JP5652830B2 - マイクロｒｎａ制御組換えワクシニアウイルス及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なワクシニアウイルス及びそれを利用したウイルスベクターに関する。具体的には、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関る遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したマイクロＲＮＡ制御型ウイルスであり、マイクロＲＮＡ制御機構による遺伝子発現調節と同調して癌細胞においてのみ、ウイルス増殖に関わる遺伝子を発現させウイルスが増殖することによって、癌細胞を破壊するワクシニアウイルス及びワクシニアウイルスベクターに関する。
近年、ウイルスを癌治療に用いる癌ウイルス治療に関する種々の技術が開発されている。このような治療に用いるウイルスとして、アデノウイルス、レトロウイルスの他、ワクシニアウイルスがある。
ワクシニアウイルスに関しては、日本国で開発された痘瘡ワクチン株であるＬＣ１６ｍ８株は、宿主体内でのウイルス拡散や病原性に関わるＢ５Ｒ遺伝子がフレームシフト変異によって機能を失うことによって弱毒化された株である。該ワクチン株は日本では過去に痘瘡ワクチンとして約１０万人の乳幼児に接種された実績がある。その際、死亡等の重篤な副作用は一例もなく、一方で従来のワクチンと同等の免疫応答が認められ、その高い有効性と安全性が証明されている（非特許文献１を参照）。このＬＣ１６ｍ８株のＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させることによって遺伝的安定性をさらに向上させた改良型ワクチンがＬＣ１６ｍ８Δである（特許文献１を参照）。
近年ワクシニアウイルスは、その広い宿主域と高い発現効率という特性から、外来遺伝子を導入した発現ベクターとして感染症（ＨＩＶやＳＡＲＳ）のための多価ワクチンとしても用いられている。
一方、近年マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と癌の関連が注目されており、特定のマイクロＲＮＡが癌細胞でダウンレギュレート又はアップレギュレートされていることが報告されている（非特許文献２及び３等を参照）。
ワクシニアウイルスに関しては、日本国で開発された痘瘡ワクチン株であるＬＣ１６ｍ８株は、宿主体内でのウイルス拡散や病原性に関わるＢ５Ｒ遺伝子がフレームシフト変異によって機能を失うことによって弱毒化された株である。該ワクチン株は日本では過去に痘瘡ワクチンとして約１０万人の乳幼児に接種された実績がある。その際、死亡等の重篤な副作用は一例もなく、一方で従来のワクチンと同等の免疫応答が認められ、その高い有効性と安全性が証明されている（非特許文献１を参照）。このＬＣ１６ｍ８株のＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させることによって遺伝的安定性をさらに向上させた改良型ワクチンがＬＣ１６ｍ８Δである（特許文献１を参照）。
近年ワクシニアウイルスは、その広い宿主域と高い発現効率という特性から、外来遺伝子を導入した発現ベクターとして感染症（ＨＩＶやＳＡＲＳ）のための多価ワクチンとしても用いられている。
一方、近年マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と癌の関連が注目されており、特定のマイクロＲＮＡが癌細胞でダウンレギュレート又はアップレギュレートされていることが報告されている（非特許文献２及び３等を参照）。
橋爪壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５
Ｓｔｅｖｅｎ Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２０：６３５−６４７，２００５
Ｃａｒｌｏ Ｍ．Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：７０４−７１４，２００９
本発明は、癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を破壊するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用を目的とする。
現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する前臨床研究、及び臨床治験が積極的に行われている。このウイルス療法における最大のキーポイントは、ウイルスが元来持っている正常組織に対する病原性をいかに排除するかという点にある。
本発明者らは、高い安全性が確立しているＬＣ１６ｍ８Δワクチン株をベースに、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖し、破壊する組換えワクシニアウイルスを作出し、癌組織のみを攻撃する癌特異的ウイルス療法を確立した。すなわち、ＬＣ１６ｍ８Δにワクシニアウイルスの増殖や病原性に関与するＢ５Ｒ遺伝子とその３’非翻訳領域中に癌細胞において正常細胞に比べ発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を挿入した。その結果、正常細胞ではマイクロＲＮＡの制御によりワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、ワクシニアウイルスは増殖することができず正常細胞を傷害することはなかったが、一方、マイクロＲＮＡの発現が少ない癌細胞ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されず、ワクシニアウイルスが効率よく増殖するために、癌細胞のみを特異的に傷害することを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、マイクロＲＮＡにより増殖が制御される組換えワクシニアウイルスを用いて癌を治療する方法を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関るＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［２］ 正常細胞で発現するマイクロＲＮＡによって、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、［１］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［３］ Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、３’非翻訳領域にマイクロＲＮＡの標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子を導入した、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［４］ ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株又はＬＣ１６ｍＯ株である、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［５］ ワクシニアウイルスが、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に欠失したＬＣ１６ｍ８株又はＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失したｍ８Δ株である、［３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［６］ 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ（配列番号１）、ｌｅｔ−７ｂ（配列番号２）、ｌｅｔ−７ｃ（配列番号３）、ｌｅｔ−７ｄ（配列番号４）、ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５）、ｌｅｔ−７ｆ（配列番号６）、ｍｉＲ−９（配列番号７）、ｍｉＲ−１５ａ（配列番号８）、ｍｉＲ−１６−１（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１２）、ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１５）、ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号１６）、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１７）、ｍｉＲ−３０ｄ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−３３ａ（配列番号２０）、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号２１）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号２２）、ｍｉＲ−９５（配列番号２３）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２４）、ｍｉＲ−１２２（配列番号２５）、ｍｉＲ−１２４（配列番号２６）、ｍｉＲ−１２５ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２８）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２９）、ｍｉＲ−１２７（配列番号３０）、ｍｉＲ−１２８（配列番号３１）、ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−１３９−５ｐ（配列番号３３）、ｍｉＲ−１４０（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４１（配列番号３５）、ｍｉＲ−１４２（配列番号３６）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３７）、ｍｉＲ−１４４（配列番号３８）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３９）、ｍｉＲ−１５５（配列番号４０）、ｍｉＲ−１８１ａ（配列番号４１）、ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号４２）、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号４３）、ｍｉＲ−１９２（配列番号４４）、ｍｉＲ−１９５（配列番号４５）、ｍｉＲ−１９８（配列番号４６）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号４７）、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ（配列番号４８）、ｍｉＲ−２００ａ（配列番号４９）、ｍｉＲ−２０３（配列番号５０）、ｍｉＲ−２０４（配列番号５１）、ｍｉＲ−２０５（配列番号５２）、ｍｉＲ−２１７（配列番号５３）、ｍｉＲ−２１８（配列番号５４）、ｍｉＲ−２１９−５ｐ（配列番号５５）、ｍｉＲ−２２０ａ（配列番号５６）、ｍｉＲ−２２０ｂ（配列番号５７）、ｍｉＲ−２２０ｃ（配列番号５８）、ｍｉＲ−２２２（配列番号５９）、ｍｉＲ−２２３（配列番号６０）、ｍｉＲ−２２４（配列番号６１）、ｍｉＲ−３４５（配列番号６２）、及びｍｉＲ−３７５（配列番号６３）からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［７］ 癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の１つ又は複数を欠損させた、［１］〜［６］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［８］ 少なくともチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させた、［７］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［９］ さらに、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を削除させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１０］ さらに、Ｆフラグメントを欠損させた、［９］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１１］ さらに、ＶＧＦ遺伝子を欠損させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
［１３］ ［１］〜［１２］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１４］ 外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、［１３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１５］ ［１３］又は［１４］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
［１６］ ［１］〜［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を評価する方法であって、
（ｉ） 前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及び
（ｉｉ） 癌細胞及び正常細胞におけるマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程
を含み、前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると判断する方法。
［１７］ マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を評価する、［１６］の方法。
本発明のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、特定のマイクロＲＮＡの発現程度により、増殖が制御される。該特定のマイクロＲＮＡの発現が増大している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるため増殖できず、一方、マイクロＲＮＡの発現が低下している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が誘導され、ウイルスが増殖しその細胞を傷害する。従って、特定のマイクロＲＮＡとして癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているものを選択することにより、癌細胞中でワクシニアウイルスが効率良く増殖し、強力な抗腫瘍効果を発揮する。従って、あらかじめ個々の癌患者検体におけるマイクロＲＮＡ発現を調べ、癌組織におけるマイクロＲＮＡを解析することにより、適切なマイクロＲＮＡを選択することができ、癌細胞のみを攻撃するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを選択できるオーダーメイド創薬となり得る。
また、本発明においては高い安全性が確立しているワクシニアウイルス株であるＬＣ１６ｍ８Δワクチン株等をベースにすることにより、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖破壊するマイクロＲＮＡ制御組換えウイルスを提供することができる。
さらに、ワクシニアウイルスは、広い宿主域と高い発現効率を有しているため、他の外来遺伝子を導入するベクターとしても機能する。ルシフェラーゼやＧＦＰを発現するマイクロＲＮＡ制御組換えワクシニアウイルスは、その感染細胞を簡便、迅速に同定することが可能となる。また、細胞毒性効果や免疫賦活効果を有する治療遺伝子を発現させることによって、他の治療法との併用も可能となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０９０６６２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する前臨床研究、及び臨床治験が積極的に行われている。このウイルス療法における最大のキーポイントは、ウイルスが元来持っている正常組織に対する病原性をいかに排除するかという点にある。
本発明者らは、高い安全性が確立しているＬＣ１６ｍ８Δワクチン株をベースに、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖し、破壊する組換えワクシニアウイルスを作出し、癌組織のみを攻撃する癌特異的ウイルス療法を確立した。すなわち、ＬＣ１６ｍ８Δにワクシニアウイルスの増殖や病原性に関与するＢ５Ｒ遺伝子とその３’非翻訳領域中に癌細胞において正常細胞に比べ発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を挿入した。その結果、正常細胞ではマイクロＲＮＡの制御によりワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、ワクシニアウイルスは増殖することができず正常細胞を傷害することはなかったが、一方、マイクロＲＮＡの発現が少ない癌細胞ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されず、ワクシニアウイルスが効率よく増殖するために、癌細胞のみを特異的に傷害することを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、マイクロＲＮＡにより増殖が制御される組換えワクシニアウイルスを用いて癌を治療する方法を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関るＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［２］ 正常細胞で発現するマイクロＲＮＡによって、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、［１］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［３］ Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、３’非翻訳領域にマイクロＲＮＡの標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子を導入した、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［４］ ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株又はＬＣ１６ｍＯ株である、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［５］ ワクシニアウイルスが、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に欠失したＬＣ１６ｍ８株又はＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失したｍ８Δ株である、［３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［６］ 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ（配列番号１）、ｌｅｔ−７ｂ（配列番号２）、ｌｅｔ−７ｃ（配列番号３）、ｌｅｔ−７ｄ（配列番号４）、ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５）、ｌｅｔ−７ｆ（配列番号６）、ｍｉＲ−９（配列番号７）、ｍｉＲ−１５ａ（配列番号８）、ｍｉＲ−１６−１（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１２）、ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１５）、ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号１６）、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１７）、ｍｉＲ−３０ｄ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−３３ａ（配列番号２０）、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号２１）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号２２）、ｍｉＲ−９５（配列番号２３）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２４）、ｍｉＲ−１２２（配列番号２５）、ｍｉＲ−１２４（配列番号２６）、ｍｉＲ−１２５ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２８）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２９）、ｍｉＲ−１２７（配列番号３０）、ｍｉＲ−１２８（配列番号３１）、ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−１３９−５ｐ（配列番号３３）、ｍｉＲ−１４０（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４１（配列番号３５）、ｍｉＲ−１４２（配列番号３６）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３７）、ｍｉＲ−１４４（配列番号３８）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３９）、ｍｉＲ−１５５（配列番号４０）、ｍｉＲ−１８１ａ（配列番号４１）、ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号４２）、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号４３）、ｍｉＲ−１９２（配列番号４４）、ｍｉＲ−１９５（配列番号４５）、ｍｉＲ−１９８（配列番号４６）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号４７）、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ（配列番号４８）、ｍｉＲ−２００ａ（配列番号４９）、ｍｉＲ−２０３（配列番号５０）、ｍｉＲ−２０４（配列番号５１）、ｍｉＲ−２０５（配列番号５２）、ｍｉＲ−２１７（配列番号５３）、ｍｉＲ−２１８（配列番号５４）、ｍｉＲ−２１９−５ｐ（配列番号５５）、ｍｉＲ−２２０ａ（配列番号５６）、ｍｉＲ−２２０ｂ（配列番号５７）、ｍｉＲ−２２０ｃ（配列番号５８）、ｍｉＲ−２２２（配列番号５９）、ｍｉＲ−２２３（配列番号６０）、ｍｉＲ−２２４（配列番号６１）、ｍｉＲ−３４５（配列番号６２）、及びｍｉＲ−３７５（配列番号６３）からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［７］ 癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の１つ又は複数を欠損させた、［１］〜［６］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［８］ 少なくともチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させた、［７］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［９］ さらに、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を削除させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１０］ さらに、Ｆフラグメントを欠損させた、［９］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１１］ さらに、ＶＧＦ遺伝子を欠損させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
［１３］ ［１］〜［１２］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１４］ 外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、［１３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１５］ ［１３］又は［１４］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
［１６］ ［１］〜［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を評価する方法であって、
（ｉ） 前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及び
（ｉｉ） 癌細胞及び正常細胞におけるマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程
を含み、前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると判断する方法。
［１７］ マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を評価する、［１６］の方法。
本発明のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、特定のマイクロＲＮＡの発現程度により、増殖が制御される。該特定のマイクロＲＮＡの発現が増大している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるため増殖できず、一方、マイクロＲＮＡの発現が低下している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が誘導され、ウイルスが増殖しその細胞を傷害する。従って、特定のマイクロＲＮＡとして癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているものを選択することにより、癌細胞中でワクシニアウイルスが効率良く増殖し、強力な抗腫瘍効果を発揮する。従って、あらかじめ個々の癌患者検体におけるマイクロＲＮＡ発現を調べ、癌組織におけるマイクロＲＮＡを解析することにより、適切なマイクロＲＮＡを選択することができ、癌細胞のみを攻撃するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを選択できるオーダーメイド創薬となり得る。
また、本発明においては高い安全性が確立しているワクシニアウイルス株であるＬＣ１６ｍ８Δワクチン株等をベースにすることにより、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖破壊するマイクロＲＮＡ制御組換えウイルスを提供することができる。
さらに、ワクシニアウイルスは、広い宿主域と高い発現効率を有しているため、他の外来遺伝子を導入するベクターとしても機能する。ルシフェラーゼやＧＦＰを発現するマイクロＲＮＡ制御組換えワクシニアウイルスは、その感染細胞を簡便、迅速に同定することが可能となる。また、細胞毒性効果や免疫賦活効果を有する治療遺伝子を発現させることによって、他の治療法との併用も可能となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０９０６６２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、ヒトＢｘＰＣ−３膵癌腹膜播種マウスモデルにおける弱毒化ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を示す写真である。
図２は、ヒトＢｘＰＣ−３膵癌腹膜播種マウスモデルにおける弱毒化ワクシニアウイルス病原性を示す図である（†：死亡）。図２ＡはＭｏｃｋの結果、図２ＢはＬＣ１６ｍＯの結果、図２ＣはＬＣ１６ｍ８Δの結果を示す。
図３は、組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスのゲノムの構造を示す図である。
図４は、ヒト癌細胞における組換えＢ５Ｒ遺伝子欠失ウイルスと組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
図５は、癌マイクロＲＮＡの特性を利用した癌特異的ウイルス療法開発の新戦略を示す図である。
図６は、ヒト癌細胞におけるｌｅｔ７ａの相対的発現レベルを示す図である。
図７は、組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
図８は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのＢ５Ｒ発現と細胞変性効果を示す写真である。
図９は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの増殖性を示す図である。
図１０は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルのゲノム構造を示す図である。
図１１は、癌細胞における組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
図１２Ａは、ＳＣＩＤマウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
図１２Ｂは、ＳＣＩＤマウスにおける増殖ウイルスの数値化の結果を示す図である。
図１３Ａは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
図１３Ｂは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１４Ａは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
図１４Ｂは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１５は、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布及び抗腫瘍効果を示す図である。
図１６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
図１７は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１８は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
図１９は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図２０は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
図２は、ヒトＢｘＰＣ−３膵癌腹膜播種マウスモデルにおける弱毒化ワクシニアウイルス病原性を示す図である（†：死亡）。図２ＡはＭｏｃｋの結果、図２ＢはＬＣ１６ｍＯの結果、図２ＣはＬＣ１６ｍ８Δの結果を示す。
図３は、組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスのゲノムの構造を示す図である。
図４は、ヒト癌細胞における組換えＢ５Ｒ遺伝子欠失ウイルスと組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
図５は、癌マイクロＲＮＡの特性を利用した癌特異的ウイルス療法開発の新戦略を示す図である。
図６は、ヒト癌細胞におけるｌｅｔ７ａの相対的発現レベルを示す図である。
図７は、組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
図８は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのＢ５Ｒ発現と細胞変性効果を示す写真である。
図９は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの増殖性を示す図である。
図１０は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルのゲノム構造を示す図である。
図１１は、癌細胞における組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
図１２Ａは、ＳＣＩＤマウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
図１２Ｂは、ＳＣＩＤマウスにおける増殖ウイルスの数値化の結果を示す図である。
図１３Ａは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
図１３Ｂは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１４Ａは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
図１４Ｂは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１５は、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布及び抗腫瘍効果を示す図である。
図１６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
図１７は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図１８は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
図１９は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
図２０は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株、リスター株から確立されたＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（橋爪 壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５等）、ＮＹＢＨ株等の株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株等が挙げられる。ＬＣ１６ｍＯ株は、Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６株を経て作出された株であり、ＬＣ１６ｍ８株は、さらにＬＣ１６ｍＯ株から作出された株である（蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４８ Ｎｏ．１２（２００３），ｐ．１６９３−１７００）。
ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。Ｂ５Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、Ｂ５Ｒ遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。Ｂ５Ｒ遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のＬＣ１６ｍ８株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させて確立されたｍ８Δ株（ＬＣ１６ｍ８Δ株とも呼ぶ）、が挙げられる。また、ＬＣ１６ｍＯ株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失して確立されたｍＯΔ株（ＬＣｍＯΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第ＷＯ２００５／０５４４５１号国際公開パンフレットに記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、Ｂ５Ｒタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、ＲＫ１３細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
本発明において用いるワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子を癌細胞中で発現させ、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なＢ５Ｒ遺伝子を保持している必要性がある。上記のようにＢ５Ｒ遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なＢ５Ｒ遺伝子を導入する。Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、非翻訳領域特に３’非翻訳領域を含むＢ５Ｒ遺伝子を挿入して、本発明のワクシニアウイルス製造の材料として用いればよい。Ｂ５Ｒ遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のＢ５Ｒ遺伝子を挿入する位置は、もともとＢ５Ｒ遺伝子が存在していたＢ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、３’非翻訳領域に標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子をＤＮＡコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。配列番号８７にワクシニアウイルスゲノムのＢ４Ｒ遺伝子、Ｂ５Ｒ遺伝子及びＢ６Ｒ遺伝子配列を含む部分の配列を示す。配列番号８７の１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質をコードするｏｒｆ部分を示し、この停止コドンの下流に３’非翻訳領域が存在する。
相同組換えとは、細胞内で２つのＤＮＡ分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムＤＮＡを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、Ｂ５Ｒ遺伝子を連結したプラスミド（これをトランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスＤＮＡとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたＢ５Ｒ遺伝子がウイルスゲノム中に組み込まれる。このとき用いる細胞としては、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１９〜２３塩基からなる低分子ＲＮＡであり、多くの場合、特定の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域に存在する標的部位に結合し、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又はそのｍＲＮＡを分解することによりタンパク質の発現を抑制する。この際、標的部位の標的配列は、ｍｉＲＮＡの配列と完全に又は部分的に相補的な配列を含んでいるので、ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、特定の遺伝子の発現を制御する。
本発明においては、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用する。用いるワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡの標的配列を挿入する。正常細胞では前記ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるので、ワクシニアウイルスは正常細胞には病原性を示さない。一方、癌細胞においては前記ｍｉＲＮＡの発現が低下しているので、標的配列にｍｉＲＮＡが結合せず、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現は抑制されず、産生される。このため、癌細胞においては、Ｂ５Ｒタンパク質が正常に機能し、ワクシニアウイルスが癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し傷害をもたらす。すなわち、本発明のワクシニアウイルスは癌細胞特異的な腫瘍溶解性を有する。
正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡは限定されず、現在知られているｍｉＲＮＡも今後見いだされるであろうｍｉＲＮＡもすべて包含する。ｍｉＲＮＡの配列や由来は、ｍｉＲＮＡに関するデータベース、例えばｍｉＲＢａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を検索して確認することができる。また、実験医学、Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．８（５月号）２００９，ｐ．１１８８−１１９３及びｐ．１２１８−１２２２；Ｙｏｎｇ Ｓｕｎ Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｎｉｎｄｙａ Ｄｕｔｔａ，″ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ″，Ａｎｕｎ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｃｈ，ＤＩｓ，２００９．４：１９９−２２７；Ｃａｒｌｏ Ｍ．Ｃｒｏｃｅ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００９，７０４−７１４等に記載の癌細胞でダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することができる。
正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているヒト由来のｍｉＲＮＡの例として、以下のものが挙げられ、ｍｉＲＮＡ名及び各ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡの配列を示す。下記の配列は５’→３’で示してある。
ｌｅｔ−７ａ
ｌｅｔ−７ｂ
ｌｅｔ−７ｃ
ｌｅｔ−７ｄ
ｌｅｔ−７ｅ
ｌｅｔ−７ｆ
ｍｉＲ−９
ｍｉＲ−１５ａ
ｍｉＲ−１６−１
ｍｉＲ−２１
ｍｉＲ−２０ａ
ｍｉＲ−２６ａ
ｍｉＲ−２７ｂ
ｍｉＲ−２９ａ
ｍｉＲ−２９ｂ
ｍｉＲ−２９ｃ
ｍｉＲ−３０ａ
ｍｉＲ−３０ｄ
ｍｉＲ−３２
ｍｉＲ−３３ａ
ｍｉＲ−３４ａ
ｍｉＲ−９２ａ
ｍｉＲ−９５
ｍｉＲ−１０１
ｍｉＲ−１２２
ｍｉＲ−１２４
ｍｉＲ−１２５ａ
ｍｉＲ−１２５ｂ
ｍｉＲ−１２６
ｍｉＲ−１２７
ｍｉＲ−１２８
ｍｉＲ−１３３ｂ
ｍｉＲ−１３９−５ｐ
ｍｉＲ−１４０
ｍｉＲ−１４１
ｍｉＲ−１４２
ｍｉＲ−１４３
ｍｉＲ−１４４
ｍｉＲ−１４５
ｍｉＲ−１５５
ｍｉＲ−１８１ａ
ｍｉＲ−１８１ｂ
ｍｉＲ−１８１ｃ
ｍｉＲ−１９２
ｍｉＲ−１９５
ｍｉＲ−１９８
ｍｉＲ−１９９ａ
ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ
ｍｉＲ−２００ａ
ｍｉＲ−２０３
ｍｉＲ−２０４
ｍｉＲ−２０５
ｍｉＲ−２１７
ｍｉＲ−２１８
ｍｉＲ−２１９−５ｐ
ｍｉＲ−２２０ａ
ｍｉＲ−２２０ｂ
ｍｉＲ−２２０ｃ
ｍｉＲ−２２２
ｍｉＲ−２２３
ｍｉＲ−２２４
ｍｉＲ−３４５
ｍｉＲ−３７５
また、癌の種類により、発現が低下しているｍｉＲＮＡに違いがあり、例えば、脳腫瘍ではｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１８１等、乳癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ−２０４等、肺癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２９ｂ，ｍｉＲ３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−９５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４０，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９８，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−１９９ｂ，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−２２０，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、食道癌ではｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、胃癌ではｌｅｔ−７等、結腸直腸癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−３４，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３３ｂ，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、肝細胞癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ１２２，ｍｉＲ１２５ａ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ２００ａ等、膵臓癌ではｍｉＲ−１３９，ｍｉＲ−１４２，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３７５等、前立腺癌ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２１８等、子宮頸癌ではｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、Ｂ−ＣＣＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−２２０等の発現が正常細胞に比べて低下している。従って、本発明のワクシニアウイルスを特定の癌種の治療に用いる場合は、上記の特定の癌種で特に発現がダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを用いることもできる。ただし、必ずしも各々のｍｉＲＮＡが上記の特定の癌のみにおいてダウンレギュレートされているのではなく、程度の差こそあれ、あるｍｉＲＮＡは種々の癌種の細胞でダウンレギュレートされている。従って、いずれのｍｉＲＮＡも癌種を問わずに癌の治療に利用することができる。
上記のｍｉＲＮＡの中でも、ｌｅｔ−７ａは、肺癌、膵臓癌、メラノーマなどの臨床検体で発現が低下しており、現行の治療法に極めて高い抵抗性を示す難治性悪性腫瘍に対する新規治療法の確立に貢献する点で好ましい。また、正常細胞に比べて癌細胞での発現低下が著しいｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５などのｍｉＲＮＡも好適に利用することができる。
ｍｉＲＮＡは３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの配列と部分的に又は完全に相補的な配列を含むｍＲＮＡに結合して、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害、又はｍＲＮＡを分解することによって、特定の遺伝子発現を抑制する。従って、本発明においては、上記ｍｉＲＮＡの標的配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡの結合部位として挿入する。挿入する位置は限定されず、３’非翻訳領域の両末端を含む３’末端領域中ならばどの部位でもよく、例えば、Ｂ５Ｒタンパク質のｏｒｆの停止コドンの直後に挿入すればよい。配列番号８７に示す塩基配列中、１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質のｏｒｆをコードする塩基配列であり、ｍｉＲＮＡの標的配列をｏｒｆの停止コドンより後の部分に挿入すればよい。
標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列の一部配列又は全配列に対する相補配列からなり、塩基長は７〜２５塩基長、好ましくは１５〜２５塩基長、さらに好ましくは１９〜２３塩基長である。好ましくは、各々のｍｉＲＮＡ配列に対して完全相補配列からなる。但し、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする限り、１〜数個、例えば、１〜３個、１若しくは２個、あるいは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のワクシニアウイルスを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のワクシニアウイルスを試薬としてｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２〜１６時間でのハイブリダイズ条件が挙げられる。また、本発明のｍｉＲＮＡの完全相補配列と標的配列は、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値で９５％以上、好ましくは９６、９７、９８又は９９％以上の配列同一性を有する。また、完全相補配列の一端又は両端に１〜数個、例えば、１〜３個、１若しくは２個、あるいは１個の塩基が付加されていてもよい。
ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡに結合するので、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入する標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列に対して逆相補の関係にあるチミン（Ｔ）を含むＤＮＡ配列であり、逆相補の関係にあるＤＮＡ配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すればよい。例えば、ｍｉＲＮＡとして５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’（配列番号１）であるｌｅｔ−７ａを利用する場合、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号６４）からなる標的配列を挿入すればよい。当業者ならば、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すべき結合部位の配列を適宜設定することができる。
標的配列は、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に少なくとも１つあればよい。また、複数の標的配列の繰り返し配列であってもよい。複数の繰り返し配列である場合、繰り返しの数は、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜４個である。さらに、同一のｍｉＲＮＡに対する標的配列ばかりでなく、異なるｍｉＲＮＡに対する複数の標的配列が挿入されていてもよい。この際、ｍｉＲＮＡ配列と配列の間には、スペーサー配列を挿入してもよい、スペーサー配列の長さ、塩基は限定されないが、例えば、３〜１０塩基、好ましくは３〜５塩基長の塩基配列を挿入すればよい。
本発明は、癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用するが、患者によって、特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。また、癌種によっても特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。あらかじめ、患者ごとに癌細胞で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択し、或いは特定の癌種で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することにより、患者ごとに、又は癌種ごとにより特異的に効果的な治療を行うことが可能である。
本発明の、Ｂ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの標的配列を結合部位として含むワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス又はｍｉＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスと呼ぶ。
本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌治療のために用いることができる。すなわち、本発明はｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用の医薬組成物を包含する。
対象とする癌は限定されず、例えば発生臓器別に分類した場合、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種が対象となる。
本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約１０２〜１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０５〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。
さらに、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするＤＮＡが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。本発明において、これらの外来遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターということもできる。
これらのマーカー遺伝子をＢ５Ｒ遺伝子のプロモーターの制御下に挿入した場合、すなわちＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子として挿入したｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、ｍｉＲＮＡ制御の評価のために用いることができる。すなわち、特定のｍｉＲＮＡの標的配列を挿入し、特定の癌細胞に感染させる。用いたｍｉＲＮＡがワクシニアウイルスの増殖制御に有効な場合、すなわち、用いたｍｉＲＮＡが癌細胞において発現が低下している場合、前記癌細胞中でＢ５Ｒ遺伝子と共にマーカー遺伝子が発現するので、蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子産物が細胞中で産生される。マーカーを測定することにより用いたｍｉＲＮＡの有効性を評価することが可能になる。本発明は、マーカー遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを用いてｍｉＲＮＡを評価する系及び評価する方法を包含する。例えば、特定の癌患者に適したｍｉＲＮＡを選択しようとする場合、該患者から癌細胞及び正常細胞を採取し、両細胞に、それぞれ種々のｍｉＲＮＡの標的配列を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを感染させ、ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しなくなるｍｉＲＮＡを選択すればよい。
治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子等が挙げられる。
外来遺伝子（外来ＤＮＡ）としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするＤＮＡを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ＝サーズ）ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のＤＮＡ配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。トランスファーベクターとして、例えばｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、ｐＭＭ４、ｐＧＳ２０、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐ２００１、ｐＢＣＢ０１−３，０６、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１−３ｓ、ｐＴＭ１、ｐＴＭ３、ｐＰＲ３４，３５、ｐｇｐｔ−ＡＴＡ１８−２、ｐＨＥＳ１−３等を用いることができる。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。あるいは、例えば、癌細胞においては、外来遺伝子の挿入により機能が欠損した場合であっても、癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子や特定の領域中に挿入しても良い。この場合、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中では増殖することができ、ｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。このような遺伝子として、例えば赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；Ｆフラグメント；Ｆ３遺伝子；ＶＧＦ遺伝子（米国特許出願公開第２００３／００３１６８１号明細書）；出血領域又はＡ型封入体領域（米国特許第６，５９６，２７９号明細書）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｆ、Ｆ１３Ｌ若しくはＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域（米国特許第６，５４８，０６８号明細書）；Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ若しくはＡ３６Ｒ遺伝子（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：１２２６６−１２２７５（２００３））；ＳａｌＦ７Ｌ遺伝子（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２ １１：１９７３−１９８０）；Ｎ１Ｌ遺伝子（Ｋｏｔｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８９ １７１：５７９−５８）；Ｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０ １７４：６２５−６２９）；ＨＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫＦ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＮＭ、ＲＲ若しくはＢａｍＦ領域（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９２ ６６：２６１７−２６３０）；Ｃ２１Ｌ遺伝子（Ｉｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２ ８９：６２８−６３２）等が挙げられる。これらの遺伝子の中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。例えば、ＴＫ遺伝子が機能を失うと、正常細胞におけるワクシニアウイルスの増殖能が低下する。一方、癌細胞にはこの遺伝子の機能を補う酵素が豊富に存在するため癌細胞では増殖能は低下しない。正常細胞において増殖能が低下することは正常細胞に対する病原性が低下することを意味し、すなわち、生体に適用した場合の安全性が向上する。ワクシニアウイルスを感染させる細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞等、ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。
また、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスにおいて上記の癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の機能を失わせてもよい。このような遺伝子の正常な機能を失わせることにより、ｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中で増殖しｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。ここで、遺伝子の正常な機能を失わせるとは、該遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質が正常な機能を保持していないことをいい、遺伝子を欠損させるともいう。遺伝子の正常な機能を失わせるためには、上記のように該遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよく、また、遺伝子を部分的に欠失させても、完全に欠失させてもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失は例えば相同組換えにより行うことができる。癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子としては、上記の遺伝子が挙げられ、この中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。これらの遺伝子の１つ又は複数を欠損させればよい。この中でもＴＫ遺伝子を欠損させた場合、正常組織におけるウイルス増殖が抑制され、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数が高まり、好ましい。さらに、ＴＫ遺伝子に加えてＨＡ遺伝子及びＦフラグメントを欠損させてもよく、あるいはＴＫ遺伝子に加えてＶＧＦ遺伝子を欠損させてもよい。
また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 遺伝子導入＆発現解析実験法 斎藤泉他編集、羊土社（１９９７年９月１日発行）、あるいは、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進 監訳ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−（第２版）ＴａＫａＲａ、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８７年 ６巻 ｐ．３３７９−３３８４等の記載に従えばよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例１ 弱毒化ワクシニアウイルスの抗癌効果（腫瘍溶解性）と安全性
ルシフェラーゼを恒常的に発現するヒト膵癌ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞（５×１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、腹膜播種マウスモデルを作成した。ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与４日目に、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を１０μＬ／ｇで腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与し、癌細胞で発現するルシフェラーゼによる発光をＩＶＩＳＴＭ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）によって非侵襲的にモニターした（図１；治療前）。次に、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与７日目に、１０７プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ；ｐｆｕ）のＬＣ１６ｍＯ株（Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６ｍ８株を分離する過程の中間株であり、特徴的性質としては中枢神経病原性が減弱している）、またはＬＣ１６ｍ８Δ（ＬＣ１６ｍ８株の遺伝的安定性を向上させた組換えウイルスであり、ワクチンとして副作用無くヒトに使用された実績を持つＣ１６ｍ８株と同様の特性を示す）を腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与した。ウイルスによる抗癌効果を判定するため、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与１８日目、及び２９日目に、マウス体内の癌細胞を上述のようにモニターした（図１；治療後）。その結果、ウイルスを投与していない模擬対照群（Ｍｏｃｋ）では、時間経過に伴って移植した癌細胞の増殖が確認された。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ投与群では、強力な抗腫瘍効果を示した。ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では、一時的に抗腫瘍効果を示したが、２９日目では移植した癌細胞の再増殖が確認された。同時に、治療に伴うウイルスによる副作用を投与後の体重変化により評価した結果、ＬＣ１６ｍＯ投与マウスは全身でのウイルス増殖による発痘を伴う急激な体重減少によって、全てのマウスが２１日から２８日目の間に死亡した。その一方、ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では模擬対照群と同様に全く副作用は見られなかった（図２）。以上より、ＬＣ１６ｍ８Δは非常に安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスになり得るが、それ自体の抗癌効果は完全に癌細胞を死滅させるには不十分であると示唆された。
参考例２ ヒト腫瘍細胞における弱毒化ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ発現とウイルス増殖性
ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ＴＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号６５）と５’−ＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣ−３’（配列番号６６）によって、Ｂ４ＲからＢ５Ｒ、そしてＢ６Ｒまでの遺伝子領域を増幅し、ＴＡベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＢ５Ｒを構築した。
組換えウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ（図３）の回収のため、６ｗｅｌｌディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍ８Δ）をＭＯＩ＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＢ５Ｒ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２〜５日間培養した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったＲＫ１３細胞に適当に希釈して接種し、０．８％メチルセルロースを含むＥａｇｌｅ ＭＥＭ，５％ＦＢＳ培地を加え、３７℃で２〜５日間培養した。培地を除き、ラージプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浮遊させた。ＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その２００μＬを１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、沈査に５０μＬの滅菌蒸留水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）を添加した。３０秒間ソニケーション後、９５℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。２つのプライマー５’−ｃｇｔａｔａａｔａｃｇｔｔｇｇｔｃｔａｔ−３’（配列番号６７）と５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｃａａｔａｇｔａｇｔｔａ−３’（配列番号６８）によってＰＣＲを行い、所定の大きさのＰＣＲプロダクトが検出されたクローンについて、ＰＣＲプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
図３に示すウイルスゲノムを持つ各ウイルスの腫瘍溶解性を検討するため、９６ｗｅｌｌで培養したヒト癌細胞株（肺癌Ａ５４９細胞、膵癌ＢｘＰＣ−３・ＰａｎｃＩ細胞、結腸癌Ｃａｃｏ−２細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、咽頭癌ＨＥｐ−２細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞）にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ｒ）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、そのマニュアルに従い生細胞数を測定した（図４）。その結果、Ｂ５Ｒを発現するＬＣ１６ｍＯ株と組換えＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒは、全ての癌細胞に対して同等の腫瘍溶解性を示し、模擬対照群の生細胞数を１００％とした時、約６０〜９５％の細胞を死滅させた。一方、Ｂ５Ｒを発現しないＬＣ１６ｍ８Δは、一部の細胞株で腫瘍溶解性を示したが、０〜５０％の細胞を死滅させるにとどまった。これらの結果より、ワクシニアウイルスが腫瘍細胞に感染後、増殖しながら死滅させるという腫瘍溶解性は、Ｂ５Ｒの発現によって劇的に増強されることが示された。
本発明のワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株、リスター株から確立されたＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（橋爪 壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５等）、ＮＹＢＨ株等の株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株等が挙げられる。ＬＣ１６ｍＯ株は、Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６株を経て作出された株であり、ＬＣ１６ｍ８株は、さらにＬＣ１６ｍＯ株から作出された株である（蛋白質 核酸 酵素 Ｖｏｌ．４８ Ｎｏ．１２（２００３），ｐ．１６９３−１７００）。
ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。Ｂ５Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、Ｂ５Ｒ遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。Ｂ５Ｒ遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のＬＣ１６ｍ８株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させて確立されたｍ８Δ株（ＬＣ１６ｍ８Δ株とも呼ぶ）、が挙げられる。また、ＬＣ１６ｍＯ株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失して確立されたｍＯΔ株（ＬＣｍＯΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第ＷＯ２００５／０５４４５１号国際公開パンフレットに記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、Ｂ５Ｒタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、ＲＫ１３細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
本発明において用いるワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子を癌細胞中で発現させ、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なＢ５Ｒ遺伝子を保持している必要性がある。上記のようにＢ５Ｒ遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なＢ５Ｒ遺伝子を導入する。Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、非翻訳領域特に３’非翻訳領域を含むＢ５Ｒ遺伝子を挿入して、本発明のワクシニアウイルス製造の材料として用いればよい。Ｂ５Ｒ遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のＢ５Ｒ遺伝子を挿入する位置は、もともとＢ５Ｒ遺伝子が存在していたＢ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、３’非翻訳領域に標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子をＤＮＡコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。配列番号８７にワクシニアウイルスゲノムのＢ４Ｒ遺伝子、Ｂ５Ｒ遺伝子及びＢ６Ｒ遺伝子配列を含む部分の配列を示す。配列番号８７の１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質をコードするｏｒｆ部分を示し、この停止コドンの下流に３’非翻訳領域が存在する。
相同組換えとは、細胞内で２つのＤＮＡ分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムＤＮＡを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、Ｂ５Ｒ遺伝子を連結したプラスミド（これをトランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスＤＮＡとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたＢ５Ｒ遺伝子がウイルスゲノム中に組み込まれる。このとき用いる細胞としては、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１９〜２３塩基からなる低分子ＲＮＡであり、多くの場合、特定の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域に存在する標的部位に結合し、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又はそのｍＲＮＡを分解することによりタンパク質の発現を抑制する。この際、標的部位の標的配列は、ｍｉＲＮＡの配列と完全に又は部分的に相補的な配列を含んでいるので、ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、特定の遺伝子の発現を制御する。
本発明においては、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用する。用いるワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡの標的配列を挿入する。正常細胞では前記ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるので、ワクシニアウイルスは正常細胞には病原性を示さない。一方、癌細胞においては前記ｍｉＲＮＡの発現が低下しているので、標的配列にｍｉＲＮＡが結合せず、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現は抑制されず、産生される。このため、癌細胞においては、Ｂ５Ｒタンパク質が正常に機能し、ワクシニアウイルスが癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し傷害をもたらす。すなわち、本発明のワクシニアウイルスは癌細胞特異的な腫瘍溶解性を有する。
正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡは限定されず、現在知られているｍｉＲＮＡも今後見いだされるであろうｍｉＲＮＡもすべて包含する。ｍｉＲＮＡの配列や由来は、ｍｉＲＮＡに関するデータベース、例えばｍｉＲＢａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を検索して確認することができる。また、実験医学、Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．８（５月号）２００９，ｐ．１１８８−１１９３及びｐ．１２１８−１２２２；Ｙｏｎｇ Ｓｕｎ Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｎｉｎｄｙａ Ｄｕｔｔａ，″ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ″，Ａｎｕｎ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｃｈ，ＤＩｓ，２００９．４：１９９−２２７；Ｃａｒｌｏ Ｍ．Ｃｒｏｃｅ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００９，７０４−７１４等に記載の癌細胞でダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することができる。
正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているヒト由来のｍｉＲＮＡの例として、以下のものが挙げられ、ｍｉＲＮＡ名及び各ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡの配列を示す。下記の配列は５’→３’で示してある。
ｌｅｔ−７ａ
ｌｅｔ−７ｂ
ｌｅｔ−７ｃ
ｌｅｔ−７ｄ
ｌｅｔ−７ｅ
ｌｅｔ−７ｆ
ｍｉＲ−９
ｍｉＲ−１５ａ
ｍｉＲ−１６−１
ｍｉＲ−２１
ｍｉＲ−２０ａ
ｍｉＲ−２６ａ
ｍｉＲ−２７ｂ
ｍｉＲ−２９ａ
ｍｉＲ−２９ｂ
ｍｉＲ−２９ｃ
ｍｉＲ−３０ａ
ｍｉＲ−３０ｄ
ｍｉＲ−３２
ｍｉＲ−３３ａ
ｍｉＲ−３４ａ
ｍｉＲ−９２ａ
ｍｉＲ−９５
ｍｉＲ−１０１
ｍｉＲ−１２２
ｍｉＲ−１２４
ｍｉＲ−１２５ａ
ｍｉＲ−１２５ｂ
ｍｉＲ−１２６
ｍｉＲ−１２７
ｍｉＲ−１２８
ｍｉＲ−１３３ｂ
ｍｉＲ−１３９−５ｐ
ｍｉＲ−１４０
ｍｉＲ−１４１
ｍｉＲ−１４２
ｍｉＲ−１４３
ｍｉＲ−１４４
ｍｉＲ−１４５
ｍｉＲ−１５５
ｍｉＲ−１８１ａ
ｍｉＲ−１８１ｂ
ｍｉＲ−１８１ｃ
ｍｉＲ−１９２
ｍｉＲ−１９５
ｍｉＲ−１９８
ｍｉＲ−１９９ａ
ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ
ｍｉＲ−２００ａ
ｍｉＲ−２０３
ｍｉＲ−２０４
ｍｉＲ−２０５
ｍｉＲ−２１７
ｍｉＲ−２１８
ｍｉＲ−２１９−５ｐ
ｍｉＲ−２２０ａ
ｍｉＲ−２２０ｂ
ｍｉＲ−２２０ｃ
ｍｉＲ−２２２
ｍｉＲ−２２３
ｍｉＲ−２２４
ｍｉＲ−３４５
ｍｉＲ−３７５
また、癌の種類により、発現が低下しているｍｉＲＮＡに違いがあり、例えば、脳腫瘍ではｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１８１等、乳癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ−２０４等、肺癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２９ｂ，ｍｉＲ３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−９５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４０，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９８，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−１９９ｂ，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−２２０，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、食道癌ではｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、胃癌ではｌｅｔ−７等、結腸直腸癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−３４，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３３ｂ，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、肝細胞癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ１２２，ｍｉＲ１２５ａ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ２００ａ等、膵臓癌ではｍｉＲ−１３９，ｍｉＲ−１４２，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３７５等、前立腺癌ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２１８等、子宮頸癌ではｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、Ｂ−ＣＣＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−２２０等の発現が正常細胞に比べて低下している。従って、本発明のワクシニアウイルスを特定の癌種の治療に用いる場合は、上記の特定の癌種で特に発現がダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを用いることもできる。ただし、必ずしも各々のｍｉＲＮＡが上記の特定の癌のみにおいてダウンレギュレートされているのではなく、程度の差こそあれ、あるｍｉＲＮＡは種々の癌種の細胞でダウンレギュレートされている。従って、いずれのｍｉＲＮＡも癌種を問わずに癌の治療に利用することができる。
上記のｍｉＲＮＡの中でも、ｌｅｔ−７ａは、肺癌、膵臓癌、メラノーマなどの臨床検体で発現が低下しており、現行の治療法に極めて高い抵抗性を示す難治性悪性腫瘍に対する新規治療法の確立に貢献する点で好ましい。また、正常細胞に比べて癌細胞での発現低下が著しいｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５などのｍｉＲＮＡも好適に利用することができる。
ｍｉＲＮＡは３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの配列と部分的に又は完全に相補的な配列を含むｍＲＮＡに結合して、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害、又はｍＲＮＡを分解することによって、特定の遺伝子発現を抑制する。従って、本発明においては、上記ｍｉＲＮＡの標的配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡの結合部位として挿入する。挿入する位置は限定されず、３’非翻訳領域の両末端を含む３’末端領域中ならばどの部位でもよく、例えば、Ｂ５Ｒタンパク質のｏｒｆの停止コドンの直後に挿入すればよい。配列番号８７に示す塩基配列中、１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質のｏｒｆをコードする塩基配列であり、ｍｉＲＮＡの標的配列をｏｒｆの停止コドンより後の部分に挿入すればよい。
標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列の一部配列又は全配列に対する相補配列からなり、塩基長は７〜２５塩基長、好ましくは１５〜２５塩基長、さらに好ましくは１９〜２３塩基長である。好ましくは、各々のｍｉＲＮＡ配列に対して完全相補配列からなる。但し、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする限り、１〜数個、例えば、１〜３個、１若しくは２個、あるいは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のワクシニアウイルスを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のワクシニアウイルスを試薬としてｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２〜１６時間でのハイブリダイズ条件が挙げられる。また、本発明のｍｉＲＮＡの完全相補配列と標的配列は、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値で９５％以上、好ましくは９６、９７、９８又は９９％以上の配列同一性を有する。また、完全相補配列の一端又は両端に１〜数個、例えば、１〜３個、１若しくは２個、あるいは１個の塩基が付加されていてもよい。
ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡに結合するので、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入する標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列に対して逆相補の関係にあるチミン（Ｔ）を含むＤＮＡ配列であり、逆相補の関係にあるＤＮＡ配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すればよい。例えば、ｍｉＲＮＡとして５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’（配列番号１）であるｌｅｔ−７ａを利用する場合、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号６４）からなる標的配列を挿入すればよい。当業者ならば、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すべき結合部位の配列を適宜設定することができる。
標的配列は、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に少なくとも１つあればよい。また、複数の標的配列の繰り返し配列であってもよい。複数の繰り返し配列である場合、繰り返しの数は、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜４個である。さらに、同一のｍｉＲＮＡに対する標的配列ばかりでなく、異なるｍｉＲＮＡに対する複数の標的配列が挿入されていてもよい。この際、ｍｉＲＮＡ配列と配列の間には、スペーサー配列を挿入してもよい、スペーサー配列の長さ、塩基は限定されないが、例えば、３〜１０塩基、好ましくは３〜５塩基長の塩基配列を挿入すればよい。
本発明は、癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用するが、患者によって、特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。また、癌種によっても特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。あらかじめ、患者ごとに癌細胞で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択し、或いは特定の癌種で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することにより、患者ごとに、又は癌種ごとにより特異的に効果的な治療を行うことが可能である。
本発明の、Ｂ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの標的配列を結合部位として含むワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス又はｍｉＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスと呼ぶ。
本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌治療のために用いることができる。すなわち、本発明はｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用の医薬組成物を包含する。
対象とする癌は限定されず、例えば発生臓器別に分類した場合、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種が対象となる。
本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約１０２〜１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０５〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。
さらに、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするＤＮＡが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。本発明において、これらの外来遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターということもできる。
これらのマーカー遺伝子をＢ５Ｒ遺伝子のプロモーターの制御下に挿入した場合、すなわちＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子として挿入したｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、ｍｉＲＮＡ制御の評価のために用いることができる。すなわち、特定のｍｉＲＮＡの標的配列を挿入し、特定の癌細胞に感染させる。用いたｍｉＲＮＡがワクシニアウイルスの増殖制御に有効な場合、すなわち、用いたｍｉＲＮＡが癌細胞において発現が低下している場合、前記癌細胞中でＢ５Ｒ遺伝子と共にマーカー遺伝子が発現するので、蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子産物が細胞中で産生される。マーカーを測定することにより用いたｍｉＲＮＡの有効性を評価することが可能になる。本発明は、マーカー遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを用いてｍｉＲＮＡを評価する系及び評価する方法を包含する。例えば、特定の癌患者に適したｍｉＲＮＡを選択しようとする場合、該患者から癌細胞及び正常細胞を採取し、両細胞に、それぞれ種々のｍｉＲＮＡの標的配列を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを感染させ、ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しなくなるｍｉＲＮＡを選択すればよい。
治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子等が挙げられる。
外来遺伝子（外来ＤＮＡ）としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするＤＮＡを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ＝サーズ）ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のＤＮＡ配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。トランスファーベクターとして、例えばｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、ｐＭＭ４、ｐＧＳ２０、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐ２００１、ｐＢＣＢ０１−３，０６、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１−３ｓ、ｐＴＭ１、ｐＴＭ３、ｐＰＲ３４，３５、ｐｇｐｔ−ＡＴＡ１８−２、ｐＨＥＳ１−３等を用いることができる。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。あるいは、例えば、癌細胞においては、外来遺伝子の挿入により機能が欠損した場合であっても、癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子や特定の領域中に挿入しても良い。この場合、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中では増殖することができ、ｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。このような遺伝子として、例えば赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；Ｆフラグメント；Ｆ３遺伝子；ＶＧＦ遺伝子（米国特許出願公開第２００３／００３１６８１号明細書）；出血領域又はＡ型封入体領域（米国特許第６，５９６，２７９号明細書）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｆ、Ｆ１３Ｌ若しくはＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域（米国特許第６，５４８，０６８号明細書）；Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ若しくはＡ３６Ｒ遺伝子（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：１２２６６−１２２７５（２００３））；ＳａｌＦ７Ｌ遺伝子（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２ １１：１９７３−１９８０）；Ｎ１Ｌ遺伝子（Ｋｏｔｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８９ １７１：５７９−５８）；Ｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０ １７４：６２５−６２９）；ＨＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫＦ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＮＭ、ＲＲ若しくはＢａｍＦ領域（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９２ ６６：２６１７−２６３０）；Ｃ２１Ｌ遺伝子（Ｉｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２ ８９：６２８−６３２）等が挙げられる。これらの遺伝子の中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。例えば、ＴＫ遺伝子が機能を失うと、正常細胞におけるワクシニアウイルスの増殖能が低下する。一方、癌細胞にはこの遺伝子の機能を補う酵素が豊富に存在するため癌細胞では増殖能は低下しない。正常細胞において増殖能が低下することは正常細胞に対する病原性が低下することを意味し、すなわち、生体に適用した場合の安全性が向上する。ワクシニアウイルスを感染させる細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞等、ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。
また、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスにおいて上記の癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の機能を失わせてもよい。このような遺伝子の正常な機能を失わせることにより、ｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中で増殖しｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。ここで、遺伝子の正常な機能を失わせるとは、該遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質が正常な機能を保持していないことをいい、遺伝子を欠損させるともいう。遺伝子の正常な機能を失わせるためには、上記のように該遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよく、また、遺伝子を部分的に欠失させても、完全に欠失させてもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失は例えば相同組換えにより行うことができる。癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子としては、上記の遺伝子が挙げられ、この中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。これらの遺伝子の１つ又は複数を欠損させればよい。この中でもＴＫ遺伝子を欠損させた場合、正常組織におけるウイルス増殖が抑制され、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数が高まり、好ましい。さらに、ＴＫ遺伝子に加えてＨＡ遺伝子及びＦフラグメントを欠損させてもよく、あるいはＴＫ遺伝子に加えてＶＧＦ遺伝子を欠損させてもよい。
また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 遺伝子導入＆発現解析実験法 斎藤泉他編集、羊土社（１９９７年９月１日発行）、あるいは、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進 監訳ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−（第２版）ＴａＫａＲａ、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８７年 ６巻 ｐ．３３７９−３３８４等の記載に従えばよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例１ 弱毒化ワクシニアウイルスの抗癌効果（腫瘍溶解性）と安全性
ルシフェラーゼを恒常的に発現するヒト膵癌ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞（５×１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、腹膜播種マウスモデルを作成した。ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与４日目に、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を１０μＬ／ｇで腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与し、癌細胞で発現するルシフェラーゼによる発光をＩＶＩＳＴＭ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）によって非侵襲的にモニターした（図１；治療前）。次に、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与７日目に、１０７プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ；ｐｆｕ）のＬＣ１６ｍＯ株（Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６ｍ８株を分離する過程の中間株であり、特徴的性質としては中枢神経病原性が減弱している）、またはＬＣ１６ｍ８Δ（ＬＣ１６ｍ８株の遺伝的安定性を向上させた組換えウイルスであり、ワクチンとして副作用無くヒトに使用された実績を持つＣ１６ｍ８株と同様の特性を示す）を腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与した。ウイルスによる抗癌効果を判定するため、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与１８日目、及び２９日目に、マウス体内の癌細胞を上述のようにモニターした（図１；治療後）。その結果、ウイルスを投与していない模擬対照群（Ｍｏｃｋ）では、時間経過に伴って移植した癌細胞の増殖が確認された。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ投与群では、強力な抗腫瘍効果を示した。ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では、一時的に抗腫瘍効果を示したが、２９日目では移植した癌細胞の再増殖が確認された。同時に、治療に伴うウイルスによる副作用を投与後の体重変化により評価した結果、ＬＣ１６ｍＯ投与マウスは全身でのウイルス増殖による発痘を伴う急激な体重減少によって、全てのマウスが２１日から２８日目の間に死亡した。その一方、ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では模擬対照群と同様に全く副作用は見られなかった（図２）。以上より、ＬＣ１６ｍ８Δは非常に安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスになり得るが、それ自体の抗癌効果は完全に癌細胞を死滅させるには不十分であると示唆された。
参考例２ ヒト腫瘍細胞における弱毒化ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ発現とウイルス増殖性
ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ＴＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号６５）と５’−ＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣ−３’（配列番号６６）によって、Ｂ４ＲからＢ５Ｒ、そしてＢ６Ｒまでの遺伝子領域を増幅し、ＴＡベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＢ５Ｒを構築した。
組換えウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ（図３）の回収のため、６ｗｅｌｌディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍ８Δ）をＭＯＩ＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＢ５Ｒ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２〜５日間培養した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったＲＫ１３細胞に適当に希釈して接種し、０．８％メチルセルロースを含むＥａｇｌｅ ＭＥＭ，５％ＦＢＳ培地を加え、３７℃で２〜５日間培養した。培地を除き、ラージプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浮遊させた。ＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その２００μＬを１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、沈査に５０μＬの滅菌蒸留水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）を添加した。３０秒間ソニケーション後、９５℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。２つのプライマー５’−ｃｇｔａｔａａｔａｃｇｔｔｇｇｔｃｔａｔ−３’（配列番号６７）と５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｃａａｔａｇｔａｇｔｔａ−３’（配列番号６８）によってＰＣＲを行い、所定の大きさのＰＣＲプロダクトが検出されたクローンについて、ＰＣＲプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
図３に示すウイルスゲノムを持つ各ウイルスの腫瘍溶解性を検討するため、９６ｗｅｌｌで培養したヒト癌細胞株（肺癌Ａ５４９細胞、膵癌ＢｘＰＣ−３・ＰａｎｃＩ細胞、結腸癌Ｃａｃｏ−２細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、咽頭癌ＨＥｐ−２細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞）にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ｒ）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、そのマニュアルに従い生細胞数を測定した（図４）。その結果、Ｂ５Ｒを発現するＬＣ１６ｍＯ株と組換えＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒは、全ての癌細胞に対して同等の腫瘍溶解性を示し、模擬対照群の生細胞数を１００％とした時、約６０〜９５％の細胞を死滅させた。一方、Ｂ５Ｒを発現しないＬＣ１６ｍ８Δは、一部の細胞株で腫瘍溶解性を示したが、０〜５０％の細胞を死滅させるにとどまった。これらの結果より、ワクシニアウイルスが腫瘍細胞に感染後、増殖しながら死滅させるという腫瘍溶解性は、Ｂ５Ｒの発現によって劇的に増強されることが示された。
癌細胞のみを特異的に破壊するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルス（図５）の構築
Ｂ５Ｒ遺伝子の３’ＵＴＲにＮｈｅＩとＡｇｅＩの制限酵素配列を挿入するため、ｐＢ５Ｒプラスミドを鋳型に各２つのプライマー５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＴ−３’（配列番号６９）と５’−ｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７０）、又は５’−ｃｃｇｃｔａｇｃａｃｃｇｇｔＡＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号７１）と５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７２））によって、２種類のＤＮＡ断片を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＨｉｎｄＩＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒを構築した。ｐＴＮ−Ｂ５Ｒプラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃａａａａｔａｔｔｔｔｃｇｔｔｇｃｇａａｇａ−３’（配列番号７３）と５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＣＴ−３’（配列番号７４）によって、終止コドンを除去したＢ５Ｒを増幅した。又、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡ−３’（配列番号７５）と５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（配列番号７６）によって、ＮｈｅＩ制限酵素配列を付加したＥＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）遺伝子を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｃｏＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩとＮｈｅＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐを構築した。２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｔａｇｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇａｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７７）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａｔｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇ−３’（配列番号７８））をアニールした。それを制限酵素ＮｈｅＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２を構築した。同様な方法で、変異を加えた２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入する場合は、５’−ｃｔａｇｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇａｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７９）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａｔｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇ−３’（配列番号８０）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔｘ２を構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｇｃｇｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｔｃａｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号８１）と５’−ｃｃｇｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇｔｇａＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａ−３’（配列番号８２））をアニールしたＤＮＡ断片を、制限酵素ＭｌｕＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２にクローニングし、４回繰り返してｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列をもつｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａを構築した。同様な方法で、変異を加えた標的配列を挿入する場合は、５’−ｃｇｃｇｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｔｃａｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡ−３’（配列番号８３）と５’−ｃｃｇｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇｔｇａＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａ−３’（配列番号８４）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔを構築した。
各組換えウイルス（図７）は、参考例２で記述した方法と同様に、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、またはｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔのトランスファーベクターを用いて作出し、ラージプラーク、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
Ｂ５Ｒ遺伝子の３’ＵＴＲにＮｈｅＩとＡｇｅＩの制限酵素配列を挿入するため、ｐＢ５Ｒプラスミドを鋳型に各２つのプライマー５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＴ−３’（配列番号６９）と５’−ｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７０）、又は５’−ｃｃｇｃｔａｇｃａｃｃｇｇｔＡＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号７１）と５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７２））によって、２種類のＤＮＡ断片を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＨｉｎｄＩＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒを構築した。ｐＴＮ−Ｂ５Ｒプラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃａａａａｔａｔｔｔｔｃｇｔｔｇｃｇａａｇａ−３’（配列番号７３）と５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＣＴ−３’（配列番号７４）によって、終止コドンを除去したＢ５Ｒを増幅した。又、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡ−３’（配列番号７５）と５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（配列番号７６）によって、ＮｈｅＩ制限酵素配列を付加したＥＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）遺伝子を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｃｏＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩとＮｈｅＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐを構築した。２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｔａｇｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇａｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７７）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａｔｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇ−３’（配列番号７８））をアニールした。それを制限酵素ＮｈｅＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２を構築した。同様な方法で、変異を加えた２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入する場合は、５’−ｃｔａｇｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇａｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７９）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａｔｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇ−３’（配列番号８０）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔｘ２を構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｇｃｇｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｔｃａｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号８１）と５’−ｃｃｇｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇｔｇａＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａ−３’（配列番号８２））をアニールしたＤＮＡ断片を、制限酵素ＭｌｕＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２にクローニングし、４回繰り返してｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列をもつｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａを構築した。同様な方法で、変異を加えた標的配列を挿入する場合は、５’−ｃｇｃｇｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｔｃａｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡ−３’（配列番号８３）と５’−ｃｃｇｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇｔｇａＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａ−３’（配列番号８４）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔを構築した。
各組換えウイルス（図７）は、参考例２で記述した方法と同様に、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、またはｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ ｍｕｔのトランスファーベクターを用いて作出し、ラージプラーク、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの迅速簡便な評価システムの確立
ヒト腫瘍細胞より、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従いｓｍａｌｌ ＲＮＡを含むトータルＲＮＡを回収した。１０ｎｇの各回収ＲＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従い各腫瘍細胞のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ；０００３７７）をＴａｑＭａｎ法で定量した。内在性コントロールには、ＲＮＵ６Ｂ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ；００１０９３）を使用した。ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの相対発現量は、ＨｅＬａ細胞を基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。その結果、ＨｅＬａ細胞に対して、Ａ５４９細胞では約６０％、ＢｘＰＣ−３細胞では約５０％、ＰａｎｃＩ細胞では約４５％の発現低下が観察された。一方、ＮＨＬＦ（正常ヒト肺線維芽細胞）では、Ｈｅｌａ細胞に対して、１．５倍の発現が観察された（図６）。
図７に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを２４ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．１で感染させ、３７℃で３日間培養後、蛍光顕微鏡（オリンパス）で生細胞のまま明視野観察と蛍光観察した。その結果、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が低下しているＡ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＰａｎｃＩ細胞では、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒ、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲにｌｅｔ７ａ標的配列、又はＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲに変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したいずれのウイルスでも、同程度の細胞変性が観察され、その変性細胞ではＥＧＦＰの発現が確認された。一方、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が高いＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａによる細胞変性、及びＥＧＦＰの発現が観察されなかった（図８）。さらに、それぞれの感染細胞を回収し、凍結融解後、ソニケーションし、遠心（２，０００ｒｐｍ、５分間）後の上清をウイルス液として回収した。各ウイルス液（１ｍｌ）のウイルス力価をＲＫ１３細胞にて測定した。その結果、Ａ５４９、ＰａｎｃＩ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ ｍｕｔは同等に増殖しており、それはＬＣ１６ｍ８Δよりも高く、ＬＣ１６ｍＯの増殖にほぼ匹敵していた。一方、ＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞において、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａの増殖はＬＣ１６ｍ８Δと同等で、他のウイルスに比べて劇的に低下していた（図９）。これらの結果より、マイクロＲＮＡ制御型ウイルスでは、細胞内のマイクロＲＮＡ制御機構による遺伝子発現調節と同調して、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、細胞変性と効率の良いウイルス増殖を示した。又、Ｂ５Ｒ遺伝子にＥＧＦＰ遺伝子を融合させて発現させることによって、蛍光顕微鏡下で生細胞のまま、容易にＢ５Ｒの発現を観察することが可能となり、ｌｅｔ７ａ以外の他のマイクロＲＮＡ制御型ウイルスの簡便迅速な評価系として有益となる。
ヒト腫瘍細胞より、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従いｓｍａｌｌ ＲＮＡを含むトータルＲＮＡを回収した。１０ｎｇの各回収ＲＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従い各腫瘍細胞のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ；０００３７７）をＴａｑＭａｎ法で定量した。内在性コントロールには、ＲＮＵ６Ｂ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＩＤ；００１０９３）を使用した。ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの相対発現量は、ＨｅＬａ細胞を基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。その結果、ＨｅＬａ細胞に対して、Ａ５４９細胞では約６０％、ＢｘＰＣ−３細胞では約５０％、ＰａｎｃＩ細胞では約４５％の発現低下が観察された。一方、ＮＨＬＦ（正常ヒト肺線維芽細胞）では、Ｈｅｌａ細胞に対して、１．５倍の発現が観察された（図６）。
図７に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを２４ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．１で感染させ、３７℃で３日間培養後、蛍光顕微鏡（オリンパス）で生細胞のまま明視野観察と蛍光観察した。その結果、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が低下しているＡ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＰａｎｃＩ細胞では、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒ、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲにｌｅｔ７ａ標的配列、又はＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲに変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したいずれのウイルスでも、同程度の細胞変性が観察され、その変性細胞ではＥＧＦＰの発現が確認された。一方、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が高いＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａによる細胞変性、及びＥＧＦＰの発現が観察されなかった（図８）。さらに、それぞれの感染細胞を回収し、凍結融解後、ソニケーションし、遠心（２，０００ｒｐｍ、５分間）後の上清をウイルス液として回収した。各ウイルス液（１ｍｌ）のウイルス力価をＲＫ１３細胞にて測定した。その結果、Ａ５４９、ＰａｎｃＩ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ ｍｕｔは同等に増殖しており、それはＬＣ１６ｍ８Δよりも高く、ＬＣ１６ｍＯの増殖にほぼ匹敵していた。一方、ＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞において、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａの増殖はＬＣ１６ｍ８Δと同等で、他のウイルスに比べて劇的に低下していた（図９）。これらの結果より、マイクロＲＮＡ制御型ウイルスでは、細胞内のマイクロＲＮＡ制御機構による遺伝子発現調節と同調して、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、細胞変性と効率の良いウイルス増殖を示した。又、Ｂ５Ｒ遺伝子にＥＧＦＰ遺伝子を融合させて発現させることによって、蛍光顕微鏡下で生細胞のまま、容易にＢ５Ｒの発現を観察することが可能となり、ｌｅｔ７ａ以外の他のマイクロＲＮＡ制御型ウイルスの簡便迅速な評価系として有益となる。
外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの構築
赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に挿入された２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）を発現する組換えウイルスを構築するため、ｐＧＬ４．２０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型に２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡ−３’（配列番号８５）と５’−ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号８６）によって、両末端にＳｆｉＩとＦｓｅＩ制限酵素配列を付加したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩとＦｓｅＩで切断し、ｐＶＮＣ１１０（Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９ １１；２７（７）：９６６−９７１）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃを構築した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドから制限酵素ＳｍａＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築した。そして、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰから制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ遺伝子断片を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでその両末端を平滑化した。この平滑化遺伝子断片を、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃの制限酵素ＦｓｅＩ処理後に平滑化した部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを構築した。
各組換えウイルス（図１０）は、参考例２で記述した方法と同様に、ＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８Δ、参考例２で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ、実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ）を感染させ、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを細胞に取り込ませることによって作出し、プラークの大きさ、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に挿入された２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）を発現する組換えウイルスを構築するため、ｐＧＬ４．２０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型に２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡ−３’（配列番号８５）と５’−ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号８６）によって、両末端にＳｆｉＩとＦｓｅＩ制限酵素配列を付加したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩとＦｓｅＩで切断し、ｐＶＮＣ１１０（Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９ １１；２７（７）：９６６−９７１）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃを構築した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドから制限酵素ＳｍａＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築した。そして、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰから制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ遺伝子断片を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでその両末端を平滑化した。この平滑化遺伝子断片を、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃの制限酵素ＦｓｅＩ処理後に平滑化した部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを構築した。
各組換えウイルス（図１０）は、参考例２で記述した方法と同様に、ＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８Δ、参考例２で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ、実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ）を感染させ、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを細胞に取り込ませることによって作出し、プラークの大きさ、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの特性
図１０に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを９６ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、参考例２で記述した方法によって生細胞数を測定した（図１１）。その結果、ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのｌｅｔ７ａ高発現Ｈｅｌａ細胞おける殺細胞効果は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８Δと同等で、Ｂ５Ｒを挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧや変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧと比較して顕著に低下した。それに対し、ｌｅｔ７ａの発現が低下しているＡ５４９、及びＢｘＰＣ−３細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧやＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧと同等で強力な殺細胞効果が見られた。以上より、外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスにおいても、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、効率の良いウイルス増殖による殺細胞効果を示した。
さらに、このマイクロＲＮＡ制御ウイルスが、マウス体内においても機能するかどうかを検討した。Ｌｅｔ７ａは、全てのマウス正常組織において高発現しているので、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧはマウス体内で増殖できないと予想される。１０７ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＳＣＩＤマウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、３日、９日、１６日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターし（図１２Ａ）、数値化した（図１２Ｂ）。その結果、ウイルス投与３日後では、全てのウイルス投与群において腹腔内での発現が確認され、それを数値化し２要因の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって統計解析したところ、全てのウイルス間で有意な差はなかった。それに対し投与９日、１６日後では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８△／ＬＧと同様に著しく低下していたが、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、時間経過に伴って投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られる発痘と一致していた（図１２Ａ）。同様の統計解析の結果、投与後１６日のＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのウイルス増殖は、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧに対して有意な差が確認されたが、ＬＣ１６ｍ８Δに対しては有意な差がなかった（図１２Ｂ）。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫欠損ＳＣＩＤマウスの正常組織においても、その増殖性が著しく低下することを確認した。
次に、１０８ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、１日、４日、１０日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターした（図１６）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後でさえ、腹腔内での発現はわずかであり、４日後には確認できなくなった。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後は腹腔内での強い発現が確認され、４日後には投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られた。但し、１０日後では、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧウイルス投与群においても、それらの発現はわずかになった。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫が機能するＣ５７ＢＬ／６マウスの正常組織においては、感染後２４時間以内に、その増殖性が極めて著しく低下し、体内から排除されることを確認した。
図１０に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを９６ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、参考例２で記述した方法によって生細胞数を測定した（図１１）。その結果、ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのｌｅｔ７ａ高発現Ｈｅｌａ細胞おける殺細胞効果は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８Δと同等で、Ｂ５Ｒを挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧや変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧと比較して顕著に低下した。それに対し、ｌｅｔ７ａの発現が低下しているＡ５４９、及びＢｘＰＣ−３細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧやＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧと同等で強力な殺細胞効果が見られた。以上より、外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスにおいても、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、効率の良いウイルス増殖による殺細胞効果を示した。
さらに、このマイクロＲＮＡ制御ウイルスが、マウス体内においても機能するかどうかを検討した。Ｌｅｔ７ａは、全てのマウス正常組織において高発現しているので、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧはマウス体内で増殖できないと予想される。１０７ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＳＣＩＤマウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、３日、９日、１６日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターし（図１２Ａ）、数値化した（図１２Ｂ）。その結果、ウイルス投与３日後では、全てのウイルス投与群において腹腔内での発現が確認され、それを数値化し２要因の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって統計解析したところ、全てのウイルス間で有意な差はなかった。それに対し投与９日、１６日後では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８△／ＬＧと同様に著しく低下していたが、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、時間経過に伴って投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られる発痘と一致していた（図１２Ａ）。同様の統計解析の結果、投与後１６日のＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのウイルス増殖は、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧに対して有意な差が確認されたが、ＬＣ１６ｍ８Δに対しては有意な差がなかった（図１２Ｂ）。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫欠損ＳＣＩＤマウスの正常組織においても、その増殖性が著しく低下することを確認した。
次に、１０８ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、１日、４日、１０日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターした（図１６）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後でさえ、腹腔内での発現はわずかであり、４日後には確認できなくなった。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後は腹腔内での強い発現が確認され、４日後には投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られた。但し、１０日後では、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧウイルス投与群においても、それらの発現はわずかになった。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫が機能するＣ５７ＢＬ／６マウスの正常組織においては、感染後２４時間以内に、その増殖性が極めて著しく低下し、体内から排除されることを確認した。
外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの抗癌効果と安全性
５ｘ１０６個のＢｘＰＣ３、又はＡ５４９を免疫不全ヌードマウスの右腹側の皮下に移植し、その腫瘍塊が約１００ｍｍ３（皮膚を介して腫瘍塊の長径Ｌと短径Ｗをノギスで測定し、腫瘍体積Ｖを計算式Ｖ＝ＬＷ２／２により算出した大きさ）に到達した時を０日とした。１０７ｐｆｕの各ウイルスを腫瘍内に０日、３日、及び６日目と合計３回投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧは、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて強力な抗癌作用を示し、ウイルス投与無の模擬対照群と比べて、２１〜３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることがｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ統計解析によって確認された（図１３Ａ）。ＬＣ１６ｍ８Δ群では、模擬対照群と比べて、３２〜３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることが確認されたが、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。一方ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、治療５９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それらに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、他群と比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、治療５９日後で１００％のマウスが生存しており、その５匹中４匹のマウスにおいて完全な腫瘍の消失が観察された（図１３Ｂ）。同様にＡ５４９担癌マウスにおいても、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与群では、完全に腫瘍が消失したマウスはいなかったものの、副作用無く強力な抗癌作用を示した（図１４ＡとＢ）。模擬対照群と比べて、全てのウイルス投与群で生存率における有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認された。しかしながら、ＬＣ１６ｍ８Δ群では、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ群では、治療４９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。
次に、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて治療２７日、５２日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後に全身の正常組織でウイルス増殖が見られ、５２日後と時間経過に従ってウイルス増殖は増加し、それに伴う急激な体重減少が確認された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後のウイルス増殖は移植した腫瘍塊のみに限局し、完全に腫瘍が消失したマウスを含め、正常組織におけるウイルス増殖は見られず、５２日後の腫瘍が消失したマウスではそのウイルス増殖も消失していた（図１５）。
一方、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群１０匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、ウイルス投与無の模擬対照群マウスが腫瘍によって死亡、又は安楽死されるよりも早く、治療２４〜４３日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認されたが、最終的にはＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスで見られた同様のウイルス毒性によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。（図１７）。
ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）が挿入されている。そこで、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に２種類の外来遺伝子を挿入することによって、組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−を作製した。最初に、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃｇＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号８８）と５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号８９）によって、ＴＫ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、それをｐＵＣ１９ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫを構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ａａｔｔｇｃａｔｇｃｇｔｃｇａｃａｔｔａａｔＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣｔｔｃｇａａｇ−３’（配列番号９０）と５’−ａａｔｔｃｔｔｃｇａａＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣａｔｔａａｔｇｔｃｇａｃｇｃａｔｇｃ−３’（配列番号９１））をアニールし、それを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＫにクローニングし、ｐＴＫ−ＭＳＣを構築した。合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ ６６：１３５−１３８）を挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡａａｔｔｇｇａｔｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｇｃａｔａｔａａａｔａａｇｇｔｃｇａＧＧＴＡＣＣａａａａａｔｔｇａａａａａｃｔａｔｔｃｔａａｔｔｔａｔｔｇｃａｃＧＧＣＣＧＧＡＣ−３’（配列番号９２）と５’−ＣＧＧＣＣｇｔｇｃａａｔａａａｔｔａｇａａｔａｇｔｔｔｔｔｃａａｔｔｔｔｔＧＧＴＡＣＣｔｃｇａｃｃｔｔａｔｔｔａｔａｔｇｃｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇｃｔｇａｔｃｃａａｔｔ−３’（配列番号９３））をアニールし、それを制限酵素ＳｆｉＩとＳａｌＩで切断したｐＴＫ−ＭＳＣにクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣを構築した。ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩとＥｃｏＲＩの切断によって獲得したＬｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを構築した。各組換えウイルス（図１８）は、参考例２で記述した方法を若干変更して、１４３細胞にワクシニアウイルス（実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ）を感染させ、２５μｇ／ｍｌ ＢＵｄＲ（ブロモデオキシウリディン）の存在下でトランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを細胞に取り込ませることによって作出し、ＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
上述のように、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−は、ウイルス投与無の模擬対照群マウス、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、ウイルス毒性による副作用も見られなかった（図１９）。次に、２９日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ ＴＫ−の投与マウスでは、正常組織におけるウイルス増殖が見られたが、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−では、腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった（図２０）。これより、ＨＡ遺伝子に比べてＴＫ遺伝子への外来遺伝子挿入は、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数を高めた。
以上の結果より、担癌マウスモデルにおいて、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスは強力な腫瘍溶解性による抗腫瘍効果と高い安全性を兼ね備えたウイルスであることが確認された。
５ｘ１０６個のＢｘＰＣ３、又はＡ５４９を免疫不全ヌードマウスの右腹側の皮下に移植し、その腫瘍塊が約１００ｍｍ３（皮膚を介して腫瘍塊の長径Ｌと短径Ｗをノギスで測定し、腫瘍体積Ｖを計算式Ｖ＝ＬＷ２／２により算出した大きさ）に到達した時を０日とした。１０７ｐｆｕの各ウイルスを腫瘍内に０日、３日、及び６日目と合計３回投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧは、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて強力な抗癌作用を示し、ウイルス投与無の模擬対照群と比べて、２１〜３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることがｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ統計解析によって確認された（図１３Ａ）。ＬＣ１６ｍ８Δ群では、模擬対照群と比べて、３２〜３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることが確認されたが、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。一方ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、治療５９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それらに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、他群と比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、治療５９日後で１００％のマウスが生存しており、その５匹中４匹のマウスにおいて完全な腫瘍の消失が観察された（図１３Ｂ）。同様にＡ５４９担癌マウスにおいても、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与群では、完全に腫瘍が消失したマウスはいなかったものの、副作用無く強力な抗癌作用を示した（図１４ＡとＢ）。模擬対照群と比べて、全てのウイルス投与群で生存率における有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認された。しかしながら、ＬＣ１６ｍ８Δ群では、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ群では、治療４９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。
次に、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて治療２７日、５２日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後に全身の正常組織でウイルス増殖が見られ、５２日後と時間経過に従ってウイルス増殖は増加し、それに伴う急激な体重減少が確認された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後のウイルス増殖は移植した腫瘍塊のみに限局し、完全に腫瘍が消失したマウスを含め、正常組織におけるウイルス増殖は見られず、５２日後の腫瘍が消失したマウスではそのウイルス増殖も消失していた（図１５）。
一方、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群１０匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、ウイルス投与無の模擬対照群マウスが腫瘍によって死亡、又は安楽死されるよりも早く、治療２４〜４３日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認されたが、最終的にはＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスで見られた同様のウイルス毒性によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。（図１７）。
ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）が挿入されている。そこで、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に２種類の外来遺伝子を挿入することによって、組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−を作製した。最初に、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃｇＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号８８）と５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号８９）によって、ＴＫ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、それをｐＵＣ１９ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫを構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ａａｔｔｇｃａｔｇｃｇｔｃｇａｃａｔｔａａｔＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣｔｔｃｇａａｇ−３’（配列番号９０）と５’−ａａｔｔｃｔｔｃｇａａＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣａｔｔａａｔｇｔｃｇａｃｇｃａｔｇｃ−３’（配列番号９１））をアニールし、それを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＫにクローニングし、ｐＴＫ−ＭＳＣを構築した。合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ ６６：１３５−１３８）を挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡａａｔｔｇｇａｔｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｇｃａｔａｔａａａｔａａｇｇｔｃｇａＧＧＴＡＣＣａａａａａｔｔｇａａａａａｃｔａｔｔｃｔａａｔｔｔａｔｔｇｃａｃＧＧＣＣＧＧＡＣ−３’（配列番号９２）と５’−ＣＧＧＣＣｇｔｇｃａａｔａａａｔｔａｇａａｔａｇｔｔｔｔｔｃａａｔｔｔｔｔＧＧＴＡＣＣｔｃｇａｃｃｔｔａｔｔｔａｔａｔｇｃｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇｃｔｇａｔｃｃａａｔｔ−３’（配列番号９３））をアニールし、それを制限酵素ＳｆｉＩとＳａｌＩで切断したｐＴＫ−ＭＳＣにクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣを構築した。ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩとＥｃｏＲＩの切断によって獲得したＬｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを構築した。各組換えウイルス（図１８）は、参考例２で記述した方法を若干変更して、１４３細胞にワクシニアウイルス（実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ）を感染させ、２５μｇ／ｍｌ ＢＵｄＲ（ブロモデオキシウリディン）の存在下でトランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを細胞に取り込ませることによって作出し、ＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
上述のように、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−は、ウイルス投与無の模擬対照群マウス、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、ウイルス毒性による副作用も見られなかった（図１９）。次に、２９日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ ｍｕｔ／ＬＧ ＴＫ−の投与マウスでは、正常組織におけるウイルス増殖が見られたが、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ ＴＫ−では、腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった（図２０）。これより、ＨＡ遺伝子に比べてＴＫ遺伝子への外来遺伝子挿入は、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数を高めた。
以上の結果より、担癌マウスモデルにおいて、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスは強力な腫瘍溶解性による抗腫瘍効果と高い安全性を兼ね備えたウイルスであることが確認された。
本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌治療に用いることができる。
配列番号６５−７６、８５、８６、８８、８９ プライマー
配列番号７７−８４、９０−９３ 合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
配列番号７７−８４、９０−９３ 合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
Claims (16)
- 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロRNAの標的配列を、ウイルス増殖に関るB5R遺伝子の3'非翻訳領域に挿入し、さらにチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させたワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- 正常細胞で発現するマイクロRNAによって、B5R遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、請求項１記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、3'非翻訳領域にマイクロRNAの標的配列を挿入したB5R遺伝子を導入した、請求項１又は２に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- ワクシニアウイルスが、LC16株又はLC16mO株である、請求項１又は２に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- ワクシニアウイルスが、B5R遺伝子を部分的に欠失したLC16m8株又はB5R遺伝子を完全に欠失したm8Δ株である、請求項３記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- 正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロRNAが、let-7a（配列番号１）、let-7b（配列番号２）、let-7c（配列番号３）、let-7d（配列番号４）、let-7e（配列番号５）、let-7f（配列番号６）、miR-9（配列番号７）、miR-15a（配列番号８）、miR-16-1（配列番号９）、miR-21（配列番号１０）、miR-20a（配列番号１１）、miR-26a（配列番号１２）、miR-27b（配列番号１３）、miR-29a（配列番号１４）、miR-29b（配列番号１５）、miR-29c（配列番号１６）、miR-30a（配列番号１７）、miR-30d（配列番号１８）、miR-32（配列番号１９）、miR-33a（配列番号２０）、miR-34a（配列番号２１）、miR-92a（配列番号２２）、miR-95（配列番号２３）、miR-101（配列番号２４）、miR-122（配列番号２５）、miR-124（配列番号２６）、miR-125a（配列番号２７）、miR-125b（配列番号２８）、miR-126（配列番号２９）、miR-127（配列番号３０）、miR-128（配列番号３１）、miR-133b（配列番号３２）、miR-139-5p（配列番号３３）、miR-140（配列番号３４）、miR-141（配列番号３５）、miR-142（配列番号３６）、miR-143（配列番号３７）、miR-144（配列番号３８）、miR-145（配列番号３９）、miR-155（配列番号４０）、miR-181a（配列番号４１）、miR-181b（配列番号４２）、miR-181c（配列番号４３）、miR-192（配列番号４４）、miR-195（配列番号４５）、miR-198（配列番号４６）、miR-199a（配列番号４７）、miR-199b-5p（配列番号４８）、miR-200a（配列番号４９）、miR-203（配列番号５０）、miR-204（配列番号５１）、miR-205（配列番号５２）、miR-217（配列番号５３）、miR-218（配列番号５４）、miR-219-5p（配列番号５５）、miR-220a（配列番号５６）、miR-220b（配列番号５７）、miR-220c（配列番号５８）、miR-222（配列番号５９）、miR-223（配列番号６０）、miR-224（配列番号６１）、miR-345（配列番号６２）、及びmiR-375（配列番号６３）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- 癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の１つ又は複数を欠損させた、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- さらに、赤血球凝集素(HA)遺伝子を欠損させた、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- さらに、Fフラグメントを欠損させた、請求項８記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- さらに、VGF遺伝子を欠損させた、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクター。
- 外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、請求項１２記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクター。
- 請求項１２又は１３に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を予測する方法であって、
(i) 前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及び
(ii) 癌細胞及び正常細胞におけるマイクロRNA制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程
を含み、前記マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると予測する方法。 - マイクロRNA制御型ワクシニアウイルスがB5R遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を予測する、請求項１５記載の方法。
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| JPN6011020394; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１７ ｎｏ．３, 2009, ｐｐ．４０９-４１６ * |
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