CN105543182A - 携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒及其药物组合物。本发明的重组溶瘤痘苗病毒携带microRNA-101的编码序列。本发明所述的microRNA-101的编码序列是任何能够编码microRNA-101的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ？ID？NO：1或其互补序列。另一方面，本发明所述的microRNA-101的编码序列可为在严紧条件下与由SEQ？ID？NO：1的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制胃癌细胞增值活性的microRNA-101的多核苷酸或其互补序列。本发明的重组溶瘤痘苗病毒和含有其的药物组合物可用于治疗胃癌。

Description

携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒及其药物组合物

技术领域

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种携带微小RNAmicroRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒及其用途。

背景技术

全球所有癌症中，胃癌的发病率在男性中排第四位、在女性中排第五位，胃癌的死亡率居第二位，5年生存率约20％。发展新型安全有效的治疗方法以提高胃癌患者生存期具有非常重要的意义。

病毒治疗(Virotherapy)是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗新方法，并已取得一些令人鼓舞的成果，其中有些在国际上正进行Ⅰ期和Ⅱ期临床研究。国内有重组人p53腺病毒(今又生)获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书，临床上用于治疗实体肿瘤患者。Pan1等报道用携带p53基因的溶瘤腺病毒(Oncolyticadenovirus)联合放疗治疗进展期鼻咽部肿瘤，结果有66.7％患者获得完全缓解(CR)，而单用放疗组CR仅为24.4％。表明溶瘤病毒是一种有前景的治疗癌症的新方法。溶瘤痘苗病毒(OncolyticPoxvirus)是病毒治疗的新型载体，其优点在于：病毒稳定性好、致病性低、基因转染效力高、安全性良好。溶瘤痘苗病毒能选择性感染肿瘤细胞并在细胞内复制、杀死肿瘤细胞，而对正常组织和细胞的毒性很小。

microRNA(miRNA)是一种进化过程中高度保守的、内源性非编码小RNA，广泛地分布于植物、动物和DNA病毒中。miRNA在转录后水平调控至少30％的人类蛋白的编码基因，其功能涉及细胞生长、发育和凋亡等许多复杂生命过程。miR-101发挥作用的方式是引导miRNA核蛋白体与靶基因的3’非翻译区的结合位点结合，在转录后水平抑制靶标基因的翻译。miR-101直接作用的靶分子，包括EZH2、Stathmin、DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)。这些靶分子在细胞中起着促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能，miR-101通过多种靶分子的累积和协同效应介导了肿瘤细胞的过度增殖和凋亡抑制。

何晓璞(2012)利用逆转录病毒载体Lenti-virus作为miR-101的转导工具发现，miR-101能引起胃癌细胞生物学行为的改变，而这种改变有可能是通过抑制或沉默COX-2表达实现的。

发明内容

本发明的发明人发现，现有技术中的携带miR-101的病毒载体在抑制胃癌细胞的增值上效果较弱。为此，本发明要解决的技术问题是提供一种抗胃癌的携带微小RNAmicroRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒。

因此，本发明一方面提供了一种重组溶瘤痘苗病毒，其含有microRNA-101的编码序列。

本发明的又一方面提供了治疗胃癌或者抑制胃癌细胞增殖的药物组合物，其包含重组溶瘤痘苗病毒，其中所述的重组溶瘤痘苗病毒含有microRNA-101的编码序列。

本发明的又一方面提供了重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗胃癌的药物组合物中的用途，其中所述的重组溶瘤痘苗病毒含有microRNA-101的编码序列。

具体而言，本发明所述的microRNA-101的编码序列是任何能够编码microRNA-101的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQIDNO：1或其互补序列。另一方面，本发明所述的microRNA-101的编码序列可为在严紧条件下与由SEQIDNO：1的核苷酸序列进行杂交、且编码具有抑制胃癌细胞增值活性的microRNA-101的多核苷酸或其互补序列；

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(AltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和GappedBLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。

任选地，本发明的重组病毒表达已知能抑制胃癌细胞增值的其他蛋白，例如p53。本发明的药物组合物还可以含有其他治疗胃癌的活性成分，例如紫杉醇。

本发明的作为活性成分的携带微小RNAmicroRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒可以连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含合适的药学学上可接受的载体，包括促进本发明的重组病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。

例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的(冻干)条件，在立即使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。

本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

本发明的活性成分的有效量可为治疗胃癌、或缓解胃癌症状或抑制胃癌细胞的任何量，其可以是相当于约1x10¹¹-1x10¹²v.p重组病毒。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。

根据本发明，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注射施用至荷瘤部位。

应当理解本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。

本发明的药学产品(药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容：适应症(例如胃癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

本发明的有益效果是：

1、本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达miRNA-101的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。

2、本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

3、本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

4、本发明通过构建携带微小RNAmicroRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗胃癌的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是流式细胞仪检测携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒感染BGC-823细胞，GFP的表达水平。

图2是RT-PCR检测携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒感染BGC-823细胞，microRNA-101的表达水平。

图3a和图3b是MTT法检测细胞存活率分析图，数据以剂量梯度相对于PBS组的百分率表示。

图4流式细胞术检测细胞凋亡率。

具体实施方式

本发明结合附图和实例作进一步的说明。除特别说明外，本发明可采用本领域常规技术。

实施例1、重组溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、通过基因合成方法，得到microRNA-101的初级转录物pri-miRNA-101：

tgcctcctcacgtctccaaccagaaggtgatcttttagtccttcacttcatggggagccttcagagagagtaatgcagccaccagaaaggatgccgttgaccgacacagtgactgacaggctgccctggctcagttatcacagtgctgatgctgtctattctaaaggtacagtactgtgataactgaaggatggcagccatcttaccttccatcagaggagcctcaccgtacccaggaagaaagaaggtgaaagaggaatgtgaaacaggtggctgggacccagaaaccctcttaccctgcacctctgtcat(SEQIDNO：1)；

2)、将pri-miRNA-101序列装载于穿梭质粒pCB上，得到pCB-pri-miRNA-101，其中所述的穿梭质粒pCB根据如下文献制备：房有荣，李红玉，陈科达，周文硕，阎辉.Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建，国际流行病学传染病学杂志，2012年6月第39卷第3期；需要说明的是，本发明也可用其他的pCB，例如没有选择标记的穿梭质粒pCB。

3)、在HEK293细胞中，质粒pCB-pri-miRNA-101与野生型痘苗病毒发生同源重组，pri-miRNA-101序列插入野生型痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因中；

4)、经霉酚酸药物筛选后，得到纯化的重组溶瘤痘苗病毒VACV-miRNA-101。

实施例2：流式细胞仪检测携带GFP(绿色荧光蛋白)的重组溶瘤痘苗病毒感染BGC-823细胞(人胃癌细胞系，购自中国科学院细胞库)，GFP的表达水平。

六孔板中接种5×10⁵个/mL的BGC-823细胞，分别加入1MOI、5MOI的携带GFP的重组溶瘤痘苗病毒(VACV-GFP)，对照组中加入等量的PBS，37℃、5％CO₂培养。24h后收集细胞，采用流式细胞仪(BDAccuriC6)分析各组样品的GFP表达率。结果见图1，随着VACV-miR-101剂量的增加，GFP表达水平随之增加，表明重组溶瘤痘苗病毒对胃癌细胞可有效侵袭。

实施例3：RT-PCR检测携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒感染人胃癌细胞BGC-823，microRNA-101的表达水平。

携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒(VACV-miR-101)以4MOI的剂量感染RPMI-8226和U266细胞，37℃，5％CO₂条件下培养24小时。按TRIZOL法提取细胞总RNA，以抽提的总RNA为模板逆转录成cDNA，应用Primer5.0软件设计引物。cDNA通过SYBRqPCRMix进行荧光定量PCR，扩增体系为20μL。

扩增参数为：95℃1min，95℃15s，60℃1min，40个循环。结果由AppliedBiosystems7300real-timePCR仪软件分析。结果见图2，VACV-miR-101处理BGC-823细胞后，在mRNA水平上，microRNA-101表达水平显著增高，表明VACV-miR-101能在胃癌细胞中稳定表达microRNA-101。

实施例4：携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒对胃癌细胞BGC-823增殖活性的影响。

胃癌细胞BGC-823(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、重组溶瘤痘苗病毒组(VACV)、携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒组(VACV-miR-101)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入VACV(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)、Ad-miR-101(汤福祥，郑权，黄宗海，张庆国，车小燕.应用改进的AdEasy系统制备重组腺病毒.第一军医大学学报，2003；23(5):501-503)(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)和VACV-miR-101(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μlDMSO，振荡l0min后，在ThermoVarioskanFlash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3b，随着剂量的增加，VACV、Ad-miR-101和VACV-miR-101对胃癌细胞BGC-823增殖抑制效应愈加显著，且VACV-miR-101对胃癌细胞BGC-823增殖抑制效应显著强于VACV和Ad-miR-101。

实施例5：携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒对人正常细胞增殖活性的影响。

人肝正常细胞QSG-7701(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、重组溶瘤痘苗病毒组(VACV)、携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒组(VACV-miR-101)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入VACV(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)、Ad-miR-101(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)和VACV-miR-101(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μlDMSO，振荡l0min后，在ThermoVarioskanFlash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图3a，随着剂量的增加，VACV、Ad-miR-101和VACV-miR-101对人肝正常细胞QSG-7701无明显抑制效应。

实施例6：携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒对胃癌细胞BGC-823的促凋亡作用。

六孔板中接种5×10⁵个/mL的BGC-823细胞，分别加入4MOI的携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒(VACV-miR-101)和空载重组溶瘤痘苗病毒(VACV)，对照组中加入等量的PBS，37℃、5％CO₂培养。48h后参照AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明：收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两遍，用100μL的1×BindingBuffer重悬细胞，加入5μL的Annexin-V和1μL的PI，冰上避光15min后，加入400μL1×BindingBuffer，采用流式细胞仪分析。

结果见图4，VACV-miR-101和VACV处理组均能强烈的诱导细胞凋亡，且VACV-miR-101处理组促凋亡作用更加显著。

实施例7：携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒(VACV-miR-101)和对胃癌细胞BGC-823增殖活性的影响以及携带microRNA-101的逆转录病毒载体Lenti-病毒(Len)对胃癌细胞BGC-823增殖活性的影响。

根据何晓璞.miR-101对胃癌COX-2过度表达的影响及其生物学效应:[D].南京：南京医科大学,2012制备了携带microRNA-101的逆转录病毒载体Lenti-病毒(Len-miR-101)，并根据实施例5比较了其与本发明的携带microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒胃癌细胞BGC-823增殖活性的影响。结果发现，随着剂量的增加，Len-miR-101和VACV-miR-101对胃癌细胞BGC-823增殖抑制效应愈加显著，且VACV-miR-101对胃癌细胞BGC-823增殖抑制效应显著强于Len-miR-101(图略)。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.重组溶瘤痘苗病毒，其特征是：可操作地插入能够编码microRNA-101的外源基因。

2.如权利要求1所述的重组溶瘤痘苗病毒，其中所述的外源基因是SEQIDNO：1或其互补序列。

3.如权利要求1-2中任一项所述的重组溶瘤痘苗病毒，其中所述重组溶瘤痘苗病毒被进一步修饰，以表达治疗胃癌的蛋白活性成分。

4.根据权利要求4所述的重组溶瘤痘苗病毒，其中所表达的治疗胃癌的蛋白活性成分是p53。

5.根据权利要求4所述的重组溶瘤痘苗病毒，其是用于治疗胃癌的。

6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的重组溶瘤痘苗病毒。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述组合物还含有药学上可接受的载体。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其是用于治疗胃癌的，且含有用于治疗癌症的其他活性成分。

9.根据权利要求8的药物组合物，其中所述其他活性成分是紫杉醇。

10.根据权利要求6-9中任一项的药物组合物，其是固体或注射液的形式。