KR20140032991A - 종양 항원에 대한 항체의 생산 및 종양용해 우두 바이러스의 투여에 의한 종양 특이적 보체 의존적 세포독성의 생산 - Google Patents

종양 항원에 대한 항체의 생산 및 종양용해 우두 바이러스의 투여에 의한 종양 특이적 보체 의존적 세포독성의 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양이 있는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 보체-의존적 세포독성 반응을 유도하는 방법 및 그것에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고 조성물의 투여는 동물에서, 상기 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체의 생산을 유도한다.

Description

종양 항원에 대한 항체의 생산 및 종양용해 우두 바이러스의 투여에 의한 종양 특이적 보체 의존적 세포독성의 생산 {GENERATION OF ANTIBODIES TO TUMOR ANTIGENS AND GENERATION OF TUMOR SPECIFIC COMPLEMENT DEPENDENT CYTOTOXICITY BY ADMINISTRATION OF ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS}
관련 출원
본원은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있는 US 가출원 번호 61/429,622 (2011년 1월 4일 출원)의 우선권의 이점을 주장한다.
연방 지원된 연구 또는 개발
없음
발명의 분야
본 발명은 암 치료의 개입을 위한 신규 작용 기전 및 그와 같은 작용 기전에 의존하는 암 요법을 위해 고안된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
신규 작용기전 (MOA)를 갖는 신규 암 요법이 필요하다. 현재 요법은 단일 제제로서 사용될 때 제한된 효능을 종종 갖고, 그래서 실시예에서 최대 효과를 위해 병용하여 사용된다. 신규 제제는 승인된 요법에 의해 교차내성이 이상적으로 결여되어야 하고, 다중 상보적 MOA를 가져야 한다1 -4. 조작된 바이러스는 "유전자 요법" (복제 불능 바이러스에서 치료 이식유전자 이동)5-7 및 암 백신 (종양 항원, 공동자극 분자 및/또는 시토카인의 발현)8-10을 포함하는 상이한 접근법을 사용하여 암 치료를 위해 개발되었다. 그러나, 유전자 요법은 현재까지 국소로 및 전신으로 충분한 수의 암 세포로의 비효율적인 전달에 기인하야 현재까지 환자에서 실패했다. 반대로, 바이러스-기반 암 백신은 진전된 큰 부피의 암을 갖는 환자에서 효능을 위한 숙주 인자에 대한 종양 면역 회피 및 독점적인 신뢰에 의해 제한되었다. 면역 회피는 아마도 단일 종양 항원 및/또는 단일 시토카인의 발현에 의존하는 백신 접근법에 의한다. 넓은-기반 치료 암 백신은 다중 종양 항원, 시토카인, 면역 세포 동원 및 활성화, 및 면역 반응 위험 신호를 발현시키기 위해 필요하다.
반대로, 종양용해 바이러스는 암 세포를 감염시키고, 그 내에서 배가시키고 차후에 용해시키기 위한 바이러스의 자연적인 능력의 이점을 취하기 위해 개발되었다11 -14. 제1 세대 종양용해 바이러스는 고유하게 암-선택적이었고 (예를 들면 레오바이러스15 -16, VSV17 -18), 반면에 제2 세대 제제는 암 선택성을 위해 조작되었다 (예를 들면 아데노바이러스19 -20 및 단순 헤르페스 바이러스21 -22 결실 돌연변이체). 이들 제제들에 의한 임상시험 데이타는 안전성 및 암 선택성을 실증하지만, 치료 효능은 직접적인 종양내 또는 정맥내 모두의 주사 후로 제한되었다23; 그러나 원격 종양에 대한 전신 확산 및/또는 재생가능한 전달은 제한적이었다. 따라서 전이성 종양에 대한 전신 항암 효능 및 혈액계 전달이 개선되었다.
각각의 이들 3개의 개별적인 바이러스-기반 접근법과 함께 잠재성 및 제한 모두를 고려할 때, 각각의 최상의 속성을 단일 치료제에 결합하거 최적화할 수 있었는지를 물었다. 표적으로 되고 목적으로 한 종양용해 폭스바이러스는 그렇게 하기 위해 잠재성을 갖는다. JX-594는 하기를 포함하는 3개의 상보적 MOA를 갖도록 디자인된 제3 세대 종양용해 폭스바이러스 치료제이다: 1) 직접적인 복제-매개된 종양용해, 및 2) 활성 암 예방접종. JX-594는 바이러스 티미딘 키나아제 유전자의 붕괴 및 인간 과립구-단핵구세포 콜로니 자극 인자 (hGM-CSF) 및 합성 초기-말기 및 p7.5 프로모터, 각각의 조절 하의 β-갈락토시다아제 이식유전자의 발현에 의한 Wyeth 우두 바이러스 백신-유래 종양용해이다24. 우두가 바이러스 뼈대로서 사용되었던 것은, 종양으로의 혈액계 전달이 혈액에서 안정성이 있기 때문이었다2 5. JX-594는 동시 암 세포 용해 및 내인성 종양 항원 방출을 통한 암 예방접종, 항원 제시 세포 활성화를 지지하기 위한 hGM-CSF의 발현, 면역 효과기 세포의 동원 및 전염증 시토카인 유도를 유도하기 위해 설계된다. 우두 자체의 소거는 주로 세포 매개된 면역 기전을 통해 감염된 세포 소거에 의해서이다.
발명자들은 신규 암 요법의 기술에 대한 필요성을 다루기 위해 종양용해 바이러스를 사용하는 암의 신규 치료 방법을 이제 발견했다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 종양이 있는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 보체-의존적 세포독성 반응을 유도하는 방법 및 그것을 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 조성물의 투여는 동물에서, 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체의 생산을 유도한다.
특이한 구현예에서, 본 발명은 종양이 있는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 보체-의존적 세포독성 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 상기 동물에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 조성물의 투여는 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 동물에서 유도한다. 더욱 특히, 종양용해 바이러스의 투여는 종양을 갖지 않는 동물에서 CDC 반응을 유도하지 않는다.
종양용해 바이러스 임의의 종양용해 바이러스일 수 있다. 예시적인 그와 같은 바이러스는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 인간 한타 바이러스, 점액종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 세네카 밸리 바이러스 및 신드비스 바이러스. 특이한 구현예에서, 종양용해 바이러스는 종양용해 폭스바이러스. 사용될 수 있는 종양용해 바이러스의 구체적인 예는 예를 들면 하기를 포함한다: 돌연변이된 우두 바이러스 발현 GM-CSF, p53 발현 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), ONYX-15, Delta24, VA1 영역에서 변이된 아데노바이러스, K3L 또는 E3L 영역에서 변이된 우두 바이러스, 텔로멜라이신, 텔로멜라이신-GFP, OV20.0L 유전자에서 변이된 파라폭스바이러스 orf 바이러스, 제네눅스 바이러스, 및 감마 (1)34.5 유전자에서 변이된 헤르페스 바이러스. 특이적 예시적인 구현예에서, 종양용해 폭스바이러스는 JX-594이다. 종양용해 바이러스는 치료 또는 다른 이식유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이식유전자는 GM-CSF, 또는 다른 시토카인, 케모카인, 마커 및/또는 이미지화 유전자, 자살 유전자, 전구약물 효소 유전자 카복실 에스테라제 및 시토신 데아미나제, 종양 억제제 유전자 등을 인코딩하는 이종성 핵산 서열일 수 있다.
항체가 일으키는 종양은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양을 비제한적으로 포함하는 임의의 종양일 수 있다: 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 뇌실막종, 신경집종, 신경섬유육종, 신경모세포종, 뇌하수체 샘종, 수모세포종, 두경부암, 흑색종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 췌장암, 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 방광암, 간암, 골 암, 직장암, 난소암, 육종, 위암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 편평상피 세포 암종, 신경외배엽 종양, 갑상선 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 간종양, 중피종, 상피성 암종, 및 혈액의 종양유발성 질환.
대상체에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항종양 CDC 반응을 매개하는 생체내 항체를 생산하는 방법이 또한 포함되고, 여기서 조성물의 투여는 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 유도한다. 상기 방법은 투여 후 대상체로부터의 혈액을 수확하고 CDC-반응 생성 항체를 상기 혈액으로부터 단리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
종양에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 유도하는데 효과적인 양 및 방식으로 복제 가능 종양용해 바이러스로 치료된 대상체의 혈액으로부터 단리되는 CDC-반응 생성 항체를 포함하는 조성물이 또한 고려된다. 특이한 구현예에서, 상기 조성물은 대상체로부터 수집된 혈청이다.
암 세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 성장을 억제하거나 그 세포를 사멸시키는 방법이 또한 고려된다. 특이한 구현예에서, 상기 접촉은 암 세포를 시험관내에서 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 접촉은 수확된 항체, 수확된 B 세포, 수확된 B 세포에 의해 생산된 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 암이 있는 항체에 주입하는 것을 포함한다. 본 발명의 치료 방법에서, 암 세포은 대상체의 생체내에 있을 수 있고 접촉은 조성물을 포함하는 약제를 투여하는 것을 포함한다. 추가 구현예에서, 치료 방법은 상기 대상체에게 추가 항암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 암 대상체를 치료하는 방법을 추가로 포함하고, 상기 방법은 상기 대상체에게, 종양에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 유도하는데 효과적인 양 및 방식으로 복제 가능 종양용해 바이러스로 치료된 대상체의 혈액으로부터 단리된 CDC-반응 생성 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 환자에 대해 자가조직이고 암 환자로부터 단리되고 암 환자에게 재주입된다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 조성물로 치료될 암 환자로부터 상이한 암 환자로부터 단리된 암 환자에 대해 이종성이다. 어느 경우에나, 대상체는 추가 항암 치료제로 치료될 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서 암 대상체는 고형 종양을 가질 수 있고 상기 조성물은 종양내로, 정맥내로, 복강내로 또는 이들의 조합으로 투여된다. 특이한 구현예에서, 암 대상체는 본 발명의 조성물의 투여 전에, 동시에 또는 차후에 절제된 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 암 대상체는 고형 종양을 가지며 조성물은 종양의 크기를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 암 대상체는 고형 종양을 가지며 투여는 고형 종양의 전이성 확산을 감소시킨다. 치료 방법에서, 암은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 뇌실막종, 신경집종, 신경섬유육종, 신경모세포종, 뇌하수체 샘종, 수모세포종, 두경부암, 흑색종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 췌장암, 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 방광암, 간암, 골 암, 직장암, 난소암, 육종, 위암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 편평상피 세포 암종, 신경외배엽 종양, 갑상선 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 간종양, 중피종, 상피성 암종, 및 혈액의 종양유발성 질환.
본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 암이 있는 대상체의 암 치료를 조정하는 방법을 교시를 제공한다:
a) 상기 대상체에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물의 투여는 상기 대상체의 상기 암에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체의 생산을 상기 대상체에서 감소시키는 단계;
b) 혈액을 상기 대상체로부터 단리시키는 단계로서, 상기 혈액은 수확된 항체, 상기 암에 대항하는 수확된 B 세포를 포함하는 단계;
c) 상기 항체를 확대 또는 단리시키거나 항체를 상기 B 세포로부터 생산하여; 상기 대상체에 대해 특이적인 면역요법 조성물을 생산하는 단계, 및
d) 상기 대상체에게 단계 (c)의 면역요법 조성물을 투여하는 단계.
그와 같은 방법에서, 면역요법 조성물은 항체의 단리시 즉각적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역요법 조성물은 대상체의 추가 치료적 처리를 위해 보관된다.
본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 암이 있는 대상체의 암 치료를 조정하는 방법을 교시를 제공한다: 본 발명의 추가 측면은 하기를 포함하는, 종양-특이적 항원을 확인하는 방법에 관한 것이다: 암 세포로부터 준비된 cDNA 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 종양에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 유도하는데 효과적인 양 및 방식으로 복제 가능 종양용해 바이러스로 치료된 대상체로부터 발현 벡터를 혈청과 접촉시켜서 일차 면역스크린을 수행하는 단계로서, 여기서 상기 혈청은 종양용해 바이러스의 투여 및 CDC 특이 반응의 산출 후 대상체로부터 단리되는 단계; 및 항원을 상기 혈청에 의해 인정된 상기 cDNA 라이브러리로부터 단리하는 단계.
본 발명의 보다 완전한 이해를 위해, 하기 수반되는 도면들과 함께 하기 설명을 참조한다.
도 1: VX2 종양을 가진 토끼 내로 주사된 JX-594의 혈청 효과. JX-594 또는 PBS 처리 후 기준선, 3주 및 6주에 혈청을 수집하였다. VX2 조직으로부터 효소에 의해 VX2를 분리하고, 이를 8회 계대 동안 10% FBS를 갖는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)로 시험관내에 유지시켰다. 도 1A - 정상 토끼가 아닌 VX2를 가진 토끼 내로, PBS 주사된 혈청에 의한 것이 아니라 JX-594 주사된 혈청에 의한, 토끼 PBMC가 아닌 분리된 VX2 종양 세포의 사멸. 분리된 VX2 세포 또는 토끼 PBMC에, JX594 주사된(정상 대 VX2를 가진 토끼) 또는 PBS 주사된 VX2를 가진 토끼로부터 수득한 3% 혈청을 시험하였다(각 조건에 대하여 각 동물(n=3), 각각의 경우 반응 번호=9를 의미하는 각 혈청 샘플로부터 삼반복). 도 2B - vx2를 가진 토끼 내로 JX-594 주사 후 분리된 VX2 세포에 대한 혈청의 시간 의존적 항종양 효과. JX-594(각각의 토끼에 대해 109 pfu)를 0일 및 7일에 주사하고, 각 시점에 혈청을 연속으로 얻었다. 도 2C - VX2를 가진 토끼 내로 JX-594 주사 후 분리된 VX2 세포에 대한 혈청의 용량 의존적 항종양 효과. 도 2D - JX-594 주사된 혈청의 웨스턴 블랏팅.
도 2A. JX-594 주사된 인간 혈청의 처리 후 인간 RCC SNU349 세포주의 대표적인 공초점 현미경 관찰(#301 신장 세포암종 환자 내로의 4 사이클의 JX-594 주사 후 92일에). a, d - 혈청(5%) 첨가 전; b, e - 혈청(5%) 첨가 10분 후, c, f - 혈청(5%) 첨가 30분 후(30분에 형광 없음, 표시하지 않음); g - a에서 확대된 황색 영역, h - b에서 확대된 적색 영역(CDC 효과를 대표하는 막 공격 형성(MAF)을 통한 세포 용해에 유의한다; 적색 화살표).
도 2B: #301 RCC 환자로부터 5% 혈청을 수득한 후(4 사이클 JX-594 주사 후 92일에) 상이한 유형의 인간 신장 세포암종 세포주(RCC)의 세포 생존율 변화. 별표는 각 JX-594 주사를 가리킨다.
도 2C: #103 폐암 환자로부터 5% 혈청을 수득한 후(4 사이클 JX-594 주사 후 92일에) 상이한 유형의 폐암 세포주의 세포 생존율 변화. 별표는 각 JX-594 주사를 가리킨다.
도 3: 난치성 고형 종양 환자에서의 JX-594 다중 처리 후 항체-매개된 보체-의존적 암세포 용해의 생성에 대한 증거. A - 동일한 환자의 상이한 유형의 혈청을 보여주는 도표. (a) JX-594 처리 전 기준선 미접촉(naive) 혈청(A 혈청으로 지정됨); (b) JX-594 처리 후 92일에 수득한 혈청(B 혈청으로 지정됨); (c) 보체 열 불활성화를 위해, B 혈청을 56℃에서 30분간 처리하였다(C 혈청으로 지정됨); (d) 50% A 혈청을 50% C 혈청에 첨가하였다(D 혈청으로 지정됨). 도 3B - Ig 제거 수지(ProreoExtract®Albumin/Ig Kit, Calbiochem) 컬럼에 의해 혈청을 처리하였다(E 혈청으로 지정됨).
도 3C: B, C 또는 D 혈청(각각에 대해 5%)의 처리 후 인간 암세포주의 대표적인 광학 현미경 관찰. SNU349 RCC 세포주에 #301 RCC 환자로부터 수득한 B, C 또는 D 혈청을 처리하여 4시간 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
도 3D: 암 세포 사멸 능력의 손실에서의 열 처리 지속시간의 효과. (a) 열 불활성화된 C 혈청 내로 동일한 부피의 미접촉(naive) 혈청(A 혈청)을 첨가한 후, 이 혼합 혈청을 배양된 A2790 또는 SNU349 세포 내로 첨가하였다. 혈청의 사멸 효과가 현저히 회복되었으며, 이는 B 혈청을 함유하는 암 특이적 항체 내로의 보체 부가를 제시한다. CDC에서, 항원-항체 복합체는 보체의 주된 활성제이다. 항체는 표적 특이성을 결정하는 한편, 보체 활성화는 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 통해 세포 용해를 유도한다. (b) 마지막으로 IgG 제거 컬럼(ProreoExtract®Albumin/Ig Kit, Calbiochem)에 의해 B 혈청을 용리시켜 사멸 활성의 손실을 야기하였고, 이는 IgG가 CDC에 매우 중요할 수 있음을 제시한다.
도 4: 상이한 유형의 인간 암세포주에서 선발된 JX-594 처리 환자에 대한 보체 의존적 세포독성(CDC)의 프로파일. CDC 활성을 각 환자로부터의 기준선 미접촉(naive) 5% 혈청에 의한 세포 생존율에 대한 5% 혈청에 의한 세포 생존율(1상 환자 및 2상 환자에 대하여 JX-594 처리 후 42-92일 및 56일의 기록 샘플을 사용하였음)의 역 비율로 표시하였다. a-d. JX-594 처리된 #301 RCC(a), #304 흑색종(b), #1702 HCC(c), 및 #1705 HCC(d) 환자로부터의 혈청에 의한 상이한 인간 암세포주 및 정상 세포주에서의 CDC 활성의 프로파일.
도 5: 1상(원발성 및 전이성 간 덩어리) 및 2상 JX-594 임상시험(간세포 암종)으로 등록된 환자에서 JX-594 처리 후 CDC 활성의 전체적인 분석. 도 5A - 1상 환자: A2780 세포에서의 생존 대 CDC 활성의 역. 도 5B - 상이한 HCC 세포주에서의 2상 환자(n=18)의 시간 의존적 CDC 변화. 도 5C-5E - 상이한 인간 HCC 세포주 SUN739(C), SNU475(D) 또는 SNU449(E)에서의 CDC 반응군 환자로부터 수득한 혈청의 CDC 프로파일. 반응군은 JX-594 처리 후 56일에 <80% 세포 생존율로 지정되었다.
도 6: JX-594 주사된 환자로부터 수득한 인간 혈청의 웨스턴 블랏팅.
도 7: JX-594 주사된 혈청을 이용한 시험관내 및 생체내 소라페닙 및 수니티닙(sunitinib) 상승작용.
도 8: 세렉스(Serex)에 대한 방법 개요.
도 9: CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아(vaccinia), GM-CSF 및 레오바이러스 효과. 이 도면은 표시된 혈청 농도로 3시간 배양 후의 처리전 대조군과 비교하여, % A2780 세포 생존율을 보여준다. VX2 종양을 가진 토끼로부터 수집된 혈청을 표시된 개입으로 정맥내로 처리하였다.
도 10: 인간 암세포 상에서 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아, GM-CSF 및 VSV 효과. 이 도면은 표시된 혈청 농도로 3시간 배양 후의 처리전 대조군과 비교하여, % A2780 세포 생존율을 보여준다. VX2 종양을 가진 토끼로부터 수집된 혈청을 표시된 개입으로 정맥내로 처리하였다.
도 11: 인간 암세포 상에서 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 HSV 및 VSV-GM-CSF 효과. 이 도면은 표시된 혈청 농도로 3시간 배양 후의 처리전 대조군과 비교하여, % A2780 세포 생존율을 보여준다. VX2 종양을 가진 토끼로부터 수집된 혈청을 표시된 개입으로 정맥내로 처리하였다.
도 12: 생체내 표적 종양으로부터 유래된 토끼 암세포 상에서 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아, GM-CSF 및 VSV 효과. 이 도면은 VX2 이식전 수집된 7% 혈청과 섞인 3% 처리전 혈청으로 24시간 배양 후, 처리전 대조군과 비교하여 % VX2 세포 생존율을 보여준다. 종양용해 바이러스가 정맥내로 처리된 VX2 종양을 가진 토끼로부터 수집된 혈청이 X축에 표시되어 있다.
도 13: 종양용해 백시니아 및 쥣과 GM-CSF 발현은 쥣과 종양 모델에서 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도를 매개한다. 이 도면은 5% 후처리 혈청과 함께 24시간 배양 후 처리전 대조군과 비교하여 % A2780 세포 생존율을 보여준다. 종양용해 바이러스가 정맥내로 처리된 CT26 종양을 가진 마우스로부터 수집된 혈청이 X축에 나타나 있다.
발명의 상세한 설명
종양용해 바이러스는 그의 일차 작용 기전으로서 바이러스 복제-의존적 암 세포용해를 야기하지만, 암-특이적 면역력의 유도는 또한 전임상 모델에서 주요 효능 매개체일 수 있다. 그러나, 기능성 항암 면역력 유도는 현재까지 암 환자에서 실증되지 않았다. JX-594는 항암 면역력의 유도을 강화하기 위해 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 발현시키기 위해 조작된 표적화된 종양용해 우두 바이러스이다. JX-594는 임상시험시 환자에서 종양 반응과 연관된 복제 및 GM-CSF 발현을 실증했다.
본 발명에서, 발명자들은, JX-594가 일차 또는 전이성 간 종양을 갖는 토끼 및 차후에 환자 모두에서 기능성, 항종양 면역력 유도의 매개했다는 것을 발견했다. 항체-매개된 보체-의존적 암 세포 세포독성 (CDC)은 1 단계 시행시 다양한 어레의의 종양 유형을 갖는 토끼 및 환자에서 JX-594 치료에 의해 유도되었다. CDC 유도는 차후에, 간세포 암종에서 2 단계 시행시 환자에서 확인되었다. 유의미한 CDC는 많은 경우에서1-5% 혈청에서도 여전히 분명했다. CDC 반응은 환자와 동일한 조직학의 종양 세포주에 대항하여 더 흔했다. 정상 세포는 CDC 효과에 저항력이 있었다. 가장 긴 생존 지속시간을 갖는 환자는 최고 CDC 활성을 가졌다. 우리가 아는 바로는, 이는 하기의 첫 번째 증거이다: 1) 환자에서 종양용해 바이러스에 의한 기능성 항암 면역력의 유도, 2) 암 환자에서 치료 바이러스에 의한 CDC의 유도, 및 3) 규정된 표적 항원의 발현시 다양한 어레이의 종양 유형을 가지며 신뢰가 없는 환자를 예방접종하기 위한 생성물의 능력.
또한, 발명자들은, SEREX 스크린이 JX-594 치료에 의해 유도된 폴리클로날 항체에 의해 인정된 표적 항원을 확인하기 위해 수행되었다는 것을 수행했다. 세포용해 효과를 겨냥하는 것 외에, JX-594 치료로 고형 종양 환자에서 기능성 전신 암 표적 항체 및 CDC이 유도된다. 또한, JX-594에 의한 치료는 다양한 암 유형을 갖는 환자에서 관련 종양 항원을 확인하기 위한 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명이 기반으로 하는 결과를 추가 간략히 기재하기 위해, 발명자들은, 치료-난치 간 종양이 있는 환자의 1 단계 임상시험에서, JX-594는 종양내 주사 (2-8 총, 매 3 주) 후 암-특이적 복제, GM-CSF 발현, 백색 혈구 자극 (중성구, 호산구 및 단핵구세포) 및 객관적인 암 반응을 실증했고; 비-주입된 종양에 대항하는 감염 및 효능이 또한 실증되었다는 것을 발견했다26. 2 단계 시행은 시행되어 간세포 암종 (HCC)이 있는 환자에서 3번의 격주 종양내 주사를 평가했다; 예비 항종양 활성은 2 단계 시행에서 또한 관찰되었다. 안전성은 현재까지 허용가능했고, 일시적인 flu-유사 증상은 가장 공통적인 부작용이었다. hGM-CSF27를 발현시키는 HSV 결실 돌연변이체는 2 단계 임상시험에서 흑색종에 대한 종양 반응을 실증했다.
바이러스 복제 및 이식유전자 발현은 임상시험에서 재생가능하게 실증되었지만, 전신 항암 면역력 유도는 조사가 단지 시작되고 있다28. 그러나, 직접적으로 기능성 면역 기전은 실증되지 않았다. JX-594 및 다른 면역자극 바이러스의 유용성, 및 미래의 종양용해 생성물의 설계는, 치료된 환자에서 항암 면역 반응이 설명될 수 있다면 극적으로 개선된 것이다. 따라서 발명자들 JX-594 요법 동안 및 후 항암 면역력을 평가하고자 한다.
발명자들은 또한, 전임상 모델에서 그리고 차후에 1 단계 및 2 시행 모두에서 간 종양이 있는 환자에서 면역력 유도를 평가했다. 기준선에서 그리고 경시적으로 JX-594 요법 다음에 얻은 기록 혈청 샘플은 평가에 이용가능하였다. 항체-매개된 보체-의존적 세포독성 (CDC)은 세포 사멸의 강력한 기전30이고, 종양 세포주에 대항하는 CDC 활성은 기능성 전신 항암 면역력의 직접적인 측정이다. 발명자들은 또한, 상이한 조직학의 종양 세포주의 패널에 경시적으로 대항하는 환자 혈액에서 항체-매개된 CDC의 유도에 대한 JX-594의 충격을 평가했다. 본원에서 제공된 날짜는 하기의 첫 번째 명확한 실증을 제공한다: 1) 환자에서 종양용해 바이러스에 의한 기능성 항암 면역력의 유도, 2) 암 환자에서 치료 바이러스에 의한 CDC의 유도, 및 3) 규정된 표적 항원의 발현시 다양한 어레이의 종양 유형을 가지며 신뢰가 없는 환자를 예방접종하기 위한 생성물의 능력.
본 발명은, 종양용해 바이러스가 항체-매개된 종양 특이적 CDC 반응을 낳을 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 특이한 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 선천성 면역 반응 또는 염증성 반응을 약화시키는 면역조절 폴리펩타이드, 예컨대 폴리펩타이드를 인코딩하는 1 이상의 핵산 서열을 갖는다는 것을 고려한다.
종양용해 바이러스로 수행된 구체적인 연구에서, 발명자들은, 바이러스 복제가 CDC를 매개하는 항종양 항체의 유도에서 중요하다는 것을 실?했다. 수많은 실험 (참고 도 9-13 예를 들면)은, UV 불활성화 대조군 바이러스로 치료된 동물로부터 수집된 혈청에서 CDC 유도의 결핍을 실증했다. 사용된 다양한 종양용해 바이러스 중에서, 우두 바이러스는 CDC를 항종양 항체의 유도에서 최상이고, 그러나 HSV 및 VSV가 또한 효과적인 것으로 보였다. 구체적으로, HSV 그 다음 VSV는 중간체 표현형을 갖지만, 레오바이러스는 시험된 모델에서 CDC를 유도할 수 있는 것으로 보이지 않았다.
바이러스 생물학을 기반으로, 상이한 수준의 CDC 반응이 관찰될 수 있고; 데이타 관찰로부터, (감싸진) dsDNA 바이러스는 CDC를 매개하는 항종양 항체를 유도시에 가장 강력하다는 것이 상정될 수 있다.
또한, 연구는, 종양용해 바이러스로부터의 GM-CSF 발현이 CDC를 매개하는 항종양 항체를 유도하기 위해 바이러스의 능력을 강력하게 할 수 있다는 것을 보여주었다. 이들 연구는, 종양용해 종양용해 바이러스 복제에서 발현되고 예로서 사용될 수 있는 GM-CSF의 면역자극 시토카인이 CDC를 매개하는 항종양 항체를 유도하기 위해 그와 같은 종양용해 바이러스의 능력을 강화하기 위해 사용될 수 있다는 것을 원칙적으로 보여준다.
종양용해 바이러스는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 레트로바이러스, 홍역 바이러스, Sinbis 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 및 아데노바이러스, 등, 또는 그의 재조합 변이체. 유용할 수 있는 예시적인 종양용해 바이러스는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양용해 바이러스를 포함한다: JX-594, p53 발현 바이러스, 레오바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), ONYX-15, Delta24, VA1 영역에서 변이된 아데노바이러스, K3L 또는 E3L 영역에서 변이된 우두 바이러스, 텔로멜라이신, 텔로멜라이신-GFP, OV20.0L 유전자에서 변이된 파라폭스바이러스 orf 바이러스, 및 □134.5 유전자에서 변히된 헤르페스 바이러스. 특정 예시적인 구현예에서 종양용해 바이러스는 JX-594이다.
이종성 핵산 서열은 종양용해 바이러스에 의해 전달될 수 있는 임의의 치료 단백질일 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 하기를 추가로 포함한다: 바이러스 유전자 발현, 복제 또는 증식에 필요한 종양용해 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대 폴리머라제 (예를 들면, 바이러스 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제)를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에 신경적으로 침묵하거나 작동가능하게 연결된 1 이상의 이종성 바이러스 내부 리보솜 진입 부위 (IRES); 구조 단백질 (예를 들면, 뉴클레오캡시드 단백질, 인단백질, 또는 매트릭스 단백질); 또는 당단백질 (예를 들면, 엔빌로프 단백질). 추가 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 2 또는 3개의 IRESs를 가지며 각각은 종양용해 바이러스 폴리펩타이드를 인코딩하는 상이한 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 하나의 IRES는 종양용해 바이러스 폴리머라제에 연결될 수 있고 제2 IRES는 구조 단백질 또는 당단백질에 연결될 수 있다. 또 추가의 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 하기를 갖는다: 종양용해 바이러스 폴리머라제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 IRES; 종양용해 바이러스 당단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 IRES; 및 종양용해 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제3 IRES. 또 하나의 구현예에서, IRES는 피코나바이러스 IRES, 예컨대 리노바이러스, 예컨대 인간 리노바이러스 2로부터의 유형 I IRES, 또는 발 및 입 질환 바이러스 또는 이들의 임의 조합이다.
본 발명의 특정 측면에서, 종양용해 바이러스는 종양이 있는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 보체-의존적 세포독성 반응을 유도하기 위해 사용되고, 이는 상기 동물에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 조성물의 투여는 상기 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 생산한다. 그렇게 할 때 종양용해 바이러스는 종양 세포의 성장을 억제하거나 그 세포의 사멸을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
방법은 일반적으로 그것이 투여되는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 CDC 반응을 유도하기에 충분한 다수의 감염에서 재조합 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함할 것이다. 종양 세포는, 항종양 반응이 바람직하게 대항하는 임의의 종양 세포일 수 있다. 세포는 종양용해 바이러스와 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 종양용해 바이러스는 동물 생체내에서 동물에서 투여된다. 투여는 정맥 또는 동맥으로 혈관내로 일 수 있다. 예를 들면, 간 종양의 경우에, 종양용해 바이러스는 내재하는 의료 기기 예컨대 카테터를 통해 간 동맥에 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 혈관내로, 종양내로, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
특이한 구현예에서, 본 발명의 방법은, 인간이 겪은 특이 종양에 대항하는 종양-특이적 항체 매개된 CDC 반응을 상기 인간에서 산출하여 인간 환자의 암의 치료에 관한 것이다. 예를 들면, 그와 같은 방법은 종양-특이적 항체 매개된 CDC 반응을 생성하는데 풍분한 MOI에서 본원에 기재된 1 이상의 종양용해 바이러스를 투여하는 단계를 포함한다. 반응은 인간 환자에서 종양 세포의 성장을 지연시키고/거나 그 세포를 사멸하는데 충분한 것이 고려된다. 일부 구현예에서, 반응은 상기 환자에게 종양용해 바이러스를 직접 투여하여 원위치에서 종양을 치료하는데 유용할 것이다. 다른 구현예에서, 대상체의 종양 세포는 제거되고 종양-특이적 항체 매개된 CDC 반응은 생체외에서 상기 종양 세포 대항하여 산출되는 것이 고려된다. 그 다음 이러한 생체외 반응에서 생산된 항체는 대상체에서 암의 자가조직 요법에서 종양 환자에 투여된다. 대안적으로, 생산된 항체는 종양 세포를 초기에 얻은 개체보다 상이한 대상체에 투여될 수 있다.
종양-특이적 항체 매개된 CDC 반응을 산출하기 위해 본원에 기재된 종양용해 바이러스의 사용은 광범위한 종양 세포 또는 하기 예의 암의 치료에서 유용성을 발견할 것으로 이해되어야 한다: 유방암 (예를 들면, 유방 세포 암종), 난소암 (예를 들면, 난소 세포 암종), 신장 세포 암종 (RCC), 흑색종 (예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 전립선암, 결장암, 폐암 (소세포 폐암 및 비-소세포 폐암 포함), 골 암, 골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 연골육종, 췌장암, 피부암, 섬유육종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프맥관육종, 림프종 (예를 들면, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프구 림프종, 일차 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 역형성 큰-세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 작은 절단된-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아구성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 광범위한 대세포 림프종, 혈관면역모세포 림프절병증 (AILD)-유사 T 세포 림프종 및 HIV 연관된 체강 기반 림프종), 캐슬만 질환, 카포시 육종, 혈관육종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 매크로글루불린혈증 및 다른 B-세포 림프종, 비인두 암종, 두경부암, 점액육종, 지방육종, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 이행 세포 암종, 식도암, 악성 가스트린종, 작은 창자 암, 담관세포 암종, 선암종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신 암, 연조직의 육종, 요도, 음경암, 고환암, 악성 기형종, 소아기의 고형 종양, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장 골반의 암종, 악성 수막종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 종양 신생혈관형성, 척추 종양, 뇌하수체 샘종, 표피암, 편평상피 세포암, 석면에 의해 유도된 것을 포함하는 환경 유도 암, 예를 들면, 중피종, 및 이들 암의 조합.
종양용해 바이러스는 대상체에 전달될 필요가 있을 수 있는 임의의 이종성 핵산을 포함할 수 있는 것이 추가로 이해되어야 한다.
용어 "치료적 효과적인 양" 또는 "효과적인 양"은 시험관내 또는 대상체 (예를 들면, 인간, 영장류, 개, 돼지 또는 소)에서 종양 세포 성장을 감소, 억제, 또는 없애는데 충분한 재조합 종양용해 바이러스 조성물의 양을 의미한다. 본원에서 언급한 바와 같이, 종양 세포 성장의 감소, 억제, 또는 폐기는 괴사, 세포자멸사, 또는 면역 반응의 결과일 수 있다. 치료적으로 효과적인 재조합 종양용해 바이러스 조성물의 양은 조성물에 사용된 특정한 종양용해 바이러스, 치료될 대상체의 연령 및 상태, 또는 종양 형성의 정도, 등에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 발명에 사용될 재조합 종양용해 바이러스는 편리한 방식 예컨대 by 경구, 정맥내, 동맥내, 종양내, 근육내, 피하, 비강내, 진피내, 또는 좌약 경로로 또는 이식 (예를 들면, 느린 방출 분자를 사용)으로 투여될 수 있다. 면역치료제와 같은 부속 요법의 투여 경로에 따라, 본원에서 함유된 제제는 효소, 산 및 제제를 불활성화시키는 다른 자연 상태의 작용으로부터 보호하기 위해 물질에서 코팅될 필요가 있을 수 있다. 비경구 투여 이외의 것에 의해조성물을 투여하기 위해, 제제는 불활성화를 방지하기 위해 물질에 의해 코팅되거나, 그것과 함께 투여될 것이다.
본 발명의 재조합 종양용해 바이러스는 또한 비경구 또는 복강내로 투여될 수 있다. 재조합 종양용해 바이러스 성분의 분산물이 또한, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 및 그의 혼합물을 비제한적으로 포함하는 것에서 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 보관 및 사용의 통상적은 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제, 예컨대 겐타마이신과 같은 항생제를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 사용한다. 생물학적으로 활성 물질을 위한 그와 같은 매질 및 제제의 사용은 당해분야에 공지되어 있다. 보충 활성 성분, 예컨대 항미생물제는 조성물에 통합될 수 있다.
담체는 용매 또는 분산매일 수 있고, 이는 예를 들면, 물, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 등), 적당한 그의 혼합물, 및 식물성 오일을 함유한다. 적당한 유체성은, 예를 들면, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요 입자 크기의 유지에 의해 및 표면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로산, 등에 의해 영향을 받을 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당류 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연하는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서 사용에 의해 일어날 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 적절한 용매 중 본 개시내용의 재조합 종양용해 바이러스를 본원에 열거된 다양한 다른 성분, 필요에 따라, 그 다음 적당한 멸균 수단과 통합하여 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본적 분산매 및 상기 열거된 것으로부터의 다른 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 통합하여 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동건조 기술이고, 이는 재조합 종양용해 바이러스의 분말 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 부가적 원하는 성분을 산출한다.
투여의 용이 및 투여량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태에서 비경구 조성물을 제형하는 것이 유익할 수 있다. 투약량 단위 형태는 본원에서 사용된 바와 같이 치료될 포유동물 대상체를 위해 통합 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미한다; 각각의 단위는 필요한 약제학적으로 또는 수의적 허용가능한 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 얻기 위해 계산된 예정량의 활성 물질을 함유한다.
본 개시내용의 재조합 종양용해 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물은 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정에 의해 제형될 수 있다. 약제학적 바이러스 조성물은 활성 재조합 종양용해 바이러스를 생물학적으로 또는 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 제형하는 것을 촉진하는 1 이상의 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조물을 사용하여 종래의 방식으로 제형될 수 있다. 재조합 종양용해 바이러스 조성물은 1 이상의 생물학적으로 활성제와 병용될 수 있고 본 개시내용의 약제학적 또는 수의적 조성물을 산출하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형될 수 있다.
치료용 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 약제학적 기술분야에 공지되어 있고, 예들 들면 하기에서 기재되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, ed., 18.sup.th Edition (1990)) 및 in CRC Handbook of Food, Drug, 및 Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S. C. Smolinski, ed. (1992)). 어떤 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스 조성물은 약제학적으로 또는 수의적-허용가능한 담체와 함께 제형될 수 있고, 희석제 또는 부형제는 수성, 예컨대 물 또는 만니톨 용액 (예를 들면, 약 1% 내지 약 20%), 소수용액 (예를 들면, 오일 또는 지질), 또는 이들의 조합 (예를 들면, 오일 및 물 에멀젼)이다. 어떤 구현예에서, 본원에 개시된 생물학적 또는 약제학적 조성물의 어떤 것은 보존제 또는 안정제 (예를 들면, 항생제)를 갖거나 멸균되어 있다.
본 개시내용의 생물학적 또는 약제학적 조성물은, 상기 조성물에 함유된 재조합 종양용해 바이러스가 조성물의 대상체에의 투여시 생체이용가능하도록 제형될 수 있다. 투여 후 혈청, 종양, 및 다른 조직에서 재조합 종양용해 바이러스의 수준은 다양한 잘 확립된 기술, 예컨대 항체-기반 검정 (예를 들면, ELISA)에 의해 모니터링될 수 있다. 어떤 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스 조성물은 필요한 대상체 (예를 들면, 종양이 있는 대상체), 예컨대 비-인간 동물 또는 인간에 대한 비경구 투여를 위해 제형된다. 바람직한 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내, 또는 근육내를 포함한다.
적당한 제형은 당해기술에 공지된 바와 같이 선택된 투여 경로에 의존한다. 예를 들면, 전신 제형은 투여 주사를 위해 설계된 것, 예를 들면 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 척추강내 또는 복강내 주사, 뿐만 아니라 종양내, 경피, 점막통과, 경구, 비강내, 또는 폐 투여를 위해 설계된 것을 포함하는 구현예이다. 일 구현예에서, 전신 또는 종양내 제형은 멸균되어 있다. 주사의 구현예에서, 본 개시내용의 재조합 종양용해 바이러스 조성물은 수용액에서, 또는 생리적으로 상용성 용액 또는 완충액 예컨대 한스 용액, 링거액, 만니톨 용액 또는 생리 식염수 완충액에서 제형될 수 있다. 어떤 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 종양용해 바이러스 조성물의 어떤 것은 제형제, 예컨대 현탁제, 안정제 또는 분산제를 함유할 수 있다. 점막통과 투여의 구현예에서, 침투될 침락자에 대해 적절한 침투제, 가용화제 또는 완화제는 제형에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 1-도데실헥사하이드로-2H-아제핀-2-온 (Azon®), 올레산, 프로필렌 글라이콜, 멘톨, 디에틸렌글라이콜 에톡시글라이콜 모노에틸 에테르 (Transcutol®), 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (Tween®-20), 및 의약품 7-클로로-1-메틸-5-페닐-3H-1,4-벤조디아제핀-2-온 (디아제팜), 이소프로필 미리스테이트, 및 당해기술에 일반적으로 공지된 다른 그와 같은 침투제, 가용화제 또는 완화제는 본 개시내용의 임의의 조성물에서 사용될 수 있다.
투여는 경로의 조합, 예를 들면, 동맥내 경로를 사용하는 첫 번째 투여 및 정맥내 또는 종양내 경로를 통한 차후 투여, 또는 이들의 임의 조합을 사용하여 달성될 수 있다.
특이한 구현예에서, 본 개시내용은 항종양 CDC 반응을 매개하는 생체내 항체를 산출하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 대상체에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고 여기서 상기 조성물의 투여는 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 생산한다. 발명자들은, 복제 가능 종양용해 바이러스의 투여에 의해 산출된 종양-특이적 항체 매개된 항종양 CDC 반응이 성장을 억제하거나 심지어 암세포를 사멸시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 동물에서 종양-특이적 CDC 반응을 산출하는데 충분한 다수의 감염에서 본 개시내용에 따른 재조합 종양용해 바이러스를 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하거나 종양 세포를 사멸할 것이다. 어떤 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스는 1회 초과, 바람직하게는 2회, 3 시간, 또는 최대 10 회 투여된다. 어떤 다른 구현예에서, 종양 세포는 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 치료된다.
본 개시내용의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 종양 세포 또는 암의 예는 하기를 포함한다: 간 세포 암종, 유방암 (예를 들면, 유방 세포 암종), 난소암 (예를 들면, 난소 세포 암종), 신장 세포 암종 (RCC), 흑색종 (예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 전립선암, 결장암, 폐암 (소세포 폐암 및 비-소세포 폐암 포함), 골 암, 골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 연골육종, 췌장암, 피부암, 섬유육종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프맥관육종, 림프종 (예를 들면, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프구 림프종, 일차 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 역형성 큰-세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 작은 절단된-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아구성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통의 광범위 대세포 림프종, 혈관면역모세포 림프절병증 (AILD)-유사 T 세포 림프종 및 HIV 연관된 체강 기반 림프종), 캐슬만 질환, 카포시 육종, 혈관육종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 매크로글루불린혈증 및 다른 B-세포 림프종, 비인두 암종, 두경부암, 점액육종, 지방육종, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 자궁관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 이행 세포 암종, 식도암, 악성 가스트린종, 작은 창자 암, 담관세포 암종, 선암종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신 암, 연조직의 육종, 요도, 음경암, 고환암, 악성 기형종, 소아기의 고형 종양, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장 골반의 암종, 악성 수막종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 종양 신생혈관형성, 척추 종양, 뇌하수체 샘종, 표피암, 편평상피 세포암, 석면에 의해 유도된 것을 포함하는 환경 유도 암, 예를 들면, 중피종, 및 이들 암의 조합.
본 발명은, 복제 가능 종양용해 바이러스로 환자를 치료하여 암 환자에서 항체 매개된 종양-특이적 CDC 반응을 올릴 수 있다는 것을 보여준다는 것을 고려하면, 발명자들은, 상기 대상체에서 상기 암에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체를 생산하기 위해 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암이 있는 대상체의 암 치료를 구체적으로 맞출 수 있을 것이라는 것을 발견했다. 일단 이 반응은 종양 특이적 항체를 함유하는 혈청을 산출하고 암에 대항하는 B 세포는 대상체로부터 수확되고 생체외에서 퍼진다. 항체 및/또는 항체를 생산하는 수확된 B 세포의 이러한 퍼진 모집단은 암 환자에 대해 특이적인 면역요법 조성물로서 사용된다. 그것으로서, 이러한 면역요법은 항암 효과를 생성하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 면역요법 조성물이 준비되고 항체의 단리시 대상체에 즉각적으로 투여될 수 있거나 대상체의 요법에서 나중의 단계에서 추가 치료를 위해 보관될 수 있다.
B 세포 및 항체의 생체외 팽창의 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있고 배양에서 항체 생산 세포의 성장 및 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 항체의 수확을 간단히 수반한다.
또 하나의 구현예에서, 방법은, 바람직하게는 동맥을 통해 또는 내재하는 의료 기기를 통해 재조합 종양용해 바이러스의 비경구 투여를 수반한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 재조합 종양용해 바이러스는 면역치료제 또는 면역조절물질, 예컨대 (예를 들면, 키메라, 인간화 또는 인간 모노클로날 항체)에 결합하는 항체와 함께 투여될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 재조합 종양용해 바이러스 치료는 수술 (예를 들면, 종양 적출/절제), 방사선 요법, 화학요법, 또는 면역요법과 병용될 수 있고, 상보적 치료 전, 동안 또는 그 후에 투여될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법은 종양용해 바이러스를 대상체에게 투여하여 항체 매개된 종양-특이적 CDC 반응을 산출하는 것을 포함하는 것이 고려되고, 여기서 종양용해 바이러스의 투여와 병용하여 대상체는 인간에 대한 부가적 암 치료로 치료된다. 특이한 구현예에서, 부가적 암 치료는 화학요법, 방사선, 수술, 면역요법, 유전자 요법, 또는 이들의 조합이다. 특이한 구현예에서, 암 세포는 인간 내에 있고/거나 도입 단계는 적어도 약 1×109 플라크 형성 단위 (pfu)의 종양용해 바이러스를 인간에게 투여하는 것으로서 추가로 정의된다.
암이 있는 사람의 대략 60%는 방지, 진단 또는 스테이징, 치료적 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 경험할 것이라고 추측되었다. 치료적 수술은 다른 요법, 예컨대 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적인 요법와 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치료적 수술은, 암이 있는 조직의 모두 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 의미한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동외과수술, 전기외과수술, 및 미스코피컬(miscopically) 조절된 수술 (모즈 수술)을 포함한다. 본 발명은 정상 조직의 피상적인 암, 전암, 또는 부수적인 양의 제거와 함께 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
모든 암이 있는 세포, 조직, 또는 종양의 일부의 적출시, 구멍이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 부가적 항암 치료 예컨대 본원에 기재된 종양용해 바이러스의 투여와 함께 그 면의 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해 수행될 수 있다. 그와 같은 치료는, 예를 들면, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5 주 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 반복될 수 있다. 이들 치료는 가변 투여량일 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서 종양용해 바이러스는 대상체의 종양 또는 암에 대한 항체-매개된 반응을 생성하기 위해 사용된다. 반응은 예를 들면, 암 세포를 사멸시키고, 암 세포에서 세포자멸사를 유도하고, 암 세포의 성장률을 감소시키고, 전이의 발생정도 또는 수를 감소시키고, 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고, 종양 또는 암 세포에 혈액 공급을 감소시키고, 암 세포 또는 종양에 대항하여 면역 반응을 촉진하고, 암의 진행을 방지 또는 억제하거나, 암이 있는 대상체의 수명을 증가시켜서 암 또는 종양의 치료를 생성하는데 충분하다. 더 일반적으로, 항체 또는 항체를 생산하는 B 세포는 세포의 증식을 사멸 또는 억제시키기 위해 조하된 효과를 제공하도록 종래의 항암 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
하기 비-제한 그 예는 본 개시내용의 다양한 측면을 설명하기 위해 제공된다. 모든 참조, 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 등은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 후속되는 실시예에 개시된 기술들은 본 발명자들에 의해 발견된 본 발명의 실행시 잘 기능하는 기술을 대표하는 것임이 본 기술분야의 숙련자에 의해 인식되어야 하며, 따라서 그 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 본 기술분야의 숙련자는, 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구체예에 많은 변화가 이뤄질 수 있고 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식할 것이다.
실시예 1: 방법
바이러스 및 세포주: 와이어쓰(Wyeth) 균주 백시니아 바이러스인 JX-594(티미딘 키나아제 [TK]-불활성화됨, hGM-CSF 발현)를 이 연구에 사용하였고, 종래 공개된 대로 준비하였다2 4. SNU349, SUN482 및 SNU267(인간 신장 세포 암종; 한국 세포주 은행[KCLB]으로부터 얻음) 및 SNU475 & SNU398(인간 간세포 암종; KCLB로부터 얻음)을 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 10% FBS(Hy클론)가 첨가된 RPMI 1640(Gibco)에서 배양하였다. HOP62, H157, H460 및 PC10(인간 폐 암종; 미국 종균 협회[ATCC]로부터 얻음), HepG2(인간 간세포 암종; ATCC로부터 얻음), SF-295(인간 담낭암; ATCC로부터 얻음), PC-3(인간 전립선암; ATCC로부터 얻음), PANC-1(인간 췌장암; ATCC), MCF-7(인간 유방암; ATCC)을 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. MRC-5 비형질전환 세포(폐 섬유아세포; ATCC) 및 HUVEC(내피 세포; ATCC) MRC-5를 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 2% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 내피 세포 배지 EBM-2(Lonza, MD, USA)에서 배양하였다.
토끼 VX2 종양 모델 및 VX2 세포의 분리: VX2 종양을 성장시키고, 근친교배시킨 뉴질랜드 흰토끼(Samtako, Oh-San, Korea)의 근육 내에 유지시켰다. JX-594(1×109 pfu) 또는 인산완충액(PBS)을 VX2 단편 이식 후 3주 및 4주에 골격 근육 내로 주사하였다. JX-594 또는 PBS 처리 후 기준선, 3주 및 6주에 혈청을 수집하였다. VX2를 종래 기술된 대로 분리하였다31. 요약하면, VX2 조직으로부터 효소에 의해 VX 세포를 분리하고(4℃에서 밤새 콜라게나제 0.01% 프로테아제 0.1%), 8회 계대 동안 10% 우태아혈청(FBS)을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)로 시험관내에서 유지시켰다. 각 세포 생존율 시험을 위해 신선한 VX2 세포를 사용하였다. 평행 연구에서, JX-594를 정상인 종양이 없는 토끼 내로 주사하고, 혈청을 수득하였다.
세포 생존율 & CDC 검정: 혈청이 첨가될 때(열처리하지 않음), 세포 생존율이 감소하였다. 96 웰 플레이트에서 5% 혈청으로 배양시 세포 생존율을 측정함으로써 CDC 활성을 평가하였다. JX-594 투여 후 혈청 내 세포 생존율을 기준선(JX-594 처리 전)에서의 토끼 또는 환자 혈청의 세포 생존율에 대해 정규화하였다. 각 세포주를 96-웰 플레이트 상에 시딩(seeding)하고 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 DMEM(FBS 무첨가) 및 혈청 샘플과 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS 및 10 μl 세포 계수 키트-8(CCK-8) 용액(CCK-8 키트, Dojindo, Inc., Kumamoto, Japan)에 노출시키고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 측정하였다.
웨스턴 블랏팅: VX2 세포, 토끼 말초 혈액 단핵 세포, SNU349 또는 SNU739 세포를 얼음 상에서 30분간 PRO-PREP™ 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechology, Korea)에서 ~1x106 세포/mL로 용해시켰다. 원심분리 후, SDS-PAGE 겔을 이용하여 50 μg의 단백질을 분리하고, PVDF 막(Immunobilon-P; Millipore, Billerica, MA)에 이전시켰다. 혈청을 0.1% TBST(5% 탈지분유; 0.1% 트윈 20; 50 mmol/L 트리스; 150 mmol/L 염화나트륨)에 1/100으로 희석하고, PVDF 막 상에서 실온에서 90분간 배양하였다. 그리고 나서, 상기 막을 0.1% TBST에서 1/10,00으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 염소 항-토끼 IgG(Stanta Cruz)(토끼 혈청 일차) 또는 항-인간 IgG(Sigma #A1543, 1:5,000)(인간 혈청 일차)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고 증대된 화학발광을 시각화하였다(ECL 키트; Pierce, Rockford, IL).
형광 & 공초점 현미경 관찰: 각 세포주를 6-웰 플레이트 내에 플레이팅하고, 세포를 100% 세포 밀도에 도달할 때까지 24시간 동안 배양하였다. 형광 염색을 위하여, SNU349 세포를 3×105 세포로 커버글라스-바닥 디쉬 내로 시딩(seeding)하고 밤새 정치시켰다. 카복시플루오레신 석신이미딜 에스테르(CSFE) 및 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD)(ACT 1™ Assay for CytoToxicity, Cell Technology)을 첨가하여 생존 세포 및 사멸 세포를 각각 염색하였다. 살아있는 세포에서는, CSFE(전체 세포 내에 녹색 형광)가 검출될 수 있는 반면 적색 형광은 죽은 세포의 핵에서 검출될 수 있다.
SEREX 연구: 인간 간세포 암종(HCC) 세포주인 SNU449로부터 추출된 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 상기 cDNA 라이브러리를 λ ZAP 발현 벡터(ZAP-cDNA Syhthesis Kit, [Stratagene CA]) 내로 클로닝하였다. 증폭된 라이브러리의 역가는 1×109 pfu/ml였고, 5×105 pfu를 인간 혈청에 대한 일차 면역스크리닝에 사용하였다. 42℃에서 6-8시간 배양 후 파아지 플라크가 나타났으며, 이후 이를 앞서 30분간 10 mM IPTG(Sigma-Aldrich, USA)에 침지시킨 132mm 니트로셀룰로오스 막(밀리포어, Bedford)으로 이전시켰다. 상기 니트로셀룰로오스 막을 5% BSA(Santa Cruz, USA)를 이용하여 블로킹하였다. JX-594로 처리된 HCC 환자(JX-594 주사 후 D57)로부터 모은 혈청을 1차 및 2차 스크리닝에 사용하였다. 이 연구를 위해 가장 높은 CDC 활성을 갖는 환자들의 혈청을 모았다(환자 #1702, #1703, #1704, #1705, #1712, #1713 및 #1715). 모은 혈청(1:100 희석된 혈청 6 ml)을 일차 항체 스크리닝을 위해 첨가하고, 결합된 항체를 1:5000 희석된 알칼라인 포스파타아제 표지된 염소 항-인간 IgG(Sigma-Aldrich, USA)로 검출한 다음, 막을 미리 혼합된 BCIP/NBT 용액(Sigma-Aldrich, USA)으로 현상하였다. 상기 막에 대응하는 아가 플레이트로부터 청색 플라크를 파내고, 이를 20 μl 클로로포름을 함유하는 SM 완충액(100mM 염화나트륨, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM 황산마그네슘) 내로 넣었다. 70개의 플레이트를 스크리닝한 후(1차의 경우 5개의 플레이트), 70개의 양성 플라크를 분리하였다. 2차 스크리닝(82 mm 플레이트) 후, 단일클론성(높은 밀도를 갖는 >90% 양성 파아지)으로 11개의 플라크를 정제하였다. 각 클론으로부터 DNA 추출 후, DNA의 서열을 분석하였다.
닷 블랏팅: 각 양성 클론에 대한 대장균 파아지 용해물을 SM 완충액 중에서 5배로 희석하고 1 μL의 희석된 용해물을 와트만 막(Whartman, Germany)의 테스트 스트립 상으로 스포팅하였다. 5분간 공기 건조 후, 모든 테스트 스트립을 블로킹 용액에 1시간 동안 침지시켰다. 막을 1:50 JX-594가 미리 주사된(0주, 2주, 4주) 또는 이후에 주사된(D57) 인간 혈청에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 항체를 1:2500 희석된 알칼라인 포스파타아제 표지된 염소 항-인간 IgG(Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 검출하고 BCIP/NBT 용액으로 현상하였다.
실시예 2: CDC 는 동물 모델 및 인간 환자 모두에서 유도된다
종양을 가진 JX -594-처리된 토끼의 혈청과 함께 종양 세포를 배양시 관찰된 감소된 세포 생존율. 토끼 모델에서의 CDC의 유도를 조사하기 위해, JX-594 또는 PBS 대조군으로 처리된 근육 내로 이식된 VX2 선암종을 가진 토끼로부터 혈청을 수집하였다. 주사 후 28일에 수집된 혈청을 시험관내에서 3%의 농도로 VX2 세포 또는 토끼 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하였다. JX-594-처리된, VX2 종양을 가진 토끼의 혈청과 함께 배양된 세포에서만 유의한 세포 생존율의 감소(대략 90%)가 관찰되었다(도 1a). PBS로 처리된 VX2 종양을 가진 토끼 또는 JX-594로 처리된 종양이 없는 토끼의 혈청과의 VX2 세포의 배양은 감소된 세포 생존율을 나타내지 않았다. 또한, PBMC 생존율은 임의의 치료 그룹의 혈청과 함께 배양시 유의하게 감소하지 않았다. 이후, JX-594(또는 PBS) 주사 후 다양한 시점에서 수집된 혈청과 함께 배양시에 VX2 세포 생존율을 평가하였다. VX2 종양을 가진, JX-594-처리된 토끼에서 18일 이후로부터 수집된 혈청과 함께 배양시 VX2 세포 생존율이 감소하였다(도 1b). 증가된 농도의 혈청(최대 2%까지)은 VX2 세포 생존율에서의 용량-의존적 감소를 야기하였다(도 1c). 2% 혈청과의 세포의 배양은 정상 토끼 혈청 대조군의 처리와 비교하여 대략 20% VX2 세포 생존율을 야기하였다. VX를 가진, JX-594-처리된 토끼의 혈청이 신규 항원에 결합하는지 여부를 평가하기 위해, 미접촉(naive) 토끼의 혈청 및 JX-594-처리된 종양을 가진 토끼의 혈청을 이용하여 VX2 및 PBMC 세포 용해물에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 새로운 항원에 대한 강한 반응성이 VX2 세포주 용해물에서만 관찰되었고, 다수의 새로운 밴드가 VX2 종양을 가진 토끼의 JC-594 처리시 인식되었으며, 이는 VX2 종양 항원에 대한 다중클론 항체의 유도를 가리킨다(도 1d).
JX -594-처리된 환자의 혈청과 함께 인간 암세포주의 배양시 감소된 세포 생존율의 증거. JX-594-처리된, 종양을 가진 토끼의 토끼 혈청과 함께 배양함으로써 촉발된 세포 생존율의 유의한 감소의 검출에 관하여, 본 발명자들은 JX-594-처리된 환자로부터 수집된 혈청에서 유사한 활성이 관찰될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 JX-594 요법 후 유의한 반응 및 장기 생존을 갖는 1상 간 종양 시험에서 치료된 두 명의 환자의 혈청을 시험하는 것부터 시작하였다(환자 103: 폐암, 24.5개월 생존; 환자 301: 신장 세포암, 44.1 + 개월 생존)26. 실제로, 전임상 모델에서의 관찰과 유사하게도, JX-594-처리된 환자 혈청(5%)과의 암세포주의 배양은 세포 생존율에서의 유의한 감소를 야기하였다(도 2a). 환자의 암과 동일한 기원의 암세포주를 시험하였고, 대부분의 세포주에서 시간-의존적인 세포 생존율 감소가 관찰되었다. 명시야 현미경 관찰 하에서 세포의 시각화는 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 밝혀내었으며, 이는 세포 생존율 감소가 CDC에 의해 촉발된다는 것을 보여준다(도 2b). CSFE 및 7-AAD 염료를 사용하여 각각 생존 세포 및 사멸 세포를 염색하였다. 7-AAD 염색은 JX-594 면역 환자의 혈청으로 처리된 세포가 세포 사멸을 겪고 있음을 입증한다.
실시예 3: 감소된 세포 생존율은 항체- 매개된 보체 -의존적 세포독성에 기인한다
다음으로, 본 발명자들은 JX-594 처리된 환자의 혈청이 암세포 세포독성을 매개하는 기전을 평가하기 위해 항체 및 보체의 기여도를 시험하였다. JX-594-처리된 환자의 혈청을 열-불활성화하여 임의의 보체 활성을 억제하였다. IgG에 결합하는 컬럼을 사용하여 혈청으로부터 항체를 제거하였다(도 3a에서의 실험 개요 참조). 기준선 혈청(JX-594 처리 전, 혈청 A), JX-594 처리 후 92일에 수득한 혈청(혈청 B), 열-불활성화된 혈청 B(혈청 C) 및 IgG 수지를 통과한 혈청 B(혈청 E)을 5%의 농도로 암세포주 단층에 첨가하였다. 기준선에 수집된 혈청은 감소된 세포 생존율을 야기하지 않은 반면, JX-594 처리 후 92일에 수집된 혈청은 강력한 항종양 활성을 나타내었다. 그러나, 세포들은 열-불활성화 또는 IgG 결실시 계속 생존 상태로 남았다. 또한, 혈청 C에서의 기능성 보체의 복원(기준선에서 수집되고 그 자체로 감소된 세포 생존율을 나타내지 않은 혈청 A의 첨가에 의함)은 항종양 활성의 복원을 야기하였다. 환자의 종양 유형에 해당하는 세포주에 대한 1상 연구에서 치료된 총 3명의 환자(301 - 신장암; 103 - 폐암; 304 - 흑색종)의 혈청 샘플에 대해 유사하게 관찰되었다(도 3b). 혈청 배양 후 세포주의 명시야 이미지(환자 301)가 도 3c에 나타나 있다. 마지막으로, 열 불활성화 길이에 관련하여 시간 의존적인 세포 생존율 증가가 관찰되었다(도 3d).
종양 세포에 특이적이고 동일한 종양 유형의 세포에서 효과적인 CDC 활성. 다음으로, 본 발명자들은 JX-594-처리된 환자의 혈청이 생체외에서 정상 인간 세포에 대해 독성을 유발할 수 있는지 여부를 조사하였다. HUVEC 내피 세포 및 MRC-5 폐 섬유아 세포는 시험된 5명의 환자 중 어느 환자의 혈청과 함께 배양될 때 유의한 세포 생존율 감소를 나타내지 않았다. 일반적으로, 감소된 세포 생존율은 그 기원이 환자의 종양 유형(신장암, 흑색종 및 HCC)에 해당하는 세포에서 관찰되었다(도 4 a-d). 생존 대 CDC 1상.
무작위 2상 시험에서 평가된 CDC 유도. 진행 중인 무작위 2상 시험에서 치료된 HCC 환자에서 CDC 유도를 분석하였다. JX-594-처리된 환자의 혈청과 함께 배양시 HCC 세포주에서 감소된 세포 생존율이 관찰되었다. CDC 활성은 시간이 경과함에 따라 증가하였다(도 4b 요약, 도 c-e 각각의 세포주).
실시예 4: SEREX 스크리닝은 내인성 신규 종양 항원의 확인을 야기한다
환자 혈청이 신규 항원에 결합하는지 여부를 평가하기 위해, 환자의 종양 및 환자 혈청(유의한 CDC를 나타내는 1상 및 2상 시험에서의 환자로부터)과 동일한 조직 기원의 암세포주로부터 얻은 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. JX-594 치료 후 혈청에서 새로운 항원에 대한 강한 반응성이 관찰되었으며, 이는 환자의 내인성 종양 항원에 대한 다중클론 항체의 유도를 제시한다(도 6). 신규 표적 항원을 확인하기 위하여, 인간 HCC 세포주(SNU449)로부터 생성된 cDNA 라이브러리 상에서 강한 CDC 활성을 가진 HCC를 갖는 환자로부터 모은 혈청을 이용하여 SEREX 스크리닝을 수행하였다. 2회 스크리닝 후, 17개의 후보 항원이 확인되었다(도 7, 표 1). 하위세트의 항원, 예컨대 RecQ 단백질-유사(DNA 헬리카제 Q1-유사)(RECQL) 및 렙틴 수용체(LEPR)는 종래 HCC 또는 다른 암을 위한 표적으로서 확인되어 온 반면, 다른 것들[ERBB 수용체 피드백 억제제 1(ERRFI1), 리소좀 단백질 막통과 4 알파(LAPTM4A) 및 RAS 종양유전자 패밀리(RAB1B) 포함]은 추정적인 HCC 항원이며 HCC에서의 잠재적으로 신규인 표적에 해당한다. JX-594 처리 전에 수집된 환자 혈청의 반응성을 11개의 확인된 항원에 대한 반응성으로 시험하였다. JX-594 처리 전에 하위셋의 항원에 대한 항체들이 존재하였으나, 일반적으로 반응성은 JX-594 요법 후 더 강하였으며, 이는 복제-가능한 폭스바이러스를 이용한 치료가 종양 항원을 인식하는 다중클론 항체를 유도한다는 것을 제시한다.
실시예 5: 고찰
암을 위한 첫 번째 면역요법의 승인(Provenge, Dendreon, Seattle WA)이 암 치료요법에 대한 이 신규 접근법을 입증해왔다. 환자 내에 재주입하기에 앞서 자가 수지상 세포 집단이 GM-CSF에 융합된 전립선암 항원에 노출되고, 이 접근법은 거세-내성 전립선암을 갖는 환자의 생존을 개선하는 것으로 입증되어 왔다32. 비-특이적 면역자극 접근법은 역시 면역-자극 사이토카인, 예컨대 IL-2를 이용한 치료를 비롯하여, 암 면역요법으로서 평가되어 왔다. 면역자극 사이토카인 또는 공동-자극 분자의 맥락에서 종양 항원을 발현하는 많은 복제-불능 바이러스 백신은 종양 백신으로서 평가되어 왔다. 종양-특이적 면역 반응을 유도하는데 효과적임에도 불구하고, 이들 전략은 환자에게 유의한 생존 이점을 야기하지 못하였으며 어떠한 바이러스 암 백신도 아직까지 관리 기관에 의해 승인받지 못하였다. 종양 항원에 대한 항체의 전신적인 유도가 관찰되어 왔음에도 불구하고9 , 33, 이들 항체가 기능성인지, 예컨대 이들이 CDC를 매개하는지 여부는 알려져 있지 않다.
종양용해 바이러스 복제 및 이식유전자 발현이 임상시험에서 재현성있게 입증되어 왔지만, 전신 기능성 항암 면역력 유도는 현재까지 JX-594 또는 다른 종양용해 바이러스를 이용한 어떤 시험에서도 체계적으로 평가되지 않았다. CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ 림프구, 천연 살해 세포 및 다양한 염증성 사이토카인의 전신 유도가 입증되어 입증되어 왔다2 6. HSV-hGM-CSF(Oncovex, Biovex, Cambridge MA)를 이용한 흑색종 임상시험에서, 종양 샘플로부터 유래한 T 세포의 표현형 분석은 말초 혈액 T 세포와의 뚜렷한 차이를 제시하였다. 치료되지 않은 대조군 환자로부터 유래한 T 세포와 비교하여, 백신접종 후 퇴화를 겪는 종양에서 T 세포에 의해 인식되는 흑색종-연관 항원(MART-1)-특이적 T 세포의 증가가 있었고, 기능성 항종양 면역력은 평가되지 않았다28. 전임상 연구는 종양용해 바이러스가 기능성 암-특이적 면역력을 유도할 수 있음을 입증해왔지만, 임상 데이터는 부족하다2 4 , 34-38.
보체 시스템은 선천성 면역계의 일부인 일련의 혈청 단백질로 구성된다. 보체 시스템은 감염을 막는 작용을 하며(예를 들어, 침입 박테리아를 옵소닌화하거나 직접 용해시킴으로써) 또한 선천성 및 후천성 면역력 사이에 연결고리를 형성한다30. 특히, 보체 단백질은 외래 항원에 대한 반응으로 유도된 항체에 의해 옵소닌화된 세포를 용해시키는 잠재성을 갖는다. 실제로, 보체-매개된 세포독성(CDC)은 가장 강력한 세포 사멸 시스템 중 하나이다3 0. CDC 활성은 현재 악성종양의 치료에 사용되는 단일클론 항체(mAb)에 의해 활용된다. 리툭시맙(CD20 특이적 mAb)의 항종양 효능에 대한 CDC의 기여가 전임상적으로 광범위하게 평가되어 왔다39 -41. 또한, 여포성 림프종 환자에서 리툭시맙 요법에서의 보체 시스템의 관련성은 C1q 보체 캐스케이드 유전자에서 다형성을 갖는 환자의 질병 진행시간까지의 시간이 증가하였다는 관찰에 의해 뒷받침된다42. 만성 림프구성 백혈병을 위한 알렘투주맙43 및 상이한 기원의 암세포주를 위한 파니투무맙 및 세툭시맙44을 비롯하여, 다른 항체들이 암세포주 또는 환자 샘플에서 CDC를 매개하는 것으로 나타났다. 이들 관찰은 종양-표적화된 mAb의 고유의 CDC 활성을 개선하는 전략45 - 47 뿐만 아니라 CDC 활성을 개선하는 제제와의 병용 요법의 개발로 이어졌다48. 그러나, 세포독성 대 정상 CD20-발현 PBMC의 강화가 관찰될 수 있으므로, 리툭시맙과 같은 암 특이적이 아닌 치료를 이용한 CDC 활성의 추가 증대에 대해 일부 우려가 있다48.
백시니아 바이러스는 바이러스의 전신 확산을 촉진하기 위해 보체-매개된 중화에 저항성인 것으로 나타났다. 이는 백시니아의 세포외-피막 바이러스(EEV) 형태의 외부 코트(coat) 내에 보체-조절 단백질이 혼입되는 것에 기인한다49. 그러나, 방출된 비리온(virion)의 외피 내로의 혼입을 위한 보체 조절 단백질의 결실로 인해, 백시니아 바이러스로 감염된 종양 세포가 보체-매개된 중화에 더 민감할 수 있음이 입증되어 왔다 49,50. 종양 미세환경 내에서 JX-594-감염된 세포로부터의 GM-CSF의 발현은 NK 세포 및 대식세포의 자극 및 팽창을 통해 CDC-매개된 사멸을 강화할 수 있다 51. 실제, JX-594 복제는 종양 내 염증을 촉발시킬 수 있으며 염증성 침윤물은 JX-594를 이용하여 종양내로 치료된 흑색종 병변에서 검출되어 왔다 29.
본원에서, 본 발명자들은 종양용해 바이러스로 치료된 환자에서 기능성 항종양 면역력의 유도의 첫 번째 증거를 입증한다. JX-594는 종양을 가진 토끼 뿐만 아니라 다양한 진전된, 난치성 종양을 갖는 환자 모두로부터 수득한 혈청에서 입증된 바와 같이, 생체외에서 종양 세포의 항체-의존적 CDC를 유도한다. 항암 면역요법으로서 복제가능한 종양용해 폭스바이러스의 사용은 다른 면역치료 전략에 비해 하기와 같은 주요 이점을 갖는다: 1) 항암 면역 반응의 유도는 상기 요법의 한 가지 작용기전을 대표하며, 다른 것들은 종양 세포의 직접적인 감염 및 용해 및 급성 종양 혈관 폐쇄를 포함한다; 2) 종양용해 폭스바이러스 감염은 환자-특이적/맞춤식(tailored) 면역 반응을 촉발한다; 3) 상기 요법에 대해 생체외 조작 단계가 필요하지 않다(효과적이기는 하지만, 상기 임상적으로 입증된 프로벤지(Provenge) 접근법은 힘이 들며, 각 환자의 면역 세포의 생체외 조작을 요함) 및 4) 면역 자극은 종양 미세환경 내에서 염증 반응을 촉발하는 종양 세포의 활발한 바이러스 감염에 의해 촉발된다. 면역요법 분야에서의 주된 장애물은 활성화된 면역 효과기 세포가 종양에 동원되고 종양 내에서 활성화되는 것이다. 종양용해 폭스바이러스는 후천성 면역 반응의 유도를 촉진하는 한편 동시에 종양 미세환경 내의 전-염증 사이토카인 및 국소 염증 반응의 유도를 촉발하여 종양에서 면역 세포의 동원 및 활성화를 보증하는 최적의 비히클에 해당한다.
본원에 서술된 시스템은 신규한, 환자 내인성 종양 항원이 확인될 수 있는 기전을 나타낸다. 종래 확인된 SEREX 스크리닝은 현재의 접근법을 입증하는 종양 항원 뿐만 아니라 HCC의 치료를 위한 새로운 잠재적인 표적에 해당하는 신규 종양-연관 항원을 규명하였다. (1) 복제가능한 종양용해 폭스바이러스를 이용한 환자의 치료, (2) 생체외 기능성 항종양 면역력의 측정(CDC 검정) 및 (3) 높은 CDC 활성을 갖는 환자 혈청에 대해 SEREX 스크리닝을 수행하여 표적 항원을 확인하는 것을 포함하는 본원에 서술된 실험적 설계는 신규 종양 항원을 발견하기 위한 신규 접근법에 해당한다. 이 방법은 항체의 생성이 안전한(항체가 유해한 효과 없이 인간에서 생산되었기 때문) 다수의 관련 항원(항체에 의해 인식될 수 있는 환자 내인성 항원)의 확인을 가능하게 한다. 본원에서, 본 발명자들은 HCC 환자에서 이 방법의 개념 증명을 입증하였으나, 이 방법론은 유사하게 임의의 다른 종양 유형에 사용될 수 있다.
또한, 종양 항원, 백시니아 바이러스 뿐만 아니라 JX-594 처리된 환자에서의 JX-594 이식유전자 β-갈락토시다아제에 대한 세포독성 T 림프구의 유도가 현재 평가되고 있다. 소라페닙(처방계획이 2상 시험에서 시험되고 있음)을 비롯한 항혈관형성제를 이용한 병용 요법의 JX-594-유도된 CDC에 대한 효과가 조사되고 있다.
실시예 6: CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체에 대한 종양용해 백시니아 , GM -CSF 및 레오바이러스 효과
복제가능한 종양용해 바이러스가 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체를 상이하게 유도한다는 것을 보여주기 위한 연구를 설계하였다. 항체 유도는 면역자극 사이토카인의 발현에 의해 증강될 수 있다. 이들 중 첫 번째로, CDC 반응을 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아 , GM - CSF 및 레오바이러스의 효과를 평가하였고, 데이터가 도 9에 나타나 있다.
VX2 종양을 가진 토끼에게 PBS, 인간 GM-CSF를 발현하는 UV 불활성화된 JX-594, 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594F, 쥣과 JX-594를 발현하는 JX-594, JX-963 또는 레오바이러스를 매주 2회 정맥내 주입으로 처리하였다(n=2). 바이러스를 1 × 109 pfu의 용량으로 투여하였다. 기준선 및 처리 개시 후 3주에 혈청을 수집하였다. 토끼 혈청을 표시된 농도로 3시간 동안 시험관내에서 A2780 세포와 함께 배양하였다. 처리전 혈청과 함께 배양된 A2780 세포의 생존율 대비 세포 생존율을 CCK-8 키트를 이용하여 평가하였다.
이들 연구로부터 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594(토끼에서 생물학적 활성인 사이토카인)가 2.5%의 혈청 농도에서부터 CDC를 유도하였음이 확인될 수 있다. 최대 CDC 활성은 5% 혈청 농도에서 도달되었다. 마찬가지로, JX-963은 2.5% 혈청 농도에서 CDC를 유도하였고, 최대 CDC는 5% 혈청 농도에서 도달되었다. 인간 GM-CSF를 발현하는 UV 불활성화된 JX-594(복제불능됨) 또는 PBS로 처리된 토끼로부터 수집된 혈청을 이용한 A2780 배양이 시험된 어느 농도에서도 CDC를 유도하지 않았기 때문에, CDC를 매개하는 항체의 유도는 토끼에서의 종양용해 백시니아 복제에 의존적이었다. 유사하게도, 종양용해제로서 현재 임상 개발 중인 이중가닥 RNA 바이러스인 레오바이러스로 처리된 토끼로부터 수집된 혈청은 시험된 어느 농도에서도 CDC를 유도하지 않았다. 마지막으로, 쥣과 GM-CSF(인간 GM-CSF와 마찬가지로 토끼에서 생물학적 활성이 아님)를 발현하는 JX-594의 처리는 더 높은 농도의 혈청에서만 CDC를 유도하였다. 이들 결과는 면역자극성 사이토카인 GM-CSF의 발현이 CDC를 매개하는 항종양 항체의 유도를 강화할 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 인간 암세포 상에서 CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아 , GM - CSF 및 VSV 효과
다음 세트의 연구에서, CDC 반응을 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아 , GM - CSF 및 VSV 의 효과를 평가하였으며, 데이터가 도 10에 나타나 있다.
이들 실험을 위해, VX2 종양을 가진 토끼에게 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594(1×109 pfu), 쥣과 JX-594를 발현하는 JX-594(1×109 pfu), 웨스턴 리저브 백시니아(1×109 pfu), 수포성 구내염 바이러스(VSV)(6×108 pfu) 또는 쥣과 GM-CSF를 발현하는 VSV(6×108 pfu)를 매주마다 2회 정맥내 주입으로 처리하였다(n=2). 기준선 및 처리 개시 후 3주에 혈청을 수집하였다. 토끼 혈청을 표시된 농도로 3시간 동안 시험관내에서 A2780 세포와 함께 배양하였다. 처리전 혈청과 함께 배양된 A2780 세포의 생존율 대비 세포 생존율을 CCK-8 키트를 이용하여 평가하였다.
이 실험에서, 1.25% 및 2.5% 혈청과 배양시 세포 생존율의 명백한 감소와 더불어, 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594(JX-594)가 CDC 매개 항체를 유도하는데 가장 효율적이었다. 그에 반해, 쥣과 GM-CSF(인간 GM-CSF와 마찬가지로 토끼에서 생물학적 활성이 아님)를 발현하는 JX-594의 처리는 더 높은 농도의 혈청에서만 CDC를 유도하였다(주석: 부가적인 대조군으로서, 쥣과 GM-CSF를 발현하는 VSV는 시험된 어느 농도에서도 CDC를 유도하지 않았음). 또한, 야생형 웨스턴 리저브 균주의 백시니아(GM-CSF를 코딩하지 않음)를 이용한 토끼의 처리는 CDC를 매개하는 항체를 유도하는데 덜 효율적이었다. 마지막으로 단일가닥 음성 센스 RNA 바이러스 VSV의 처리는 시험된 최고 혈청 농도(10%)에서만 CDC-매개 항체를 유도하였다. 이들 결과는 종양용해 바이러스 생물학에 따라, 상이한 수준의 CDC 반응이 관찰될 수 있음을 제시한다.
실시예 8: 인간 암세포 상에서 CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 HSV 및 VSV - GM - CSF 효과
이러한 세트의 실험에서, 인간 암세포 상에서 CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 HSV 및 VSV - GM - CSF 의 효과를 평가하였고, 데이터가 도 11에 나타나 있다.
VX2 종양을 가진 토끼에게 쥣과 GM-CSF를 발현하는 VSV(6×108 pfu) 또는 단순 헤르페스 바이러스(HSV)(1×109 pfu)를 매주 2회 정맥내 주입으로 처리하였다(n=2). 기준선 및 처리 개시 후 3주에 혈청을 수집하였다. 토끼 혈청을 표시된 농도로 3시간 동안 시험관내에서 A2780 세포와 함께 배양하였다. 처리전 혈청과 함께 배양된 A2780 세포의 생존율 대비 세포 생존율을 CCK-8 키트를 이용하여 평가하였다.
이 실험에서, 5% 및 10% 혈청과 배양시 분명한 세포 생존율 감소와 더불어, HSV가 CDC 매개 항체를 유도하는데 가장 효율적이었다. GM-CSF를 발현하는 VSV는 이 실험에서 CDC를 유도하지 않았다(10% 혈청 조건에서 높은 가변성이 관찰되었음에도 불구하고 그러함).
실시예 9: 생체내 표적 종양으로부터 유래된 토끼 암세포 상에서 CDC 를 발현하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아 , GM - CSF 및 VSV 효과
이러한 세트의 실험에서, 생체내 표적 종양으로부터 토끼 암세포 상에 CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도에 대한 종양용해 백시니아 , GM - CSF 및 VSV 의 효과를 평가하였고, 데이터가 도 12에 나타나 있다.
VX2 종양을 가진 토끼에게 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594(1×109 pfu), 쥣과 JX-594를 발현하는 JX-594(1×109 pfu), 웨스턴 리저브 백시니아(1×109 pfu), 수포성 구내염 바이러스(VSV)(6×108 pfu) 또는 쥣과 GM-CSF를 발현하는 VSV(6×108 pfu) 또는 인간 GM-CSF를 발현하는 UV 불활성화된 JX-594를 매주 2회 정맥내 주입으로 처리하였다(n=2). 기준선 및 처리 개시 후 3주에 혈청을 수집하였다. 토끼 혈청을 시험관내에서 24시간 동안 VX2 세포와 함께 배양하였다. 처리전 혈청과 함께 배양된 A2780 세포의 생존율 대비 세포 생존율을 CCK-8 키트를 이용하여 평가하였다.
VX2 표적 세포 상에 CDC를 유도하기 위해, 종양용해 바이러스 투여 전에 수집된 혈청 내에 함유된 부가적인 보체를 3% 처리후 혈청 내로 섞었다. 이전 실험에서와 같이, UV 불활성화된 JX-594는 이러한 설정에서 CDC를 매개하는 항체를 유도할 수 없었다. 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594, 쥣과 GM-CSF를 발현하는 JX-594 및 웨스턴 리저브 백시니아는 모두 이 분석에서 CDC를 유도하였고, 이는 CDC를 매개하는 항종양 항체를 유도하는 복제가능한 백시니아 바이러스의 능력을 뒷받침한다(이러한 설정에서, 표적 세포는 종양용해 바이러스로 처리된 토끼에서 항체가 상승된 종양으로부터 유래되었다). VSV(+/- 쥣과 GM-CSF)는 시험된 임의의 종양용해 백시니아 바이러스만큼 항종양 항체를 유도하는데 효율적이지 않았다.
실시예 10: 종양용해 백시니아 및 쥣과 GM - CSF 발현은 쥣과 종양 모델에서 CDC를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도를 매개한다
이 실시예에서, 종양용해 백시니아 , 및 쥣과 GM - CSF 의 효과는 쥣과 종양 모델 상에서 CDC 를 매개하는 종양-특이적 항체의 유도를 매개하였으며, 데이터가 도 13에 나타나 있다.
CT26 종양을 가진 마우스에게 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594, 쥣과 JX-594를 발현하는 JX-594, PBS 또는 인간 GM-CSF를 발현하는 UV 불활성화된 JX-594를 매주 4회 정맥내 주입으로 처리하였다(n=3). 바이러스를 1×107 pfu의 용량으로 투여하였다. 기준선 및 처리 개시 후 4주에 혈청을 수집하였다. 마우스 혈청을 시험관내에서 24시간 동안 A2780 세포와 함께 배양하였다. 처리전 혈청과 함께 배양된 A2780 세포의 생존율 대비 세포 생존율을 CCK-8 키트를 이용하여 평가하였다.
CDC 실험을 동계의 마우스 모델(피하 CT26 종양을 갖는 Balb/C 마우스)에서 반복하였다. 쥣과 GM-CSF를 발현하는 JX-594가 CDC를 매개하는 항종양 항체를 유도하는데 가장 강력하였다. 인간 GM-CSF를 발현하는 JX-594(JX-594; 인간 GM-CSF는 설치류에서 활성이 아닌 것으로 알려져 있음) 뿐만 아니라 쥣과 GM-CSF를 발현하는 UV-불활성화된 JX-594는 CDC 유도에 대하여 중간 효과를 가지고 있었다(PBS 및 쥣과 GM-CSF를 발현하는 JX-594와 비교할 때). 이는 이 마우스 모델에서 복제 뿐만 아니라 고수준 쥣과 GM-CSF 발현(복제가능한 백시니아 골격으로 처리시에만 발생함)이 시험관내에서 CDC를 매개하는 고역가 항종양 항체를 유도하는데 필요하다는 것을 보여줄 수 있다.
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Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Claims (32)

  1. 동물에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양이 있는 동물에서 종양-특이적 항체 매개된 보체-의존적 세포독성 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 상기 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 상기 동물에서 항체를 유도하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 종양용해 바이러스의 투여는 종양을 갖지 않는 동물에서 CDC 반응을 유도하지 않는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 종양용해 바이러스는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 홍역 바이러스, 인간 한타 바이러스, 점액종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 세네카 밸리 바이러스 및 신드비스 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 종양용해 바이러스는 종양용해 폭스바이러스인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 종양용해 바이러스는 JX-594, p53 발현 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), ONYX-15, Delta24, VA1 영역에서 변이된 아데노바이러스, K3L 또는 E3L 영역에서 변이된 우두 바이러스, 텔로멜라이신, 텔로멜라이신-GFP, OV20.0L 유전자에서 변이된 파라폭스바이러스 orf 바이러스, 제네눅스 바이러스, 및 γ(1)34.5 유전자에서 변이된 헤르페스 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 종양용해 폭스바이러스는 우두 바이러스인 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 종양용해 바이러스는 JX-594인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 종양용해 바이러스는 이식유전자를 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 이종성 핵산 서열은 GM-CSF, 시토신 데아미나제, 카복실 에스테라제, NIS, 스토마토스타틴 수용체를 인코딩하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 종양은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 뇌실막종, 신경집종, 신경섬유육종, 신경모세포종, 뇌하수체 샘종, 수모세포종, 두경부암, 흑색종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 췌장암, 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 방광암, 간암, 골 암, 직장암, 난소암, 육종, 위암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 편평상피 세포 암종, 신경외배엽 종양, 갑상선 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 간종양, 중피종, 상피성 암종, 및 혈액의 종양유발성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 대상체에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항종양 CDC 반응을 매개하는 생체내 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 조성물의 투여는 상기 종양에 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체의 생산을 유도하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서 상기 투여 후 상기 대상체로부터 혈액을 수확하고 CDC-반응 생성 항체를 상기 혈액으로부터 단리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 청구항 12에 따라 단리된 CDC-반응 생성 항체를 포함하는 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체로부터 수집된 혈청인 조성물.
  15. 암 세포를 청구항 13과 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 성장을 억제하거나 그 세포를 사멸시키는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉은 암 세포를 시험관내에서 상기 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉은 수확된 항체, 수확된 B 세포, 상기 수확된 B 세포에 의해 생산된 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 암이 있는 대상체에 주입하는 것을 포함하는 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 암 세포는 대상체의 생체내에 있고 상기 접촉은 상기 조성물을 포함하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  19. 청구항 1, 11 또는 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 추가 항암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 대상체에게 청구항 13의 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 대상체의 치료 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 조성물은 상기 환자에 대한 자가조직이고 상기 암 환자로부터 단리되고 상기 암 환자에게 주입되는 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 암 환자에 대해 이종성인 상기 조성물은 상기 조성물로 치료될 암 환자로부터 상이한 암 환자로부터 단리되는 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 대상체는 추가 항암 치료제로 치료되는 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 암 대상체는 고형 종양을 가지며 상기 조성물은 종양내로, 정맥내로, 복강내로 또는 이들의 조합으로 투여되는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 암 대상체는 상기 청구항 12의 조성물을 투여하기 전에, 동시에 또는 차후에 절제된 고형 종양을 갖는 방법.
  26. 청구항 20에 있어서, 상기 암 대상체는 고형 종양을 가지며 상기 조성물은 상기 종양의 크기를 감소시키는 방법.
  27. 청구항 20에 있어서, 상기 암 대상체는 고형 종양을 가지며 상기 투여는 상기 고형 종양의 전이성 확산을 감소시키는 방법.
  28. 청구항 20에 있어서, 상기 암은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 뇌실막종, 신경집종, 신경섬유육종, 신경모세포종, 뇌하수체 샘종, 수모세포종, 두경부암, 흑색종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 췌장암, 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 방광암, 간암, 골 암, 직장암, 난소암, 육종, 위암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 편평상피 세포 암종, 신경외배엽 종양, 갑상선 종양, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 간종양, 중피종, 상피성 암종, 및 혈액의 종양유발성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  29. 하기를 포함하는, 암이 있는 대상체의 암 치료를 조정하는 방법:
    a) 상기 대상체에게 복제 가능 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 조성물의 투여는 상기 대상체의 상기 암에 대해 특이적인 CDC 반응을 매개하는 항체의 생산을 상기 대상체에서 감소시키는 단계;
    b) 혈액을 상기 대상체로부터 단리시키는 단계로서, 상기 혈액은 수확된 항체, 상기 암에 대항하는 수확된 B 세포를 포함하는 단계;
    c) 상기 항체를 확대 또는 단리시키거나 항체를 상기 B 세포로부터 생산하여; 상기 대상체에 대해 특이적인 면역요법 조성물을 생산하는 단계, 및
    d) 상기 대상체에게 단계 (c)의 면역요법 조성물을 투여하는 단계.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 면역요법 조성물은 항체의 단리시에 즉각적으로 투여되는 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 면역요법 조성물은 상기 대상체의 추가 치료적 처리를 위해 보관되는 방법.
  32. 하기를 포함하는, 종양-특이적 항원을 확인하는 방법:
    a) 암 세포로부터 준비된 cDNA 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계;
    b) 상기 발현 벡터를 청구항 11의 대상체로부터의 혈청과 접촉시켜 일차 면역스크린을수행하는 단계로서, 상기 혈청은 상기 종양용해 바이러스의 투여 후 상기 대상체로부터 단리되는 단계; 및
    c) 항원을 상기 혈청에 의해 인정된 상기 cDNA 라이브러리로부터 단리하는 단계.
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