癌、胃癌、子宮頸癌、線維肉腫、扁平上皮癌、神経外胚葉腫瘍、甲状腺腫瘍、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝細胞癌、中皮腫、類表皮癌および血液の腫瘍化疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記腫瘍が、結腸癌、直腸癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、膵癌、黒色腫、卵巣癌、頭頚部癌、食道癌、肉腫および中皮腫からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

Images