CN105079821A - 一种长链非编码rna hnf1a-as1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，本发明提供了一种长链非编码RNA？HNF1A-AS1(Hepatocyte？Nuclear？Factor-1αAntisense？1)在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用。本发明研究发现，通过调控恶性实体肿瘤细胞HNF1A-AS1基因表达，可有效地抑制恶性实体肿瘤的增殖，从而本发明为临床治疗恶性实体肿瘤提供了一种新靶点。

Description

一种长链非编码RNA HNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，具体地，本发明涉及一种长链非编码RNAHNF1A-AS1(HepatocyteNuclearFactor-1αAntisense1)在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，提供了一种治疗恶性实体肿瘤的新靶点。

背景技术

恶性实体瘤的治疗是目前临床的难点之一，尤其对于手术无法切除的恶性实体瘤，临床尚缺乏有效的治疗手段。选择与肿瘤细胞发生发展密切相关的关键分子和基因进行特异性靶向调控是恶性实体瘤治疗的核心问题之一。

长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)系一类转录本长度超过200nt(核苷酸单位)的RNA分子，由于这类RNA分子缺少特异完整的开放阅读框，因而不编码蛋白质。目前的研究认为仅有2％的人类基因组序列是编码蛋白的基因，而约60％以上的人类基因组序列可转录为长链非编码RNA。既往的研究显示长链非编码RNA可广泛参与基因表达和功能的调节，具有丰富多样的生物学功能，在基因表达调控和信号转导过程中具有重要功能。在肿瘤细胞中，长链非编码RNA也发挥重要的调控作用，与编码基因(mRNA)一样可以作为肿瘤诊断和预后判段的分子标志物，同时也是潜在分子靶向治疗的靶点，具有良好的临床应用价值。

长链非编码RNA数量极大、基因组定位形式多种多样，分类复杂。其中一类位于两个基因之间的长链非编码RNA(LargeIntergenicNoncodingRNA，lincRNA)，由于其基因位置不与其他基因存在重合，是目前研究领域中较常见及功能较为重要的一类长链非编码RNA。此外，某些长链非编码RNA仅在特定的发育阶段出现，或特异性地表达于某些组织或细胞，具有精确的亚细胞定位，提示这些长链非编码RNA可能具有重要的生理功能。也有研究表明，LncRNA的特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关(Lee,J.T..EpigeneticregulationbylongnoncodingRNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.)。尽管长链非编码RNA数量庞大，但目前功能明确的长链非编码RNA数量还是极少。

长链非编码RNAHNF1A-AS1(HepatocyteNuclearFactor-1αAntisense1)为一仅在消化系统器官如肝、胃肠道等特异表达的长链非编码RNA，其基因位于编码基因肝细胞核因子1α(HepatocyteNuclearFactor1α)上游的反义链上，属于基因间长链非编码RNA(lincRNA)。尽管有研究认为HNF1A-AS1可能在食道癌、肺癌中表达升高(YangX,SongJH,ChengY,etal.Longnon-codingRNAHNF1A-AS1regulatesproliferationandmigrationinoesophagealadenocarcinomacells.Gut,2014,63(6):881-90.)(WuY,LiuH,ShiX,YaoY,YangW,SongY.Thelongnon-codingRNAHNF1A-AS1regulatesproliferationandmetastasisinlungadenocarcinoma.Oncotarget.2015；6:9160-72.)，但其在其他恶性肿瘤中的作用及其完整的基因信息均未见报道。

目前HNF1A-AS1无论文献还是数据库所公布的序列均不完整。

目前尚无文献报道HNF1A-AS1可用于治疗恶性肿瘤。

发明内容

本发明的目的在于寻找到能够有效用于人体恶性实体瘤治疗的一种长链非编码RNA。

本发明的另一目的在于提供一种长链非编码RNAHNF1A-AS1的新的医药用途，具体是在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用。

本发明在研究HNF1A-AS1过程中发现其在肝癌中表达下降；利用分子生物学手段克隆HNF1A-AS1的全长，发现本发明得到的全长HNF1A-AS1对肝癌细胞的恶性表型具有显著抑制作用，是恶性肿瘤潜在的治疗靶点。

本发明的主要技术方案是：本发明首次发现了HNF1A-AS1基因/RNA可有效地在体内抑制恶性实体瘤的恶性表型。实验表明，HNF1α不仅对肿瘤细胞增殖有影响，更可抑制实体瘤细胞的迁移和侵袭、降低肿瘤细胞的成瘤性。因此HNF1A-AS1作为首次被证实的可有效地在抑制恶性实体瘤恶性表型的关键基因/RNA，具有潜在的应用前景。本发明人在此基础上完成了本发明，提供一种抑制恶性实体瘤细胞恶性表型的长链非编码RNA基因HNF1A-AS1基因及其转录产物HNF1A-AS1RNA，以及HNF1A-AS1基因/RNA在治疗实体瘤中的用途。

本发明的第一方面，提供了一种长链非编码RNAHNF1A-AS1(HepatocyteNuclearFactor-1αAntisense1)在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用。

本发明所述的长链非编码RNAHNF1A-AS1的基因cDNA序列如SEQIDNO:1所示。

本发明所述的长链非编码RNAHNF1A-AS1的基因序列与NCBI数据库提供的HNF1A-AS1基因序列(基因ID：NR_024345.1)相比较，5’末端有330bp的延伸(如图4中方框所标序列)，全长为2785bp，是一连续序列无其他剪切形式的长链非编码RNA。

本发明所述的治疗人体恶性实体瘤药物，可以提高长链非编码RNA基因HNF1A-AS1基因或其转录产物HNF1A-AS1RNA的表达量。

所述的提高长链非编码RNA基因HNF1A-AS1基因或其转录产物HNF1A-AS1RNA的表达量的药物，包括但不限于：

1)HNF1A-AS1RNA；

2)HNF1A-AS1基因；

3)含有HNF1A-AS1基因的表达载体。

本发明所述的治疗人体恶性实体瘤药物，也可以是药物组合物，所述的药物组合物包含以上1)至3)任一活性成份以及药学上可接受的载体或赋形剂。

所述的表达载体，包括重组质粒、重组病毒、重组病毒载体、非病毒载体等。

重组病毒，优选腺病毒、慢病毒等。

非病毒载体，优选脂质体或其他靶向介质。

在本发明的一个优选例中，所述的人体恶性实体瘤选自：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、前列腺癌或生殖腺肿瘤等。

在本发明的另一个优选例中，所述的药物组合物还用于体内抑制实体瘤的形成。

在本发明的另一个优选例中，所述的人体恶性实体瘤为肝癌，包括但不限于肝肿瘤细胞株Huh7、Hep3B、MHCC等。

在本发明的另一个优选例中，所述的HNF1A-AS1是人的HNF1A-AS1。

在本发明的另一个优选例中，所述的药物为慢病毒重组质粒pCDH-HNF1A-AS1。

在本发明的另一个优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

在本发明的另一个优选例中，所述的药物组合物还含有化疗剂。

在本发明的第二方面，提供了一种在哺乳动物中抑制恶性实体瘤的方法，它包括步骤：给需要治疗的哺乳动物对象施用HNF1A-AS1RNA或含所述基因序列的表达载体。

在本发明的另一个优选例中，所述的哺乳动物是人。

术语解释

如本文所用，术语“基因/RNA”指基因和/或RNA。

如本文所用，术语“HNF1A-AS1基因”、“HNF1A-AS1RNA”可互换使用，都指HNF1A-AS1RNA。狭义上，所述术语指人的HNF1A-AS1；广义上，所述术语不仅包括人的HNF1A-AS1，还包括其他哺乳动物的HNF1A-AS1，尤其是灵长类动物的HNF1A-AS1，如猿或猴的HNF1A-AS1。该术语还包括HNF1A-AS1RNA的活性片段、活性衍生物和类似物。

本发明RNA可以是天然RNA、合成RNA。本发明的RNA可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或体外转录产生。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然HNF1A-AS1RNA相同的生物学功能或活性的RNA片段。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。例如，在本发明中，术语“人HNF1A-AS1RNA”指具有野生型HNF1A-AS1序列的RNA。该术语还包括具有与人HNF1A-AS1RNA相同的抑制实体瘤功能的、野生型序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′末端和/或3′末端添加一个或数个核苷酸。例如，在本领域中，用性能相近核苷酸进行取代时，通常不会改变RNA的功能。又比如，在5′末端和/或3′末端添加一个或数个核苷酸通常也不会改变RNA的功能。同样，该术语还包括人HNF1A-AS1的活性片段。

本发明还包括人HNF1A-AS1RNA的类似物。这些类似物与天然人HNF1A-AS1RNA的差别可以是核酸序列上的差异，也可以是不影响序列的核苷酸修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然核苷酸碱基的类似物，以及具有非天然存在的或合成的核苷酸的类似物。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。

DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

在本发明中，人HNF1A-AS1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人HNF1A-AS1的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明也涉及包含HNF1A-AS1序列的载体(尤其是病毒载体)，以及用本发明的载体或HNF1A-AS1序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经体外转录技术产生本发明所述RNA的方法。

将多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达野生型的HNF1A-AS1，以增加实体瘤中HNF1A-AS1的数量和活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HNF1A-AS1基因转移至细胞内。构建携带HNF1A-AS1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,etal.)。另外重组人HNF1A-AS1基因/RNA可包装到脂质体中，然后再转入细胞内。

本发明HNF1A-AS1RNA、HNF1A-AS1DNA及载体，当施用(给药)于哺乳动物对象(如人)时，可抑制恶性实体瘤的恶性表型。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质(包括水性载体介质)，形成药物组合物。水性载体介质的pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于诱导实体瘤的治疗，代表性的例子包括(但并不限于)：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌及生殖腺肿瘤等。在使用本发明HNF1A-AS1基因/RNA或药物组合物时，还可同时或辅助使用其他治疗剂，如顺铂、TNF等，还可与其他基因如HSK-TV基因、P53基因等其他基因或化疗与放疗联合治疗。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量(如0.0001-99wt％)的本发明HNF1A-AS1RNA、HNF1A-AS1DNA或载体以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明药物组合物中还可含有其他治疗剂，如化疗药物。使用药物组合物时，是将安全有效量的HNF1A-AS1RNA、HNF1A-AS1DNA或载体施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了一种肿瘤细胞(尤其是恶性实体瘤)基因治疗的方法，它包括将HNF1A-AS1基因导入肿瘤细胞，使之表达，其中所述将HNF1A-AS1基因导入肿瘤细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。

本发明的有益效果如下：

(a)筛选并证实长链非编码RNAHNF1A-AS1对恶性实体瘤的抑制作用。

(b)体内外证实HNF1A-AS1治疗恶性实体瘤的可行性及其对临床研究的潜在意义。

附图说明

图1.Real-TimePCR检测HNF1A-AS1在肝癌细胞株中的表达。

图2.Real-TimePCR检测HNF1A-AS1在肝癌组织及其对应癌旁组织中的表达。

图3.cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends，RACE)扩增HNF1A-AS1cDNA的5′末端(A)和3′末端(B)。

图4.根据HNF1A-AS1cDNA的5′末端和3′末端延伸获得的HNF1A-AS1全长基因核苷酸序列。

图5.PCR方法扩增获得全长HNF1A-AS1的cDNA。

图6.酶切鉴定重组慢病毒载体pCDH-HNF1A-AS1。

图7.对照慢病毒lenti-Ctrl(A)或慢病毒lenti-HNF1A-AS1(B)分别感染Huh7细胞3天后绿色荧光表达情况。

图8.lenti-HNF1A-AS1慢病毒感染Huh7细胞(A)和Hep3B细胞(B)4天后Real-TimePCR检测HNF1A-AS1基因的表达水平。

图9.外源导入HNF1A-AS1抑制肝癌细胞Huh7(A)和Hep3B(B)的增殖。图10.外源导入HNF1A-AS1抑制肝癌细胞Huh7(A)和Hep3B(B)的克隆形成能力。

图11.外源导入HNF1A-AS1可使Hep3B细胞发生G2期细胞阻滞，其中A为对照细胞流式细胞仪周期检测图，B为HNF1A-AS1过表达组细胞流式细胞仪周期检测图，C为A、B图细胞周期数据统计图。

图12.外源导入HNF1A-AS1抑制肝癌细胞Huh7(A)、Hep3B(B)、MHCC-H(C)的迁移能力。

图13.分别感染对照慢病毒lenti-Ctrl或慢病毒lenti-HNF1A-AS1的Huh7细胞的体内接种成瘤实验，其中A为肿瘤生长速率，B为小鼠成瘤在体图(上)及肿瘤离体图(下)，C为瘤体HNF1A-AS1基因表达水平。

图14.HNF1A-AS1基因治疗肝脏原位种植瘤实验，其中A为两组小鼠注射病毒前后活体呈像荧光检测图；B为小鼠肝脏及瘤体离体图，其中箭头指向为肿瘤组织；C为瘤体HNF1A-AS1基因表达水平。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：Real-TimePCR检测人肝肿瘤细胞株HNF1A-AS1基因的表达情况

1.将市售的常规肝肿瘤细胞株HepG2、Huh7、Hep3B、MHCC-L、MHCC-H、LM3、PLC、Focus均以5×10⁵/皿接种于六孔板，以含10％胎牛血清的新鲜培养液培养，第二天抽提细胞RNA，分光光度计测定OD260值，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

2.Real-TimePCR：

取1μgRNA加入4μl5×PrimeScriptRTmastermix(逆转录试剂盒)，另加入DEPC水补足体积至20μl，37℃反应15min；85℃反应5s灭活逆转录酶，即可得到逆转录产物。将逆转录产物稀释后取1μl为模板进行HNF1A-AS1PCR扩增，同时以β-actin作为内参照在相同反应条件下进行PCR反应，反应体系如下：

反应条件为95℃，30sec；95℃，5sec→60℃，34sec，40个循环；95℃，15sec→60℃，60sec→95℃，15sec。相关引物序列见表：

β-actin正向引物：CATCCTGCGTCTGGACCT(SEQIDNO:2)；

反向引物：GTACTTGCGCTCAGGAGGAG(SEQIDNO:3)；

HNF1A-AS1正向引物：CAAGAAATGGTGGCTATGA(SEQIDNO:4)；

反向引物：TGGACTGAAGGACAAGGGT(SEQIDNO:5)。

Real-TimePCR检测各肝癌细胞株HNF1A-AS1的基因表达水平。结果如图1所示，在HepG2、MHCC-L细胞中HNF1A-AS1的基因表达水平相对较高，而Huh7、Hep3B、MHCC-H细胞中HNF1A-AS1的基因表达水平居中，而PLC、LM3、Focus中HNF1A-AS1的基因表达水平相对较低。

实施例2：Real-TimePCR检测HNF1A-AS1在肝癌组织及其对应癌旁组织中的表达

取53例肝癌患者术后肝癌组织(样本来源：东方肝胆外科医院)，采用Trizol法抽提其RNA，分光光度计测定OD260值，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

按照实施例1中RNA逆转录方法逆转录得到肝癌组织标本的cDNA，将cDNA稀释后按照实施例1上述同样方法和条件检测人肝癌组织中HNF1A-AS1的表达情况，同时以β-actin基因的表达情况作为内参照，结果表明HNF1A-AS1在肝癌组织中表达下调(图2)。

实施例3：cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends，RACE)扩增HNF1A-AS1基因全长

根据HNF1A-AS1已知的序列分别设计5’末端特异性扩增引物(5’GSP)AACTCGGACTGTTCTCCTTCCCACCCC(SEQIDNO:6)和3’末端特异性扩增引物(3’GSP)ACGGCTAGTAAACGGCAGAACGAGGC(SEQIDNO:7)，合成引物。

采用市售CLONTECH的Marathon^TM试剂盒扩增HNF1A-AS1基因的cDNA序列，试剂盒中包括接头引物(adaptorprimer)及预制好的人肝脏cDNA，采用以下PCR体系进行扩增。

PCR扩增体系：

混匀各组分，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。

反应条件：94℃，5min；94℃30sec，70℃30s，72℃1min，40个循环；72℃7min，4℃∞。

PCR扩增分别得到HNF1A-AS1的5’末端和3’末端片段，1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定产物(图3)，选择最长片段割胶回收置入Eppendorf管内，称取胶重量，按每100mg胶/200mlNT液的比例加入NT液，50℃，5-10min至凝胶熔化；将液体过柱，13,000rpm离心1min，加入700μlNT3洗涤液，13,000rpm离心1min；洗涤2次。将纯化柱置于干净的Eppendorf管上，开盖晾置1min，滴加30μl双蒸水至柱内滤膜上，静放2min，13,000rpm离心1min，过柱洗脱得到DNA片段，分光光度计测定其浓度。分别取纯化后的HNF1A-AS1的5’末端或3’末端片段4μl、pMD-19T载体1μl、solutionI连接酶混合液5μl，16℃连接3h。将连接产物加入常规的感受态大肠杆菌DH5α转化，用含氨苄青霉素的LB培养基平皿铺板，37℃恒温过夜，挑取单菌落克隆至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，待菌液浓度OD600＝0.8-1.0，送至英骏生物公司测序。

测序结果表明HNF1A-AS1基因与NCBI数据库提供的序列(基因ID：NR_024345.1)5’末端有330bp的延伸(图4中方框中所标序列)，全长为2785bp，是一连续序列无其他剪切形式的长链非编码RNA。其基因全长序列为SEQIDNO:1。

实施例4：构建HNF1A-AS1基因过表达慢病毒

1.构建HNF1A-AS1基因过表达慢病毒载体

根据新得到的HNF1A-AS1的基因序列设计并合成引物：

正向引物：GGAACAGCCGGACATGGTAG(SEQIDNO:8)；

反向引物：GACGGAGTTTCGTTCTTGTTCC(SEQIDNO:9)；

同时分别带有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，以人肝脏cDNA为模板，PCR扩增HNF1A-AS1序列，产物0.7％凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图5所示，大小正确则采用试剂盒纯化回收PCR扩增片段。

BamHⅠ和EcoRⅠ分别酶切pCDH质粒(购自美国SystemBiosciences公司)和HNF1A-AS1的PCR扩增片段，凝胶电泳鉴定并纯化回收酶切后产物。取50-100ng线性化的pCDH质粒、500-1000ngBamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的HNF1A-AS1片段，5μlsolutionI连接酶混合液，混匀后16℃连接过夜。将连接产物加入慢病毒载体专用感受态大肠杆菌Stbl3转化，用含氨苄青霉素的LB培养基平皿铺板，37℃恒温过夜，挑取单菌落克隆至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，送适量菌液至公司测序。测序正确即得到慢病毒重组表达质粒pCDH-HNF1A-AS1,选择BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定重组表达质粒pCDH-HNF1A-AS1，如图6所示出现一个7kb左右片段为载体片段，另一3kb左右片段为HNF1A-AS1cDNA片段，表明质粒正确(图6)。

2.慢病毒的包装

按4×10⁶个HEK293T细胞/皿的密度接种至10mm培养皿12-24h后，用将2500ng对照质粒pCDH-Ctrl或慢病毒重组质粒pCDH-HNF1A-AS1分别与1875ngpsPAX2、625ngpMD2.G包装质粒共转染HEK293T细胞，5％CO2培养箱中培养12h后换成含有10％胎牛血清(FBS)的杜氏培养基(DMEM)，24h后收集上清储存于4℃，重新加入10ml上述培液继续培养24h，收集上清，混合两次收集的上清，1250rpm离心5min后取上清即得到对照慢病毒Lenti-Ctrl或携带有HNF1A-AS1基因的慢病毒Lenti-HNF1A-AS1。

实施例5：Real-TimePCR检测Lenti-HNF1A-AS1感染人肝肿瘤细胞株后HNF1A-AS1基因的表达水平

人肝肿瘤细胞株Huh7和Hep3B均以3×10⁵个细胞/皿的密度接种至35mm培养皿，分别加入500μl慢病毒Lenti-Ctrl或Lenti-HNF1A-AS1，24h-48h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，培养3天后观察荧光表达情况，发现对照病毒和HNF1A-AS1病毒感染后的细胞均可看到明显绿色荧光(图7)，表明病毒成功感染细胞。5天后以Trizol试剂盒抽提总RNA，并采用分光光度计测定OD260值，同时1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

按照实施例1中RNA逆转录方法逆转录得到cDNA，将cDNA稀释后按照实施例1上述同样方法和条件检测感染慢病毒Lenti-HNF1A-AS1后Huh7和Hep3B细胞中HNF1A-AS1基因的表达情况，同时以β-actin基因的表达情况作为内参照，结果表明感染慢病毒Lenti-HNF1A-AS1后Huh7和Hep3B细胞中HNF1A-AS1基因的表达均出现明显上调(图8)。

实施例6：外源导入HNF1A-AS1抑制肝肿瘤细胞增殖

人肝肿瘤细胞株Huh7和Hep3B均以2×10⁵接种于35mm培养皿，分别感染对照慢病毒Lenti-Ctrl(对照组)或慢病毒Lenti-HNF1A-AS1(实验组)48h后，计数每孔3×10³个细胞均匀分至96孔板，每天检测3复孔连续检测7天。第二天采用无血清培养基配置10％的CCK8，吸去96孔中原有培液，加入100μl配置好的CCK8试剂，37℃孵箱放置1h后检测450nm波长的吸光度以判断有活性细胞的数量。连续检测6天450nm吸光值，并绘制生长曲线。结果表明，感染慢病毒Lenti-HNF1A-AS1后人肝肿瘤细胞Huh7(图9A)和Hep3B(图9B)的增殖能力较对照组均受到明显抑制(图9)。

实施例7：外源导入HNF1A-AS1抑制肝肿瘤细胞的克隆形成能力

人肝肿瘤细胞株Huh7和Hep3B均以2×10⁵接种于35mm培养皿，分别感染对照慢病毒Lenti-Ctrl(对照组)或慢病毒Lenti-HNF1A-AS1(实验组)48h后，计数分别取2×10³/皿的细胞密度接种于35mm培养皿，每3天换液，培养3-4周，直至可见明显克隆，4％PFA固定，结晶紫染色，计数克隆，观察HNF1A-AS1对Huh7和Hep3B细胞克隆形成能力的影响。结果表明，感染慢病毒Lenti-HNF1A-AS1后Huh7和Hep3B细胞形成的克隆数较对照组明显减少(图10)。

实施例8：外源导入HNF1A-AS1使Hep3B细胞发生G2期细胞阻滞

将肝癌细胞株Hep3B以1×10⁵/皿接种于12孔板，分别加入等体积慢病毒lenti-Ctrl或lenti-HNF1A-AS1感染细胞，24h后更换含10％胎牛血清的新鲜DMEM培液，第3天观察荧光表达情况，第4天收集细胞，PBS清洗后，重悬1×10⁶个细胞至1mlPBS混合液中(含0.2％TritionX-100，50μgRNA酶，5μl碘化丙啶，0.1％FBS)，避光，室温孵育15min后，上机检测细胞周期变化并进行统计学分析。

结果表明在病毒感染72h后，HNF1A-AS1可使Hep3B细胞周期明显阻滞在G2期(图11)。

实施例9：外源导入HNF1A-AS1抑制人肝肿瘤细胞的迁移能力

人肝肿瘤细胞株Huh7、Hep3B、MHCC-H均以3×10⁵接种于35mm培养皿，分别感染对照慢病毒Lenti-Ctrl(对照组)或慢病毒Lenti-HNF1A-AS1(实验组)48h后，计数每孔1×10⁵个细胞均匀分至聚碳酸酯膜小室(Corning公司产品)的上层小室内，每组3复孔，48h后PBS清洗小室，结晶紫染色20min，镜下拍照观察HNF1A-AS1对人肝肿瘤细胞株迁移能力的影响，同时采用protein-plus软件统计迁移面积，分析HNF1A-AS1基因对肝癌细胞株迁移能力的影响。

结果表明，感染HNF1A-AS1病毒后人肝肿瘤细胞株Huh7(图12A)、Hep3B(图12B)、MHCC-H(图12C)的迁移能力较对照组明显受到抑制。上调HNF1A-AS1可明显降低肝肿瘤细胞株的迁移能力(图12)。

实施例10：上调人肝肿瘤细胞株Huh7中HNF1A-AS1的表达可抑制其体内成瘤能力

分别取感染对照慢病毒Lenti-Ctrl或慢病毒Lenti-HNF1A-AS148h后的肝癌细胞Huh7按2×10⁶的细胞数接种于裸鼠腋下，左侧接种感染对照病毒lenti-Ctrl的细胞，右侧接种感染lenti-HNF1A-AS1的细胞，观察体内成瘤情况，待肿瘤出现，每隔3天用游标卡尺测量新生肿瘤的大小并记录绘制对照组与实验组的肿瘤生长曲线。

结果表明感染对照病毒的Huh7细胞在接种后第18天检测出肿瘤生长，而感染慢病毒lenti-HNF1A-AS1的Huh7细胞则在第21天才检测到有肿瘤生成；在后续观察时间中，感染慢病毒lenti-HNF1A-AS1的Huh7细胞接种的裸鼠肿瘤生长速率明显低于对照慢病毒lenti-Ctrl组(图13A)，且对照组所形成的肿瘤较实验组明显较大、较重(图13B)，分离肿瘤组织，real-timePCR检测结果显示实验组肿瘤组织中HNF1A-AS1的表达水平高于对照组肿瘤组织(图13C)，上述结果表明HNF1A-AS1过表达可明显抑制Huh7细胞的体内成瘤能力。

实施例11：HNF1A-AS1对实验性肝癌的治疗作用

用可表达荧光素酶(fireflyluciferase,LUC)基因的慢病毒(pSin-EF2-LUC-Pur)感染肝癌细胞Huh7，嘌呤霉素筛选获得可稳定表达LUC的肝癌细胞株。将荧光素酶基因标记的肝癌细胞直接注入NOD/SCID小鼠肝内(细胞数量约2×10⁶/只)，并用活体生物体内成像系统动态监测肿瘤生长情况，待成瘤后(约10-14天)根据监测到瘤体的荧光强度将小鼠大致均匀分为2组，每组10只，通过尾静脉分别注射慢病毒Lenti-HNF1A-AS1或对照病毒Lenti-Ctrl。每隔5天用活体生物体内成像系统监测肿瘤生长情况，观察小鼠存活时间、生长状态及腹水量等，约6-8周后处死小鼠。

活体成像动态监测结果表明，注射病毒后实验组肿瘤的荧光检测值明显低于对照组(图14A)。处死小鼠后，可见实验组小鼠肝脏所成肿瘤的大小明显低于对照组小鼠(图14B)。抽提小鼠肿瘤组织的RNA，real-timePCR检测结果表明实验组小鼠肿瘤组织中HNF1A-AS1表达量高于对照组(图14C)。上述结果表明HNF1A-AS1过表达可明显抑制Huh7细胞肝脏原位种植瘤的生长速率，上调HNF1A-AS1对小鼠肝癌种植模型具有良好的治疗效果。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的长链非编码RNAHNF1A-AS1的基因cDNA序列如SEQIDNO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的治疗人体恶性实体瘤药物为提高长链非编码RNA基因HNF1A-AS1基因或其转录产物HNF1A-AS1RNA的表达量的试剂。

4.根据权利要求1或2所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的治疗人体恶性实体瘤药物包括以下任一：

A)HNF1A-AS1RNA；

B)HNF1A-AS1基因；

C)含有HNF1A-AS1基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的表达载体，包括重组质粒、重组病毒、重组病毒载体、非病毒载体。

6.根据权利要求4所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的治疗人体恶性实体瘤药物包括慢病毒重组质粒pCDH-HNF1A-AS1。

7.根据权利要求4至6任一所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的治疗人体恶性实体瘤药物为：包括A)至C)任一活性成份以及药学上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

9.根据权利要求1或2所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的人体恶性实体瘤选自：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、前列腺癌，或生殖腺肿瘤。

10.根据权利要求9所述的一种长链非编码RNAHNF1A-AS1在制备治疗人体恶性实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述的人体恶性实体瘤为肝癌细胞株Huh7、肝癌细胞株Hep3B，或肝癌细胞株MHCC。