CN107828888A - 环状RNA circ‑PTPRA的用途 - Google Patents

环状RNA circ‑PTPRA的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了环状RNA circ‑PTPRA的用途，本发明首先证实了circ‑PTPRA基因的客观存在；通过检测胰腺癌病人中circ‑PTPRA基因表达情况，发现其表达水平明显提高；通过对circ‑PTPRA基因进行细胞功能学的研究，发现过表达circ‑PTPRA基因的胰腺癌细胞生长速度增快、凋亡水平下调，下调circ‑PTPRA基因胰腺癌细胞株生长速度降低，凋亡水平显著提高。circ‑PTPRA基因及其表达产物作为诊断胰腺癌的标志物，使胰腺癌诊断更加准确、快速，作为制备治疗胰腺癌药物的靶基因为治疗胰腺癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。

Description

环状RNA circ-PTPRA的用途
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种环状RNA circ-PTPRA的用途。
背景技术
胰腺癌(Pancreatic cancer)是高恶性、预后极差的一种恶性肿瘤，在过去40年里患者5年生存率一直在5％左右。由于胰腺是腹膜后器官，位置隐蔽，早期胰腺癌很难被发现，多数患者确诊时已是晚期，加之病死率极高，因此被称“癌中之王”，是造成人口死亡的十大恶性肿瘤之一。近年来，胰腺癌发病率逐渐上升，据统计2015年全国新发胰腺癌病例9万例，另有7.9万人死于胰腺癌，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。故深入研究胰腺癌发生和发展中的分子机制、开发新的诊断标志物和治疗靶点是当前胰腺癌研究的热点和重点。
环状RNA(ciucular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征,这些特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
Circ-PTPRA(CircBase ID：hsa_circ_0006117)，其在基因组上的定位为：chr20:2944917-2945848，相应的线性基因为PTPRA(NM_002836)，环化序列有421个碱基，包含PTPRA基因的第8和第9外显子。PTRPA编码受体酪氨酸蛋白磷酸酶α(R eceptor-typetyrosine-protein phosphatase alpha)，有报道PTPRA在肺鳞癌上调，与能肺癌的不良预后相关，但在胰腺癌中没有研究。
发明内容
本发明的目的在于根据发明人对环状RNA circ-PTPRA在人胰腺癌中的表达及其对胰腺癌细胞生物学功能的调节作用的研究，提供基于circ-PTPRA基因及其表达产物在胰腺癌的诊断试剂盒和治疗药物的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种胰腺癌诊断试剂盒，所述胰腺癌诊断试剂盒包括检测环状RNA circ-PTPRA的试剂，所述环状RNA circ-PTPRA的CircBase ID为hsa_circ_0006117。
作为本发明所述的胰腺癌诊断试剂盒的优选实施方式，所述试剂包括扩增RNAcirc-PTPRA的引物。
作为本发明所述的胰腺癌诊断试剂盒的优选实施方式，所述引物包括由如SEQ IDNO:2和SED ID NO:3所示的DNA序列组成的引物对。
本发明还提供一种治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制或阻止circ-PTPRA基因表达的试剂，或者与circ-PTPRA基因表达产物结合，使circ-PTPRA基因表达产物失去活性的试剂；所述circ-FOXP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
作为本发明所述的药物组合物的优选实施方式，所述试剂包括用于沉默circ-PTPRA基因表达的shRNA或siRNA。
作为本发明所述的药物组合物的优选实施方式，所述siRNA的正义链序列如SEQID NO:4所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供了环状RNA circ-PTPRA在制备胰腺癌诊断试剂盒的用途，所述环状RNA circ-FOXP1的CircBase ID为hsa_circ_0006117。
本发明还提供了circ-PTPRA基因及其表达产物作为靶点在制备或筛选治疗胰腺癌的药物中的用途，所述circ-PTPRA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明首先通过设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR证实circ-PTPRA基因的客观存在；
2)本发明通过检测胰腺癌病人中circ-PTPRA基因表达情况，发现其表达水平明显提高，因此，环状RNA circ-PTPRA可作为胰腺癌的诊断标志；
3)本发明通过对circ-PTPRA基因进行细胞功能学的研究，发现过表达circ-PTPRA基因的胰腺癌细胞生长速度增快、凋亡水平下调；下调circ-PTPRA基因胰腺癌细胞株生长速度降低，凋亡水平显著提高，因此，该基因的细胞生物学功能研究为制备基因药物和靶向药物提供了依据。
circ-PTPRA基因及其表达产物作为诊断胰腺癌的标志物，使胰腺癌诊断更加准确、快速，作为制备治疗胰腺癌药物的靶基因，为治疗胰腺癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
附图说明
图1为实施例1中circ-PTPRA基因及其表达产物的琼脂糖凝胶电泳图，以Hela细胞作为阳性对照。
图2为QPCR检测胰腺癌和相应癌旁组织中circ-PTPRA和GAPDH的表达水平结果对比图(N：癌旁组织，T：胰腺癌组织)。
图3为实施例3中circ-PTPRA过表达质粒及siRNA效能的验证结果。
图4为实施例4中在胰腺癌细胞BxPC3中特异性siRNA干扰circ-PTPRA基因后的细胞生长曲线示意图，其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的490nm吸光值。
图5为实施例4中过表达质粒转染BxPC3胰腺癌细胞后的细胞生长曲线示意图，其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的490nm吸光值。
图6为实施例5中在胰腺癌细胞BxPC3中特异干扰或过表达circ-PTPRA基因后的细胞凋亡实验结果示意图(NC，negative control，阴性对照)。
具体实施方式
本发明首先通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来PTPRA基因的环状RNA，并通过一代测序的方法测定出来了环状RNA circ-PTPRA的准确的环化位点，确定了PTPRA基因表达一种由421个核苷酸组成的，具有闭合环状结构的环状RNA分子。circ-PTPRA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，本发明通过采用荧光定量PCR的方法检测circ-PTPRA基因在胰腺癌样本中的表达差异，结果显示circ-PTPRA基因在胰腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平。故可制作检测该基因表达变化的试剂盒以用于诊断胰腺癌。
接着，我们对circ-PTPRA基因进行了体外细胞功能学的研究，通过将circ-PTPRA基因序列特异性siRNA序列转染到BxPC3胰腺癌细胞系，以建立该基因表达下调的细胞株。转染了circ-PTPRA基因siRNA序列的胰腺癌细胞与转染空载体的对照胰腺癌细胞相比，其增殖速度显著下调，凋亡水平显著提高；接着，我们构建了circ-PTPRA过表达质粒，观察到转染了circ-PTPRA过表达质粒的细胞相比空白载体的细胞，凋亡增殖速度显著提高，凋亡水平显著下调。因此，circ-PTPRA基因及其表达产物可以应用在制备治疗胰腺癌的药物中。
上述应用中，可特别针对胰腺癌进行制备用于胰腺癌治疗的药物和方法、也可制作用于胰腺癌的诊断的试剂。
本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例一：RT-PCR反应检测circ-PTPRA基因在胰腺癌组织中的表达。
具体实验方案如下：
1、RNA提取
1)组织处理：取10mg左右组织加入1mL Trizol，用匀浆机匀浆；离心15分钟，12000g，取上清液。
2)向上清液中加入200μL氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
3)4℃，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA，脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
4)取上清液到新的EP管内；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。
5)小心去掉上清液，注意不要丢失RNA沉淀，加入1mL 75％乙醇,上下颠倒，使沉淀块重悬起。
6)4℃，12000g离心10分钟，小心去掉上清液，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。
7)加入适量体积(20～30μL)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
8)取出2μL定量，测量buffer:10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录。(1A260＝40μg/mL，A260/A280＝1.8～2.1)
2、cDNA逆转录
1)实验体系
M-MLV Reverse Transcriptase：
置于冰上，5min后加入
3、引物：环状RNA引物为反向引物，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。以Hela细胞作为阳性对照。使用的引物如下表所列：
4、PCR：以GAPDH作为内对照。PCR的反应体系：每个反应管中分别加入2μL 10×Buffer，分别加入4μL dNTP，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL cDNA模板，0.5μL KOD Plus酶，加水至20μL。PCR反应条件如下：94℃，5分钟预变性；94℃，20秒变性；60℃，30秒退火；68℃，30秒延伸；35个循环，最后68℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图1。RT-PCR证实circ-PTPRA在胰腺癌组织中的表达。环状RNA引物为反向引物，以Hela细胞作为阳性对照，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。
实施例二：QPCR检测胰腺癌中circ-PTPRA的表达情况
1、RNA提取：同实施例1；
2、cDNA逆转录：同实施例1；
3、QPCR扩增实验
1)实验体系：
2)反应条件：
第一步：95℃2min
第二步(40个循环)：95℃3秒，60℃30秒
第三步60～95℃溶解曲线
3)上机进行目标基因扩增
4)qPCR相对定量结果
目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。QPCR检测胰腺癌和相应癌旁组织中circ-PTPRA和GAPDH的表达水平，结果见图2。由图2可知，在10对胰腺癌临床组织样本中检测circ-PTPRA的表达，结果显示circ-PTPRA在癌组织中显著上调。
实施例三：circ-PTPRA干扰片段和过表达质粒构建
1、circ-PTPRA干扰片段设计：在上海吉玛公司合成siRNA序列。circ-PTPRA的siRNA正义链核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。Control阴性对照的核苷酸正义链序列如SEQ ID NO:6，反义链序列如SEQ ID NO:7所示。
2、过表达质粒构建：合成circ-PTPRA线性全序列，序列经过退火成双链DNA片段，通过多克隆位点插入到LV-Circ载体，重组质粒通过测序进行鉴定，Control阴性对照为未插入序列的LV-Circ空载体。
3、干扰和过表达效能验证：
1)细胞消化后，接种至24孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；
2)第二天细胞密度为80％，吸去培养基；
3)取0.5μg质粒或5μL干扰片段和0.5μg的内参质粒溶于250μL opti-MEM中，混匀、静置，记管A；
4)将1.5μL LipofectamineTM2000溶于250μL opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5min，记管B；
5)将B管加入至A管中，混匀，室温静置20min，滴加至24孔板孔中，混匀，37℃、5％CO2培养箱中培养；
6)4小时后，吸去转染培养基，加入2mL完全培养基，继续培养；
7)24小时后，收集细胞，进行qPCR相对定量分析。
设计干扰circ-PTPRA表达的siRNA片段以及过表达circ-PTPRA的质粒。将circ-PTPRA基因特异的siRNA或过表达质粒转染胰腺癌细胞株BxPC3，图3的qPCR检测结果显示siRNA能有效降低circ-PTPRA表达，而过表达质粒能显著提高circ-PTPRA表达水平。
实施案例四：敲低或过表达circ-PTPRA基因对胰腺癌细胞增殖能力测定
1)将转染了cir-PTPRA或过表达circ-PTPRA的BXPC-3细胞提前一天消化成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为4×104个/ml，分到96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为4×103个，各处理9孔。
2)待细胞贴壁后分别在不同的时间点(24h、48h、72h)加入MTS试剂，比例为1：10，即100μL培养液加入10μL检测液。
3)37℃孵育1h后，酶标仪检测490nm吸光值。
图4为在胰腺癌细胞BxPC3中特异性siRNA干扰circ-PTPRA基因后的细胞生长曲线示意图，由图4可以看出，干扰circ-PTPRA表达胰腺癌细胞株增殖减慢；图5为过表达质粒转染BxPC3胰腺癌细胞后的细胞生长曲线示意图，由图5可知，过表达circ-PTPRA胰腺癌细胞株增殖加快。
实施案例五：敲低或过表达circ-PTPRA基因对胰腺癌细胞凋亡的影响
1)将转染了cir-PTPRA或过表达circ-PTPRA的BxPC-3细胞用无EDTA胰酶消化并收集细胞，PBS清洗细胞二次；
2)用1倍的Binding Buffer重悬细胞为1×106个细胞/mL；
3)取100μL上述悬液至流式管中；
4)分别加入5μL Annexin V和5μL 7-AAD；
5)混匀，室温避光孵育15min；
6)加入400μL的Binding Buffer混匀后1小时内进行流式检测。
图6为在胰腺癌细胞BxPC3中特异干扰或过表达circ-PTPRA基因后的细胞凋亡实验结果示意图，图6结果显示circ-PTPRA表达下调的胰腺癌细胞株凋亡增加，过表达circ-PTPRA凋亡减少。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第一医院;广州永诺生物科技有限公司
<120> 环状RNA circ-PTPRA的用途
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 421
<212> DNA
<213> 人类
<400> 1
ataagcatgg attcctggtt cattcttgtt ctgctcggca gtggtctgat atgtgtcagt 60
gccaacaatg ctaccacagt tgcaccttct gtaggaatta caagattaat taactcatca 120
acggcagaac cagttaaaga agaggccaaa acttcaaatc caacttcttc actaacttct 180
ctttctgtgg caccaacatt cagcccaaat ataactctgg gacccaccta tttaaccact 240
gtcaattctt cagactctga caatgggacc acaagaacag caagcaccaa ttctataggc 300
attacaattt caccaaatgg aacgtggctt ccagataacc agttcacgga tgccagaaca 360
gaaccctggg aggggaattc cagcaccgca gcaaccactc cagaaacttt ccctccttca 420
g 421
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcattgttgg cactgacaca t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acggatgcca gaacagaacc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctccttcag ataagcatgg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccatgctta tctgaaggag g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (8)

1.一种胰腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述胰腺癌诊断试剂盒包括检测环状RNAcirc-PTPRA的试剂，所述环状RNA circ-PTPRA的CircBase ID为hsa_circ_0006117。
2.根据权利要求1所述的胰腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增RNAcirc-PTPRA的引物。
3.根据权利要求2所述的胰腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述引物包括由如SEQ IDNO:2和SED ID NO:3所示的DNA序列组成的引物对。
4.一种治疗胰腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括抑制或阻止circ-PTPRA基因表达的试剂，或者与circ-PTPRA基因表达产物结合，使circ-PTPRA基因表达产物失去活性的试剂；所述circ-PTPRA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述试剂包括用于沉默circ-PTPRA基因表达的shRNA或siRNA。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的正义链序列如SEQ IDNO:4所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO:5所示。
7.环状RNA circ-PTPRA在制备胰腺癌诊断试剂盒的用途，其特征在于，所述环状RNAcirc-FOXP1的CircBase ID为hsa_circ_0006117。
8.circ-PTPRA基因及其表达产物作为靶点在制备或筛选治疗胰腺癌的药物中的用途，其特征在于，所述circ-PTPRA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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