BR112015025697B1 - Cepa do vírus vaccinia mutante,uso da cepa do vírus vaccinia mutante e método para a produção de um produto de gene recombinante - Google Patents

Cepa do vírus vaccinia mutante,uso da cepa do vírus vaccinia mutante e método para a produção de um produto de gene recombinante Download PDF

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Abstract

CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, USO DA CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE GENE RECOMBINANTE E PRODUTO DE GENE RECOMBINANTE A presente invenção refere-se a cepas de vírus Vaccinia mutantes que podem se replicar seletivamente em células tumorais. A presente invenção também se refere ao uso de cepas de vírus Vaccinia mutantes para a prevenção e tratamento de tumores

Description

Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a novas cepas do vírus Vaccinia mutantes, seus usos e métodos para a produção das mesmas.
Antecedentes da Invenção
[0002] A terapia genética tem atraído muita atenção nos estudos para tratamento de câncer. A eficiência de transdução e expressão de genes terapêuticos em células tumorais são críticas para os métodos de terapia gênica. Várias abordagens foram desenvolvidas para aprimorar as eficiências de transdução e expressão de genes em células tumorais. Vários vírus foram estudados e testados quanto aos seus potenciais para serem usados como vetores para transportar os genes de interesse para células tumorais. No entanto, a segurança e a seletividade de um vetor virai para as células tumorais são questões importantes de interesse quando da seleção de vetores virais como candidatos para terapia gênica.
[0003] O vírus da Vaccinia está intimamente relacionado ao vírus que causa a varíola e tem sido utilizado como uma vacina viva no programa de erradicação da varíola. Recentemente tornou-se um objeto de estudo como um vetor para o transporte e liberação de genes de interesse de um paciente sob tratamento em terapia genética.
[0004] O vírus Vaccinia contém duas cópias dos genes de fator de crescimento de Vaccinia (VGF), que estão localizados na repetição terminal invertida (FTR) do genoma do vírus Vaccinia. A proteína VGF é um polipeptídeo similar a EGF de fator de crescimento epidérmico do resíduo 77 altamente glicosilado. A proteína VGF é expressa e secretada no início da infecção virai e atua como um mitogênico para células adjacentes primárias para a infecção de Vaccinia e tem mostrado desempenhar um papel crítico na infecção pelo vírus Vaccinia (Buller et al., J. Virolβl (1988): 866-74).
[0005] O vírus da Vaccinia também contém genes Serpina e genes Anquirina. Os genes Serpina são uma família de genes que codificam inibidores da serina-protease. As Serpinas estão potencialmente envolvidas em várias funções biológicas, tais como a regulação da coagulação, fibrinólise, resposta imune, inflamação, invasão tumoral e apoptose (vide Kummer et al. Methods 32 (2004):. 141-9). Genes Anquirina codificam uma família de proteínas que possuem sítios de ligação para diferentes proteínas integrais de membrana e desempenham um papel crítico no processo biológico envolvendo a interação proteína- proteína (vide Li et al. Biochemistry AS (2006): 15.168-78).
Descrição Resumida da Invenção
[0006] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a uma cepa do vírus Vaccinia mutante que pode se replicar seletivamente em células tumorais. Em certas realizações, a cepa do vírus mutante tem virulência diminuída.
[0007] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa do vírus Vaccinia mutante, em que as sequências de codificação dos genes VGF no genoma do vírus são truncadas no todo ou em partes.
[0008] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa do vírus Vaccinia mutante, em que as sequências de codificação dos genes Serpina no genoma do vírus são truncadas no todo ou em partes.
[0009] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa do vírus Vaccinia mutante, em que as sequências de codificação dos genes Anquirina no genoma do vírus são truncadas no todo ou em partes.
[00010] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma cepa do vírus Vaccinia mutante, que inclui truncar as sequências de codificação dos genes VGF completamente ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF funcionalmente ativas. Em certas realizações, o método inclui truncar as sequências de codificação dos genes VGF, os genes Serpina e os genes Anquirina completa ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF funcionalmente ativas, proteínas e proteínas Serpina e proteínas Anquirina.
[00011] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um vírus Vaccinia mutante como vetor para liberar seletivamente um gene alvo a uma célula tumoral e expressar o gene alvo na célula tumoral. Em um outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método para a produção de um produto de gene recombinante, o qual compreende a inserção de um gene alvo no genoma de um virus Vaccinia mutante da presente invenção. Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um produto de gene recombinante que compreende as sequências de ácido nucleico de um vírus Vaccinia mutante descritos no presente e as sequências de ácidos nucleicos de um gene alvo.
Breve Descrição dos Desenhos
[00012] A Figura 1 mostra placas formadas por vírus clonados a partir de um estoque de cepa do vírus Ifacc/n/aTianTan. Cada um das placas de vírus purificadas foram plaqueadas separadamente em células BSC-40, cultivadas por dois dias, fixadas, coradas com violeta de cristal e fotografadas. ImageJ (Schneider et al. Nat Methods 9 (2012): 671-5) foi então utilizada para medir os tamanhos de área de 20 placas selecionadas randomicamente a partir de cada prato para cada clone de vírus. O estoque original parece conter uma mistura de ambas as grandes placas e pequenas placas. As placas de vírus purificadas foram separadas em dois grupos, dos quais um grupo (por exemplo, TP03, TP11 e TP12) geram placas menores, e o outro grupo (por exemplo, TP05, TP13 e TP18) gera placas maiores. A diferença entre os tamanhos de placas dos dois é estatisticamente significativa (P < 0,001).
[00013] A Figura 2 mostra os títulos do vírus Vaccinia tipo TP03 e o vírus Vaccinia tipo TP05 após a infecção com células BSC-40. As células BSC-40 foram respectiva mente infectadas com os vírus TP03 e TP05 na multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (isto é, MOI = 0,01), incubadas a 37°C, colhidas por congelamento-descongelamento e o rendimento de vírus determinado por titulação em células BSC-40. Os vírus TP03 crescem mais devagar e, para títulos ainda menores do que os do vírus TP05. A diferença de taxa de crescimento entre as duas cepas é estatisticamente significativa (P <0,01).
[00014] A Figura 3 mostra os resultados de PCR e de Southern blot para confirmar a presença de deleções teloméricas. TT004F (SEQ ID NO: 1), TT011R (SEQ ID NO: 2) e TT010F (SEQ ID NO: 3) foram utilizados como primers para a PCR. A Figura 3A mostra os sítios de ligação dos primers de PCR para regiões de telômeros restantes TP03 e TP05. A Figura 3B mostra os resultados de PCR de TP03, TP05, TP11, TP12, TP13, TP18, TP05 e o banco (estoque não purificado de vírus) utilizando TT010F e TT011R ou TT004F e TT011R como pares de primers, respectivamente. A Figura 3C mostra os resultados de Southern blot dos DNAs digeridos por Seal que codificam TP03, TP11, TP05, TP13 e o banco direitos e esquerdos.
[00015] A Figura 4 mostra uma comparação dos locais de deleções de gene nas regiões de telômero esquerdo de 12 cepas VACV comuns. As barras verticais circuladas representam a fronteira esquerda de TIR. O TP03 inclui uma deleção que se estende para dentro dos genes VGF na região de telômero esquerdo do genoma do vírus.
[00016] A Figura 5 mostra uma comparação dos locais de deleções de gene nas regiões de telômero direito de 12 cepas VACV comuns. As barras verticais circuladas representam a fronteira direita de TIR. O TP03 inclui uma deleção que se estende para dentro dos genes VGF na região de telômero direito do genoma do vírus.
[00017] A Figura 6 mostra uma tabela que lista os genes localizados em um fragmento de 5,7 kpb nas repetições terminais invertidas do vírus tipo TP05, enquanto o fragmento de 5,7 kpb está faltando a partir do vírus tipo TP03.
Descrição Detalhada da Invenção Cepas de vírus Vaccinia mutantes
[00018] Os inventores da presente invenção identificaram e isolaram uma cepa do vírus Vaccinia mutante com maior segurança e seletividade de tumor a partir da cepa do vírus l/acc/77/aTianTan. Os inventores verificaram que a cepa do vírus Vaccinia TianTan produziu placas com vários tamanhos de área quando cultivada em células BSC-40 de rim de macaco. As placas podem ser geralmente divididas em dois tipos, um tipo tem um tamanho de área significativamente menor do que o outro. Através de clonagem e seleção, os inventores foram capazes de separar os vírus em duas cepas, uma é o tipo TP03, que tem um tamanho de área de placa menor, e a outra é o tipo TP05, que tem um tamanho de área de placa maior. Em certas realizações, o tipo TP03 tem placas com um tamanho de área que é cerca de metade do tamanho de área das placas do tipo TP05 (Figura 1). Em certas realizações, o tamanho das pequenas placas formadas pelo vírus Vaccinia tipo TP03 pode ser de menos do que cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, sobre 65%, cerca de 70%, cerca de 75% ou cerca de 80% do que de grandes placas do vírus Vaccinia tipo TP05. O tamanho da área de uma placa pode ser determinado pela medição do raio médio, diâmetro ou área da placa formada pelo vírus, tal como descrito na Patente US 4.213.965, Patente US 5.690.940 e Patente US 7.037.508.
[00019] Verificou-se também que o tipo TP03 tem uma multiplicidade menor de infecção em células hospedeiras que não se dividem do que o tipo TP05. Em certas realizações, a multiplicidade de infecção do tipo TP03 é de menos do que cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60% ou cerca de 50% da multiplicidade de infecção do tipo TP05 (Figura 2). A multiplicidade menor de infecção pode ser indicativa de virulência diminuída. A multiplicidade de infecção de um vírus pode ser determinada pela medição dos títulos virais ou resultados de imuno-histoquímica de células ou tecidos infectados com o vírus. Uma diminuição nos títulos virais ou resultados de imuno-histoquímica aprimorados pode ser um indicativo de uma redução na virulência. Descrição detalhada da avaliação de virulência pode ser encontrada na Patente US 7.740.867 e Patente US 7.732.188.
[00020] Além disso, a virulência de um vírus pode ser avaliada através de outros métodos comumente usados no estado da técnica, por exemplo, a sobrevivência de animais ou estudo de crescimento de célula hospedeira. Para estudo de sobrevivência de animais, os vírus podem ser injetados em animais e a porcentagem de animais que sobrevivem após infecção com vírus diferentes será gravada para gerar uma curva de sobrevivência e/ou determinar a LD50. Um vírus que resulta em uma taxa de sobrevivência superior ou tempo de sobrevivência mais elevado ou maior LD50 pode ser considerado como tendo virulência diminuída e, por conseguinte, uma maior segurança.
[00021] As sequências de genes de vírus tipo TP03 e tipo TP05 foram determinadas utilizando 0 método de sequenciamento padrão conhecido no estado da técnica (vide, por exemplo, Qin et al., J. Virol. 85 (2011): 13.049-60; Chen et al. k?/o/opy317 (2003): 16586). Os resultados do sequenciamento revelaram que 0 tipo TP03 é uma cepa mutante que contém grandes deleções no genoma do vírus, enquanto 0 tipo TP05 contém um genoma quase completo de um vírus Vaccinia, que é representativo da cepa de vírus TianTan original. As Figuras 4 e 5 mostram diagramas esquemáticos do telômero esquerdo e telômero direito dos vírus tipo TP03 e tipo TP05. A deleção do gene do tipo TP03 é uma deleção de 5,7 kpb simétrica nas repetições teloméricas invertidas esquerda e direita (HRs) do vírus, em que os promotores e N-terminais de ambas as cópias dos genes VGF são eliminados, o gene Serpina (SPI -1), o gene Anquirina e alguns outros genes também são excluídos. As deleções de gene nos vírus tipo TP03 e os genes homólogos correspondentes nos vírus tipo TP05 são listadas numa tabela mostrada na Figura 6.
[00022] A cepa do vírus tipo TP03 foi depositada em 8 de abril de 2013 no China Centre for Type Culture Collection (CCTCC) sob o número de depósito CCTCC V201307, sob as disposições do Tratado de Budapeste.
[00023] Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes VGF artificialmente truncados, de modo que o vírus não expresse proteínas FCV funcionalmente ativas. O termo "funcionalmente ativa", quando utilizado em relação a uma molécula, tal como uma proteína, significa que a molécula é capaz de realizar pelo menos uma função ou atividade no seu estado ativo. A função ou atividade refere-se a, por exemplo, mas não limitado a atividade ou função biológica, fisiológica ou imunológica.
[00024] Em certas realizações, ambos os genes VGF no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85%, mais de 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35%, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% dos genes VGF são truncados. Em uma realização preferida, ambos os genes VGF são completamente truncados. Em certas realizações, os genes VGF são truncados por deleções de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200 ou mais nucleotídeos contíguos em cada gene VGF, contíguos ou não contíguos.
[00025] Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes Serpina artificialmente truncados, de modo que o vírus não consiga expressar proteínas Serpina funcionalmente ativas. Em certas realizações, os genes Serpinas no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85%, mais do que 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35%, mais de 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% do gene Serpina é truncado. Em uma realização preferida, os genes Serpinas são completamente truncados. Em certas realizações, os genes Serpinas são truncados por deleções de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 900 ou mais nucleotídeos contíguos em cada gene Serpina, contíguos ou não contíguos.
[00026] Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes Anquirina artificialmente truncados, de modo que o vírus não possa expressar proteínas Anquirina funcionalmente ativas. Em certas realizações, os genes Anquirina no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85%, mais de 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35%, mais de 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais de 10% do gene Anquirina é truncado. Em uma realização preferida, os genes Anquirina são completamente truncados.
[00027] Em certas realizações, os genes Anquirina são truncados por deleções de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 300, 400 ou mais nucleotídeos contíguos em cada gene Anquirina, contíguos ou não contíguos.
[00028] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes VGF e os genes Serpina artificialmente truncados, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF funcionalmente ativas e proteínas Serpina. Em certas realizações, os genes VGF e os genes Serpinas no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85 %, mais do que 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35%, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% de cada um dos genes VGF e Serpinas são truncados. Em uma realização preferida, todos os genes VGF e genes Serpina no genoma do vírus Vaccinia são completamente truncados.
[00029] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes VGF e os genes Anquirina artificialmente truncados, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF e proteínas Anquirina funcionalmente ativas. Em certas realizações, os genes VGF e os genes Anquirina no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85%, mais do que 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35 %, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% de cada um dos genes VGF e Anquirina são truncados. Em uma realização preferida, todos os genes VGF e genes Anquirina no genoma do vírus Vaccinia são completamente truncados.
[00030] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes Anquirina e os genes Serpina artificialmente truncados, de modo que o vírus não possa expressar proteínas Anquirina e proteínas Serpina funcionalmente ativas. Em certas realizações, os genes Anquirina e os genes Serpinas no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais do que 90%, mais do que 85%, mais do que 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais do que 40%, mais do que 35 %, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% de cada um dos genes Anquirina e Serpinas são truncados. Em uma realização preferida, todos os genes Anquirina e genes Serpina no genoma do vírus Vaccinia são completamente truncados.
[00031] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um vírus Vaccinia mutante recombinante com os genes VGF, os genes Serpina e os genes Anquirina artificialmente truncados, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF, Serpina e Anquirina funcionalmente ativas. Em certas realizações, os genes VGF, os genes Serpina e os genes Anquirina no genoma do vírus Vaccinia são completamente ou parcialmente truncados, por exemplo, mais do que 99%, mais do que 98%, mais do que 95%, mais de 90% , mais do que 85%, mais do que 80%, mais do que 75%, mais do que 70%, mais do que 65%, mais do que 60%, mais do que 55%, mais do que 50%, mais do que 45%, mais de 40%, mais do que 35%, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15%, mais do que 10% de cada um dos genes VGF, genes Serpina e genes Anquirina são truncados. Em uma realização preferida, todos os genes VGF, genes Serpina e genes Anquirina no genoma do vírus Vaccinia são completamente truncados.
[00032] A truncagem do gene no genoma do vírus pode ser produzida por vários métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, recombinação homóloga. A recombinação homóloga é um tipo de recombinação genética em que as sequências de nucleotídeos são trocadas entre duas moléculas similares ou idênticas de ácidos nucleicos. A recombinação homóloga pode ser realizada pelas etapas de primeiro criar um plasmídeo de transporte de Vaccinia contendo um gene repórter para recombinação homóloga na região alvo, infectar uma célula hospedeira adequada com um vírus de Vaccinia nativo, transfectar o vírus Vaccinia nativo com o plasmídeo de transporte de Vaccinia para permitir recombinação homóloga do plasmídeo de transporte para a região alvo, e isolar as placas positivas de acordo com o produto do gene repórter. O método para criar um vetor de transporte do vírus Vaccinia é conhecido no estado da técnica, tal como descrito por Du et al. J. Virol. MethodslüS (2012): 175-83; Blasco et al. <76/76158 (1995): 157-62; Coupar et al. Gene 68 (1988): 1-10; Falkner et al. J Virol. 64 (1990): 3108-11.
[00033] Em um outro aspecto, a presente descrição refere-se a um método de produção de uma cepa do vírus Vaccinia mutante, que inclui as sequências de codificação truncadas dos genes VGF completamente ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF funcionalmente ativas. Em certas realizações, o método inclui ainda truncar as sequências de codificação dos genes Serpinas completamente ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não consiga expressar proteínas Serpina funcionalmente ativas. Em certas realizações, o método inclui ainda truncar as sequências de codificação dos genes Anquirina completamente ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não possa expressar proteínas Anquirina funcionalmente ativas. Em certas realizações, o método inclui truncar as sequências de codificação dos genes VGF, genes Serpina e genes Anquirina completa ou parcialmente a partir do genoma do vírus, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF, proteínas e proteínas Serpina e proteínas Anquirina funcionalmente ativas.
[00034] O vírus Vaccinia inclui, mas não se limita a, Western Reserve (WR), Copenhagen, Tashkent, TianTan, Lister, Wyeth (também conhecido como Dryvax), 1HD-J, DIC-W, Brighton, Ancara, MVA, Dairen I, LIPV, LC16M8, LC16MO, LIVP, WR 65-16 e Connaught. Usos das cepas de vírus mutantes
[00035] Os vírus Vaccinia mutantes descritos no presente podem se replicar seletivamente nas células tumorais e podem ser úteis para infectar seletivamente células tumorais. Como utilizado no presente, "replicar seletivamente" significa que a taxa de replicação do vírus mutante em um tipo de célula (por exemplo, células tumorais) é significativamente mais elevada do que em um outro tipo de célula (por exemplo, células normais). Em certas realizações, um vírus Vaccinia mutante apresenta pelo menos 1 dobra, 2 dobras, 3 dobras, 4 dobras, 5 dobras, 10 dobras, 50 dobras, 100 dobras ou 1000 dobras de maior multiplicidade de infecção em células tumorais do que em células normais. Em certas realizações, o vírus Vaccinia mutante mostra pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de maior multiplicidade de infecção em células tumorais do que em células normais.
[00036] Em certas realizações, os vírus Vaccinia mutantes da presente invenção podem se replicar seletivamente nas células cancerosas hepáticas (por exemplo, Hepal-6, células Hep3B, células 7402 e células 7721), células cancerosas da mama (por exemplo, células MCF-7), células cancerosas da língua (por exemplo, células TCa8113), células cancerosas de adenoide cístico (por exemplo, células ACC-M), células cancerosas da próstata (por exemplo, células LNCaP), células de rim embrionário humano (por exemplo, células HEK293), células cancerosas de pulmão (por exemplo, células A549) e células cancerosas do colo do útero (por exemplo, células Hela).
[00037] Em outro aspecto, os vírus Vaccinia mutantes da presente invenção têm virulência presentam menos do que 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% da multiplicidade de infecção em células normais do que o vírus Vaccinia de tipo selvagem.
[00038] Em outro aspecto, um vírus Vaccinia mutante descrito no presente pode ser usado como um vetor para liberar seletivamente um gene alvo a uma célula tumoral e expressar o gene alvo na célula tumoral. O termo "expressar" como utilizado no presente refere-se a um processo em que uma sequência de DNA é lida por uma RNA polimerase para produzir uma cadeia de RNA complementar à sequência de DNA e/ou um processo em que uma sequência de RNA é lida por um ribossomo para produzir um peptídeo codificado pela sequência de DNA e a sequência de RNA.
[00039] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um produto de gene recombinante, o qual compreende a inserção de um gene alvo no genoma de um vírus Vaccinia mutante da presente divulgação. Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um produto de gene recombinante que compreende as sequências de ácido nucleico de um vírus Vaccinia mutante descrito no presente e as sequências de ácidos nucleicos de um gene alvo.
[00040] Em certas realizações, tais genes alvo podem incluir, sem limitação, os genes que matam ou inibem as células tumorais, genes que podem aumentar as respostas imunes contra as células tumorais, genes que podem reparar ou substituir genes mutados ou alterados de células tumorais, ou genes que podem tornar as células tumorais mais sensíveis à quimioterapia ou terapia de radiação. Em certas realizações, os genes alvo são citoquinas, tais como fatores de estimulação de colônias (por exemplo, fatores de estimulação de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSFs), fatores de estimulação de colônias de macrófagos (M-CSFs), fatores de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF)), fatores de células troncos, eritropoietina, intérferons (IFNs), fatores de necrose tumoral (TNFs) e quimiocinas. Em certas realizações, os genes alvo codificam para polipeptídeos que apresentam antígeno, tais como as proteínas de choque de calor. Em certas realizações, os genes alvo codificam para anticorpos monoclonais contra proteínas que possam ser associadas a tumores, por exemplo, anticorpos monoclonais contra os fatores de crescimento endoteliais vasculares ou os fatores de necrose tumoral.
[00041] Um gene alvo pode ser inserido no vírus Vaccinia mutante utilizando métodos convencionais conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o gene alvo pode ser produzido pela reação em cadeia de polimerase (PCR) e carregam sítios enzimáticos específicos em cada extremidade do gene alvo, cujos sítios enzimáticos são complementares para os mesmos ou similares sítios enzimáticos no vírus Vaccinia mutantes, e o gene alvo é ligado ao vírus através de ligação nos sítios enzimáticos. Para mais detalhes vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)), que é incorporado ao presente por referência na sua totalidade.
[00042] Em outro aspecto, um vírus Vaccinia mutante da presente divulgação e um produto de gene recombinante contendo o vírus Vaccinia mutante pode ser útil para a prevenção e tratamento de tumores. Exemplos de tumores incluem, sem limitações, câncer anal, câncer do duto biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer de intestino (câncer de cólon, câncer retal), câncer cerebral, câncer de mama, câncer carcinoide, câncer do colo do útero, câncer endócrino, câncer de olho, câncer de vesícula biliar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de sarcoma de Kaposi, o câncer de rim, câncer de laringe, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de linfoma, câncer de melanoma, câncer de mesotelioma, câncer do mieloma múltiplo, câncer neuroendócrino, câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de pele, câncer de sarcomas de tecidos moles, câncer da medula espinal, câncer de estômago, câncer de testículos, câncer da tireoide, câncer de vagina, câncer de vulva ou câncer do útero.
Exemplos
[00043] Os Exemplos a seguir são apresentados para auxiliar na compreensão do presente relatório descritivo e não devem ser interpretados de forma a limitar, de qualquer forma, o âmbito da presente invenção, tal como definida nas reivindicações contidas no presente.
Exemplo 1 Isolamento e caracterização do vírus
[00044] O vírus Vaccinia (cepa TianTan) foi obtido a partir do China Center for Type Culture Collection (Wuhan, Hubei) e células BSC-40 de rim de macaco foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células e os vírus foram cultivados em meio de Eagle modificado (MEM, Gibco) suplementado com soro bovino fetal a 5%, aminoácidos não essenciais a 1%, L-glutamina a 1% e antibiótico a 1% a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5%.
[00045] 24 clones de vírus a partir de um estoque de cepa VACV TianTan foram selecionados randomicamente e purificados em placa em células BSC-40. Cada um dos vírus purificados em placas foi cultivado utilizando células BSC-40 a uma baixa multiplicidade de infecção (MOI = 0,01) durante dois dias, fixados, corados com violeta de cristal e fotografados. Image J (Schneider et al. Nat Methods 9 (2012): 671-5) foi então utilizada para medir os tamanhos de área de 20 placas para cada clone de vírus, as placas foram selecionados randomicamente a partir de cada prato. Estes vírus produziram dois tipos de placas. Como mostrado na Figura 1, os vírus mais abundantes (21/24 clones) de tipo TP03 (clones representativos: TP03, TP11, TP12) formaram placas menores com um tamanho de área de cerca de metade do que os vírus do tipo TP05 (3/24 clones) (clones representativos: TP05, TP13, TP18). Os resultados do isolamento do vírus sugeriram que o estoque de vírus continha pelo menos duas formas variantes de vírus, isto é, do tipo TP03 e do tipo TP05.
[00046] Os títulos de TP03 e TP05 também foram plotados ao longo do tempo através da infecção de células BSC-40 com TP03 e TP05 a MOI=0,01. Os vírus foram incubados a 37°C, coletados por congelamento-descongelamento e o rendimento de vírus em cada ponto de tempo foi determinado por titulação em células BSC-40. Como mostrado na Figura 2, os títulos de TP03 em cada ponto de tempo é menor do que os títulos de TP05, o que indica que a taxa de crescimento de TP03 é mais lenta do que a de TP05.
Exemplo 2 Análise de deleções de 5,7 kpb no vírus de tipo TP03
[00047] Os materiais de DNA do tipo TP03 e do tipo TP05 foram purificados e sequenciados. De acordo com os resultados do sequenciamento, o tipo TP03 é diferente do tipo TP05 por duas deleções de 5,7 kpb localizadas nas repetições teloméricas invertidas direita e esquerda (TIRs) do vírus tipo TP03, respectivamente.
[00048] A presença de deleções de 5,7 kpb nas TIRs de tipo TP03 foi confirmada por PCR. Os resultados de PCR são apresentados na Figura 3, em que a Figura 3 A mostra os sítios de ligação de primers usados na PCR (TT004F, TT010F e TT011R) em um mapa dos telômeros esquerdos de TP03 e TP05. Quando o primer forward TTOIOF (5' Illi IGTAGGAAGGAGGC 3' (SEQ ID NO: 3)) e o primer reverse TT011R (5' CCGGGAGATGGGATATATGA 3' (SEQ ID NO: 2)) foram utilizados em PCR, nenhuma amplificação de DNA do tipo TP03 (TP03, TP11, TP12) foi observada (Figura 3B), que é devido ao sítio de ligação do primer TTOIOF ser eliminado devido às deleções de 5,7 kpb no tipo TP03. Quando o primer forward TT004F (5 TGGATGGCCGTATTGATT 3' (SEQ ID NO: I)) e o iniciador inverso TTOllR foram utilizados em PCR, amplificação de DNA de tipo TP03 foi observada (Figura 3B).
[00049] Em contraste, quando TT010F e TTOllR foram utilizados como par de primers em PCR, a amplificação de DNA de tipo TP05 foi observada (Figura 3B), isto porque o sítio de ligação do primer TT010F é retido no tipo TP05. Quando TT004F e TTOllR foram utilizados como par de primers em PCR, nenhuma amplificação de DNA de tipo TP05 foi observada (Figura 3B) uma vez que a distância entre o par de primers de tipo TP05 é muito longe para permitir que os primers sirvam como primers de PCR. As deleções de 5,7 kpb em tipo TP03 também foram confirmadas por Southern blot, em que os DNA virais foram digeridos com Scà, seguido por fraccionamento em um gel de agarose a 0,7%, transferidos para membranas de nylon e manchados com uma sonda marcada com biotina. Os resultados de Southern blot de DNAs digeridos por Scá do tipo TP03 (TP03, TP11), tipo TP05 (TP05, TP13) e o banco são mostrados na Figura 3C. A sonda utilizada no Southern blot codifica DNA abrangendo o lado direito da fronteira de deleção (Figura 3A), portanto, as deleções de 5,7 kpb no tipo TP03 encurtam grandemente os fragmentos de Scd que codificam as TIRs esquerda e direita em comparação com o tipo TP05. O estoque não purificado dos vírus (banco na Figura 3C) demonstrou conter vírus de ambos o tipo TP03 e o tipo TP05 (Figura 3C).
Exemplo 3 Análise genômica do vírus
[00050] As sequências de genes de vários vírus Vaccinia são comparadas umas com as outras para verificar se há similaridade ou diferenças de sequências. As cepas de vírus Vaccinia analisadas incluem CL3, ACAM2K, RPXV, Duke, Lister, CVA, Cop, WR, HPXV e TianTan (TP03 e TP05). "TP00" refere-se à sequência de vírus TianTan publicada anteriormente (AF095689).
[00051] As montagens de genoma foram preparadas utilizando CLC Genomics Workbench (v4.6) e anotadas usando GATU (Tcherepanov et al. BMC Genomics! (2006): 150) como descrito previamente (Qin et al., J. ViroiüS (2011):. 13049-60). Análises de bioinformática foram realizadas utilizando Viral Genome Organizer (Lefkowitz et al., Nucleic Acids Res 33 (2005): D311-6; Upton et al. Virus Res. 70 (2000): 55-64) e clusters ortólogos de poxvirus (Ehlers et al. Bioinformatics 18 (2002): 1544-5). Estas e ferramentas de bioinformática adicionais podem ser acessadas no http://www.virology.ca. Um alinhamento das sequências de vírus que se encontram entre os genes homólogos de genes DVX058 a DVX155 (genes de Copenhagen VACV F9L-a-A24R) para os vírus indicados foi preparado.
[00052] Pesquisa de BLASTN foi executada usando cerca de 20 kpb da sequência que abrange o telômero esquerdo de cepas de vírus Vaccinia comum (Figura 4). A localização da fronteira TIR esquerda (barras verticais circuladas na Figura 4) varia entre as cepas, devido à presença de diferentes deleções na região que circunda a fronteira TIR esquerda. A TP05 se assemelha a cepas VACV mais completas e TIRs de TP05 se assemelham mais às de outras cepas VACV.
[00053] Um padrão semelhante de deleções de genes também se encontra no telômero direito dos diferentes genomas VACV (Figura 5). A cepa TP05 codifica um complemento de genes no telômero direito similar a maioria das outras cepas VACV, enquanto TP03 codifica uma deleção única à direita da fronteira TIR (círculo barrado na Figura 5) que se estende para o gene VGF em comparação com outras cepas VACV.
[00054] Os genes localizados na deleção de 5,7 kpb simétrica de vírus tipo TP03 são comparados com os genes homólogos do vírus tipo TP05 e a cepa Copenhagen. Tal como mostrado na tabela na Figura 6, em comparação com TP05 e a cepa Copenhagen, o vírus de tipo TP03 tem o gene Serpina (SPI-1), gene Anquirina e vários outros genes completamente removidos da TIRs em ambas as extremidades do genoma do vírus. Além disso, o promotor e a região N-terminal do gene VGF também são removidos de ambas as extremidades do DNA TP03, apenas uma região C-terminal de 253 pb do gene VGF é deixada em cada extremidade do DNA TP03.

Claims (5)

1. CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, que pode se replicar seletivamente em células tumorais e que tem virulência diminuída para células normais caraterizada pelo fato de que as sequências de codificação dos dois genes do fator de crescimento do vírus (VGF) Vaccinia, dos genes Serpina, e dos genes Anquirina no genoma do vírus são completamente ou parcialmente truncadas, de modo que o vírus não possa expressar proteínas VGF, proteínas Serpinas, e proteínas Anquirinas funcionalmente ativas, e a cepa está depositada sob o número de depósito CCTCC igual a V201307.
2. CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, de acordo com a reivindicação 1, caraterizada pelo fato de que a cepa produz placas menores do que o vírus Vaccinia não mutante correspondente.
3. CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, de acordo com a reivindicação 1, caraterizada pelo fato de que as células tumorais são selecionadas a partir do grupo que consiste em células de Hepal-6, MCF-7, TCa8113, ACC-M, LNCaP, células HEK293, Hep3B, A549, 7402, 7721 e Hela.
4. USO DA CEPA DO VÍRUS VACCINIA MUTANTE, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caraterizado pelo fato de ser como um vetor para liberar seletivamente um gene alvo a uma célula tumoral e expressar o gene alvo na célula tumoral.
5. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE GENE RECOMBINANTE, caraterizado pelo fato de que compreende a inserção de um gene alvo no genoma de um vírus Vaccinia mutante conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
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