CN1374316A - 大环状靶特异性反义核酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了一种能够有效消除RNA和蛋白质表达的大环状靶特异性反义分子。大环状反义分子用来治疗任何人类疾病,在该疾病中基因表达调节能有益于干涉疾病的开始和发展。

Description

大环状靶特异性反义核酸化合物
连续资料
本申请要求了2001年10月13日提交的专利PCT/KR01/01730的优先权，该专利内容以其全文在此引用。
发明背景
1.发明领域：
本发明涉及反义技术领域。本发明还涉及在治疗和基因功能鉴别系统中使用反义技术。
2.背景描述：
反义分子通过沃森-克里克碱基配对与mRNA的互补序列结合。反义寡核苷酸(AS-oligos)在通过以序列特异的方式降低基因的表达来对基因进行功能性研究中是非常有价值的(Thompson等，Nature，314，363-366(1985)；Melani等，Cancer Res.，51，2897-2901(1991)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3379-3383(1989))。已经付出了很大努力来开发能够消除涉及肿瘤发生和发展基因的异常表达的反义抗癌药剂(Kamano等，Leuk.Res.，14，831-839(1990)；Melotti等，Blood，87，2221-2234(1996)；Ferrari等，Cell growth Differ.，1，543-548(1990)；Ratajczak等，Blood，79，1956-1961(1992)；Kastan等，Blood，74，1517-1524(1989)；Thaler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，1352-1356(1996)；Wagner，Nature，372，333-335(1994))。由于它们易于设计和合成以及对靶基因潜在的特异性，合成的AS-oligos已经被广泛的使用。基因表达的反义抑制被认为是由反义DNA-mRNA双链体形成后的RNaseH活性造成，或者是mRNA与核糖体复合物结合运动位阻所造成(Dolnick，Cancer Invest.，9，185-194(1991))。已经有人利用寡核苷酸针对基因组DNA的启动子区域形成三股螺旋来阻止基因表达。而且，与基因组DNA的启动子区竞争的双链体寡核苷酸诱饵也已经形成(Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10023-10026(1991))。在动物模型以及近来的几个临床研究中已经证实了AS-oligos的功效(Offensperger等，EMBO J.，12，1257-1262(1993)；Tomita等，Hypertension，26，131-136(1995)；Nesterova等，Nat.Med.，1，528-533(1995)；Roush，Science，276，1192-1193(1997))。此外，美国和欧洲也已经批准了用于CMV视网膜炎的第一个反义药物。
然而，对于AS-oligos的预期由于结果总是不确定而经常令人失望。应用AS-oligos的一些问题在于靶点的不可接近性(Flanagan等，Mol.Cell Biochem.，172，213-225(1997)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell，7，1095-1106(1996))、核酶的不稳定性(Akhtar等，Life Sci.，49，1793-1801(1991)；Wagner等，Science，260，1510-1513(1993)；Gryaznov等，Nucleic Acids Res.，24，1508-1514(1996))、缺乏序列特异性以及体内各种副作用。利用化学方法修饰的寡核苷酸已经将AS-oligos的稳定性改善到某一程度，其被称为第二代AS-oligos(Helene，Eur J Cancer，27(11)，1466-71(1991)；Bayever等，Antisense Res.Dev.3(4)，383-90(1993)；Baker等，Biochim.Biophys.Acta.，1489，3-18(1999))。硫代磷酸(PS)寡核苷酸和甲基膦酸酯(MP)寡核苷酸已经被大量研究并主要用于增加核酶的稳定性。但是，每种修饰过的AS-oligos都表现出缺乏序列特异性以及对RNaseH的不敏感性。而且，对DNA复制或修复过程中由水解修饰的核酸循环所导致的意外插入突变存在担忧。
已描述了一系列具有增强的稳定性的独特反义分子，称为‘第三代AS-oligos’，其具有：1)茎环结构，2)CMAS(共价闭合多反义)结构和3)RiAS(带状反义核酸)结构(Moon等，Biochem J.，346，295-303(2000)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell，7，1095-1106(1996)；Moon等，J Biol Chem.，275(7)，4647-53(2000))。CMAS和RiAS都表现出对生物流体中外切核酸酶和核酸酶的稳定性。这些反义分子对特异性的减少靶mRNA也有效。但是，本领域中仍然需要开发具有更简易以及具有增强的结合效率的反义分子。
某些噬菌体，如M13噬菌体，具有一条单链环状基因组，其被用于DNA测序分析以及突变研究。M13噬菌粒，其作为用于构建重组噬菌体的质粒能改建成产生大量包含某特定基因的反义序列的环状单链基因组DNA。这种生产反义DNA的方法利用了与共价闭合结构相关的核酸酶的稳定性，高序列保真度，消除费力的靶点搜寻以及容易的构建反义文库。
α-肿瘤坏死因子(TNF-α)对于正常的免疫应答(Perkins等，ArthritisRheum.，41(12)，2205-10(1998))、败血症休克(Camenisch等，J.Immunol.，162(6)，3498-503(1999))以及当生产过量时移植物对宿主排斥反应(Hill等，J.Immunol.，164(2)，656-63(2000))是必须的细胞因子。TNF-α也是一种典型的促炎细胞因子，与关节炎、过敏反应和其它免疫失调包括败血症和炎症状况都密切相关(Perkins等，Arthritis Rheum.，41(12)，2205-10(1998))。TNF-α表达能用脂多糖(LPS)处理大鼠单核细胞系WRT7/P2来诱发。
核因子-κB(NF-κB)调节多种细胞因子(Collins，Lab Invest.，68，499-508(1993))；Collins等，FASEB J.，9，899-909(1995)和粘着受体(Thanos等，Cell，80，529-532(1995))的基因。在巨噬细胞、平滑肌细胞和人关节巩膜组织的内皮细胞中都能检测到活化的NF-κB(Defillipi等，Curr Top Microbiol Immunol.，184，87-98(1993))，这表明NF-κB在炎症和增殖过程中的重要作用(Brand等，J Clin Invest.，97，1715-1722(1996))。
致癌基因ras在人肿瘤中经常处于活化状态。RAS p21蛋白属于GTP/GDP-结合蛋白大家族，位于质膜的内侧。ras基因内的一个点突变能够使RAS p21蛋白不能够水解其所结合的GTP，从而传递胞内信号，导致不可调节的细胞增殖(Alberts等，Molecular biology of the cell.Garland，New York，1273-1290(1994))。
原癌基因c-myb在造血细胞的增殖和分化中扮演重要的角色。造血细胞表现出差别表达c-myb并且对于终末分化展示了较少的基因表达(Melotti等，Blood，87，2221-2234(1996)；Ferrari等，Cell growth Differ.，1，543-548(1990))。在白血病细胞中经常能够发现c-myb基因产物的过量表达(Melani等，Cancer Res.，51，2897-2901(1991)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3379-3383(1989)；Kamano等，Leuk.Res.，14，831-839(1990))。
MYC癌蛋白在肿瘤细胞生长中起到决定性的作用(Packham等，Biochim.Biophys.Acta.，1242，11-28(1995)；Henriksson等，Adv.Cancer Res.，68，109-182(1996))。MYC能够诱导处于静止期的细胞进入细胞周期(Eilers等，Nature，340，66-68(1989))，表明其对于持续的细胞生长是必须的，而其抑制能够干涉有丝分裂信号并诱导细胞进入末期分化(Heikkila等，Nature，328，445-448(1987)；Sawyers等，Cell，70，901-910(1992))。
细胞周期调节基因的主要组分代表为一类被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的蛋白激酶家族。对于控制细胞周期从一个时相转化到另一个时相的分子事件的更深刻理解使人们发现了CDK(Morgan，Nature(Lond.)，374，131-134(1995))。CDK直到与它们的共活化剂一单独的细胞周期蛋白结合后才变为活化状态。细胞进入G1期时，CDK4和CDK6的激酶活性对于通过早期G1检查点的转化是必须的(Sherr，Cell，73，1059-1065(1993))，CDK2-细胞周期蛋白E复合体的活性对于从G1期到S期的转化是必须的(Ohtsubo等，Mol.Cell.Biol.，15，2612-2624(1994))。开发对于CDK活性有效的反义寡核苷酸用于抑制肿瘤细胞生长是一条有吸引力的途径。
本领域需要采用针对各种人类疾病的更特异、更稳定和更有效的反义分子。
发明概述
本发明克服了上述问题，并提供了反义分子、反义分子的组合物制备这种反义分子的方法以及采用所要求的分子和组合物的方法，这些分子和组合物具有抑制或显著修改某些靶基因表达。在这些靶基因的表达是造成癌症的情况下，将所发明的反义分子施用细胞会导致靶RNA的切除，这会抑制细胞的增殖，反过来又会导致治愈或者至少改善了与癌症相关的生存。
应该理解到本发明不仅局限于治疗癌症。本发明反义化合物的原理可以应用于有效消除任何靶RNA。这种以治疗肿瘤、清除病毒感染产生的副作用、治疗代谢疾病、免疫失调等形式所表现的化学活性都是反义治疗的结果。
本发明进一步包含所要求的反义分子与可药用载体的组合物。
本发明指一种大环状核酸分子，包括靶点特异性反义区域，其能够特异性的结合于一种基因所表达的一部分RNA，其中所述的反义分子能够有效的降低所述基因的表达。大环状核酸分子至少可以约3,000个核苷酸的长度，分子的反义区至少可以有50个核苷酸的长度。进一步，反义区域可以基本上与整个基因序列相互补。
在本发明的一个实施方案中，大环状核酸分子可以为重组噬菌体或噬菌粒基因组的单链形式，例如丝状噬菌体，以及尤其是噬菌体M13。
在本发明的另一个实施方案中，公开了一种包含如上所述大环状核酸分子的载体。该载体可以来源于丝状噬菌体。同样在本发明的另一个实施方案中，公开了包含该载体的宿主细胞。
本发明还指一种组合物，包含大环状核酸分子和其可药用载体，该分子包含靶特异性反义区域，能够特异性的结合到一种基因所表达的部分RNA上，其中所述的反义分子能够有效降低所述基因的表达。
在本发明的另一个实施方案中，公开了一种通过大环状核酸分子靶向与编码所选定蛋白的RNA来抑制所选定的蛋白表达的方法，其中该方法包括将核酸分子靶向RNA使得核酸分子能够与RNA杂交形成与RNA的双链体，该双链体抑制了选定蛋白的表达。靶蛋白可以导致细胞增殖或癌症。癌症可以为但不限于白血病、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、脑癌或前列腺癌。具体的，癌症可以为白血病、子宫癌或乳腺癌。
可替代的，靶蛋白可以为肿瘤坏死因子、核因子、MYB、MYC、RAS或细胞分裂激酶。如果靶蛋白是病毒蛋白，病毒可以是但不限于疱疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、单核细胞增多症病毒(EB病毒)、肝炎病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)。
靶蛋白可以造成代谢疾病或免疫失调。代谢疾病可以是但不限于苯丙酮尿症(PKU)、原发性甲状腺机能减退、半乳血糖症、血色素异常、I型和II型糖尿病或肥胖症。如为免疫失调疾病，其可以是但不限于斯耶格伦综合征、抗磷脂综合征、免疫复合体疾病、紫癜、舍恩莱因-亨诺赫、免疫缺陷综合征、全身性红斑狼疮、免疫缺陷、风湿病、肾或肝硬化。
本发明还指一种嵌合的大环状核酸分子，其包含靶特异性反义区域，能够特异性的结合到由多个靶基因所表达的多个靶RNA，其中所述的核酸分子能够有效的降低所述基因的表达。而且，还公开了包含嵌合的大环状核酸分子和可药用载体的组合物。
本发明还指一种通过大环状核酸分子靶向编码多个所选定蛋白的多个RNA分子来抑制多个选定蛋白表达的方法，其包括：
(1)产生包含靶向于所述多个靶RNA的靶特异性反义区域的嵌合大环状核酸分子；和
(2)靶向多个RNA使得嵌合的大环状核酸分子与所述RNA杂交形成双链体，其中该双链体能够降低多个选定蛋白的表达。
进一步，本发明还指一种抑制细胞增殖的方法，包括：
给所述细胞施用一种大环状核酸分子，其包含一个或多个基本与一个或多个靶基因互补的反义区，其中通过抑制所述基因的表达来抑制细胞增殖。
在另一个实施方案中，公开了一种用来制备能抑制选定蛋白表达的包含靶特异性反义区的大环状核酸分子的方法，包括：
(1)将目的靶特异性DNA插入到噬菌体或噬菌粒基因组中；
(2)使噬菌体能够产生单链形式，其为大环状核酸分子；以及
(3)通过凝胶柱分离所述的大环状核酸分子。
本发明还提供了一种用来筛选基因功能的方法，包括：
(a)产生含有与人细胞中表达的RNA基本互补的反义核酸区的大环状核酸分子；
(b)用大环状核酸分子接触细胞使得反义分子能够进入细胞并与细胞中表达的RNA杂交从而抑制其基因产物的表达；和
(c)分析细胞表型变化。
在上述方法中，步骤(a)到(c)可以应用于所述大环状核酸分子的文库。而且，方法中的核酸分子可以为单链形式的重组噬菌体或噬菌粒基因组。
本发明中的这些和其它目的可以通过本发明下面的描述、所附参考图以及权利要求来更充分理解。
附图简述
从下面给出的详述中将更充分理解本发明，并且仅由说明方式给出的附图不是对本发明的限制，和其中；
图1表明了大鼠TNF-α的噬菌体基因组环状反义分子(rTNFα-M13AS)的示意图。大鼠TNF-α被克隆到噬菌粒载体pBS-KS(-)的多克隆位点。通过将TNF-α插入到与lacZ基因相同的方向得到了单链有义分子，通过将TNF-α基因以反方向插入到lacZ基因得到反义分子。当用辅助噬菌体M13KO7共同感染时能够从这些构建体中拯救出TNF-α单链反义或有义分子
图2表明TNFα-M13AS的DNA序列。用T3测序引物进行DNA测序以证实在TNFα-M13AS中存在TNF-α反义序列。有义序列显示的是TNF-α，并且显示在箭头所指的右端。模板中实际的反义序列是反向并且互补的。
图3A和3B表明噬菌体基因组反义分子的层析纯化。
A.从凝胶滤柱层析中对环状反义分子的洗脱图。Sephacryl S-1000超细(1.0×50cm)树脂被用于DNA分级分离。洗脱缓冲液为包含0.2MNaCl的50mM Tris-HCl(pH8.3)，流速设定为0.3ml/分钟。每个分离级分的样品体积设定为70μg(70μl洗脱液浓度1mg/ml)。
B.从凝胶滤柱层析中得到的级分电泳图。1道为粗DNA，2-8道组分I-VII相应于保留时间。纯化的DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳并用溴乙锭染色显色。
图4A和4B表明包含有TNF-α序列的噬菌体基因组的反义分子的生化特性：
A.TNFα-M13AS分子的特征。1道，入HindIII DNA分子量标记物；2道，包含TNFαcDNA的质粒DNA(TNFα-质粒)；3道，TNFα-M13AS：4道，TNFα-质粒用Xho I酶切；5道，TNFα-M13AS质粒用Xho I酶切；6道，TNFα-质粒用S1核酸酶酶切；7道，TNFα-M13AS用S1核酸酶酶切；8道，TNFα-质粒用Xho I酶切后再用外切核酸酶III温育；9道，TNFα-M13AS用Xho I酶切后再用外切核酸酶III温育。TNFα-质粒或TNFα-M13AS按照厂商的说明和各种酶温育。
B.TNFα-M13AS的稳定性检测。噬菌体基因组的反义分子在30％胎牛血清中温育不同的时间。1-8道用血清处理不同的时间和9道，为假性处理的对照。用血清处理的反义分子在1％琼脂糖凝胶中电泳并用溴乙锭染色显色。
图5A和5B表明TNFα-M13AS和双链质粒分子的熔解温度图。当温度从30℃上升到95℃时在3分钟间隔中每0.5℃的增量检测吸光度。A.包含TNFα插入的双链噬菌粒的Tm1/2图。B.单链环状反义分子TNFα-M13AS的Tm1/2图。
图6A-6D表明在WRT7/P2细胞中TNFα-M13AS在TNFαmRNA水平的反义活性。在A，C和D中显示的结果得自于RT-PCR，在B中显示的结果得自于Southern杂交。RT-PCR用全RNA来进行。细胞用TNFα-M13AS(1.4nM，1.65μg/ml)与脂转染胺试剂(Lipofectamine)(6.6μg/ml)形成的混合物来处理。在用反义分子进行脂质体转染后，在WRT7/P2细胞中用LPS处理来诱导TNF-α产生，然后分离全RNA。A.用两套引物：或TNF-α引物或β-肌动蛋白引物来进行RT-PCR：1道，脂质体；2道，TNFα-M13AS(反义)；3道，TNFα-M13SE(有义)；4道，M13SS(没有反义插入的噬菌体基因组DNA)。B.将来自A组的DNA转移到尼龙膜上并用的标记20多聚体寡核苷酸作探针。C.通过RT-PCR扩增IL-1β和GAPDH来检查非特异性反义的作用。总RNA和单链环状分子，包括反义化合物的量与A组中的相同。扩增的PCR片段在1％琼脂糖凝胶中电泳并用溴乙锭染色显色。D.TNFα-M13AS对TNFαmRNA表达的剂量依赖作用。1道，脂质体；2-5道，TNFα-M13AS；6道，TNFα-M13SE；和7道，M13SS。
图7A和7B表明在THP1细胞中NFκB-M13AS对人NF-κB mRNA水平的作用。用不同量的NFκB-M13AS、NFκB-M13SE或M13SS转染THP1细胞(1×105细胞/孔)。脂质体转染后，细胞用PMA(160nM)刺激6小时。总RNA被分离并进行RT-PCR。A.通过NFκB-M13AS处理以剂量依赖方式降低了NF-κB的信使RNA水平。根据图，1道左侧没有标记道为分子量标记物(100bp梯级标记)，1道，假性处理的对照；2-4道，NFκB-M13AS(分别为0.14nM、0.28nM和0.56nM)；5-6道，NFκB-M13SE(分别为0.28nM和0.56nM)；7-8道，M13SS(0.28nM和0.56nM)；在9道右侧没有标记的道为脂转染胺试剂。B.A组中的DNA条带被转移到尼龙膜上并进行Southern杂交。
图8A-8D表明c-myc-M13AS、c-myb-M13AS、k-ras-M13AS和cdk2-M13AS对于它们各自基因mRNA表达的作用。K562和HL-60细胞用c-myc-M13AS和c-myb-M13AS分子分别转染。A.在K562细胞上进行RT-PCR的结果。1-2道，c-myc-M13AS(分别为0.56nM和1.12nM)；3-4道，c-myc-M13SE(分别为0.56nM和1.12nM)；5道，M13SS(0.56nM)。B.在HL-60细胞上进行RT-PCR的结果。1-2道，c-myb-M13AS(分别为0.56nM和1.12nM)；3-4道，c-myb-M13SE(分别为0.56nM和1.12nM)。C和D.HeLa细胞分别用不同量的k-ras-M13AS和cdk2-M13AS分子来处理。C.1-2道，k-ras-M13AS(分别为0.28nM和0.84nM)；3-4道，k-ras-M13SE(分别为0.28nM和0.56nM)；5-6道，M13-SS(分别为0.28nM和0.56nM)。D.1-3道，cdk2-M13AS(分别为0.28nM、0.56nM和0.84nM)；4-6道，cdk2-M13SE(分别为0.28nM、0.56nM和0.84nM)。扩增的DNA片段在1％琼脂糖凝胶中电泳并用溴乙锭染色显色。
图9A和9B表明通过施用噬菌体基因组反义分子降低了TNFα和CDK2的表达。A.释放到培养基中的TNF-α用ELISA测量。WRT7/P2细胞用TNFα-M13AS、TNFα-M13SE或M13SS转染(分别为1-3道)。用30μg/ml LPS诱导TNF-α6小时。细胞培养物中的上清液在检测前立即稀释50倍。每个柱值代表了三次重复试验的平均值±S.D。统计学显著性用斯氏t检验(方差分析，*p＜0.05)来计算。B.在用cdk2-M13AS分子处理后HeLa细胞中对CDK2用Western印迹分析。
图10A和10B表明噬菌体基因组反义分子对MCF-7和HeLa细胞的增殖的作用。MTT分析用k-ras-M13AS和cdk2-M13AS分别处理后测定对细胞生长的抑制。A.MCF-7细胞以1∶3(w/w)的比率用0.28nM或0.56nM k-ras-M13AS与Lipofectamine 2000形成的复合物处理：□为k-ras-M13AS； 为k-ras-M13SE；
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为仅裸k-ras-M13AS；和■为仅Lipofectamine 2000。B.HeLa细胞用cdk2-M13AS(0.84nM)与Lipofectamine 2000形成的复合物来处理。柱1，cdk2-M13AS(0.84nM)；柱2，cdk2-M13SE(0.84nM)；柱3，没有脂质体的cdk2-M13AS；和柱4，仅Lipofectamine 2000。每个柱值都代表了三次重复试验的平均值±S.D.。
图11A和11B表明c-myb-M13AS分子对K562和HL-60细胞增殖的作用。MTT分析检测c-myb-M13AS对细胞生长的抑制。构建了两种c-myb-M13AS分子：c-myb-M13AS1和c-myb-M13AS2，它们分别包含0.5kb或1.5kb的c-myb序列。K562(A)和HL-60(B)细胞用c-myb-M13AS(0.84nM)与Lipofectamine 2000形成的复合物来处理。柱1，c-myb-M13AS 0.5kb；柱2，c-myb-M13AS 1.5kb；柱3，c-myb-M13SE 1.5kb；和柱4，仅裸c-myb-M13AS 1.5kb。每个柱值都代表了三次重复试验的平均值±S.D.。
发明详述
本发明是基于发现：大环状核酸分子包含靶特异性反义区，尤其是由噬菌体产生的大环状核酸分子可用作有效的基因表达抑制物。
在本发明中，“a”和“an”用来指单个和多个物体。
如本发明所用，术语“反义”是指反义核酸(DNA或RNA)和其类似物，也指一系列化学物种，这些化学物种具有一系列核苷酸碱基序列，能通过与靶序列的核苷酸碱基氢键相互作用识别多核苷酸靶序列或序列部分。靶序列可以是单链或双链RNA，或单链或双链DNA。
这些RNA或DNA类似物包括但不限于2′-O-烷基糖修饰、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲缩醛(formacetal)、3′-硫代甲缩醛(3′-thioformacetal)、砜、氨基磺酸酯和硝基骨架修饰、氨基化合物和其中碱基部分已被修饰的类似物。而且，分子的类似物可以为多聚物，其中的糖部分已被其它合适的部分修饰或替换，产生的多聚物包括但不限于吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物。这些类似物包括上述修饰的不同组合，包含连接基团和/或糖或碱基的结构修饰来改进RNaseH介导的靶RNA的破坏、结合亲和力、核酸酶抗性和/或靶特异性。
如本发明所用，术语“反义疗法”为一个遗传名词，其包含大环状核酸分子的特异性结合，该分子包括了对于靶基因的反义区段，从而在体内或体外使非所需的目的靶DNA或RNA序列失活。
如本发明所用，“细胞增殖”是指细胞分裂。如本发明所用，术语“生长”包括由于较快的细胞分裂和由于较慢的编程性细胞死亡速率即细胞死亡所造成的细胞数目的增加。非控制的细胞增殖是癌细胞或非正常细胞类型的标志。正常非癌细胞以特定细胞类型的特征频率有规律的分裂。当一个细胞已经转化为癌细胞状态时，细胞分裂和增殖不受控制。抑制增殖或生长能够调节不受控制的细胞分裂。
如本发明所用，“嵌合大环状核酸分子”指包含多个基本与多个靶基因互补反义核酸区段的大环状核酸分子。反义核酸的区段可以用每个区段之间间隔区使其直接或间接的相互联系或连接。
如本发明所用，”丝状噬菌体”指用于生产本发明的大环状核酸分子的运载体。可以使用噬菌体或噬菌粒。在这个例子中，所需序列插入或克隆到运载体中使得当单链分子能够由噬菌体或噬菌粒产生时，大环状核酸分子被产生出来。DNA或RNA噬菌体可以用于此目的。特别的，可以使用丝状噬菌体。丝状噬菌体如M13、fd和f1具有丝状衣壳以及环状ssDNA分子。它们的生命周期包括细胞内dsDNA中间复制形式，该形式早于衣壳化被转化为ssDNA。这种转化提供了制备ssDNA的一种方法。噬菌体M13已经被改造用作克隆载体。
如本发明所用，“基因”指基因完整的核酸序列或基因的部分序列。
如本发明所用，术语“抑制”和“降低”可以替换使用，表示降低基因表达或细胞增殖或任何其它表型特性。
如本发明所用，“大环状核酸分子”也被称为“大环状反义分子”为一单链分子，其至少包含一个与靶基因或RNA序列基本互补并结合反义区，该反义区抑制或降低了基因表达以及在某种情况下该基因同种型的表达。环状单链核酸分子可以包含对于一个或几个基因的有义或反义序列，只要该序列对于靶基因为反义形式。
大环状核酸分子可以通过化学方法合成。但通常其由丝状噬菌体系统生产，该系统包括M13和来源于M13的噬菌粒。当大环状核酸分子被从噬菌体中产生出来时，其也可以称为“噬菌体基因组反义复合物”。
在某种意义上，大环状核酸分子比通常的寡核苷酸序列要长，后者约为20到30核苷酸。相反，大环状核酸分子至少有3,000核苷酸长。通常其范围从约3,000到约8,000核苷酸长。尽管约3,100到约7,000长度的核苷酸可以用于本发明，优选的长度范围约为3,300到约6,000碱基。
可替代的，可以理解对于大环状核酸分子长度没有绝顶的上限和下限。当噬菌体用来产生大环状核酸分子时特别如此，在该情况下噬菌体的大小和至少编码一部分靶基因的插入片段的大小可控制所产生的单链核酸的长度。因此，在一个实施方案中，核酸分子可以为一个噬菌体如丝状噬菌体所能容纳的长度。
大环状核酸分子可以包括特异性的反义序列和外部序列。外部序列可以包括其它各种基因的有义或反义形式。或者，如果噬菌体被用于产生核酸分子，外部序列可以为载体序列。大环状核酸分子的靶特异性反义区的长度可以无限制从稍低于约100核苷酸到超过5,000个核苷酸。通常范围为从约200到约3000核苷酸。更具体的，范围从约400到约2,00核苷酸。靶特异性反义区也可以互补于整个基因。
在另一个实施方案中，反义分子可以由噬菌体基因组中产生，作为噬菌体天然生命周期的一部分。
如本发明所用，“基本互补”意指反义序列与一个反义化合物具有约80％的同源性，该化合物本身与靶RNA互补并特异性结合。通常不需要绝对的互补。任何与靶核酸分子具有足够互补性形成稳定的双链体或三链体的反义分子都被认为是合适的。因为稳定双链体的形式依赖于杂交反义分子的序列和长度以及在反义分子和靶序列之间互补的程度，系统可以容忍与大环状分子互补性中较低的保真度。
如本发明所用，“靶”或“靶向”指制备的反义分子所针对的特定的单个基因。在本发明的一个实施方案中，反义分子来自于在LC-反义化合物中的一个插入。在某些情况下，“靶向”意指反义分子结合或导致被结合到内源性表达的转录文本使得靶基因表达被消除。靶核酸序列可以选自涉及各种恶性肿瘤的基因，包括涉及不同疾病如免疫疾病、感染性疾病、代谢性疾病和遗传疾病或任何其它由基因不正常表达所引发的疾病起始与发展的基因。
本发明的反义分子在生化和生物学活性上发现要优于常规合成的AS-oligos。尽管常规的AS-oligos能容易的用DNA合成仪合成，但它们需要对靶点进行选择。选择靶点的过程有时被命名为“AS-oligos设计”。这个过程费时而且有时是非决定性的。此外，合成的AS-oligos对于核酸酶是不稳定的，具有频繁的序列错误，需要高的生产成本，以及即使在与脂质体形成复合物后表现出较差的细胞吸收。
在本发明的一个实施方案中，公开了由噬菌体产生的单链环状基因组DNA被用于反义载体。具体的，所用的噬菌体可以是M13噬菌体或其任何修饰形式。但可以理解任何能产生单链核酸分子的噬菌体或噬菌粒，病毒或任何克隆运载体都可以使用。优选的，所产生的单链核酸为环状。产生反义分子的DNA分子可以被克隆到运载体的基因组中，例如噬菌体。
在反义研究领域中常规知识已阻碍使用长的反义分子，因为人们认为长AS-oligos具有更少的特异性、合成困难以及对细胞的吸收效率低下。实际上，化学修饰的第二代AS-oligos如硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸如同AS-oligos被延长一样已经降低了序列特异性。而且，线性AS-oligos的合成越来越困难，随着AS-oligos长度的增加序列保真度显著降低。
噬菌体载体使得容易产生包括高序列保真度的反义序列的长单链序列。所发明的反义分子，尽管长度非常规长，但在消除靶mRNA的表达方面仍表现出较好的序列特异性。不被任何反义核酸作用的特定理论或机制所限制，人们认为一旦一小部分反义序列结合到其互补序列上，反义序列就会在全长互补靶序列上拉上拉链。然后反义DNA和有义RNA之间所形成的长双链体作为RNasH活性的底物更稳定地维持着。
发明的反义分子优势结合的另一个原因可能是对于长反义分子存在较高的机会结合到结构暴露的靶点上。信使RNA通过与细胞质中的RNA结合蛋白相互作用在其自身序列内倾向于形成广泛的二级和三级结构。发现了一个对反义分子开放的靶位点，这对于成功的反义活性是关键的。因其较长的长度，噬菌体基因组反义分子不得不具有能够接近暴露的靶mRNA互补序列的某些序列，因此增加了靶mRNA消除的机会。
本发明的反义分子的原理可以应用于任何目的靶基因。尽管如本发明反义分子实施例公开了TNF-α、NFκB、c-myb、c-myc、cdk2和k-ras，本发明的反义分子可制成针对任何目的基因。实际上，本发明的反义分子对于核酸酶具有更显著的稳定性以及有效的靶消除。作例证的序列特异性的降低了靶基因TNF-α、NFκB、c-myb、c-myc、cdk2和k-ras支持了本反义方法的广泛应用。因此，本发明的反义分子可以被用于结合到任何来源的任何靶mRNA序列。
反义活性也在蛋白质水平上被检测以保证靶mRNA和蛋白消除的相关性。施用TNFα-M13AS发现细胞培养基中能显著降低大鼠TNF-α的分泌，从而证实了有效的反义活性。相反的，对照的噬菌体基因组复合物(没有反义插入的单链环状分子)DNA仅表现出TNF-α分泌的轻微减少。通过添加对照反义分子轻微降低TNF-α分泌，这由位于核内体的自由阳离子脂质体的细胞毒性部分能够解释。用阳离子脂质体单独处理的细胞表现出比用脂质体-反义分子复合物处理的细胞更低的存活率。用cdk2-M13AS处理导致相似的CDK2表达的消除。而且，当本发明的基因特异性反义复合物施用到携带c-myb和cdk2的肿瘤细胞系中，观察到生长抑制。
传统AS-oligos当与阳离子脂质体形成复合物后，其细胞吸收能够显著增强。但是，AS-oligos在与不同类型的脂质体形成复合物后表现出不一致和细胞吸收经常无效。相反，噬菌体基因组反义分子由于其自身长度较长形成众多短的茎环结构，表现得更像质粒DNA。实际上，当和不同类型的脂质体形成复合物时，反义DNA表现出一致并增强细胞吸收(数据未显示)。
合成的AS-oligos通常为15到25个核酸残基，只与一个单靶点结合并消除底物mRNA。但是，大多数人类慢性疾病表现出多基因失调需要反义分子能够靶向涉及疾病的多个基因。为满足这个需要，需设计一种具有多重靶向能力的反义分子。但是，由于化学合成中的各种障碍，化学合成这种分子是不切实际的。利用噬菌体基因组DNA，多重反义序列可以通过基因克隆容易构建。而且，具有多重反义序列的噬菌体基因组DNA的序列完整性等于在细菌细胞中扩增的质粒DNA的序列完整性。
用噬菌体基因组反义分子的另一个优势为对于序列变异的广泛耐受性。只要在不同的基因变异体间小块相同序列有超过约15个连续的核苷酸是保守的，本发明的基因组反义分子就有效。这个特性在靶向致病病毒如HIV和HBV多态性株时特别有用，在这些多态性株中同样的反义分子可以用来针对变异形式。此外，只要在来源和靶向的生物体之间的序列变异不是沿着编码序列均匀的扩散，从一个物种如人中产生的这种类型的噬菌体基因组反义分子可以被用于研究其它物种如啮齿动物的基因功能。
反义分子还是通过所谓的“基因敲低(knockdown)”途径研究基因功能的有效手段(De Backer等，Nat.Biotechnol.，19，235-241(2001)；Ji等，Science，293，2266-2269(2001))。在“基因敲低”途径中，基因功能可以在不破坏基因的情况下被阐明。这种策略比通常所用鉴别基因功能的“基因敲除”方法更快。在本发明的一个实施方案中的基因组反义分子，独特的适合于‘海量(massive)’的功能基因组。这些噬菌体基因组反义复合物用于海量功能基因组的一些显著的特性为：1)不需要详尽的反义设计即能构建反义分子，2)用大量单独的克隆来构建反义文库，以及3)较高的反义活性，从而避免由于部分反义活性造成的数据的错误解释。
在本发明的一个实施方案中通过使用噬菌体基因组反义方法，用于海量功能基因组的系统有效性要比常规的AS-oligos方法高几百倍。而且，与用其它间接的系统相反，如DNA芯片、基因表达的连续分析(SAGE)、TIGR直向同源基因对比(TOGA)数据库和蛋白质组，使用发明的噬菌体基因组反义系统的海量功能基因组采用了一种直接基因功能化的系统。
来源于噬菌体系统特别是M13噬菌体系统或相称的噬菌粒系统的环状反义分子是稳定并能够有效的阻断靶基因的表达。噬菌体基因组反义分子在少量时即是有效的，但也能大量的制备。发明的反义分子针对各种类型的癌症、病毒感染、免疫失调、代谢性失调和其它人类疾病是有效的治疗剂，其中调节基因表达对于干涉疾病的发生和发展都有好处。
在治疗应用中，大环状核酸分子能够根据不同给药方式配成制剂，包括口服、局部或局部化给药。技术和配方通常在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中可以找到。活性组分为反义分子其通常结合着一种载体如稀释的赋形剂，包括装填物、补充剂、接合剂、润湿剂、分解质、表面活性剂、可降解的多聚物或滑润剂、依赖于给药模式的性质和配药形式。典型的配药形式包括药片、药粉、液体制剂包括悬浮液、乳化液和溶液、药粒和胶囊。
本发明的大环状核酸化合物的某些类型特别适合于口服给药，这在常规的药物传送条件下需要在将药暴露于胃酸条件下长达4小时，当以持续释放的形式呈递时，能够长达12小时。将这些反义化合物配成以持续释放的形式制剂对于治疗某些疾病非常有利。
可以通过跨粘膜或经皮方法获得大环状核酸分子系统给药，或口服复合物。对于跨粘膜或经皮给药，适合于穿透屏障的渗透剂可以被用于制剂中。这些渗透剂在本领域中通常是已知的，包括，例如用于跨粘膜给药的胆酸盐和梭链孢酸衍生物。此外，去垢剂可以被用来协助透过。跨粘膜给药例如可以是通过用鼻腔喷雾，以及适合于吸入或栓剂给药的制剂。
本发明的大环状核酸分子也能够与适于被试者施用的可药用载体结合。合适的药物载体的例子为各种阳离子脂质体，包括但不限于N-(1-2，3-二油基氧)丙基-n，n，n-三甲基铵氯(N-(1-2，3-dioleyloxy)propyl)-n，n，n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油酰基磷脂酸基乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂质体也是本发明的反义分子的合适载体。其它合适的载体为包含所要求的反义分子的缓释凝胶或聚合体。
大环状核酸分子可以通过任何有效途径施用给病人，包括肌肉注射、静脉内注射、胸内注射、鼻内注射、腹膜注射、瘤内注射、皮下注射、原位注射和口服给药。口服给药需要肠衣以保护所要求的反义分子和其类似物在胃肠道中免被降解。大环状核酸分子可以与一定量的生理上可接受的载体和稀释剂混合，例如盐溶液或其它合适的液体。反义分子还可以与其它保护核酸分子或其类似物在到达其靶点之前免被降解的载体和/或与协助反义分子或其类似物通过组织障碍的载体相结合。
在一个实施方案中，大环状核酸分子以有效抑制癌症或异常的细胞生长的剂量给药。在其它实施方案中，反义分子可以用来治疗病毒感染，如但不限于疱疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、单核细胞增多症病毒(EB病毒)，或呼吸道合胞病毒(RSV)等。此外，也可以治疗代谢性疾病，例如但不限于苯丙酮尿症(PKU)、原发性甲状腺机能减退、半乳血糖症、血色素异常、I型和II型糖尿病或肥胖症等。本发明的反义分子还可以用于治疗其它疾病如免疫性疾病包括，例如但不限于：斯耶格伦综合症、抗磷脂综合症、免疫复合物疾病、紫癜、舍恩莱因-亨诺赫、免疫缺陷综合症、全身性红斑狼疮、免疫缺陷、风湿病等。
任何所施用的特定大环状核酸分子的实际用量依赖于很多因素如疾病或感染的类型和阶段、反义分子对体内其它细胞的毒性、其被细胞吸收的速率、施用核酸分子的病人的年龄和体重。通过常规方法例如：逐渐增加反义分子的剂量使其从对抑制细胞增殖无效到有效，可以确定病人的有效量。预计呈递给疾病细胞的浓度范围从约0.1nM到约30μM都能够有效抑制基因表达并表现出可检测的表型。对于反义分子在治疗癌症或其它疾病化疗应用中测定药理学/药代动力学的方法在本领域是已知的。
大环状核酸分子施用给病人至少持续的时间足够产生所需要效果。为维持有效水平，可有必要每天多次、每天一次或间隔频率较短施用反义核酸分子。对于癌细胞，施用反义分子直到检测不到癌细胞，或降低到进一步治疗不能够明显降低其数量的程度，或者细胞数减少到能够被外科手术或其它治疗处理的程度。施用反义分子的时间长度依赖于多种因素例如癌细胞对于特定分子的吸收速率和细胞对于分子作出反应所需要的时间。
以本发明说明而不是限制方式提供了下列实施例。实施例
实施例1-材料和方法
1.细胞培养
采用单核小鼠细胞系WRT7/P2。从韩国细胞系库(KCLB，Korea)中得到人细胞系THP-1、HL-60(急性原髓细胞白血病)、K562(慢性骨髓白血病)、HeLa(子宫颈癌)和MCF-7(乳腺癌)。这些细胞系维持在补加有10％热灭活的FBS(JBI，Korea)，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640或者EMEM中(JBI，Korea)。细胞于37℃培养在CO2(5％)培养箱中并仔细维持避免过量生长。在脂质体感染前一天用新鲜培养基给细胞换液并在试验的当天用0.4％的台盼蓝检测细胞的存活率。
2.TNF-αmRNA的诱导表达以及编码大鼠TNF-α和人NF-κB的基因的克隆
在WRT7/P2细胞中用脂多糖(LPS，30μg/ml)诱导大鼠TNF-α的表达。在48孔板每个孔中按1×105细胞/孔接种细胞并用LPS处理。在所需要的时间点收集细胞并检测mRNA的量。选择诱导TNF-α表达达到最高水平的LPS温育时间来进行进一步的试验。
从如上所述从扩增的cDNA片段中得到大鼠TNF-αcDNA。包含全部编码序列的TNF-αRT-PCR片段(708bp)用下列引物对扩增：5’-GATCGTCGACGATGAGCACAGAAAGCATGATCC-3’(SEQ IDNO：1)和5-GATCGAATTCGTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO：2)。利用SalI和EcoRI限制性位点，将大鼠TNF-αcDNA片段克隆到pBluescript(pBS)KS(-)载体的多克隆位点，其方向与lacZ基因的方向相同(图1)。
相似的，NF-κB、c-myb、c-myc、k-ras和cdk2基因的cDNA片段用一组PCR引物对(表1)扩增并克隆到经末端补平的pBS-KS(+)载体的EcoRV位点。总用限制性酶切和DNA测序来证实扩增的cDNA片段。
3.用噬菌粒载体和M13KO7辅助噬菌体来构建大环状核酸分子
(1)构建含有有义或反义序列的单链噬菌体基因组
根据标准的克隆程序构建含有特异性针对靶基因的反义区的大环状核酸分子(Sambrook等，Molecular Cloning，1989)。含有pBS-KS(+)或(-)噬菌粒以及适当的cDNA的感受态细菌细胞(XL-1 Blue MRF′)用辅助噬菌体M13K07(NEB Nucleic Acids，USA)感染。在噬菌粒载体中克隆的cDNA的方向决定着是有义还是反义序列。辅助噬菌体感染的细胞生长在2X YT中过夜培养，20％聚乙二醇(PEG 8000)加入到上清液中。噬菌体沉淀在TE(pH8.0)中重新悬浮，噬菌体基因组DNA用苯酚抽提和乙醇沉淀分离。
(2)噬菌体基因组反义分子的纯化
从辅助噬菌体残余的基因组DNA和宿主细菌中纯化噬菌体基因组反义分子，或者用0.8％低熔点(LMP)琼脂糖凝胶中进行小规模纯化，或者用凝胶过滤柱层析(1.0×50cm)进行大规模纯化。用于凝胶过滤的柱树脂为超细SephacrylTM S-1000(截留分子量：20,000bp)(Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)，并用含有0.2M NaCl(pH8.3)的50mM Tris-HCl缓冲液来包装和平衡。反义分子的起始体积调整为凝胶外水体积的5％并且用与平衡树脂相同的缓冲液来进行DNA洗脱(流速为：0.3ml/min)。用双波长UV检测系统在260/280nm对样品进行UV扫描并在洗脱过程中每隔5分钟收集样品。清洗样品级分并用70％的冰乙醇沉淀然后重悬于蒸馏的超纯水和PBS(磷酸盐缓冲液)中来进行后续的试验。在1％琼脂糖凝胶中检测纯化的反义分子的数量和纯度。用克隆到pBS-KS(+)的TNF-αcDNA片段构建对照有义分子，其方向与载体中lacZ基因的方向相反。通过用T7引物测序来证实有义或反义的单链分子序列的完整性。DNA测序用自动化DNA测序仪进行。
4.噬菌体基因组环状反义分子的结构分析和稳定性检测
按照下述方式检测反义分子为单链、环状和稳定的事实。编码TNF-α基因的反义分子(1μg)用XhoI(10U/μg DNA)、核酸外切酶III(160U/μg DNA)或S1核酸酶(10U/μg DNA)在37℃处理3小时，并用苯酚抽提，乙醇沉淀，并在1％的琼脂糖凝胶中电泳来研究它们的稳定性和酶切模式。
对于稳定性检测，单独检测1μg的反义分子或在其与脂质体以DNA：脂质体约为1∶3(w/w)的比率形成混合物来检测。没有热灭活的30％FBS溶液加入到反义-脂质体复合物中并在37℃温育不同的时间直到48小时。在用FBS和核酸酶温育后，反义DNA用氯仿抽提并用乙醇沉淀，然后用1％琼脂糖凝胶电泳。
环状反义分子(TNF-α反义)和双链质粒DNA(包含TNF-αcDNA片段的噬菌粒pBS-KS(-))的热变性在100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM钠盐PIPES(Sigma，USA)的溶液中进行。10μg/ml(10nM)的DNA加热到95℃并在变性试验前缓慢的冷却到室温。温度以0.5℃/3分钟的速率上升。在装备有珀耳帖温度控制器的二极管阵列分光光度计(Hewlett Packard，USA)。上进行熔化研究。
5.靶基因转录的检测
(1)反义分子与脂质体复合物的转染
阳离子脂质体，如LipofectamineTM，Lipofectamine 2000TM或Lipofectamine PlusTM(Life Technologies，USA)与反义分子或有义对照分子混合。这些脂质体-DNA复合体与OPTI-MEM(Life Technologies，USA)混合，并根据生产商提示的方案加入到细胞中。按照如下方式进行脂质体转染：细胞培养在补加有10％FBS的PRMI 1640或EMEM中并在脂质体转染前30分钟用OPTI-MEM洗两次。细胞在200μl培养基中接种于48-孔板(1×105细胞/孔)。反义分子与阳离子脂质体以约1∶3(w/w)的比率混合并加入到细胞中进行转染。细胞在没有血清的培养基中37℃温育6小时。脂质体转染后，2X FBS和抗生素加入到培养基中并于37℃进一步温育18小时。大鼠TNF-α的表达用LPS(30μg/ml)诱导。细胞用于制备RNA，用酶联免疫吸附分析(ELISA)培养上清液中是否存在IL-10。
(2)用RT-PCR检测转录
根据生产商推荐的试验程序采用Tri reagentTM(MRC，USA)制备RNA。从每个孔中收集的细胞和1ml Tri Reagent和200μl氯仿混合用于RNA纯化。纯化的RNA在50μl反应体积中用AccessTM RT-PCR试剂盒(Promega，USA)进行RT-PCR。在PCR管中加入纯化RNA、一对引物(表2)、AMV反转录酶(5U/μl)、Tfl DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MgSO4(25mM，2.5μl)。反转录和聚合酶链式反应在热循环仪(Hybaid，UK)上连续进行。第一条链cDNA的合成在48℃进行45分钟，随后通过30个重复的循环进行DNA扩增，在94℃30秒(变性)，59℃ for 1分钟(退火)，68℃2分钟(聚合)。在1％琼脂糖凝胶上证实PCR产物，用AlphaImager 1220-凝胶记录设备(AlphaInno-Tech corporation，USA)对扩增的DNA进行定量分析。
(3)Southern印迹
用ECL(化学发光增强剂)标记寡核苷酸以及检测系统(AmershamLife Science，UK)制备用于Southern杂交的探针。RT-PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳并转到在0.4M NaOH溶液中的尼龙膜上。用于TNF-α的寡核苷酸探针为22多聚体：5’-GATGAGAGGGAGCCCATTTGGG-3’(SEQ ID NO：3)，对于NF-κB的寡核苷酸探针为25多聚体5’-CTTCCAGTGCCCCCTCCTCCACCGC-3’(SEQ ID NO：4)。
100pmol的寡核苷酸探针与荧光素-11-dUTP、二甲胂酸盐缓冲液和末端转移酶混合，在37℃温育70分钟来进行ECL标记。探针与转移有DNA的尼龙膜在6ml的杂交缓冲液(5 X SSC、0.02％SDS、液体封闭(liquid block))中于42℃杂交14小时。尼龙膜用含有0.1％SDS的5XSSC中清洗两次和用含0.1％SDS的1XSSC中清洗一次，每次清洗45℃15分钟。膜与结合有HRP抗荧光素的抗体一起温育30分钟，随后在暴露于X-射线胶片前用ECL检测试剂温育约5分钟。
(4)用ELISA或Western印迹检测多肽
在反义处理后用ELISA或Western印迹方法对靶蛋白进行定量分析。对于ELISA检测，细胞培养上清液稀释50倍并加入到包被有抗TNF-α抗体的ELISA板中。将抗TNF-α生物素酰化的二级抗体加入到ELISA板的各孔中并在室温下温育90分钟。清洗三次后，加入链霉抗生物素蛋白过氧化物酶并温育45分钟。板洗四次以除去没结合的链霉抗生物素蛋白过氧化物酶，然后加入色原。温育20分钟显色后，在450nm测量其光密度。
进行Western印迹来检测CDK2的存在。在细胞用有义或反义DNA处理后用BCATM蛋白分析试剂盒(Pierce，USA)来测定全部蛋白的量。20μg蛋白样品加到12％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后，蛋白被转移到PVDF膜上(Bio-Rad，USA)。用含有3％脱脂牛奶和0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液温育膜来封闭。然后膜与兔抗人CDK2的多克隆IgG抗体(Santa Cruz biotechnology，USA)温育。连接有辣根过氧化酶的驴抗兔IgG的二级抗体(Amersham Life science，Sweden)加入，蛋白条带用ECL试剂盒显色。
(5)MTT检验用于检测细胞生长抑制
用MTT检验研究反义分子对c-myb、k-ras和cdk2的生长抑制作用。MTT试剂为3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-苯基-四唑鎓溴化物(Sigma，USA)。用OPTI-MEM将K562、HL-60、HeLa和MCF-7细胞清洗两遍并以6×104细胞/ml的细胞密度在96孔板的各孔中接种50μl体积。Lipofectamine 2000或Lipofectamine Plus(Life Technologies，USA)以约1∶3(w/w)的比率与反义分子混合用于细胞吸收。细胞和反义-脂质体复合体在含有10％FBS(HyClone，USA)的OPTI-MEM中温育5小时并于37℃在CO2(5％)培养箱中维持5天。
MTT试剂用PBS稀释到5μg/ml的浓度，100mg MTT试剂加入到含有100μl培养基的每孔中。细胞于37℃在CO2(5％)培养箱中维持4小时并用等量的异丙醇(含有0.1N HCl)在室温下处理1小时。然后用ELISA读数仪，SpectraMAX 190(Molecular devices，USA)在570nm测定吸光度。实施例2-试验方法和结果
1.用重组M13噬菌体系统构建大环状核酸化合物
进行试验以检测M13噬菌体的环状噬菌体基因组是否能容纳反义序列作为其基因组的一部分，以及这些新的反义分子能否克服和反义寡核苷酸合成形式相关的问题。通过M13K07辅助噬菌体感染已经转化有pBluescript KS(-)噬菌粒的细菌细胞来生产重组的M13噬菌体(Jupin等，Nucleic Acid Res.，23，535-536(1995))。我们利用噬菌粒的Fl起始子来产生含有对于靶基因反义或有义序列的单链环状噬菌体基因组。在编码大鼠TNFα基因的情况下，基因的全长cDNA安放到pBluescript KS(-)载体中来产生反义序列(图1)。采用T7测序引物通过DNA测序来证实单链基因组DNA中的反义序列(图2)。在TNF-α反义插入的5’和3’侧翼序列表明为噬菌粒载体的序列。插入序列相应于TNF-αmRNA序列表明反义序列的存在。含有对TNF-α、NF-kB、c-myb、c-myc、k-ras和cdk2的反义序列的环状噬菌体基因组被分别命名为TNFα-M13AS、NFκB-M13AS、c-myb-M13AS、c-myc-M13AS、k-ras-M13AS和cdk2-M13AS。
2.噬菌体基因组反义DNA的柱层析纯化
在用M13K07辅助噬菌体感染已经由含大鼠TNF-αcDNA的重组噬菌粒转化的细菌细胞后，分离TNFα-M13AS。当用噬菌粒系统生产具有反义序列的噬菌体基因组DNA时，单链DNA可能会被少量的M13噬菌体的双链复制形式和/或来自辅助噬菌体的野生型单链基因组DNA所污染。而且，反义制剂发现含有高水平的污染的脂多糖(LPS)，LPS能够显著降低转染效率并影响细胞的增殖(数据没有显示)。用琼脂糖凝胶纯化方法可以少量分离含有反义序列的噬菌体基因组DNA。
凝胶过滤柱层析检测用来大规模纯化环状噬菌体基因组反义DNA。Sephacryl S-1000超细凝胶用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3，0.2M NaCl)平衡并装入反义样品(胶体积的5％)。当柱用与平衡缓冲液相同的洗脱缓冲液洗脱时，在75到120分钟的保留时间段得到主洗脱峰(图3A)。峰分为7个级分，每个级分的保留时间为5或10分钟，从级分I到级分VII。每个洗脱级分加入到1％琼脂糖凝胶来证实反义链的纯化质量(图3B)。在级分III中发现野生型的M13噬菌体DNA作为主要条带(保留时间75分钟)。级分IV包含大环状反义分子作为主要条带(保留时间80分钟)。跨越保留时间为80到110分钟的级分被收集并用乙醇沉淀。然后用70％的冰乙醇来洗涤反义沉淀物并用蒸馏水重新悬浮用于进一步试验。大环状反义链以回收率60％获得，反义分子的光密度在260/280比率时超过1.8。当用LAL检验测定LPS时，反义分子基本没有LPS的污染，表明通过层析纯化有效的除去了污染物。
3.噬菌体基因组DNA的结构分析和稳定性检测
检测TNFα-M13AS的环状结构和其对核酸酶的稳定性。反义分子由于其封闭的环状结构，预期具有对核酸外切酶的稳定性。当TNFα-M13AS和核酸内切酶XhoI和外切酶III一起温育时，发现反义分子至少在和核酸酶温育3小时后大部分仍保持完整。与之相反，当XhoI加入到重组M13噬菌体DNA的双链复制形式中时，如同预期的一样，DNA被限制性酶和核酸外切酶III完全降解。通过用S1核酸酶对反义分子的完全消化证实了TNFα-M13AS为单链环状分子的事实(图4A)。
由于在与血清温育后大部分仍能够保持其结构完整性，发现噬菌体基因组反义分子具有稳定性。当TNFα-M13AS与阳离子脂质体相结合时，在与胎牛血清(FBS)进行长时间温育后大部分反义分子能够保持其完整性。实际上，即使与30％FBS一起温育超过24小时后TNFα-M13AS仍然保持完整。结果表明通过与脂质体形成复合物，噬菌体基因组反义分子在体内应用中可进一步稳定(图4B)。
通过测量熔解温度(Tm1/2)测定了单链TNFα-M13AS和含有TNF-α插入的双链噬菌粒DNA的结构差异。当温度逐渐升高时检测双链噬菌粒DNA在260nm的吸收值，在约87℃时检测到典型的染色质变化。但是，当检测噬菌体基因组反义分子的熔解温度时，在约54℃检测到中度斜率的染色质变化，这表明带有短分子内双链体区域变性(图5)。这些结果证实了TNFα-M13AS为单链环状分子。
4.通过TNFα-M13AS有效和特异性的消除大鼠TNF-αmRNA
检测TNFα-M13AS的反义活性。TNFα-M13AS包含一段长的反义序列，其包括非特异性的反义噬菌粒载体序列和特异于大鼠TNFαmRNA的反义区。噬菌体基因组反义分子具有大量非特异性序列的事实对于全面分析反义活性的靶特异性是必要的。为了测定噬菌体基因组反义分子是否特异性地消除靶基因表达，多个对照基因用于比较mRNA的消除水平。
为检测TNFα-M13AS的特异性活性，0.5μg(1.4nM)的反义分子与1.5μg的阳离子脂质体形成复合体并加入到1×105个细胞的单核细胞系WRT7/P2中。然后细胞用LPS处理来诱导TNF-α的表达。当细胞用TNFα-M13AS处理时，TNF-αmRNA的诱导水平显著降低。相反的，当细胞用TNFα-M13SE(TNF-α的有义链)或M13SS(没有反义插入的单链噬菌体基因组)处理时，并没有表现TNF-αmRNA的大量减少(图6A)。用能够结合扩增的DNA片段中部的探针通过Southern杂交证实了TNF-α的RT-PCR条带(图6B)。
TNFα-M13AS包含大鼠TNF-α反义序列以及β-半乳糖酶(LacZ)和内酰胺酶(Amp)基因的反义序列，为全长3.7kb的单链环状基因组。TNF-α特异性的反义部分约708碱基长。因此与常规合成的20或30个核苷酸反义分子相比TNFα-M13AS中的TNF-α特异性反义序列非常长。这是非常重要的，因为在此技术领域中通常认为随着反义分子的延长，其序列的特异性下降。进一步的确证试验表明TNFα-M13AS的反义活性确实是序列特异性的。
为表明序列特异性的反义活性，在TNFα-M13AS的脂质体转染后检测三种不同的基因的mRNA水平。其为β-肌动蛋白、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和IL-1β(白介素-1β)。这些基因的表达不受TNFα-M13AS的脂质体感染的影响(Fig.6A，C)。
同时检测了TNFα-M13AS反义活性的剂量依赖性。当TNFα-M13AS以0.01μg(0.03nM)的浓度使用时，TNF-α的表达只有轻微的降低。当浓度为0.05μg(0.14nM)时，TNF-α的表达被部分消除。当TNFα-M13AS的量达到0.1μg(0.28nM)时，发现TNF-αmRNA完全消除(图6D)。这些结果表明TNFα-M13AS能以比常规使用的反义分子小得多的量有效的消除靶mRNA。
5.通过噬菌体基因组反义分子特异性的消除NF-κB、c-myc、c-myb、k-ras和cdk2基因的mRNA表达
观察TNFα-M13AS的有效性，进行试验检测特异性的针对其它基因的噬菌体基因组反义复合物能否阻断这些基因的表达，如NF-κB、c-myc、c-myb、k-ras和cdk2。对NF-κB(NFκB-M13AS)的反义复合物生产出来并在THP-1细胞中检测其有效的反义活性。NFκB-M13AS也和脂质体形成复合体并以增加量加入到细胞中。当0.05μg(0.14nM)的NFkB-M13AS加入到THP-1中时，NF-кB mRNA降低约70％。当NFκB-M13AS的量增加到0.1μg(0.28nM)和到0.2μg(0.56nM)时，NF-κB mRNA消除超过90％。相反的，细胞用NFκB-M13SE(具有NFκB有义序列的噬菌体基因组DNA)或M13SS处理，NF-κB的表达不受太大影响(图7A)。通过Southern杂交进一步证实NF-κB的PCR扩增条带(图7B)。
当0.4μg(1.12nM)的c-myc-M13AS加入到K562细胞中时，c-mycmRNA降低约80％。相反的，在用c-myc-M13SE或M13SS处理的K562细胞中，c-myc的表达基本不受影响(图8A)。当0.2μg(0.56nM)和0.4μg(1.12nM)的c-myb-M13AS加入到HL-60细胞中时，与c-myb-M13SE相比c-myb mRNA降低了约70％。相反的，在用c-myb-M13SE处理的HL-60细胞中，c-myb表达基本上不受影响(图8B)。
当0.3μg(0.84nM)的k-ras-M13AS加入到HeLa细胞中时，k-rasmRNA降低了约80％。相反的，在用k-ras-M13SE或M13SS处理的HeLa细胞中，k-ras的表达没有太大影响(图8C)。
最后，当用0.1μg(0.28nM)和0.2μg(0.56nM)的cdk2-M13AS加入到HeLa细胞中时，与cdk2-M13SE相比，cdk2 mRNA水平分别降低了约70％和75％。当cdk2-M13AS的量增加到0.3μg(0.84nM)时，内源性的cdk2 mRNA水平消除超过90％。相反的，在用cdk2-M13SE处理的HeLa细胞中，cdk2的表达基本上不受影响(图8D)。
6.TNF-α和CDK2活性的降低
当靶基因的mRNA通过反义方法消除后，不能产生mRNA的翻译产物。证实靶基因蛋白的降低或消除对支持由反义分子导致的生物作用是必要的。在用反义分子处理细胞后用两种不同的方法检测蛋白水平。
WRT7/P2细胞用TNFα-M13AS进行脂质体转染，用ELISA分析测定转染子中分泌的TNF-α。与内源性TNF-αmRNA降低的水平相似，在施用TNFα-M13AS后细胞培养上清液中的TNF-α蛋白也降低超过90％(图9A)。但是，对照的反义分子TNFα-M13SE(含有TNF-α基因的有义链)或M13SS都不会降低WRT7/P2转染子的TNF-α表达。这些结果表明TNFα-M13AS对于TNF-αmRNA的消除和随后转染子中TNF-α的消失都是有效的。
用Western印迹检查转染有cdk2-M13AS的转染子的CDK2水平。HeLa细胞用cdk2-M13AS或cdk2-M13SE处理，转染后48小时用于抽提总细胞蛋白。分离的蛋白标准化用于定量并用Western印迹技术检验。当cdk2-M13AS浓度达到0.8nM(0.3μg/孔)，CDK2水平降低超过70％，而cdk2-M13SE对蛋白细胞水平没有作用(图9B)。这些结果表明这种噬菌体基因组反义分子能够有效的特异性消除靶mRNA，并导致转染子中靶蛋白的消失。
7.用噬菌体基因组反义方法对癌细胞的生长抑制
癌基因涉及肿瘤转化和癌细胞的发展。由于癌基因是反义介入的良好靶子，检测了几种肿瘤细胞系以测定如果两个重要的癌基因c-myb和k-ras的表达由特异于这些基因的噬菌体基因组反义分子所特异性阻断，肿瘤细胞生长抑制能否发生。此外，因为对施用cdk2-M13AS的反应阻断了cdk2基因表达，也检测了其对肿瘤细胞生长的抑制作用。
k-ras的噬菌体基因组反义分子加入到MCF-7(乳腺癌)细胞系中；c-myb反义分子加入到K562(慢性髓性白血病)或HL-60(急性原发性白血病)细胞系；以及cdk2的反义分子加入到HeLa(子宫颈癌)细胞系。用MTT检验法检测对每一个这些反义复合物的反义转化子用于抑制肿瘤细胞生长(图10和11)。
当k-ras(k-ras-M13AS)的噬菌体基因组反义分子加入到MCF-7细胞中时，在反义浓度为0.1μg(0.5nM)和0.2μg(1nM)时转染子表现出超过70％抑制细胞生长。相反，k-ras-M13SE(Ras基因的有义对照)只表现了对于细胞生长微弱的抑制，在反义浓度为0.5nM时少于约9％的抑制，在浓度为1nM时少于约15％的抑制(图10A)。
当HeLa细胞用浓度为2nM的cdk2-M13AS处理时，观察到70％以上的生长抑制。相反，cdk2-M13SE(cdk2基因的有义对照)表现出对转染的HeLa细胞不到30％的抑制(图10B)。
构建两种不同长度的c-myb反义分子，0.5kb(c-myb-M13AS1)和1.5kb(k-myb-M13AS2)。当白血病细胞系，K562和HL-60用c-myb-M13AS1或c-myb-M13AS2处理后，这些细胞系被观察到具有相似的超过约60％的生长抑制(图11)。相反，c-myb-M13SE(对照有义分子)基本上不表现出K562和HL-60细胞生长抑制。
所有在此引用文献都以其全文引作参考。
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那些本领域的普通技术人员无需采用比常规试验更复杂的试验就能够认识到或确定许多与具体在此描述的本发明的具体实施方案的相等物。这些相等物包含在本权利要求书所涵盖的范围中。
                   表1.克隆引物和大小表
   引物                  序列                                        克隆大小
                                                                       (bp)c-myb1  5′    5′-ggcggcagcgccctgccgacgcc-3′(SEQ ID NO：5)               502
    3′        5′-cattgttttccaattctcccct-3′(SEQ ID NO：6)c-myb2  5′    5′-cggcggagccccgccgcccgccgc-3′(SEQ ID NO：7)              1560
    3′        5′-tgaaactcagcaacaaatccag-3′(SEQ ID NO：8)c-myc   5′            5′-ggagaacttctaccagca-3′(SEQ ID NO：9)            978
    3′    5′-gacattctcctcggtgtccgaggac-3′(SEQ ID NO：10)k-ras   5′  5′-cggactgggagcgagcgcggcgcag-3′(SEQ ID NO：11)              761
    3′      5′-gaaaaaaattaggtaatgctaaaa-3′(SEQ ID NO：12)cdk2    5′          5′-atggctacctctcgatatga-3′(SEQ ID NO：13)           911
    3′          5′-cactccggattaccttcat-3′(SEQ ID NO：14)NFκB   5′    5′-gatcgtcgacgcgccacccggcttcagaatggc-3′(SEQ ID NO：15)    700
    3′    5′-gatcgaattcggtgaagctgccagtgctatccg-3′(SEQ ID NO：16)
                   表2.RT-PCR引物表基因         引物                  序列TNF-α    5′引物    5′-catctccctccggaaaggacac-3′(SEQ ID NO：17)
      3′引物     5′-cggatgaacacgccagtcgc-3′(SEQ ID NO：18)NFκB     5′引物     5′-cctggccggagccactagac-3′(SEQ ID NO：19)
      3′引物      5′-ctatactcagatccatcacc-3′(SEQ ID NO：20)c-myc     5′引物    5′-ccagcagcctcccgcgacgatg-3′(SEQ ID NO：21)
      3′引物    5′-gaggggtcgatgcactctgagg-3′(SEQ ID NO：22)c-myb     5′引物    5′-gctaccaacacagaaccacac-3′(SEQ ID NO：23)
      3′引物    5′-tgaaactcagcaacaaatccag-3′(SEQ ID NO：24)k-ras     5′引物      5′-ctcccggcccccgccatttc-3′(SEQ ID NO：25)
      3′引物    5′-ctctgggaatactggcacttcg-3′(SEQ ID NO：26)cdk2      5′引物    5′-ctgacccgactcgctggcgc-3′(SEQ ID NO：27)
      3′引物    5′-ggagagggtgagattagggc-3′(SEQ ID NO：28)
                        序列表<110>伟进株式会社(Welgene Inc.)<120>大环状靶特异性反义核酸化合物(Large Circular Target-specific AntisenseNucleic Acid Compounds)<130><150>PCT/KR01/01730<151>2001-10-13<150>KR2001-12061<151>2001-03-08<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>1gatcgtcgac gatgagcaca gaaagcatga tcc                                 33<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>2gatcgaattc gtcacagagc aatgactcca aag                                 33<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>3gatgagaggg agcccatttg gg                                             22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>4cttccagtgc cccctcctcc accgc                                          25<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>5ggcggcagcg ccctgccgac gcc                                            23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>6cattgttttc caattctccc ct                                             22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>7cggcggagcc ccgccgcccg ccgc                                           24<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>8tgaaactcag caacaaatcc ag                                             22<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>9ggagaacttc taccagca                                                  18<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>10gacattctcc tcggtgtccg aggac                                          25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>11cggactggga gcgagcgcgg cgcag                                          25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>12gaaaaaaatt aggtaatgct aaaa                                           24<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>13atggctacct ctcgatatga                                                20<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>14cactccggat taccttcat                                                 19<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>15gatcgtcgac gcgccacccg gcttcagaat ggc                                 33<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>16gatcgaattc ggtgaagctg ccagtgctat ccg                                 33<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>17catctccctc cggaaaggac ac                                             22<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>18cggatgaaca cgccagtcgc                                                20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>19cctggccgga gccactagac                                                20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>20ctatactcag atccatcacc                                                20<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>21ccagcagcct cccgcgacga tg                                             22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>22gaggggtcga tgcactctga gg                                             22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>23gctaccaaca cagaaccaca c                                              21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>24tgaaactcag caacaaatcc ag                                             22<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>25ctcccggccc ccgccatttc                            20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>26ctctgggaat actggcactt cg                         22<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>27ctgacccgac tcgctggcgc                            20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>28ggagagggtg agattagggc                            20<210>29<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：合成引物<400>29ccccctcgag gtcgacgatg agcacagaaa gcatgatccg agatgtggaa ctggcagagg    60aggcgctccc ca                                                        72

Claims (29)

1.一种包含靶特异性反义区的大环状核酸分子，其特异性地与一种基因表达的RNA的一部分相结合，其中所述的反义分子能够有效地降低所述基因的表达。
2.根据权利要求1的大环状核酸分子，其中所述的分子至少为约3,000个核苷酸长度。
3.根据权利要求1的大环状核酸分子，其中所述分子的反义区至少为约50个核苷酸的长度。
4.根据权利要求1的大环状核酸分子，其中所述的反义区基本上与整个基因序列互补。
5.根据权利要求1的大环状核酸分子，其中所述的核酸分子为重组噬菌体或噬菌粒基因组的单链形式。
6.根据权利要求5的大环状核酸分子，其中所述的噬菌体或噬菌粒来源于丝状噬菌体。
7.根据权利要求6的大环状核酸分子，其中所述的丝状噬菌体为噬菌体M13。
8.一种重组载体，其包含权利要求1的大环状核酸分子。
9.根据权利要求8的载体，其中所述的载体来源于丝状噬菌体。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求8的载体。
11.一种组合物，其包括含有靶特异性的反义区的大环状核酸分子和其可药用载体，所述大环状核酸分子特异性地与基因所表达的RNA的一部分相结合，其中所述的反义分子能够有效的降低所述基因的表达。
12.通过靶向编码选定蛋白的RNA的大环状核酸分子来抑制选定蛋白表达的方法，包括：使所述核酸分子靶向RNA使得核酸分子与RNA杂交并与RNA形成双链体，其中所形成的双链体抑制选定蛋白的表达。
13.根据权利要求12的方法，其中所述靶蛋白的表达导致细胞增殖或癌症。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的癌症为白血病、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、脑癌或者前列腺癌。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的癌症为白血病、子宫颈癌或乳腺癌。
16.根据权利要求13的方法，其中所述的靶蛋白为肿瘤坏死因子、核因子、MYB、MYC、RAS或细胞分裂激酶。
17.根据权利要求12的方法，其中所述的蛋白为病毒蛋白。
18.根据权利要求17的方法，其中所述的病毒为疱疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、单核细胞增多症病毒(EB病毒)、肝炎病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)。
19.根据权利要求12的方法，其中所述靶蛋白的表达导致了代谢性疾病或免疫失调。
20.根据权利要求19的方法，其中所述的代谢性疾病为苯丙酮尿症(PKU)、原发性甲状腺机能减退、半乳血糖症、血色素异常、I型和II型糖尿病或肥胖症。
21.根据权利要求18的方法，其中所述的免疫失调为斯耶格伦综合征、抗磷脂综合征、免疫复合物疾病、紫癜、舍恩莱因-亨诺赫、免疫缺陷综合征、全身性红斑狼疮、免疫缺陷、风湿病、肾或肝硬化。
22.嵌合大环状核酸分子，其包含靶特异性反义区，该反义区特异性地与多个靶基因表达的多个靶RNA结合，其中所述的核酸分子能够有效地降低所述基因的表达。
23.一种组合物，其包括含有靶特异性反义区的嵌合的大环状核酸分子及可药用载体，所述反义区特异性地与多个靶基因表达的多个靶RNA结合，其中所述的核酸分子能够有效地降低所述基因的表达。
24.一种通过靶向于编码多个选定蛋白的多个RNA分子的大环状核酸分子来抑制多个选定蛋白表达的方法，其包括：
(i)产生一种包含靶向所述多个靶RNA的靶特异性反义区的嵌合大环状核酸分子；和
(ii)靶向多个RNA使得嵌合大环状核酸分子与所述的RNA杂交形成双链体，其中所形成的双链体降低多个选定蛋白的表达。
25.一种抑制细胞增殖的方法，其包括：
给所述细胞施用大环状核酸分子，该分子包括一个或多个基本上与一个或多个靶基因互补的反义区，其中通过抑制所述基因的表达来抑制细胞增殖。
26.一种产生包含靶特异性反义区的大环状核酸分子的方法，所述反义区抑制选定蛋白的表达，该方法包括：
(i)将目的靶特异性DNA插入到噬菌体或噬菌粒基因组中；
(ii)使噬菌体产生单链形式，其为大环状核酸分子；和
(iii)通过凝胶过滤柱分离所述的大环状核酸分子。
27.一种筛选基因功能的方法，包括：
(a)产生包含与细胞中所表达的RNA基本上互补的反义区的大环状核酸分子；
(b)使大环状核酸分子接触细胞以使得反义分子进入细胞并与细胞表达的RNA杂交从而抑制其基因产物的表达；和
(c)检测细胞表型的变化。
28.根据权利要求27的方法，其中将步骤(a)到(c)应用于所述大环状核酸分子的文库。
29.根据权利要求27的方法，其中所述核酸分子为重组噬菌体或噬菌粒基因组的单链形式。
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