KR20190027926A - 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일부 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암세포를 선택적으로 살상하며, 암세포에서의 복제능이 우수하다. 또한, 정상 세포에 대한 독성이 낮아 인체에 안전한 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암 치료를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 일부 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 암 치료제 개발 목적으로 다양한 바이러스를 유전적으로 조작하여 변형시킨 종양 살상 바이러스(Oncolytic virus)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지는 종양 살상 바이러스의 한계점이 완전히 해결되지 못하고 있는 상황이다. 예를 들어, 항암제로 개발하기 위하여 유전적 조작을 통해 종양 선택적 복제능을 갖는 바이러스를 제작하였으나 암세포뿐만 아니라 정상세포에서도 복제하여 세포를 살상한다거나, 항암 효과가 충분하지 못한 한계가 있었다. 따라서, 상기 종양 살상 바이러스가 정상세포에 미치는 영향을 최소화하면서 암세포에 대한 선택성 및 효능을 높일 수 있는 기술의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
한편, 백시니아 바이러스는 약 200개의 독립 유전자를 인코딩하는 약 200 kbp의 이중가닥 선형 게놈 DNA를 갖는, 피막 DNA 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 18세기에 에드워드 제너가 최초로 천연두(smallpox)의 예방백신으로 사용한 이후 다양한 예방 백신들로 개발되었다. 초기의 백시니아 바이러스 백신은 야생형 바이러스를 사용하였고, 백신을 투여한 환자에서 전신감염 또는 진행성 감염 등의 심각한 부작용이 나타났었다. 이에, 부작용을 줄이기 위해 앙카라(MVA, modified vaccinia Ankara), LC16m8(derived from the Lister strain) 및 NYVAC(derived from the Copenhagen vaccinia strain, New York Vaccinia Virus) 등과 같이 독성이 약화된 변형 백시니아 바이러스들이 개발되었다. 이러한 백시니아 바이러스들을 기반으로 다양한 질환을 대상으로 한 백신들이 개발되고 있으며, 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC, Wyeth, 리스터(Lister) 등의 백시니아 바이러스 종(strain)들은 종양 살상 바이러스로도 개발되고 있다.
본 발명의 목적은 일부 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스 및 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 K3L, TK(thymidine kinase) 및 VGF(vaccinia growth factor) 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 백시니아 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암세포를 선택적으로 살상하며, 암세포에서의 복제능이 우수하다. 또한, 암세포 선택적 살상능이 우수하므로 인체에 보다 안전한 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 암 치료를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 VGF 유전자의 발현을 억제하는 셔틀 플라스미드의 구성 일부를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 TK 유전자의 발현을 억제하는 셔틀 플라스미드의 구성 일부를 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 K3L 유전자의 발현을 억제하는 셔틀 플라스미드의 구성 일부를 도식화한 것이다.
도 4A는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 바이러스에 의해 하기 표 1-1에 나타난 바와 같은 다양한 암세포주가 사멸되는 것을 확인한 결과이다:
[표 1-1]
도 4B는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 바이러스에 의해 하기 표 1-2에 나타난 바와 같은 다양한 암세포주가 사멸되는 것을 확인한 결과이다:
[표 1-2]
도 5는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 결실 또는 비활성화로 유전자의 발현이 억제된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스가 대장암 세포주의 사멸을 유도하는 것을 확인한 결과이다. 결실된 유전자에 대해 약기한 용어의 의미는 하기 표 2에 나타난 바와 같다:
[표 2]
도 6은 K, VT 또는 VTK 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-K, IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 IHD-W-VTK 값을 기준으로 비교한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 WR-ViTiKi 값을 기준으로 비교한 그래프이다.
도 7은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다.
도 8은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다.
도 9는 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 뒤 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 뒤 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다.
도 10은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 투여한 후 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다; (b)는 재조합 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 TK 유전자의 발현을 억제하는 셔틀 플라스미드의 구성 일부를 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 K3L 유전자의 발현을 억제하는 셔틀 플라스미드의 구성 일부를 도식화한 것이다.
도 4A는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 바이러스에 의해 하기 표 1-1에 나타난 바와 같은 다양한 암세포주가 사멸되는 것을 확인한 결과이다:
[표 1-1]
도 4B는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 바이러스에 의해 하기 표 1-2에 나타난 바와 같은 다양한 암세포주가 사멸되는 것을 확인한 결과이다:
[표 1-2]
도 5는 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 결실 또는 비활성화로 유전자의 발현이 억제된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스가 대장암 세포주의 사멸을 유도하는 것을 확인한 결과이다. 결실된 유전자에 대해 약기한 용어의 의미는 하기 표 2에 나타난 바와 같다:
[표 2]
도 6은 K, VT 또는 VTK 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-K, IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 IHD-W-VTK 값을 기준으로 비교한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스의 정상세포 대비 암세포 살상능을 WR-ViTiKi 값을 기준으로 비교한 그래프이다.
도 7은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 종양의 크기 변화를 관찰한 그래프이다.
도 8은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 후 마우스 개체별 체중 변화를 확인한 그래프이다.
도 9는 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 뒤 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 또는 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 뒤 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다; (b)는 재조합 WR-ViTi 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 대장암 마우스 모델에 투여한 마우스의 폐사율을 확인한 그래프이다.
도 10은 대장암 마우스 모델에 VT 또는 VTK 유전자 발현이 억제된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 투여한 후 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다:
(a)는 재조합 IHD-W-VT 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다; (b)는 재조합 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리에서 염증 반응을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면으로, 본 발명은 VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "VGF" 는 백시니아 성장인자를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자는 상피세포 성장인자와 유사한 활성을 나타내는 효소이다. 상기 VGF 유전자에 의해 코딩된 백시니아 성장인자는 바이러스에 감염되었을 때 성장인자의 활성을 나타내고, 바이러스에 의한 감염 초기에 합성될 수 있다. 상기 VGF는 GenBank: AA089288.1, ABD52455.1 또는 AIX98927.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 VGF는 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 VGF 유전자는 서열번호 66으로 표시되는 염기서열일 수 있다. 상기 VGF 또는 이의 유전자는 서열번호 67의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 염기서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 VGF 또는 이의 유전자는 서열번호 67의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK" 는 티미딘 키나아제를 의미한다. 상기 티미딘 키나아제는 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 TK 유전자에 의해 코딩된 티미딘 카나아제는 ATP의 감마(γ) 위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 바이러스 DNA를 구성하는 뉴클레오티드들을 만들 수 있다. 상기 TK는 GenBank: AA089373.1, ABD52560.1 또는 AIX99011.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 TK는 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 TK 유전자는 서열번호 68로 표시되는 염기서열일 수 있다. 상기 TK 또는 이의 유전자는 서열번호 69의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 염기서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 TK 또는 이의 유전자는 서열번호 69의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "K3L" 은 K3L 단백질을 의미한다. 상기 K3L 유전자에 의해 코딩되는 K3L 단백질은 eIF-2α(translation initiation factor-2α)와 상동성을 갖는 단백질로, 인터페론 활성화 인자인 PKR(protein kinase R)의 작용을 억제할 수 있다. 상기 K3L은 GenBank: AA089313.1, ABD52483.1 또는 AGB75754.1의 서열일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 K3L은 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있으며, 상기 K3L 유전자는 서열번호 70으로 표시되는 염기서열일 수 있다. 상기 K3L 또는 이의 유전자는 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 염기서열과 약 70% 또는 75%이상, 바람직하게는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89% 이상일 수 있다. 또한, 상기 K3L 또는 이의 유전자는 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 발현 억제란, 유전자 일부 또는 전부의 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입됨으로써, 유전자가 발현되지 않거나, 유전자의 일부만 발현되어 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 나타나지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자를 결실시키거나, 외래 유전자를 삽입하는 방법은 통상의 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Methods described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hiliar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16에 개시되어 있는 외래 유전자를 삽입하는 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 pGEM-T Easy (Promega, Cat No. A1360) 또는 pGEM-T (Promega, Cat No. A3600) 벡터 시스템을 이용하여 외래 유전자를 삽입하였다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 WR, Lister 또는 IHD-W 백시니아 바이러스일 수 있으며, GenBank: AY243312.1, DQ121394.1 또는 AIX98951.1의 서열을 가지는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 상기 백시니아 바이러스는 IHD-W 일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "V" 또는 "바이러스 V" 는 백시니아 성장인자 유전자인 VGF가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 VGF 유전자가 결실되어, VGF 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "Vi" 또는 "바이러스 Vi" 는 백시니아 성장인자의 발현이 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 VGF 유전자를 발현하지 못한다. 상기 백시니아 성장인자는 VGF 유전자 내부에 외래 유전자를 삽입함으로써 발현이 억제될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "T" 또는 "바이러스 T" 는 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 TK 유전자가 결실되어, TK 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "Ti" 또는 "바이러스 Ti" 는 티미딘 키나아제의 발현이 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 TK 유전자를 발현하지 못한다. 상기 티미딘 키나아제는 TK 유전자 내부에 외래 유전자를 삽입함으로써 발현이 억제될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "K" 또는 "바이러스 K" 는 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 K3L 유전자가 결실되어, K3L 유전자를 발현하지 못한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "Ki" 또는 "바이러스 Ki" 는 K3L 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 의미하며, 상기 바이러스는 K3L을 발현하지 못한다. 상기 K3L 단백질은 K3L 유전자 내부에 외래 유전자를 삽입함으로써 발현이 억제될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "VT" 또는 "바이러스 VT" 는 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 "ViTi" 또는 "바이러스 ViTi" 는 백시니아 성장인자 및 티미딘 키나아제의 발현이 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자 및 티미딘 키나아제의 발현을 비활성화 시키는 방법은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "VTK" 또는 "바이러스 VTK" 는 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 "ViTiKi" 또는 "바이러스 ViTiKi" 는 백시니아 성장인자, 티미딘 키나아제 및 K3L 단백질의 발현이 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 상기 백시니아 성장인자, 티미딘 키나아제 및 K3L 단백질의 발현을 비활성화 시키는 방법은 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "ViTK" 또는 "바이러스 ViTK" 는 백시니아 성장인자의 발현이 비활성화 되고, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 "VTiK" 또는 "바이러스 VTiK" 는 티미딘 키나아제의 발현이 비활성화 되고, VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 "VTKi" 또는 "바이러스 VTKi" 는 K3L 단백질의 발현이 비활성화 되고, VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 의미한다.
또한, 본 발명의 일 측면으로 상기 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 재조합 백시니아 바이러스는 상술한 바와 같이 VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있다. 상기 VGF, TK 및 K3L 유전자는 상기 서술한 바와 같다.
재조합 백시니아 바이러스의 일 예로는 다음과 같은 것들이 가능하다. WR 백시니아 바이러스의 변이체는 WR-VTK, WR-ViTiKi, WR-ViTK, WR-VTiK 또는 WR-VTKi일 수 있다. 또한, NYVAC 백시니아 바이러스의 변이체는 NYVAC-VTK, NYVAC-ViTiKi, NYVAC-ViTK, NYVAC-VTiK 또는 NYVAC-VTKi일 수 있다. 나아가, Wyeth 백시니아 바이러스의 변이체는 Wyeth-VTK, Wyeth-ViTiKi, Wyeth-ViTK, Wyeth-VTiK 또는 Wyeth-VTKi일 수 있다. 또한, LC16m8 백시니아 바이러스의 변이체는 LC16m8-VTK, LC16m8-ViTiKi, LC16m8-ViTK, LC16m8-VTiK 또는 LC16m8-VTKi일 수 있다. 나아가, Lister 백시니아 바이러스의 변이체는 Lister-VTK, Lister-ViTiKi, Lister-ViTK, Lister-VTiK 또는 Lister-VTKi일 수 있다. 또한, Copenhagen 백시니아 바이러스의 변이체는 Copenhagen-VTK, Copenhagen-ViTiKi, Copenhagen-ViTK, Copenhagen-VTiK 또는 Copenhagen-VTKi일 수 있다. 나아가, TianTan 백시니아 바이러스의 변이체는 TianTan-VTK, TianTan-ViTiKi, TianTan-ViTK, TianTan-VTiK 또는 TianTan-VTKi일 수 있다. 또한, USSR 백시니아 바이러스의 변이체는 USSR-VTK, USSR-ViTiKi, USSR-ViTK, USSR-VTiK 또는 USSR-VTKi일 수 있다. 나아가, TashKent 백시니아 바이러스의 변이체는 TashKent-VTK, TashKent-ViTiKi, TashKent-ViTK, TashKent-VTiK 또는 TashKent-VTKi일 수 있다. 또한, Evans 백시니아 바이러스의 변이체는 Evans-VTK, Evans-ViTiKi, Evans-ViTK, Evans-VTiK 또는 Evans-VTKi일 수 있다. 나아가, IHD-J 백시니아 바이러스의 변이체는 IHD-J-VTK, IHD-J-ViTiKi, IHD-J-ViTK, IHD-J-VTiK 또는 IHD-J-VTKi일 수 있다. 나아가, IHD-W 백시니아 바이러스의 변이체는 IHD-W-VTK, IHD-W-ViTiKi, IHD-W-ViTK, IHD-W-VTiK 또는 IHD-W-VTKi일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스가 다양한 암세포에 대한 살상능을 갖는 것을 확인하였다(도 4A 및 도 4B). 또한, 재조합 IHD-W-VTK, IHD-W-ViTK, IHD-W-VTiK 및 IHD-W-VTKi 백시니아 바이러스를 대장암 세포주에 처리하여 암세포 살상능을 비교한 결과, 모두 우수한 살상능을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 유전자의 결실과 비활성화에 관계없이 VTK 유전자의 발현을 억제시킨 백시니아 바이러스는 모두 항암 활성을 가지는 것을 확인하였다(도 5). 또한, 재조합 IHD-W-K, IHD-W-VT, IHD-W-VTK, WR-K, WR-ViTi, WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 정상세포와 암세포에 처리하였을 경우 상기 VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현을 동시에 억제한 재조합 IHD-W-VTK 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스가 상기 K3L 유전자의 발현만 억제한 재조합 IHD-W-K 또는 WR-K 백시니아 바이러스나 상기 VGF와 TK 유전자의 발현을 동시 억제한 재조합 IHD-W-VT 또는 WR-ViTi 백시니아 바이러스보다 정상세포 대비 암세포 살상능이 상대적으로 우세한 것을 확인하였다(도 6).
또한, 재조합 IHD-W-VT 및 IHD-W-VTK와 WR-ViTi 및 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 종양 마우스 모델에 투여한 결과, 모두 암 성장을 억제한다는 것을 확인하였다(도 7).
이에 더하여, 재조합 IHD-W-VTK 또는 WR-ViTiKi 백시니아 바이러스를 투여한 종양 마우스 모델의 체중 감소량 및 폐사율이 재조합 IHD-W-VT 또는 WR-ViTi 백시니아 바이러스를 투여한 종양 마우스 모델의 체중 감소량 및 폐사율보다 낮은 것을 확인하였다(도 8 및 도 9). 또한, 재조합 IHD-W-VTK 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리 부위에서 나타나는 염증반응이 재조합 IHD-W-VT 백시니아 바이러스를 투여한 마우스의 꼬리 부위에서 나타나는 염증반응보다 적은 것을 확인하였다(도 10).
따라서, 본 발명의 K3L, TK 및 VGF 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어 "암"은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 이때, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 섬유육종, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 암은 폐암, 간암, 전립선암, 두경부암, 섬유육종, 뇌암, 유방암, 난소암, 췌장암 또는 대장암일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제가 추가로 함유될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 특히 포유동물에 투여된 후 유효성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 상기 제형에 따라 본 발명의 조성물은 개체에 적절하게 투여될 수 있다. 상기 투여는 비경구 투여일 수 있고, 그 예로는 암 조직 내, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 동맥 내, 피하 내, 코 안, 경막외 및 구강경로 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 형태는 주사제일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 재조합 백시니아 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 투여될 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 1일 수회일 수 있다.
본 발명의 재조합 백시니아 바이러스의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적으로, 환자에게 1x105 내지 1x1018 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수치 및 범위를 포함할 수 있다. 또한, 바이러스 투여량은 0.1 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖ 또는 그 이상, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
I. 재조합 백시니아 바이러스 제조
본 발명자들은 티미딘 키나아제(TK), 백시니아 성장인자(VGF) 및 K3L 유전자가 결실 또는 발현이 비활성된 재조합 백시니아 바이러스 벡터를 제작하였으며, 이들 벡터를 이용하여 상기 유전자들의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하여 항암 물질로써의 특성을 비교하였다.
실시예 1. 재조합 W 백시니아 바이러스의 제조
실시예 1.1. VGF, TK, 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 WR 백시니아 바이러스 벡터의 제작
실시예 1.1.1. VGF 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 벡터의 제작
WR 백시니아 바이러스 (ATCC, Cat No. VR-1354) 의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭한 후, 각각 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-VGF-L(WR), pGEM-T Easy-VGF-R(WR)을 제작하였다. VGF 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
VGF 유전자 위치에 재조합이 일어난 바이러스를 선별하기 위한 표지자로 p11 프로모터에 의해 발현이 조절되는 LacZ를 이용하였다. WR gDNA내의 p11 프로모터 부위를 PCR로 증폭하고 pAAV-LacZ(Stratagene, Cat No. 240071-52)내의 LacZ 유전자를 PCR로 증폭한 후 각각 pGEM-T Easy 및 pGEM-T에 삽입하여 pGEM-T Easy-p11 및 pGEM-T-LacZ를 각각 제작하였다. p11 프로모터와 LacZ의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 표 3에 나타내었다.
VGF 유전자의 기능이 일부 결실된 셔틀 플라스미드를 제작하기 위하여 pGEM-T Easy-VGF-L(WR)에 PvuII와 PstI을 처리하고, pSP72(Promega, Cat No. P2191)에 PvuII와 PstI을 처리한 벡터와 라이게이션하여 pSP72-VGF-L(WR)을 제작하였다. 또한 pGEM-T Easy-VGF-R(WR)을 EcoRV와 BamHI으로 처리하고, 위에서 제작한 pSP72-VGF-L(WR)을 EcoRV와 BamHI으로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)을 확보하였다. LacZ 발현 카세트를 도입하기 위하여 pGEM-T Easy-p11은 SalI과 NheI로 처리하고, pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)을 SalI과 NheI으로 처리한 벡터와 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)을 EcoRI과 PacI으로 처리한 후 앞서 제작한 pGEM-T-LacZ를 EcoRI과 PacI으로 자르고 라이게이션하여 VGF 셔틀 플라스미드인 pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(WR) (이하 "WR VGF(i) 셔틀 플라스미드" )을 완성하였다.
실시예 1.1.2. TK 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 벡터의 제작
WR 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 TK 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 확보하기 위하여, WR의 gDNA를 PCR로 증폭한 후 TK 유전자의 왼쪽과 오른쪽에 상동한 염기 서열 조각을 각각 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-TK-L(WR), pGEM-T Easy-TK-R(WR)을 제작하였다. TK 유전자의 양쪽과 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
TK 유전자 위치에 재조합이 일어난 바이러스를 선별하기 위한 표지자로 pSE/L 프로모터에 의해 발현이 조절되는 EGFP와 p7.5 프로모터에 의해 발현이 조절되는 Gpt를 이용하였다. WR gDNA를 주형으로 PCR 하여 p7.5 프로모터 부위를 증폭하였고, pEGFP-N3(Clontech, Cat No. 6080-1)내의 EGFP 유전자와 DH5α(Takara, Cat No. 9057)내의 Gpt 유전자 또한 PCR로 증폭한 후 각각을 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-p7.5, pGEM-T Easy-EGFP 및 pGEM-T Easy-Gpt를 각각 제작하였다. 또한 프라이머 어닐링을 통해 pSE/L 프로모터 및 TF를 제작하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 표 4에 나타내었다.
pGEM-T Easy-p7.5와 어닐링한 pSE/L 프로모터를 각각 BamHI와 PstI으로 처리하고 라이게이션하여 pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5를 제작하였다. 제작된 pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5와 pGEM-T Easy-EGFP를 각각 BglII와 XhoI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5를 제작하였다.
TK 유전자의 기능이 일부 결실된 셔틀 플라스미드를 제작하기 위하여 pSP72를 EcoRI과 BglII로 처리하고, pGEM-T Easy-TK-R(WR)은 EcoRI과 BamHI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-TK-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-TK-R(WR)을 XhoI과 PstI으로 처리하고, SalI과 PstI으로 처리한 pGEM-T Easy-TK-L과 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TK-R(WR)을 제작하였다. EGFP 발현 카세트의 도입을 위하여, 제작된 pSP72-TK-L-TK-R(WR)과 pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5를 각각 EcoRI와 PstI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)을 제작하였다.
또한, 제작된 pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)과 어닐링한 TF 올리고머를 각각 PstI과 NotI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)을 제작하였다. Gpt 발현 카세트를 도입하기 위하여, 제작된 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)과 pGEM-T Easy-Gpt를 각각 EcoRI과 SpeI으로 처리한 후 라이게이션하여 TK 셔틀 플라스미드인 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(WR)을 (이하 "WR TK(i) 셔틀 플라스미드" ) 최종 제작하였다.
실시예 1.1.3. K3L 유전자가 결실된 재조합 WR 백시니아 바이러스 벡터의 제작
WR 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자의 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭하였다. 이때, K3L 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 5에 나타내었다. 증폭한 유전자들을 각각 pGEM-T에 삽입하여 pGEM-T-K3L-L(WR), pGEM-T-K3L-R(WR)을 제작하였다.
[표 5]
K3L 유전자가 결실된 셔틀 플라스미드를 제작하기 위하여 표 5의 TF 프라이머를 어닐링한 후 EcoRI과 EcoRV를 처리하고, pSP72에 EcoRI과 EcoRV를 처리한 벡터와 라이게이션하여 pSP72-TF를 제작하였다. 또한 pDsRed2 (Clontech,Cat No. 632404)를 EcoRI과 BamHI으로 처리하고, pSP72-TF를 EcoRI과 BamHI으로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-DsRed-TF를 제작하였다. 위에서 제작한 pGEM-T-K3L-R(WR)를 EcoRV와 BamHI으로 처리하고, pSP72-DsRed-TF를 EcoRV과 BamHI으로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-DsRed-TF-K3L-R(WR)를 제작하였다. 그 다음으로 위에서 제작한 pGEM-T-K3L-L(WR)를 XhoI과 HindIII로 처리하고, pSP72-DsRed-TF-K3L-R(WR)를 XhoI과 HindIII로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-K3L-L-DsRed-TF-K3L-R(WR)를 제작하였다. 마지막으로 WR gDNA를 주형으로 하여 p7.5 프로모터를 PCR로 증폭한 후, pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-p7.5를 제작하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머 정보는 상기 표 5에 나타내었다. pGEM-T Easy-p7.5를 HindIII와 BamHI으로 처리하고, pSP72-K3L-L-DsRed-TF-K3L-R(WR)를 HindIII와 BamHI으로 처리한 벡터와 라이게이션함으로써 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed--TF-K3L-R(WR) (이하 "WR K3L 셔틀 플라스미드" )를 제작하였다.
실시예 1.1.4. K3L 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 벡터의 제작
WR 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로 왼쪽에 위치한 유전자와 K3L 유전자 일부를 PCR로 증폭하였다. 이때 K3L 유전자의 시작 코돈은 K3L-L 서열 바로뒤에 두어 증폭하였으며, K3L 유전자 왼쪽의 상동한 염기서열 증폭에 사용된 프라이머는 하기 표 6에 나타내었다. 이때, K3L 유전자의 시작 코돈을 제외한 이후 부분을 포함하여 증폭한 K3L-L-K3Li(WR) 단편을 수득한 후 pGEM-T Easy 벡터와 라이게이션하여 pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)를 제작하였다.
[표 6]
실시예 1.1.3.에서 제작한 WR K3L 셔틀 플라스미드와 pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)을 SnaBI 과 HindIII로 처리하고, 라이게이션을 통해 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3L-R(WR)을 제작하였다. 제작된 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3L-R(WR)에 K3L의 시작 코돈을 도입하기 위해 상기 표 6에 나타낸 프라이머를 이용하여 point mutation을 수행하였으며, 최종적으로 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3LATG-K3L-R(WR) (이하 "WR K3L(i) 셔틀 플라스미드" )을 제작하였다.
실시예 1.2. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 WR 백시니아 바이러스 제조
실시예 1.2.1. K3L 유전자가 결실된 WR 백시니아 바이러스의 생산
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, HeLa (ATCC, Cat No. CCL-2) 세포를 6-웰 플레이트에 3x105 세포/웰 조건 및 2% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지 상태로 준비한 후, 상기 실시예 1.1.3.에서 제작된 WR K3L 셔틀 플라스미드 2 ㎍을 jetPRIME (Polyplus, Cat No. 114-07)을 이용하여 형질주입시키고, WR 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 동시 처리하였다. 2시간 배양 후, 세포를 5% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지로 교체한 후 48시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 배지 500 ㎕와 함께 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복하여 세포를 용해시키고, 상기 세포 용해물을 크루드(crude) 바이러스로 명명하였다. 제작된 크루드 바이러스를 이용하여 6회 플라크 분리(plaque isolation)를 거쳐 순수 분리된 재조합 WR 백시니아 바이러스 K를 확보하였다.
실시예 1.2.2. VGF 및 TK 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 생산
먼저, WR VGF(i) 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.2.1과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 Vi를 수득하였다. 그 후, WR TK(i) 셔틀 플라스미드 및 재조합 WR 백시니아 바이러스 Vi를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 및 TK 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTi를 수득하였다.
실시예 1.2.3. VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스의 생산
먼저, WR K3L(i) 셔틀 플라스미드와 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTi를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.2.1과 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK, 및 K3L 유전자의 발현이 비활성화된 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTiKi를 수득하였다.
실시예 2. 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 제조
실시예 2.1. VGF, TK, 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터 제작
실시예 2.1.1 VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터 제작
IHD-W 백시니아 바이러스(ATCC, Cat No. VR-1441)의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭하였다. 이때 VGF 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 7에 나타내었다. 이를 통해 VGF-L(IHD-W) 및 VGF-R(IHD-W) 단편을 수득한 후 pGEM-T Easy 벡터와 라이게이션하여 pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W) 또는 pSEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다.
[표 7]
상기 pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)를 EcoRI 및 BamHI으로 처리하고, pSP72를 EcoRI 및 BglII로 처리한 뒤 라이게이션하여 pSP72-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다. 제작된 pSP72-VGF-R(IHD-W)과 pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)을 각각 HindIII 및 BamHI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다.
다음으로, 상기 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)에 p11 프로모터 및 LacZ 유전자를 도입하기 위하여, 실시예 1.1.1의 WR VGF 셔틀 플라스미드 내 p11-LacZ 발현 카세트 및 pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)을 NheI과 PacI으로 처리하고, 라이게이션하여 pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W) (이하, "IHD-W VGF 셔틀 플라스미드")을 제작하였다.
실시예 2.1.2. TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터의 제작
IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 TK 유전자를 중심으로, 양옆에 위치한 유전자들을 확보하기 위하여 PCR을 수행한 결과로 TK-L(IHD-W) 및 TK-R(IHD-W) 단편을 수득하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 8에 나타내었다. 확보한 TK-R(IHD-W) 단편 및 pSP72 벡터를 각각 EcoRI 및 BglII로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-R(IHD-W)을 제작하였다. 또한, 상기 pSP72-TK-R(IHD-W) 및 TK-L(IHD-W) 단편을 각각 PstI 및 BamHI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)을 제작하였다.
제작된 pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W) 벡터 및 실시예 1.1.2.에서 제작한 WR TK 셔틀 플라스미드를 각각 EcoRI 및 NotI으로 처리하고 라이게이션하여 pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(IHD-W)(이하 "IHD-W TK 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
[표 8]
실시예 2.1.3. K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터의 제작
IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로, 양옆에 위치한 유전자들을 PCR한 후 pGEM-T Easy에 각각 삽입하여 pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W), pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)을 제작하였다. 이때, 사용된 프라이머는 하기 표 9에 나타내었다.
K3L 셔틀 플라스미드 내부의 유전자 발현 카세트를 제작하기 위하여 실시예 1.1.3.에서 제작한 WR K3L 셔틀 플라스미드를 주형으로 p7.5-DsRed 유전자 카세트를 PCR로 증폭한 후 pGEM-T Easy에 삽입하여 pGEM-T Easy-p7.5-DsRed를 제작하였다. p7.5 프로모터와 DsRed 유전자의 증폭에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 9에 나타내었다.
[표 9]
제작된 pGEM-T Easy-p7.5-DsRed와 pSP72 벡터를 각각 HindIII와 EcoRV로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-p7.5-DsRed를 완성하였다. 또한 제작된 pSP72-p7.5-DsRed는 EcoRV와 BglII로 처리하고, 상기 제작한 pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)을 EcoRV와 BamHI으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)을 제작하였다. 제작된 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)은 XhoI과 HindIII으로 처리하고, pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)은 SalI과 HindIII으로 처리한 후 라이게이션하여 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W) (이하, "IHD-W K3L 셔틀 플라스미드")을 최종 제작하였다.
실시예 2.1.4. VGF 유전자의 발현이 비활성된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터의 제작
IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 VGF 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들과 VGF 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이때, VGF 유전자의 시작 코돈은 VGF-L 서열 바로 뒤에, VGF 유전자의 나머지 서열은 VGF-R 서열의 앞에 두어 증폭하였으며, VGF 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 10에 나타내었다. 이를 통해 VGF-L-VGFATG(IHD-W) 및 VGFi-VGF-R(IHD-W) 단편을 수득한 후 IHD-W VGF 셔틀 플라스미드에 InFusion 클로닝을 시행하였다.
[표 10]
IHD-W VGF 셔틀 플라스미드는 NheI 및 HindIII로 처리하고, 증폭된 VGF-L-VGFATG(IHD-W) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다. 제작된 pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)은 PacI 및 BglII로 처리하고 증폭된 VGFi-VGF-R(IHD-W) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGFi-VGF-R(IHD-W)을 제작하였다.
다음으로, 상기 pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-Ri(IHD-W)에 VGF의 시작 코돈 이후 스탑 코돈을 도입하기 위하여, 표 10에 나타낸 프라이머를 이용하여 point mutation을 실시하여 pSP72-VGF-L-VGFATGTAA-P11-LacZ-VGFi-VGF-R(IHD-W)(이하, "IHD-W VGF(i) 셔틀 플라스미드")을 제작하였다.
실시예 2.1.5. TK 유전자의 발현이 비활성된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터의 제작
IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA와 IHD-W TK 셔틀 플라스미드로부터 TK 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들과 TK 유전자를 획득하기 위하여 PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 11에 나타내었다. 이때, TK 유전자의 시작 코돈은 TK-L 서열 바로 뒤에, TK 유전자의 나머지 서열은 TK-R 서열의 앞에 두어 증폭하였다. 이를 통해 IHD-W TK 셔틀 플라스미드로부터 TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt (IHD-W) 단편을,IHD-W 백시니아 게놈 DNA로부터 TKi-TK-R (IHD-W) 단편을 수득한 후 IHD-W TK 셔틀 플라스미드에 InFusion 클로닝을 시행하였다.
[표 11]
IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 EagI으로 처리하고, 증폭된 TKi-TK-R (IHD-W) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-TK-L-TKi-TK-R(IHD-W)를 제작하였다. 제작된 pSP72-TK-L-TKi-TK-R(IHD-W)는 NotI 및 SalI으로 처리하고 증폭된 TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt (IHD-W) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TKi-TK-R(IHD-W) (이하, "IHD-W TK(i) 셔틀 플라스미드")을 제작하였다.
실시예 2.1.6. K3L 유전자의 발현이 비활성된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 벡터의 제작
IHD-W 백시니아 바이러스의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로 왼쪽에 위치한 유전자와 K3L 유전자 일부를 PCR을 통해 획득하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 12에 나타내었다. 이때, K3L 유전자의 시작 코돈을 제외한 이후 부분을 포함하여 증폭한 K3Li-L-K3L (IHD-W) 단편을 수득한 후 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드에 InFusion 클로닝을 시행하였다.
[표 12]
IHD-W K3L 셔틀 플라스미드는 SnaBI과 HindIII로 처리하고, 증폭된 K3Li-L-K3L (IHD-W) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-K3L-L-K3Li(IHD-W)를 제작하였다. 제작된 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(IHD-W)에 K3L의 시작 코돈을 도입하기 위해 표 12에 나타낸 프라이머를 이용하여 point mutation을 수행하였으며, 최종적으로 pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3LATG-K3L-R(IHD-W) (이하 "IHD-W K3L(i) 셔틀 플라스미드" )을 제작하였다.
실시예 2.2. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 제조
실시예 2.2.1. K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 생산
상기 실시예 2.1.3.에서 제작된 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드를 이용하여 다음과 같은 방법으로 K3L 유전자가 결실된 백시니아 바이러스를 생산하였다.
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에 3x105 세포/웰 조건 및 2% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지 상태로 준비한 후, 상기 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 2 ㎍을 jetPRIME을 이용하여 형질주입시키고, IHD-W 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 동시 처리하였다. 2시간 배양 후, 세포를 5% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지로 교체한 후 48시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 배지 500 ㎕와 함께 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복하여 세포를 용해시키고, 이를 동결 및 해동을 3회 반복하여 크루드 바이러스를 수득하였다. 상기 크루드 바이러스를 이용하여 통상적인 방법으로 플라크 분리를 반복하여 순수 분리된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 K를 수득하였다.
실시예 2.2.2. VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.1. 및 2.1.2.에서 각각 제조한 VGF 및 TK 셔틀 플라스미드를 사용하여 VGF 및 TK 유전자가 결실된 백시니아 바이러스를 생산하였다.
먼저, IHD-W VGF 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 수득하였다. 그 후, IHD-W TK 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 수득하였다.
실시예 2.2.3. VGF, TK, 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.3.에서 제조한 K3L 셔틀 플라스미드를 사용하여 VGF와 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 생산하였다.
IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 VGF와 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTK를 수득하였다.
실시예 2.2.4. VGF 유전자의 발현이 비활성화 되고 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.4., 실시예 2.1.2. 및 실시예 2.1.3.에서 각각 제조한 VGF(i), TK 및 K3L 셔틀 플라스미드를 사용하여 VGF 유전자의 발현이 비활성화 되고 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 생산하였다.
먼저, IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 T를 수득하였다. 그 후, IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 T를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 TK를 수득하였다.
또한, IHD-W VGF(i) 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 TK를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 유전자의 발현이 비활성화 되고 TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 ViTK를 수득하였다.
실시예 2.2.5. TK 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.5., 실시예 2.1.1. 및 실시예 2.1.3.에서 각각 제조한 TK(i), VGF 및 K3L 셔틀 플라스미드를 사용하여 TK 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 생산하였다.
먼저, IHD-W VGF 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 수득하였다. 그 후, IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 수득하였다.
또한, IHD-W TK(i) 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VK를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 TK 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTiK를 수득하였다.
실시예 2.2.6. K3L 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.6., 실시예 2.1.1. 및 실시예 2.1.2.에서 각각 제조한 K3L(i), VGF 및 TK 셔틀 플라스미드를 사용하여 K3L 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스를 생산하였다.
먼저, IHD-W VGF 셔틀 플라스미드를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 수득하였다. 그 후, IHD-W TK 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 V를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 수득하였다.
또한, IHD-W K3L(i) 셔틀 플라스미드 및 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VT를 이용한 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법으로 K3L 유전자의 발현이 비활성화 되고 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTKi를 수득하였다.
실시예 3. 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 제조
실시예 3.1. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 벡터의 제작
실시예 3.1.1 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 벡터 제작
Lister 백시니아 바이러스 (ATCC, VR-1549)의 게놈 DNA에서 K3L 유전자를 중심으로 양옆에 위치한 유전자들을 PCR로 증폭하였다. 이때 K3L 유전자 양옆의 상동한 염기 서열의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 13에 나타내었다. 이를 통해 K3L-L(Lister) 및 K3L-R(Lister) 단편을 수득한 후 IHD-W K3L 셔틀 플라스미드 제작 과정에서 생성된 pSP72-p7.5-DsRed을 사용하여 InFusion 클로닝을 시행하였다.
[표 13]
pSP72-p7.5-DsRed을 EcoRV 및 BglII로 처리하고, 증폭된 K3L-R(Lister) 단편을 InFusion 클로닝하여 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(Lister)을 제작하였다. 제작된 pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(Lister)은 XhoI 및 HindIII로 처리하고 증폭된 K3L-L(Lister) 단편을 InFusion 클로닝하여 K3L 셔틀 플라스미드인 pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(Lister) (이하, Lister K3L 셔틀 플라스미드)을 제작하였다.
실시예 3.2. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 제조
실시예 3.2.1. VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 생산
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에 3x105 세포/웰 조건 및 2% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지 상태로 준비한 후, 상기 실시 예 2.1.1.에서 제작된 IHD VGF 셔틀 플라스미드 2 ㎍을 jetPRIME을 이용하여 형질 주입시키고, Lister 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 동시 처리하였다. 2시간 배양 후, 세포를 5% 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지로 교체한 후 48시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 배지 500 ㎕와 함께 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복하여 세포를 용해시키고, 상기 세포 용해물을 크루드(crude) 바이러스로 명명하였다. 제작된 크루드 바이러스를 이용하여 6회 플라크 분리(plaque isolation)를 거쳐 순수 분리된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 V를 확보하였다.
상기 재조합 Lister 백시니아 바이러스 V 및 상기 실시예 2.1.2.에서 제작된 IHD-W TK 셔틀 플라스미드를 이한 것을 제외하고는, 상기 기술한 내용과 동일한 조건 및 방법으로 VGF 및 TK 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VT를 확보하였다.
실시예 3.2.2. VGF, TK, 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스의 생산
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Lister K3L 셔틀 플라스미드와 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VT를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3.2.1.과 동일한 조건 및 방법으로 VGF, TK, 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VTK를 수득하였다.
Ⅱ.
In vitro
에서 재조합 백시니아 바이러스의 종양 살상능 확인
실험예 1. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스의 암세포 살상능 확인
상기 실시예 I .에서 생산한 재조합 백시니아 바이러스 VTK가 다양한 종류의 암세포에 대한 살상능을 갖는지 확인하기 위하여 CCK-8 분석을 수행하였다.
다양한 인체 암세포주에서 재조합 바이러스의 세포 살상능을 확인하기 위하여 하기 표 14에 나타낸 바와 같이 암세포주를 준비하고 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양한 후, 이를 96-웰 플레이트에 분주하였다.
[표 14]
이때, 웰당 세포수는 SW620은 5x104개, A2780, A549, DU145, T-47D 및 FaDu는 2x104개, Hep3B과 HT-1080은 1x104개, MIA PaCa-2, U-87 MG는 5x103개가 되도록 분주하였다. 배양 24시간 후, 상기 세포주에 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTK 또는 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTiKi 또는 재조합 Lister 백시니아 바이러스 VTK 를 각각 0.5 MOI가 되도록 감염시켰다. 이때, 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 3 내지 5일 후, CCK-8 (Dojindo, Cat No. CK04) 용액으로 세포를 염색하여 암세포주 생존율을 확인한 결과를 도 4A 및 도 4B에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 백시니아 종(strain)에 관계없이 VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실되거나 발현이 비활성화된 경우 다양한 종류의 암세포에 대한 살상능이 있음을 확인하였다.
실험예 2. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실 또는 발현 비활성화된 재조합 백시니아 바이러스의 암세포 살상능 확인
재조합 백시니아 바이러스에서 발현이 억제된 본 발명의 유전자가 그 발현 억제 방법에 따른 암세포 대상 살상능에 차이가 없는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1.2.9. 내지 1.2.12.에서 제작한 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTK, ViTK, VTiK, 및 VTKi에 의한 대장암 세포주 SW620의 사멸 정도를 확인하였다.
먼저, 인체 대장암 세포주인 SW620은 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하고, 이를 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때, SW620 세포는 웰 당 각각 5x104개가 되도록 분주하였다. 배양 24시간 후, 상기 세포주에 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 VTK, ViTK, VTiK 및 VTKi를 각각 0.001, 0.01, 0.1 또는 1 MOI가 되도록 감염시켰다. 3일 후, CCK-8 용액으로 세포를 염색하여 ED50을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
결과에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에서 제시된 VTK 유전자를 결실시켜 발현을 완전 억제한 바이러스나 유전자의 구조적 파괴에 의해 발현이 비활성화된 바이러스 모두 통계적으로 유의한 차이 없이 암세포 살상능이 우수하였다.
실험예 3. VGF, TK 및 K3L 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스의 암세포 선택적 살상능 확인
세포에서 백시니아 바이러스의 증식에 필요한 세 가지 유전자 VGF, TK, 및 K3L 의 발현을 동시에 억제한 재조합 백시니아 바이러스에서 두 가지 유전자 VGF와 TK 의 발현을 동시에 억제한 재조합 백시니아 바이러스 또는 한 가지 유전자 K3L의 발현만 억제한 재조합 백시니아 바이러스의 경우보다 정상세포 대비 암세포의 살상능이 선택적으로 증가하는지 여부를 확인하였다.
먼저, 인체 정상 세포주인 NHBE(Lonza, CC-2540)는 BEGM SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors(Lonza, CC-4175)가 포함된 BEBM Basal 배지(Lonza, 3171)를, 인체 대장암 세포주인 SW620은 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하고, 이를 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때, NHBE와 SW620 세포는 웰 당 각각 5x103개 및 5x104개가 되도록 분주하였다. 배양 24시간 후, 상기 세포주에 재조합 백시니아 바이러스 IHD-W K, VT, VTK 또는 WR K, ViTi, ViTiKi를 각각 0.001, 0.01, 0.1 또는 1 MOI가 되도록 감염시켰다. 3일 후, CCK-8 용액으로 세포를 염색하여 ED50 값을 구하고, 암세포 대상 ED50을 정상세포의 ED50으로 나눈 뒤, 각 바이러스 그룹에서 내 VTK (IHD-W) 또는 ViTiKi (WR)에 해당하는 값을 기준으로 정상세포 대비 암세포에 대한 선택적 살상능을 비교한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스의 경우, 하나의 K3L 유전자 발현이 억제된 IHD-W K 바이러스에 비하여 IHD-W VT 또는 VTK 바이러스의 정상세포 대비 암세포 대상 살상능이 우수한 것을 확인할 수 있다. 또한, IHD-W VTK 바이러스는 IHD-W VT 바이러스 대비 암세포 선택적 살상능이 우수한 것을 확인할 수 있다. 재조합 WR 백시니아 바이러스의 경우, 세 유전자의 발현이 억제된 WR ViTiKi의 살상능이 WR ViTi 보다 우수함을 확인할 수 있었다. 이때, 하나의 K3L 유전자 발현이 억제된 WR K 는 정상세포와 암세포에 대한 살상능이 매우 낮아 ED50을 구할 수 없었다.
결론적으로, VGF, TK, 및 K3L 세 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스의 암세포 선택적 살상능이 K3L 유전자 또는 VGF 및 TK 유전자 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스보다 암세포에 대한 선택적 살상능이 우수함을 확인할 수 있었다.
Ⅲ.
In vivo
에서 재조합 백시니아 바이러스의 항암 효과 확인
실험예 4. 종양 동물 모델에서 VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스의 항암 효과 확인
상기 실시예 I에서 제조된 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 YT 및 VTK, 또는 재조합 WR 백시니아 바이러스 ViTi 및 ViTiKi의 항종양 효과를 마우스 모델에서 확인하였다.
먼저, 대장암 세포주인 SW620 세포주를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 배지에 배양하여 준비하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양 중이던 세포가 dish의 70-80%가 될 때 암세포 접종을 위한 준비를 하였다. 준비된 각각의 암세포를 4℃, 1,500rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 모두 제거하고, 부형제(RPMI 배지)를 첨가하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포 5x106개를 누드 마우스 (nu/nu BALB/c mouse; Charles river Japan (Yokohama))의 오른쪽 측면 피하에 주입하여 대장암 마우스 모델을 제작하였다. 일주일 후, 종양의 크기가 70 내지 100 ㎣ 정도 성장하였을 때 제작된 마우스 모델을 각 그룹당 6마리씩 PBS, IHD-W VT, IHD-W VTK, WR ViTi, WR ViTiKi 처리군으로 분리한 후 5x106 TCID50로 바이러스를 종양 내로 단회 투여하였다. 바이러스 투여 후 암세포의 크기를 확인한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 대조군인 PBS (Weigene, Cat No. LB001-02) 처리군과 비교하여 재조합 IHD-W 또는 WR 백시니아 바이러스 처리군에서는 암세포의 성장이 억제되었다. 하지만 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스와 WR 백시니아 바이러스간의 항암 효과에는 유의미한 차이가 없음을 확인하였다.
실험예 5. VGF, TK 및 K3L 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스의 안전성 확인
상기 실시예 I에서 생산한 IHD-W, WR 종의 재조합 백시니아 바이러스 VT(ViTi) 및 VTK(ViTiKi)의 안전성을 평가하기 위하여, 이를 투여한 마우스들의 체중변화, 폐사율, 및 염증 반응을 확인하여 도 8 내지 10에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 재조합 IHD-W 백시니아 바이러스 투여 후 49일에 VT 투여군은 25%의 체중 감소율을 나타낸 반면 VTK 투여군은 5% 내외의 체중 감소율을 나타내었다. 또한, 재조합 WR 백시니아 바이러스 투여 후 44일차에 ViTi 처리군은 일부 개체에서 45%의 체중 감소율이 관찰된 반면 ViTiKi는 체중 감소가 관찰된 개체가 없었다. 이에 더하여, 도 9에 나타난 바와 같이, 재조합 백시니아 바이러스 투여 49일 이후, IHD-W, WR 종 모두 VT(ViTi) 투여군은 34%의 폐사율을 나타낸 반면 VTK(ViTiKi) 투여군에서는 모든 개체가 생존하였다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, IHD-W 종 VT를 투여한 후 생존한 마우스가 IHD-W 종 VTK를 투여한 마우스 대비 꼬리 부위 염증 반응이 많이 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 재조합 백시니아 바이러스에서 VGF, TK, 및 K3L 세 유전자의 발현을 억제한 경우가, VGF 및 TK 두 유전자의 발현을 억제한 경우보다 생체 내 안전성면에서 현저하게 우수함을 알 수 있다.
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<220>
<223> TK-R reverse primer (WR)
<400> 12
tcgggatcct cagtctcatg ttctcaccgg 30
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter forward primer (WR)
<400> 13
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter reverse primer (WR)
<400> 14
gaattcgcac tagttccgat cgccgtgcaa taaattagaa tataccc 47
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP forward primer (WR)
<400> 15
cgctcgagat ggtgagcaag ggcgagg 27
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP reverse primer (WR)
<400> 16
tgagatcttt acttgtacag ctcgtccatg 30
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gpt forward primer (WR)
<400> 17
cgactagtac acaagacagg cttgcgag 28
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gpt reverse primer (WR)
<400> 18
cggaattcgg cccactcata aatccagtt 29
<210> 19
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter forward primer (WR)
<400> 19
cgagctgcag ataaaaatta attaattacc cgggtaccag gcctagatct gtcgactcga 60
gcttatttat attccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt tttaagcttc gggatccgca 120
a 121
<210> 20
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter reverse primer (WR)
<400> 20
ttgcggatcc cgaagcttaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa tataaataag 60
ctcgagtcga cagatctagg cctggtaccc gggtaattaa ttaattttta tctgcagctc 120
g 121
<210> 21
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF forward primer (WR)
<400> 21
atcggcggcc gctttttatc tgcgcggtta accgcctttt tatccatcag gtgatctgtt 60
tttattgtgg agctgcagcg at 82
<210> 22
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF reverse primer (WR)
<400> 22
atcgctgcag ctccacaata aaaacagatc acctgatgga taaaaaggcg gttaaccgcg 60
cagataaaaa gcggccgccg at 82
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (WR)
<400> 23
tcggtcgacc atatgtttaa acgacgcatt atctg 35
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (WR)
<400> 24
tcgaagcttt ttttataccg aacataaaaa taaggttaat tat 43
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (WR)
<400> 25
tcggatatcc ttgttaacgg gctcgtaaat tggg 34
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (WR)
<400> 26
tcgggatcct gataatacac atatttattt aggaagcg 38
<210> 27
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF forward primer (WR)
<400> 27
atcggcggcc gctttttatc tgcgcggtta accgcctttt tatccatcag gtgatctgtt 60
tttattgtgg agctgcagcg at 82
<210> 28
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF reverse primer (WR)
<400> 28
atcgctgcag ctccacaata aaaacagatc acctgatgga taaaaaggcg gttaaccgcg 60
cagataaaaa gcggccgccg at 82
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter forward primer (WR)
<400> 29
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter reverse primer (WR)
<400> 30
cgtggatccc cgtgcaataa attagaatat a 31
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li forward primer (WR)
<400> 31
tgtacgtata tttagatgtt ttcagct 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li reverse primer (WR)
<400> 32
ataagcttct tgcattttgt tattcgt 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri forward primer (WR)
<400> 33
cgcagataaa aacatatcct tgttaac 27
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri reverse primer (WR)
<400> 34
gttaacaagg atatgttttt atctgcg 27
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer(IHD-W)
<400> 35
cgaaagcttg taagatgttt agaaaatgga tatttc 36
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer(IHD-W)
<400> 36
ctgggatcct aggctagcgt gtaaataata taaaaataac aatacaatat tg 52
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer(IHD-W)
<400> 37
ctggaattcg atttaattaa tttttataaa ttttttttat gagtattttt acaaaaaa 58
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer(IHD-W)
<400> 38
tagggatccc atcgatagta caataacttt tatgaaat 38
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (IHD-W)
<400> 39
gatctgcagc cctcttcaag aacccattag 30
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (IHD-W)
<400> 40
tagggatcct aggcggccgc atgacaataa agaattaatt attgttcact t 51
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (IHD-W)
<400> 41
catgaattct attatatttt ttatctaaaa aactaaaaat aaacat 46
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer(IHD-W)
<400> 42
agatctatcg ctttagtagt aggaaatgtt ttattg 36
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (IHD-W)
<400> 43
tcggtcgacc atatgtttaa acgacgcatt atctg 35
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (IHD-W)
<400> 44
tcgaagcttt ttttataccg aacataaaaa taaggttaat tat 43
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (IHD-W)
<400> 45
cgcagataaa aatcacttgt taacgggctc gtaa 34
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (IHD-W)
<400> 46
aagcgctaac atggattagg aagcgctaac atgg 34
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed forward primer (IHD-W)
<400> 47
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed reverse primer (IHD-W)
<400> 48
cggatatctt tttatctgcg cggttaac 28
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L-VGFatg forward primer (IHD-W)
<400> 49
cgagcagctg aagcttgtaa gatgtttaga aaatggatat ttcc 44
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L-VGFatg reverse primer (IHD-W)
<400> 50
cgcttctaga gctagccatt tttgatggat tttgtgttta tgct 44
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 51
caggggggat ccttaattaa tcgatgaaat atctgatgtt gttgtt 46
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 52
tatagtcaat agatctggaa aatgtctgtt agtaaataac ca 42
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGFatgtaa forward primer (IHD-W)
<400> 53
catcgcttct agagctagct tacatttttg atggattttg tgttta 46
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Li forward primer (IHD-W)
<400> 54
tattgtcatg cggccgcatg gtcgacaacg gcggacatat tcagttgat 49
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Li reverse primer (IHD-W)
<400> 55
atcatgatgg cggccgtcaa ttagcatcca tttgatgatc 40
<210> 56
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 56
attctttatt gtcatcatgg cggccgcttt ttatctgcgc ggttaacc 48
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 57
gtccgccgtt gtcgacggcc cactcataaa tccagtt 37
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li forward primer (IHD-W)
<400> 58
gttagatcag tgtacgtata tttagat 27
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li reverse primer (IHD-W)
<400> 59
tgggtttgga aagcttcttg cattttgtta ttcgt 35
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 60
cgcagataaa aacatatcct tgttaac 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 61
gttaacaagg atatgttttt atctgcg 27
<210> 62
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (Lister)
<400> 62
cgcagataaa aagatatcct tgttaacggg ctcgtaaatt g 41
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (Lister)
<400> 63
ggagaccggc agatcttgat aatacacata tttatttagg aagcg 45
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (Lister)
<400> 64
cactatagaa ctcgagcata tgtttaaacg acgcattatc tg 42
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (Lister)
<400> 65
tgggtttgga aagctttttt tataccgaac ataaaaataa gg 42
<210> 66
<211> 423
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 66
atgtcgatga aatatctgat gttgttgttc gctgctatga taatcagatc attcgccgat 60
agtggtaacg ctatcgaaac gacattgcca gaaattacaa acgctacaac agatattcca 120
gctatcagat tatgcggtcc agagggagat ggatattgtt tacacggtga ctgtatccac 180
gctagagata tcgacggtat gtattgtaga tgctctcatg gttatacagg cattagatgt 240
cagcatgtag tattagtaga ctatcaacgt tcagaaaaac caaacactac aacgtcatat 300
atcccatctc ccggtattgt gcttgtatta gtaggcatta ttattatgtg ttgtctatta 360
tctgtttata ggttcactcg aagaactaat aaactacctc tacaagatat ggttgtgcca 420
taa 423
<210> 67
<211> 140
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 67
Met Ser Met Lys Tyr Leu Met Leu Leu Phe Ala Ala Met Ile Ile Arg
1 5 10 15
Ser Phe Ala Asp Ser Gly Asn Ala Ile Glu Thr Thr Leu Pro Glu Ile
20 25 30
Thr Asn Ala Thr Thr Asp Ile Pro Ala Ile Arg Leu Cys Gly Pro Glu
35 40 45
Gly Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Asp Cys Ile His Ala Arg Asp Ile
50 55 60
Asp Gly Met Tyr Cys Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys
65 70 75 80
Gln His Val Val Leu Val Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Lys Pro Asn Thr
85 90 95
Thr Thr Ser Tyr Ile Pro Ser Pro Gly Ile Val Leu Val Leu Val Gly
100 105 110
Ile Ile Ile Met Cys Cys Leu Leu Ser Val Tyr Arg Phe Thr Arg Arg
115 120 125
Thr Asn Lys Leu Pro Leu Gln Asp Met Val Val Pro
130 135 140
<210> 68
<211> 534
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 68
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatgtcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggt 240
atcgatgaag gacagttctt tccagacatt gttgaattct gtgagcgtat ggcaaacgaa 300
ggaaaaatag ttatagtagc cgcactcgat gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat 360
attttgaatc ttattccatt atctgaaatg gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa 420
tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata 480
ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt agaaagtgtt acatcgactc ataa 534
<210> 69
<211> 177
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 69
Met Asn Gly Gly His Ile Gln Leu Ile Ile Gly Pro Met Phe Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Leu Ile Arg Arg Val Arg Arg Tyr Gln Ile Ala Gln
20 25 30
Tyr Lys Cys Val Thr Ile Lys Tyr Ser Asn Asp Asn Arg Tyr Gly Thr
35 40 45
Gly Leu Trp Thr His Asp Lys Asn Asn Phe Glu Ala Leu Glu Ala Thr
50 55 60
Lys Leu Cys Asp Val Leu Glu Ser Ile Thr Asp Phe Ser Val Ile Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Arg
85 90 95
Met Ala Asn Glu Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr
100 105 110
Phe Gln Arg Lys Pro Phe Asn Asn Ile Leu Asn Leu Ile Pro Leu Ser
115 120 125
Glu Met Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Lys Cys Phe Lys Glu
130 135 140
Ala Ser Phe Ser Lys Arg Leu Gly Glu Glu Thr Glu Ile Glu Ile Ile
145 150 155 160
Gly Gly Asn Asp Met Tyr Gln Ser Val Cys Arg Lys Cys Tyr Ile Asp
165 170 175
Ser
<210> 70
<211> 267
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 70
ttattgatgt ctacacatcc ttttgtaatt gacatctata tatccttttg tataatcaac 60
tctaatcact ttaactttta cagttttccc taccagttta tccctatatt caacatatct 120
atccatatgc atcttaacac tctctgccaa gatagcttca gagtgaggat agtcaaaaag 180
ataaatatat agagcataat ccttctcgta tactctgccc tttattacat cgcccgcatt 240
gggcaacgaa taacaaaatg caagcat 267
<210> 71
<211> 88
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 71
Met Leu Ala Phe Cys Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Gly Asp Val Ile Lys
1 5 10 15
Gly Arg Val Tyr Glu Lys Asp Tyr Ala Leu Tyr Ile Tyr Leu Phe Asp
20 25 30
Tyr Pro His Ser Glu Ala Ile Leu Ala Glu Ser Val Lys Met His Met
35 40 45
Asp Arg Tyr Val Glu Tyr Arg Asp Lys Leu Val Gly Lys Thr Val Lys
50 55 60
Val Lys Val Ile Arg Val Asp Tyr Thr Lys Gly Tyr Ile Asp Val Asn
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Met Cys Arg His Gln
85
Claims (15)
- K3L, TK 및 VGF 유전자의 발현이 억제된 재조합 백시니아 바이러스.
- 제 1항에 있어서,
유전자의 일부 또는 전부의 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자의 삽입에 의해 상기 유전자의 발현이 억제되는 것인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 VGF 유전자가 서열번호 66의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 TK 유전자가 서열번호 68의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 K3L 유전자가 서열번호 70의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 백시니아 바이러스가 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J), IHD-W(International Health Division-White) 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 백시니아 바이러스가 IHD-W인, 재조합 백시니아 바이러스. - 제1항의 재조합 백시니아 바이러스를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 8항에 있어서,
상기 암이 고형암 또는 혈액암인, 약학 조성물. - 제 9항에 있어서,
상기 고형암이 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물. - 제 9항에 있어서,
상기 혈액암이 림프종, 급성 백혈병, 다발성 골수종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물. - 제 1항의 재조합 백시니아 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
- 제 12항에 있어서,
상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 간암, 난소암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료방법. - 암을 예방 또는 치료하기 위한 제 1항의 재조합 백시니아 바이러스 용도.
- 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제 1항의 재조합 백시니아 바이러스 용도.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160092684 | 2016-07-21 | ||
| KR20160092684 | 2016-07-21 | ||
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