CN1346363A - 具有更好稳定性和反义效果的新颖的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖的反义(AS)寡核苷酸,含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列。具体地说,本发明涉及共价闭合的多重反义(CMAS)－寡核苷酸,其构建方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型,和带型反义(RiAS)－寡核苷酸,由两个含有多重反义序列的环和连接这两个环的茎组成,其构建方法是利用互补序列的连接反应在两个5’末端上形成茎环结构。由于本发明的新颖的AS－寡核苷酸对外切核酸酶活性是极为稳定的,并显示显著的肿瘤细胞生长抑制作用,含有本发明的新型AS－寡核苷酸的药物组合物有效治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人疾病。

Description

具有更好稳定性和反义效果的新颖的反义寡核苷酸
发明领域
本发明涉及新颖的反义寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列，以提高它们的目标序列特异性和对核酸酶活性的稳定性。
具体地说，本发明涉及共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸，含有针对包括c-myb、c-myc或k-ras在内的各种原癌基因mRNA的多目标反义序列。构建CMAS-寡核苷酸的方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型。
另外，本发明涉及带型反义(RiAS)-寡核苷酸，含有针对包括c-myb、c-myc或k-ras在内的各种原癌基因mRNA的多目标反义序列。构建RiAS-寡核苷酸的方法是利用互补序列的连接反应在两个5’末端上形成茎环结构。
本发明涉及含有新型AS-寡核苷酸的药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
背景
反义寡核苷酸(以下称之为“AS-寡核苷酸”)对通过按序列特异性方式降低基因表达而进行的基因功能研究一直具有重要价值(Thompson，C.B.等《自然》(Nature)，314，363-366，1985)。人们为开发分子反义试剂也已付出了巨大努力，这些试剂能够消除参与肿瘤形成和发展的异常基因表达(Chavany，C.等《分子药学》(Mol.Pharm.)，48，738-746，1995)。
为了使设计和合成轻松易行，也为了对致病基因的潜在特异性，合成AS-寡核苷酸已经得到广泛利用。长度较短(13-30个核苷酸)的AS-寡核苷酸已经设计用来通过形成Watson-Crick碱基对、提供特异性和亲和性而结合互补序列。基因表达的抑制据信是通过形成DNA-mRNA双螺旋之后的RNA酶H活性或核糖体复合物结合的空间位阻而实现的(Dolnick，B.J.，《癌症研究》(Cancer Inv.)，9，185-194，1991)。人们为抑制基因表达还进行了一些努力，采用少量螺旋结构的形成或双螺旋寡核苷酸-圈套，主要针对基因组DNA的启动子区或与之竞争(Young，S.L.等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88，10023-10026，1991)。
AS-寡核苷酸的功效已经在一些动物模型以及最近一些人类疾病的临床研究中得到了验证。硫代磷酸酯(以下称之为“PS”)AS-寡核苷酸的10天静脉内注射消除了鸭肝中的乙型肝炎病毒DNA(Offenserger，W.B.等《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，12，1257-1262，1993)。已经发现血管紧张素原的AS-寡核苷酸在注射给自发性高血压同系繁殖大鼠后，有效降低血压(Tomita，N.等《高血压》(Hypertension)，26，131-136，1995)。硫代磷酸酯AS-寡核苷酸抗裸鼠RI、即蛋白激酶A亚单位的皮下用药停止了肿瘤生长(Nesterova，M.等《天然医药》(Nat.Med.)，1,528-533，1995)。利用导致各种疾病的不同基因的AS-寡核苷酸所进行的若干临床试验也在进行中，包括卵巢癌和局限性肠炎(Roush，W.,《科学》(Science)，276，1192-1193，1997)。
不过，利用其对基因的序列特异性的关于AS-寡核苷酸的过高预期以及可能的关于疾病的过高预期经常令很多研究人员失望，因为它们不总是明确无误的，有时也是互相抵触的。关于AS-寡核苷酸的突出问题是对核酸酶的不稳定性和无效的细胞摄取。
通过使用修饰的寡核苷酸，AS-寡核苷酸的稳定性已经在一定程度上得到提高，例如PS-寡核苷酸和甲基磷酸酯(以下称之为“MP”)-寡核苷酸，它们用于增加抗核酸酶的稳定性。不过，每种修饰的核苷酸暴露出自身的问题，也就是缺少序列特异性和对RNA酶H的不敏感性。此外，一旦循环使用水解后的核苷酸，关于不需要的突变的引入逐渐才能察觉到。
AS-寡核苷酸与互补目标序列的结合是有效的。所有mRNA中的序列都没有发现与AS-寡核苷酸是同样可使用的。目标mRNA的二级和/或三级结构至少在部分程度上能够解释AS-寡核苷酸的不均等结合(Gryaznov，S.等《核酸研究》(Necleic Acids Res.)，24，1508-1514，1996)。因此，可以理解的是，AS-寡核苷酸可能易于定位在具有较小二级结构的区域。
在增强AS-寡核苷酸稳定性的努力中，本发明人设计了利用计算机模拟寻找更好的目标位点的合理方式，据此预测了mRNA的二级结构，因此他们构建了具有茎环结构或共价闭合的多重反义序列的AS-寡核苷酸。
针对c-myb基因的AS-寡核苷酸能够用于抑制肿瘤细胞的生长。
由c-myb原癌基因编码的Myb蛋白主要位于核内，在细胞周期中充当G1/S相过渡的转录调节剂。原癌基因c-myb在造血细胞的增殖和分化中扮演重要角色。造血细胞表现出c-myb的差异表达，在向终末期分化时几乎不显示基因表达(Melani，C.等《癌症研究》(Cancer Res.)，51，2897-2901，1991)。常常发现c-myb在白血病细胞中被过度表达。
据报道，c-myb表达被AS-寡核苷酸封闭可抑制前髓细胞癌细胞系HL-60和慢性骨髓性白血病细胞系K562的生长(Kimura，S.等《癌症研究》(Cancer Res.)，55，1379-1384，1995)。不过，上述实验所用c-myb AS-寡核苷酸被证明是部分有效的。用于上述实验的c-mybAS-寡核苷酸是磷酸二酯(以下称之为“PO”)-寡核苷酸或PS帽-寡核苷酸(Anfossi，G.等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86，3379-3383，1989)。这些寡核苷酸分子不是稳定的，尤其是PO-寡核苷酸，这可能是部分反义效果的原因。
通过合理的目标位点搜索联合提高稳定性所选择的AS-寡核苷酸将用于完全切除c-myb mRNA，更好地抑制白血病细胞生长。最近，大量关注的焦点在于开发对抗人恶性肿瘤的基于AS-寡核苷酸策略的分子治疗学。因此，需要找到改进的c-myb反义分子，它能够封闭白血病细胞生长至完成。
因此，为了开发具有更好稳定性和反义效果的新颖结构的AS-寡核苷酸，在优选的实施方式中本发明人通过二级结构分析在c-myb mRNA上选择了8个位点，联合所选择的c-myb的反义序列，构建新颖的大反义分子，即共价闭合的多重反义(以下称之为“CMAS”)-寡核苷酸和具有茎环结构的带型反义(以下称之为“RiAS”)-寡核苷酸。
因此，本发明人已经证明，该新颖的AS-寡核苷酸对核酸酶活性是稳定的，并且在阻止基因表达方面显示显著的特异性。
发明概述
本发明的目的是提供新颖的AS-寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列，以提高它的目标序列特异性和对核酸酶活性的稳定性。
按照本发明，上述目的和优点是易于达到的。
在本发明的这些方面，本发明提供选自具有较小二级结构的c-myb、c-myc或k-ras的mRNA区的反义序列。
本发明提供共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸，其含有针对c-myb mRNA的多重反义序列。构建CMAS-寡核苷酸的方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型。
本发明还提供带型反义(RiAS)-寡核苷酸，其含有针对c-mybmRNA的多重反义序列。RiAS-寡核苷酸由两个含有多重反义序列的环和连接这两个环的茎组成，利用互补序列的连接反应在两个5’末端上加以构建。另外，本发明提供含有针对c-myc mRNA或k-rasmRNA的多重反义序列的RiAS-寡核苷酸。
本发明进一步提供含有新型AS-寡核苷酸的药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
本发明进一步的目的和优点参见下文。
附图的简要说明
图1显示c-myb CMAS-寡核苷酸的构建流程。
图2显示CMAS-寡核苷酸的电泳图谱。
A是用5％Metaphor琼脂糖凝胶分析的寡核苷酸，其中
第1道：大小标记物；第2道：14mer连接反应引物；第3道：线性60mer寡核苷酸；第4道：CMAS-寡核苷酸。
B显示线性和共价闭合的寡核苷酸在变性聚丙烯酰胺凝胶上的稳定性，其中
第1和3道：没有用外切核酸酶III处理；第2和4道：用外切核酸酶III处理。
图3显示c-myb RiAS-寡核苷酸的构建流程。
图4显示RiAS-寡核苷酸的电泳图谱。
A是用15％变性聚丙烯酰胺凝胶分析的寡核苷酸，其中
第1道：58mer MIJ-78分子；第2道：116mer RiAS-寡核苷酸。
B显示MIJ-78和RiAS-寡核苷酸用外切核酸酶III处理的稳定性试验，其中
第1和3道：没有用外切核酸酶III处理；第2和4道：用外切核酸酶III处理。
图5显示在血清的存在下，线性与CMAS-寡核苷酸的降解图谱。
A显示线性AS-寡核苷酸的稳定性试验，其中
第1道：没有用血清处理(阴性对照)；第2道：用50％未加工血清处理；第3道和第4道：分别用FBS和CS处理24小时。
B显示CMAS-寡核苷酸的稳定性试验，其中
第1道：没有用血清处理(阴性对照)；第2道：用50％未加工血清处理；第3道和第4道：分别用FBS和CS处理24小时。
图6显示在血清的存在下，线性与RiAS-寡核苷酸的降解图谱。
A显示MIJ-78分子的稳定性试验，其中
第1道：没有用血清处理(阴性对照)；第2道：用50％未加工血清处理；第3道和第4道：分别用FBS和CS处理24小时。
B显示RiAS-寡核苷酸的稳定性试验，其中
第1道：没有用血清处理(阴性对照)；第2道：用50％未加工血清处理；第3道和第4道：分别用FBS和CS处理24小时。
图7显示c-myb CMAS-寡核苷酸对c-myb在HL-60细胞内表达的作用。
A显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中
第1道：60mer CMAS-寡核苷酸0.3μg+脂转染试剂(Lipofectin)1μg；第2道：60mer CMAS-寡核苷酸1μg+脂转染试剂1μg；第3道：混杂的AS-寡核苷酸1μg+脂转染试剂1μg。
B显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中
上板：c-myb mRNA的杂交RT-PCR带；下板：β-肌动蛋白mRNA的杂交RT-PCR带。
图8显示c-myb RiAS-寡核苷酸对c-myb mRNA在HL-60细胞内表达的作用。
A显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中
第1道：RiAS-寡核苷酸0.1μg+脂转染试剂0.8μg；第2道：RiAS-寡核苷酸0.2μg+脂转染试剂0.8μg；第3道：SC-寡核苷酸0.2μg+脂转染试剂0.8μg。
B显示用总RNA和两个c-myb引物进行的RT-PCR，其中
上板：c-myb mRNA的杂交RT-PCR带；下板：β-肌动蛋白mRNA的杂交RT-PCR带。
图9显示60merCMAS或线性AS-寡核苷酸对HL-60细胞增殖的作用，其中
-◆-：CMAS-寡核苷酸(1)；-■-：CMAS-寡核苷酸(2)；-●-：AS-寡核苷酸；-▲-：S-MIJ-7；●：单独的脂转染试剂；○：未处理的对照；(1)或(2)：用AS-寡核苷酸处理的时间。
图10显示c-myb RiAS-寡核苷酸对HL-60细胞增殖的作用。
A显示c-myb RiAS-寡核苷酸的MTT测定。
B显示c-myb RiAS-寡核苷酸的[3H]胸苷掺入。
图11显示HL-60细胞被c-myb RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myb RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图12显示HT-29细胞被c-myb RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myb RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图13显示HT-29细胞被c-myc RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是c-myc RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
图14显示HT-29细胞被k-ras RiAS-寡核苷酸抑制的显微照片。
A是k-ras RiAS-寡核苷酸，B是SC-寡核苷酸，C是单独的脂转染试剂。
优选实施方式的详细说明
下面，对本发明进行详细描述。
本发明在一方面提供新颖的AS-寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的区域的一个或更多反义序列。
具体地说，在优选的实施方式中，选择原癌基因之一c-mybmRNA的8个不同区域作为反义寡核苷酸的目标位点。对AS-寡核苷酸采用合理的目标位点搜索，以增加预测天然二级结构的机会。上述8个反义序列与所选择的目标位点是互补的。在所选择的8个对AS-寡核苷酸的目标位点中，最终选择了在形成CMAS分子时位于一个组合中的4个位点(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)和在形成RiAS分子时位于一个组合中的3个位点(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)，因为它们形成最小的分子内二级结构(见表1)。
具有磷酸二酯主链的AS-寡核苷酸缺少成功的反义应用所必需的稳定性。修饰的寡核苷酸、例如PS-寡核苷酸或MP-寡核苷酸的稳定性提高了，但是稳定性的增益仅是部分性的，而且在DNA复制或修复期间产生潜在有害的水解修饰的核苷酸的错误掺入。据前人报道，与阳离子脂质体形成复合物的茎环寡核苷酸也部分提高了稳定性。不过，稳定性仍然是所要考虑的AS-寡核苷酸的主要问题所在。因此，本发明人试图开发具有更好稳定性的改进AS-寡核苷酸。
因此，本发明提供共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸。
具体地说，在构建AS-寡核苷酸的细胞内二级结构时无需在AS-寡核苷酸与目标mRNA之间形成双螺旋。在优选的实施方式中，这些AS-寡核苷酸被设计成含有四个反义序列(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)(如SEQ ID NO：1、NO：2、NO：3和NO：4所述)的CMAS(共价闭合的多重反义)-寡核苷酸形式，将它们一前一后地放置在环内，以增加CMAS-寡核苷酸的长度(见图1)。CMAS-寡核苷酸在15％变性PAGE凝胶上的电泳迁移图谱比其线性前体减慢了约10％(见图2的A)。正如所预期的，CMAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如变性PAGE凝胶上的多条带所示，其中单体(60mer)是最丰富的，另有二聚体(120mer)和三聚体(180mer)。
与CMAS-寡核苷酸相反，线性寡核苷酸在用外切核酸酶III保温2小时后完全降解了(见图2的B)。
本发明也提供带型反义(RiAS)-寡核苷酸。
CMAS-寡核苷酸尽管是非常稳定的，也需要分子内连接反应的引物，而且在后来必须被消除。因此，为了避免使用连接反应引物和获得AS-寡核苷酸的同源种群，本发明人用酶学方法连接两个AS-寡核苷酸，形成带型闭合的分子，称为RiAS-寡核苷酸。
RiAS-寡核苷酸(116mer)由两个环和一个连接这两个环的茎组成(见图3)。在优选的实施方式中，将三个反义序列(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)(如SEQ ID NO：3、NO：4和NO：5所述)串联地放置在环内，以增加RiAS-寡核苷酸的长度。所以，RiAS-寡核苷酸中有三个不同反义序列的两个副本(共6个反义序列)。RiAS-寡核苷酸中这种加长的环将适应由与目标mRNA序列形成双螺旋所导致的扭力。
发现RiAS-寡核苷酸在变性PAGE凝胶上比其线性前体(MIJ-78)明显减慢了(见图4的A)。正如所预期的，RiAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如PAGE凝胶上的主要带(116mer)所示。与RiAS-寡核苷酸相反，MIJ-78在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了(见图4的B)。
为了证明本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸抗核酸酶活性的稳定性增强了，将CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸与不加热灭活以保持核酸酶活性的血清一同孵育。
其结果是，在血清的存在下孵育24小时后，线性60mer寡核苷酸(CMAS-寡核苷酸的前体，见图5的A)和线性59mer寡核苷酸(RiAS-寡核苷酸的前体，见图6的A)被完全消化了。不过，CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸在用未加工的人血清、FBS和小牛血清孵育24小时后仍然保持大部分完整，说明其比线性前体显著提高了抗核酸酶活性的稳定性(见图5的B和图6的B)。
另外证明，CMAS-寡核苷酸能够按序列特异性方式充分消除目标mRNA。
具体地说，将CMAS-寡核苷酸与脂转染试剂联合运输到细胞内。采用脂转染试剂的原因是发现它对细胞较少毒性，并且产生一致性结果。MIJ-5是人c-myb的CMAS-寡核苷酸，与对照的SC-寡核苷酸相比能够减少95％以上的c-myb mRNA。同时，MIJ-5的线性配对物、即MIJ-5A减少37％的c-myb mRNA(见图7的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的CMAS-寡核苷酸在消除目标mRNA方面也优于线性前体。
利用与CMAS-寡核苷酸相同的方法也证明了RiAS-寡核苷酸消除目标mRNA的功能。
将HL-60细胞用RiAS-寡核苷酸、混杂的(SC)-寡核苷酸以及单独的脂转染试剂进行试验。RiAS-寡核苷酸是在与脂转染试剂形成复合物之后被运输到细胞内的。所以，RiAS-寡核苷酸能够消除c-mybmRNA至完全。相形之下，与单独的脂转染试剂处理相比，SC-寡核苷酸温和地减少约30％的c-myb mRNA(见图8的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的RiAS-寡核苷酸在消除目标mRNA方面也是优异的。
本发明人还利用PCR产物的DNA印迹法检查了CMAS-oilgo和RiAS-寡核苷酸的反义效果。
在CMAS-寡核苷酸的情况下，当c-myb信息用RT-PCR扩增时，发现用MIJ-5处理减少了超过90％的信息(见图7的B)。
在RiAS-寡核苷酸中，用经过标记的内部杂交寡核苷酸(30mer)检测用RT-PCR扩增的c-myb信息(图8的B)。结果确认所扩增的信息的确是来自c-myb的。
本发明还提供含有新型AS-寡核苷酸的药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
已经证明，c-myb CMAS-寡核苷酸或c-myb RiAS-寡核苷酸抑制白血病细胞生长。
具体地说，c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用是通过三种方法测量的，即MTT测定法、[3H]胸苷掺入法或软琼脂糖上的集落形成。
作为MTT测定法的结果，当用递增量的MIJ-5、即针对人c-myb的CMAS-寡核苷酸处理时，细胞数逐渐减少。当细胞用MIJ-5处理两次时，更促进了对细胞生长的抑制作用。即使在低浓度下也观察到超过80％的HL-60细胞生长抑制(见图9)。同时，与伪对照相比，线性60mer AS-寡核苷酸、即MIJ-5A和线性有义寡核苷酸对细胞生长不起任何显著的抑制作用。这些结果说明，本发明的c-mybCMAS-寡核苷酸是有效的反义试剂，以浓度依赖性方式有效对抗肿瘤生长。
另外，观察到RiAS-寡核苷酸抑制91％的细胞生长(见图9的A)。
同时，与未经处理的对照相比，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂并不显著地抑制细胞生长。这些结果说明，本发明的c-myb RiAS-寡核苷酸也是用于抑制白血病细胞生长的有效反义试剂。
在软琼脂糖上的集落形成中，MIJ-5减少超过90％的集落形成(见表2)。MIJ-5A也减少集落形成，但是关于生长抑制不太有效，集落减少约70％。另一方面，有义寡核苷酸和SC-寡核苷酸减少集落较少，分别约为11％和32％。
而且，与未经处理的对照相比，转染到细胞内的c-myb RiAS-寡核苷酸能够减少约92％的集落形成(见表3)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂减少集落较少，分别约为7.9％和7.1％。
另外，利用[3H]胸苷掺入法观察c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。具体地说，RiAS-寡核苷酸抑制93％的HL-60细胞生长。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂温和地抑制细胞生长，分别约为16.8％和15.4％(见图10的B)。在显微镜下观察，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸处理HL-60细胞后明显抑制其生长(见图11)。
受本发明的c-mybRiAS-ologo的显著抑制活性的鼓励，本发明人构建了抗两种不同原癌基因、即c-myc和k-ras的其他RiAS-寡核苷酸，并验证c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸是否能够充分抑制细胞生长。
作为显微镜观察的结果，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，所有RiAS-寡核苷酸、c-myb RiAS-寡核苷酸、c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸都明显抑制HT-29细胞的生长(见图12、图13和图14)。
因此，本发明的新颖的针对各种目标序列的RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞显示出有效的生长抑制作用，对核酸酶活性的稳定性也增强了。因此，本发明的新颖的RiAS-寡核苷酸可以有效地用于开发治疗各种人类疾病的分子反义寡核苷酸。实施例
下列实施例阐述本发明的实施和优选实施方式。
不过，将为本领域技术人员所领会的是，在公开内容的基础上可以在本发明的精神和范围内进行修饰和改进。
实施例1：AS-寡核苷酸目标位点的选择
已经发现AS-寡核苷酸的目标位点选择是达到反义效果、减少或切除目标mRNA的关键。不过，目标位点选择的方法一直是相当随意的。因此，在优选的实施方式中，本发明人浏览了全部人c-mybmRNA序列的公认的二级结构，以搜索合理的目标位点。
具体地说，利用DNAsis程序(Hitach Software，Japan)进行二级结构模拟。在100个碱基的邻近框架内循序扫描全部c-myb序列的二级结构形成。然后，将二级结构模拟框架向下错开30个碱基，导致在5’端有60个碱基交错。再次重复这个过程，以便扫描所有给定序列在三个不同框架内的潜在二级结构。
其结果是，从c-myb mRNA序列中选择在三个不同框架内具有最小二级结构的八个序列(表1)。采用AS-寡核苷酸的合理目标位点搜索的目的是增加预测天然二级结构的机会。
表1：选自c-myb mRMA序列的八个反义寡核苷酸目标序列
    名称   互补位点   类型   大小(mer)     序列
  MIJ-1   253-267   反义     15  SEQ ID NO：1
  MIJ-2   401-415   反义     15  SEQ ID NO：2
  MIJ-3   613-627   反义     15  SEQ ID NO：3
  MIJ-4   1545-1559   反义     15  SEQ ID NO：4
  MIJ-6   253-267   反义     15  SEQ ID NO：9
  MIJ-16   585-602   反义     18  SEQ ID NO：10
  MIJ-17   961-978   反义     18  SEQ ID NO：5
  MIJ-19   97-114   有义     8  SEQ ID NO：11
如表1所述，上述8个反义序列与所选择的目标位点是互补的。在8个所选择的AS-寡核苷酸目标位点中，最后选择在形成CMAS分子时在一个组合中的4个位点(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)和在形成RiAS-寡核苷酸时在一个组合中的3个位点(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)，因为它们形成最小的分子内二级结构。
实施例2：共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸的构建
本发明人试图开发具有更好稳定性的改进AS-寡核苷酸。
实施例1所得4个不同AS-寡核苷酸(MIJ-1、MIJ-2、MIJ-3和MIJ-4)用于构建CMAS-寡核苷酸。为了更容易与目标位点结合，构建一个CMAS-寡核苷酸以包容在一个组合中的4个具有最小二级结构的不同反义序列。在合成期间磷酸化AS-寡核苷酸的5’末端，以遵循分子内或分子间共价连接反应(图1)。含有4个不同反义序列的60mer AS-寡核苷酸序列如SEQ ID NO：7所述。用连接反应引物连接AS-寡核苷酸的两端，该引物在其两个搭接端具有与所述60mer AS-寡核苷酸的两个极末端序列(每侧各7个碱基)互补的序列。14mer连接反应引物的序列如SEQ ID NO：6所述。将连接反应引物与AS-寡核苷酸混合，在85℃下加热2分钟，然后逐渐冷却至室温。加入一单位T4连接酶，在16℃下孵育16小时，以生成共价闭合的分子。将CMAS-寡核苷酸在5％MethphorTM琼脂糖凝胶(FMC，USA)或12％变性PAGE上电泳，鉴定其对外切核酸酶III的耐受性以及与线性60mer寡核苷酸相比的轻微凝胶缓聚作用。在90℃下加热后，通过变性凝胶电泳展开，连接反应引物被外切核酸酶III降解或者从CMAS-寡核苷酸分离。
所以，在构建AS-寡核苷酸的细胞内二级结构时无需在AS-寡核苷酸与目标mRNA之间形成双螺旋。这种AS-寡核苷酸被称为CMAS(共价闭合的多重反义)-寡核苷酸。CMAS-寡核苷酸在15％变性PAGE凝胶上的电泳迁移图谱比其线性前体减慢了约10％(图2的A)。正如所预期的，CMAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如变性PAGE凝胶上的多条带所示，其中单体(60mer)是最丰富的，另有二聚体(120mer)和三聚体(180mer)(图2的B)。与CMAS-寡核苷酸相反，线性寡核苷酸在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了。
实施例3：带型反义(RiAS)-寡核苷酸的构建
本发明人用酶学方法连接两个AS-寡核苷酸，形成带型闭合的分子，称为RiAS-寡核苷酸。
具体地说，RiAS-寡核苷酸由两个环和一个连接这两个环的茎组成。每个环含有三个不同的反义(MIJ-3、MIJ-4和MIJ-17)序列，如SEQ ID NO：3、NO：4和NO：5所述。为了更容易与目标位点结合，为AS-寡核苷酸选择三个反义序列与最小可能的二级结构的组合。在5’端磷酸化c-mybAS-寡核苷酸(MIJ-78)。58merMIJ-78的序列如SEQ ID NO：8所述。MIJ-78用于形成茎环结构。茎是由每个寡核苷酸两端上的互补序列所形成的。茎的5’末端具有4碱基的单链序列5′-(p)GATC-3′。两个MIJ-78分子通过该互补的4碱基序列在两个5’末端连接。将MIJ-78分子混合，在85℃下加热2分钟，然后逐渐冷却至室温。加入一单位T4 DNA连接酶，在16℃下孵育24小时，以生成具有双对称性的共价连接分子(图3)。将该RiAS-寡核苷酸在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，检查其对外切核酸酶III的耐受性以及凝胶缓聚作用。
其结果是，构建的RiAS-寡核苷酸(116mer)由两个环和一个连接这两个环的茎组成。将三个反义序列串联地放置在环内，以增加RiAS-寡核苷酸的长度。所以，在RiAS-寡核苷酸中有三个不同反义序列的两个副本(共6个反义序列)。RiAS-寡核苷酸中这种加长的环将适应由与目标mRNA序列形成双螺旋所导致的扭力。发现RiAS-寡核苷酸在变性PAGE凝胶上的迁移比其线性前体(MIJ-78)明显减慢了(图4的A)。正如所预期的，RiAS-寡核苷酸对外切核酸酶III是耐受性的，如PAGE凝胶上的主带(116mer)所示(图4的B)。与RiAS-寡核苷酸相反，MIJ-78在用外切核酸酶III孵育2小时后完全降解了。
实施例4：CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸对核酸酶活性的稳定性增强
为了试验本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸抗核酸酶活性的稳定性，将CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸与不加热灭活以保持核酸酶活性的血清孵育。
具体地说，将非特异性对照-磷酸二酯寡核苷酸(线性60mer)和CMAS-寡核苷酸各1μg分别与未加工人血清、FBS和小牛血清(未加热灭活；HyClone，Logan，Utah，USA)或外切核酸酶III一同孵育。向AS-寡核苷酸中分别加入15％各种血清，反应体积为100μl，在37℃下孵育24小时。然后用苯酚和氯仿抽提AS-寡核苷酸，在15％变性PAGE凝胶上检查。向线性与CMAS-寡核苷酸中加入160U/μg寡核苷酸的外切核酸酶III(Takara，Japan)，在37℃下孵育2小时。按相同方式抽提用外切核酸酶III处理的AS-寡核苷酸并进行电泳。
作为CMAS-寡核苷酸的结果，在血清的存在下孵育24小时后，线性60mer寡核苷酸被完全消化了(图5的A)。不过，本发明的CMAS-寡核苷酸在用未加工人血清、FBS和小牛血清培养24小时后仍然保持大部分完整，说明比其线性前体显著提高了抗核酸酶的稳定性(图5的B)。
在RiAS-寡核苷酸的情况下，在每种不同血清的存在下培养24小时后，线性58mer被完全水解了(图6的A)。不过，本发明的RiAS-寡核苷酸在用未加工血清培养24小时后仍然保持大部分完整，说明比其线性前体显著提高了抗核酸酶的稳定性(图6的B)。
实施例5：CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸特异性地减少c-myb mRNA
受本发明的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸的显著稳定性的鼓励，本发明人检查AS-寡核苷酸是否能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
<5-1>细胞系和组织培养物
白血病细胞系HL-60(前髓细胞白血病细胞系)和K562(慢性骨髓性白血病细胞系)是从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的，在补充有10％加热灭活的FBS(HyClone，USA)和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(Gibco BRL，USA)中进行培养。在37℃下、在CO2孵箱内培养细胞。严格遵守例行细胞培养惯例，以保持适当的细胞密度和避免在解冻储备小瓶之后所培养的细胞超过5代。在用AS-寡核苷酸处理前一天更换培养基。
<5-2>与阳离子脂质体形成复合物的CMAS-寡核苷酸和RiAS-寡核苷酸的转染
将0.3μgCMAS-寡核苷酸加0.8μg脂转染试剂(LipofectinTM)(Gibco BRL，USA)或0.2μg RiAS-寡核苷酸加0.8μg脂转染试剂分别稀释在20μl OPTI-MEMTM中，在室温下孵育40分钟。然后在室温下将每种组分混合15分钟形成复合物。在细胞中加入与不含抗生素的新鲜培养基(RPMI 1640+10％FBS)，1天后加入寡核苷酸，在开始实验前用OPTI-MEM洗涤细胞两次。将细胞密度调整为5×105细胞/ml，每100μl等分在48孔平板(Falcon，USA)中。向细胞加入40μl脂质体-寡核苷酸复合物两次，一次在第0天，一次在第1天。将用寡核苷酸处理的细胞在37℃、5％CO2下培养4小时，然后加入含10％FBS的100μl OPTI-MEM。第二天，小心地除去100μl上清液，用含有寡核苷酸-脂质体复合物的20μl新鲜OPTI-MEM代替。四小时后，细胞中加入与含有抗生素的另外100μl完全培养基，在37℃下培养超过1天，然后开始测定。
<5-3>总RNA的分离和RT-PCR
按照厂商推荐的操作用TripureTM分离试剂(Boehringer Manhein，Germany)分离总RNA。简言之，向所收获的细胞中加入0.4ml Tripure试剂、10μg糖原和80μl氯仿，得到总RNA。在单反应试管内用AccessTM RT-PCR试剂盒(Promrga，USA)进行RT-PCR。在PCR试管内加入RNA、PCR引物、AMV逆转录酶(5U/μl)、Tfl DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MgSO4(25mM，2.5μl)。在48℃DNA热循环器(Hybaid，USA)内进行45分钟第一条cDNA链的合成。随后用厂商推荐的条件进行25个循环的PCR扩增。在1％琼脂糖凝胶中确认扩增后的PCR产物，利用凝胶文档程序(Bio-Rad，USA)进行量化。
<5-4>RT-PCR片段的DNA杂交
在1％琼脂糖凝胶上进行RT-PCR产物电泳。在0.4M NaOH中4小时，将DNA转移到尼龙膜(New England Biolab，USA)上。将膜与30mer内部引物杂交，后者已用ECL 3’末端寡核苷酸-标记与检测系统(Amersham Life Science，England)标记。30mer内部引物的序列如SEQ ID NO：9所述。在含有5×SSC、0.02％SDS的6ml缓冲液中、在62℃下进行杂交60分钟。膜用含有0.1％SDS的5×SSC洗涤两次，用含有0.1％SDS的1×SSC洗涤两次每次15分钟。膜用封闭溶液封闭，然后用HRP(辣根过氧化酶)抗荧光素共轭抗体处理30分钟，然后进行放射自显影。
证明本发明的CMAS-寡核苷酸能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
具体地说，CMAS-寡核苷酸与脂转染试剂形成复合物，运输到细胞内。采用脂转染试剂的原因是发现它对细胞较少毒性，并且产生一致性结果。其结果是，0.3μg MIJ-5、即人c-myb的CMAS-寡核苷酸与1μg脂转染试剂形成复合物，转染到HL-60细胞内。与对照SC-寡核苷酸相比，MIJ-5能够减少超过95％的c-myb mRNA。同时，MIJ-5的线性配对物MIJ-5A减少37％的c-myb mRNA(图7的A)。这些结果说明，即使使用更少的量，本发明的CMAS-寡核苷酸在切除目标mRNA方面也优于线性前体。
这也证明了本发明的RiAS-寡核苷酸能够以序列特异性方式充分消除目标mRNA。
将HL-60细胞用RiAS-寡核苷酸、SC-寡核苷酸以及单独的脂转染试剂转染。RiAS-寡核苷酸是在与脂转染试剂形成复合物之后被运输到细胞内的。人c-myb的RiAS-寡核苷酸(0.1μg或0.2μg)与0.8μg脂转染试剂形成复合物，转染到HL-60细胞内。所以，0.2μg RiAS-寡核苷酸(40nM)能够切除c-myb mRNA至完全。同时，0.1μgRiAS-oilgo减少约70％c-myb mRNA(图8的A)。相形之下，与单独的脂转染试剂处理相比，SC-寡核苷酸温和地减少约30％c-mybmRNA。不过，如底板所示的β-肌动蛋白表达不受RiAS-寡核苷酸处理以及其他处理条件的影响。这些结果说明，即使使用更少的量，RiAS-寡核苷酸在切除目标mRNA方面也是优异的。
本发明人还利用PCR产物通过DNA印迹法检查了CMAS-oilgo和RiAS-寡核苷酸的反义效果。将HL-60细胞用包括MIJ-5在内的寡核苷酸和对照寡核苷酸转染，这些细胞用于分离总DNA。
在CMAS-寡核苷酸的情况下，当用RT-PCR扩增c-myb信息时，发现用MIJ-5处理减少了超过90％的信息(图7的B)。不过，如底板所示的β-肌动蛋白表达不受MIJ-5处理的影响。
在RiAS-寡核苷酸中，用经过标记的内部杂交寡核苷酸(30mer)检测用RT-PCR扩增的c-myb信息(图8的B)。结果证实所扩增的信息的确是来自c-myb的，用0.2μg c-myb RiAS-寡核苷酸处理完全消除了该信息。
实施例6：c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的有效生长抑制作用
据报道，c-myb在白血病细胞增殖中扮演重要角色。另据报道c-myb的AS-寡核苷酸也优先抑制白血病细胞生长。因此，本发明人试验了本发明的c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸抑制白血病细胞生长的作用。
具体地说，c-myb CMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用是通过三种方法测量的，即MTT测定法、[3H]胸苷掺入法或软琼脂糖上的集落形成。
<6-1>MTT测定法
关于MTT(3，-[4，5-二甲基噻唑-2-基]2，5-二苯基溴化四唑鎓，以下称之为“MTT”)测定法，将HL-60细胞用OPTI-MEM洗涤两次，以50μl体积等分在96孔平板中(5×103细胞/孔)。将细胞用预先在不同量寡核苷酸(0.01-1μg/15μl CMAS-寡核苷酸或0.2μg/15μlRiAS-寡核苷酸)与脂转染试剂(0.2μg/15μl)之间形成的复合物处理5小时，并培养5天。然后收获100μl体积的细胞，加入20μl(100μg)MTT试剂(在5mg/ml PBS中；Sigma，USA)，然后在37℃下培养4小时。向细胞加入100μl异丙醇(含有0.1N HCl)，在室温下培养一小时。利用ELISA读数器测量570nm下的吸光度，统计存活的细胞数。
在CMAS-寡核苷酸中，当用递增量的MIJ-5处理时，细胞数逐渐减少。当细胞用MIJ-5处理两次时，更促进了对细胞生长的抑制作用。即使在低浓度下、即0.13μg(共0.24μg)CMAS-寡核苷酸也观察到超过80％的HL-60细胞生长抑制(图9)。同时，与伪对照相比，线性60mer AS-寡核苷酸、即MIJ-5A和线性有义寡核苷酸对细胞生长不起任何显著的抑制作用。这些结果说明，c-myb CMAS-寡核苷酸是有效的反义试剂，是以浓度依赖性方式有效对抗肿瘤生长的试剂。
在RiAS-寡核苷酸中，也观察到RiAS-寡核苷酸抑制91％的细胞生长(图10的A)。
同时，与未经处理的对照相比，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂并不显著地抑制细胞生长。这些结果说明，c-myb RiAS-寡核苷酸是用于抑制白血病细胞生长的有效反义试剂。
<6-2>软琼脂糖上的集落形成
还用另一种方法、即软琼脂糖上的集落形成测量了c-mybCMAS-寡核苷酸和c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。
具体地说，如实施例6所述转染K562细胞，在37℃和5％CO2下培养24小时。向细胞加入0.8％低熔点琼脂糖与2(含有20％FBS加抗生素的RPMI 1640)的等体积混合物，接种在6孔平板上，固结。将6孔平板冷却至4℃达5分钟，并培养15天。含有超过20个细胞的集落记为阳性。
其结果是，CMAS-寡核苷酸MIJ-5减少超过90％的集落形成(表2)。MIJ-5A也减少集落形成，但是关于生长抑制不太有效，集落减少约70％。另一方面，有义寡核苷酸和SC-寡核苷酸较少地减少集落，分别约为11％和32％。
表2：c-myb寡核苷酸对K562细胞集落形成的作用
    寡核苷酸   集落数   集落形成％
    结构 大小(mer)     类型
    线性     15  AS-MIJ-1     55     44.4
    线性     15  S-MIJ-3     110     88.7
    线性     15  SC-MIJ-1     84     67.7
    线性     60  AS-MIJ-5A     29     23.4
    CMAS     60  AS-MIJ-5     9     7.2
单独的脂转染试剂     109     88.0
  未经处理的对照     124     100.0
另一方面，与未经处理的对照相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸转染的细胞能够减少约92％的集落形成(表3)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂较少地减少集落，分别约为7.9％和7.1％。
表3：c-myb寡核苷酸对K562细胞集落形成的作用
    寡核苷酸   大小(mer)     集落数   集落形成％
  RiAS-寡核苷酸     116     7.6±1.53     7.8
  混杂的寡核苷酸     116     0.5±2.12     92.1
  单独的脂转染试剂     91.3±4.16     92.9
  未经处理的对照     98.3±4.04     100.0
<6-3>[3H]胸苷掺入
还用[3H]胸苷掺入法测量了c-myb RiAS-寡核苷酸对白血病细胞的生长抑制作用。
关于[3H]胸苷掺入法，如上所述将HL-60细胞用AS-寡核苷酸处理。向细胞加入0.5μCi的[3H]胸苷(2.0Ci/mmol；Amersham，England)，培养16小时，一式三份。然后在玻璃微纤维滤器(WhatmanGF/C，England)上收获细胞。滤器按顺序用冷PBS、5％TCA和纯乙醇洗涤。在含有甲苯、Triton X-100，PPO和POPOP的鸡尾酒溶液中，利用液体闪烁计数器测量[3H]胸苷掺入。
结果，RiAS-寡核苷酸(0.2μg)抑制93％HL-60细胞生长(图10的B)。同时，SC-寡核苷酸和单独的脂转染试剂温和地抑制细胞生长，分别约为16.8％和15.4％。在显微镜下观察，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，用c-myb RiAS-寡核苷酸处理HL-60细胞后明显抑制其生长(图11)。
实施例8：c-mycRiAS-寡核苷酸和k-rasRiAS-寡核苷酸的有效生长抑制作用
受本发明的c-myb RiAS-ologo的显著抑制活性的鼓励，本发明人构建了抗两种不同原癌基因、即c-myc和k-ras的其他RiAS-寡核苷酸，方法同实施例3。
然后检查c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸是否能够充分抑制细胞生长。
具体地说，使用不同的细胞系，即结肠直肠腺癌细胞系HT-29。c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞的生长抑制作用是用[3H]胸苷掺入法测量的，方法同实施例<6-3>。将HT-29细胞分别用0.2μg c-myb RiAS-寡核苷酸加0.6μg脂转染试剂或0.5μg c-myc RiAS-寡核苷酸加1.5μg脂转染试剂或0.5μg k-rasRiAS-寡核苷酸加1.5μg脂转染试剂的阳离子脂质体复合物处理。用以上RiAS-寡核苷酸处理5天后，利用显微镜检查观察HT-29细胞的生长。各用RiAS-寡核苷酸(A)、混杂的寡核苷酸(B)和单独的脂转染试剂(C)处理后，每个显微照片都表现对生长抑制的作用。
作为显微镜观察的结果，与用混杂的寡核苷酸和单独的脂转染试剂处理的细胞相比，所有RiAS-寡核苷酸、c-myb RiAS-寡核苷酸、c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸都明显抑制HT-29细胞的生长(图12、图13和图14)。
因此，本发明的新颖的各种目标序列RiAS-寡核苷酸对肿瘤细胞显示有效的生长抑制作用，对核酸酶活性的稳定性也增强了。因此，本发明的新颖的RiAS-寡核苷酸可以有效地用于开发治疗各种人疾病的分子反义寡核苷酸。
工业实用性
本发明提供新颖的AS-寡核苷酸，含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列，并且具有更好的目标序列特异性和对核酸酶活性的稳定性。
具体地说，本发明提供共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸，含有针对c-myb mRNA的多目标反义序列，其构建方法是利用互补引物的连接反应形成闭合型。另外，本发明提供带型反义(RiAS)-寡核苷酸，含有c-myb mRNA的多目标反义序列，其构建方法是利用互补序列的连接反应在两个5’末端上形成茎环结构。
已经证明，当人肿瘤细胞用本发明的c-myb RiAS-寡核苷酸和c-myb CMAS-寡核苷酸以及c-myc RiAS-寡核苷酸和k-ras RiAS-寡核苷酸处理时，本发明的新颖的AS-寡核苷酸有效去除异常基因表达。因此提示了本发明的新颖的AS-寡核苷酸可以用于开发各种致病基因的分子反义药物，以及用于基因的功能研究。具体地说，本发明的新颖的AS-寡核苷酸可以用于开发药物组合物，用于治疗癌症、免疫疾病、传染病和其他由异常基因表达导致的人类疾病。
将为本领域技术人员所领会的是，在上述说明中公开的概念和具体实施方式易于用作修饰或设计其他实施方式的基础，以实现本发明的相同目的。也将为本领域技术人员所领会的是，这些等价的实施方式并不背离如所附权利要求所阐明的本发明精神和范围。

Claims (23)

1、一种新颖的反义寡核苷酸，通过含有针对具有较小二级结构的mRNA区的一个或更多反义序列来提高其目标序列特异性，通过构建闭合型来提高其对核酸酶活性的稳定性。
2、根据权利要求1的新颖的AS-寡核苷酸，其中所述mRNA是从各种导致人类疾病的基因转录的。
3、根据权利要求1的新颖的AS-寡核苷酸，它是共价闭合的多重反义(CMAS)-寡核苷酸，其中用连接反应引物通过所述AS-寡核苷酸的连接反应将CMAS-寡核苷酸构建成闭合型。
4、根据权利要求3的CMAS-寡核苷酸，其中所述AS-寡核苷酸是如SEQ ID NO：7所述的60mer AS-寡核苷酸。
5、根据权利要求4的CMAS-寡核苷酸，其中所述SEQ ID NO：7包含如SEQ ID NO：1、NO：2、NO：3和NO：4所述的4个反义序列。
6、根据权利要求3的CMAS-寡核苷酸，其中所述连接反应引物包含如SEQ ID NO：6所述的14mer核苷酸。
7、根据权利要求3的CMAS-寡核苷酸，它有效消除或降低参与人类疾病的异常基因表达。
8、根据权利要求7的CMAS-寡核苷酸，其中所述基因是原癌基因c-myc、c-myb或k-ras。
9、根据权利要求3的CMAS-寡核苷酸，它有效抑制肿瘤细胞生长。
10、根据权利要求9的CMAS-寡核苷酸，其中所述肿瘤细胞是前髓细胞性白血病细胞系HL-60、慢性骨髓性白血病细胞系K562或结肠直肠腺癌细胞系HT-29。
11、根据权利要求1的新颖的AS-寡核苷酸，它是带型反义(RiAS)-寡核苷酸，其中使用互补序列通过在两个AS-寡核苷酸的每个5’末端的连接反应将所述RiAS-寡核苷酸构建成带型。
12、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，它具有两个环和一个连接这两个环的茎的茎环结构。
13、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，其中所述AS-寡核苷酸是如SEQ ID NO：8所述的58mer AS-寡核苷酸。
14、根据权利要求13的RiAS-寡核苷酸，其中所述SEQ ID NO：8包含如SEQ ID NO：3、NO：4和NO：5所述的3个反义序列。
15、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，其中所述互补序列是5’-(p)GATC-3’。
16、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，它有效消除或降低参与人类疾病的异常基因表达。
17、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，其中所述基因是原癌基因c-myc、c-myb或k-ras。
18、根据权利要求11的RiAS-寡核苷酸，它有效抑制肿瘤细胞生长。
19、根据权利要求18的RiAS-寡核苷酸，其中所述肿瘤细胞是前髓细胞性白血病细胞系HL-60、慢性骨髓性白血病细胞系K562或结肠直肠腺癌细胞系HT-29。
20、AS-寡核苷酸-脂质体复合物，含有权利要求3所述的CMAS-寡核苷酸或权利要求11所述的RiAS-寡核苷酸。
21、根据权利要求20的AS-寡核苷酸-脂质体复合物，其中所述脂质体是阳离子脂质体。
22、含有权利要求3所述的CMAS-寡核苷酸或权利要求11所述的RiAS-寡核苷酸作为有效成分的药物组合物。
23、根据权利要求22的药物组合物，它用于治疗癌症、免疫疾病、传染病或其他由异常基因表达导致的人类疾病。
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