CN1131437A - 反义寡核苷酸对血管内皮生长因子表达的抑制作用 - Google Patents

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Abstract

已证明也可称为血管通透性因子(VPF)的血管内皮生长因子(VEGF)在与各种各样的病理状态相关的异常血管生成中起着必要的作用。本发明提供了用于抑制这种异常血管生成的化合物、组合物和方法。具体地说，本发明公开了19-21个碱基长的几种反义寡核苷酸，它们与VEGF RNA相结合并抑制表达产物的产生。这些反义寡核苷酸可用于治疗由于VEGF表达的作用而产生的病理状态。

Description

反义寡核苷酸对血管内皮生 长因子表达的抑制作用
本发明涉及用于抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的反义寡核苷酸。
血管内皮细胞生长因子(VEGF)也称为血管通透性因子(VPF)，是由各种各样的肿瘤和正常细胞合成并分泌的一种34-43KDa(主要形式为约45KDa)二聚体形式的二硫键连接的糖蛋白。Leung等人，Science，246，1306(1989)观察到三种VEGF转录物(长度分别为121，165和189个氨基酸)，这意味着涉及另一种拼接机理，最近，Houck等人发现具有长度为206个氨基酸的第四种VEGF转录物。Tischer等人，J.Biol.Chem.266，11947(1991)已经测出人的VEGF编码区是由8个外显子组成的。再者，该研究小组证实三种mRNA转录物(编码长度为121，165和189个氨基酸的肽)是另一种拼接方式产生的。已经在牛系统中鉴别出与121和165个氨基酸多肽相类似的转录物。Le-ung等人，文献同上。在啮齿动物系统-大鼠(Conn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，2628(1989))，豚鼠(Sanger等人，Can-cer Res.50，1774(1990))，以及小鼠(Claffey等人，J.Biol.Chem.257，16317(1992)中也已经鉴定出对应于165个氨基酸的转录产物。
Tischer等人(文献同上)报道了三种类型的人VEGF编码区的核酸序列。Claffey等人(文献同上)公开了鼠VEGF的序列。进行比较后结果显示VEGF分子具有85％以上的种间保守性。还没有鉴别出所有的以另一种方式拼接的VEGF分子，但基于种之间的保守性，应该在不久的将来可能做到。
下面的讨论提供了几种与VEGF相关的病理状态，并且强调了VEGF作为治疗的潜在目标的重要性。
糖尿病性视网膜病
在美国，糖尿病性视网膜病是引起工作年龄的成年人(20-64岁)眼睛失明的最主要原因。在糖尿病期间，引发的一种并发症是视网膜静脉闭塞。这种静脉闭塞导致由于脉管壁扩张，出血(血渗到周围区域)，代表细胞渗出物(即细胞损伤)的“棉花”斑形成，以及扩伸到玻璃体中的视网膜新血管形成而形成微动脉瘤，导致出血。治疗糖尿病性视网膜病的经典方法是1)控制血液葡萄糖和血压以及2)盘状视网膜激光光凝固作用(PRP)。治疗方法#1可根据患病个体的努力情况推迟疾病的发作。治疗方法#2是非常有效的，但可导致其他出血以及对视力必需的关键区域(即小凹纤维)的损伤。有较少副作用的治疗该疾病的其他方法将是十分有价值的。
最近的研究结果显示，在糖尿病患者的视网膜中VEGF蛋白水平增加，这意味着这种细胞因子/生长因子在该疾病中起着重要作用。下面所述的VEGF的特征提供了这样的证据：它可能是糖尿病性视网膜病的一种重要调节子：(1)VEGF的作用具有对内皮细胞的特异性；(2)已证明VEGF是促血管形成的并且是促有丝分裂的；(3)VEGF是一种分泌的分子；(4)VEGF诱导血管通透性；(5)VEGF是在缺氧条件下被诱导(即在视网膜静脉闭塞)。
动脉粥样硬化斑的形成
VEGF可能在动脉粥样硬化斑的演变过程中起作用。动脉粥样硬化显示一种状态，该状态中中等动脉和主动脉中出现了含有脂类的损伤。在美国，它是心肌和脑梗死的首要原因。内膜内的损伤，即动脉壁最里面层的损伤可分为两种形式：脂肪条纹(早期)，以及纤维斑(较严重的)。这两种形式以充满脂类的巨噬细胞(衍生于血产生的单核细胞)以及平滑肌细胞为特征。纤维斑的另外的特征在于沉积了连接组织以及胆固醇晶体。这些损伤堵塞了血管的腔，减小了血流，导致局部缺血和坏死。研究已经证明，新血管的形成也可以出现于动脉粥样硬化损伤。这些患病区域的VEGF蛋白质的水平还没有测出，但已经证明单核细胞和巨噬细胞都表达VEGF。
创伤愈合
VEGF在保持创伤愈合的正常状态中也可能起重要作用。参见Brown等人，J.Exp.Med.176，1375(1992)。创伤愈合通常是对损伤或外伤产生受调节的应答。病灶的出血跟随着从血浆往外渗出(渗出)纤维蛋白原从而形成纤维蛋白凝胶或凝块。该起始基质由肉芽组织(粘连蛋白，胶原蛋白，蛋白聚糖)所替代并且最后形成瘢痕组织。另外，角质化细胞迁移并且形成外被以防止体液损失和细菌感染。创伤愈合的一个主要特性是在出血终止之后某段时间出现了脉管的通透性过高。另外，在该段时间内可检测到促血管形成活动。最近研究证明，位于伤口边界以及在伤口外被层中的角质化细胞产生VEGF。Brown等人，文献同上。该结果暗示VEGF可能对与伤口愈合相关的通透性过高和促血管生成活动起作用。
与外科手术相关的异常的伤口愈合可导致产生并发症，例如瘢痕增生(过量胶原沉积)，瘢痕瘤形成(瘢痕组织入侵到周围正常组织中)，以及腹腔粘连。在肺纤维化形成期间和糖尿病(创伤不愈合)中出现与未受调控的创伤愈合相关的其他问题。据认为，VEGF在这些过程中也起着作用。
肿瘤血管形成
VEGF可能是一种肿瘤血管生成因子。Plate等人，Nature 359，845(1992)。血管生长是受严格调控的过程，该过程演化出了新血管。血管系统的形成对营养物和废物流至和流出组织和器官是必要的。较小的固体肿瘤(＜1-2mm)不需要广泛的血管系统而可生存，但代之以通过必需营养物扩散而得到营养物质。但是，为了使这些细胞群生长至大于几个毫米以上，需要其他血管生成。参见例如，Folkman，J.Natl.Cancer Inst.82，4(1990)。已经有人提示，抑制肿瘤血管生成可能是抵抗肿瘤生长以及防止发生对传统抗肿瘤治疗剂产生抗性的有效方案。Kerbel，BioEssays 13，31(1991)。Kim等人，Nature 362，841(1993)报道了特异于VEGF的单克隆抗体在体内抑制肿瘤生长。
含有连接组织和血管系统的肿瘤基质实质上是肿瘤的“生命线”。正常组织的脉管系统有很好的组织形式，并且可应答代谢中的变化，而肿瘤基质中的组织形式较差，非常类似于伤口愈合期间的疤痕组织。肿瘤基质仅代表总的肿瘤(例如乳腺髓状癌)的一小部分或者以占总细胞群的80-90％存在(例如在结缔组织生成的癌)。肿瘤血管也与正常组织中的不相同，肿瘤血管对血浆和血浆蛋白的渗透性过高。而在正常组织中仅在伤口愈合期间可看到这样的渗透性，固体肿瘤无限期地保留这种渗透特性。
尽管基质是肿瘤生长的必要成分，它也起着针对大分子(例如单克隆抗体)的障碍层的作用，从而需要足够量的这些大分子才可起到有效治疗剂的作用。在巨大肿瘤中，由于扩散空间大以及吸收到外周肿瘤细胞的血管周区域，抗体/大分子也不是有效的。因此，迫切需要另一种治疗化合物。
正如所讨论的，VEGF是许多病理状态和过程的主要成分。研究证明，VEGF存在于肿瘤区域，其中出现毛细管生长，并且暗示VEGF可以引起导致血管生成的整个一系列事件的发生。相反，在正常组织中VEGF水平相当低。因此，对VEGF表达水平进行调节可能是治疗病理状况而不会明显影响正常组织的重要方法。例如，从早期讨论中得出对VEGF表达的抑制可以在下列方面起着重要作用(a)调节与糖尿病性视网膜病相关的视觉上的并发症，(b)调节动脉粥样硬化斑的形成，(c)控制涉及伤口愈合过程中的不受调节的活动，以及(d)阻止和改变与肿瘤生长和转移相关的血管生成。当然，这些仅是涉及VEGF的疾病状态的例子，并且在这些实例中对VEGF表达进行调节被证明是有用的。由VEGF表达引起的其他病理状态也可能采用对VEGF表达进行调节而进行治疗。
反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotide technology)为抑制VEGF的表达提供了一种新的方法。参见综述Agrawal，Tren-ds in Biotech.10，152(1992)。反义寡核苷酸通过结合到互补核酸序列(有义义链)上，能够抑制RNA的拼接和转译。以这种方式，反义寡核苷酸能够抑制蛋白质表达。反义寡核苷酸也可结合到基因组DNA上，形成螺旋，而抑制转录。再者，从统计学上说在人基因组中17聚体碱基序列仅出现一次，因而用这样的反义寡核苷酸十分精确地靶击特异的序列是可能的。
1978年，Zamecnik和Stephenson首先建议将反义寡核苷酸用于治疗目的。Stephenson和Zamecnik，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75，285(1978)；Zamecnik和Stephenson，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75，280(1978)。他们报道了利用与劳氏肉瘤病毒的RNA互补的13聚体寡核苷酸可抑制细胞培养物中病毒的生长。从那时起，已发表了大量其他的研究成果，证明反义寡核苷酸体外抑制病毒生长的效能，例如对水疱性口炎病毒(Leonetti等人，Gene 72，323(1988))，单纯性疱疹病毒(Smith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，2787(1986)以及流感病毒(Zerial等人，Nucleic Ac-ids Res.15，9909(1987))的效果。
还在哺乳动物系统中证明反义寡苷酸抑制蛋白质表达。例如Burch和Mahan，J.Clin.Invest.88，1190(1991)公开了分别靶击鼠和人IL-1受体的反义寡核苷酸，它们分别在鼠和人成纤维细胞中抑制IL-1刺激的PGE2合成；Colige等人，Biochemistry 32，7(1993)公开了一种反义寡核苷酸，它们特异地抑制在转染的鼠3T3细胞中被突变的人原胶原基因的表达，但并不抑制表达相同蛋白质的内源性基因的表达；以及Monia等人，J.Biol.Chem.267，19954(1992)公开了用硫代磷酸酯反义寡核苷酸选择性地抑制突变Ha-ras mRNA的表达。
但是在大多数情况下，未经修饰的反义寡核苷酸不适用于体内系统，因为其易于受核酸酶功击。因此，已经在这一领域进行了大量研究，以修饰寡核苷酸，使其免受这种功击，从而在体内使用时使该分子稳定。参见综述Uhlmann和Peymann，Chemical Reviews90，543(1990)P.545-561及其引用的参考文献。人们的注意力集中于对核苷酸间磷酸残基的修饰，对核苷单元修饰，对2′位置的修饰以及用其他成分替代核苷酸间磷酸酯。例如，Padmapriya和Agrawal，Bioorg & Med.Chem.Lett.3，761(1993)公开了寡脱氧核苷甲基硫代膦酸酯(methylphosphonothioate)的合成；Temsa-mani等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，318(1992)公开了一些3′末端加帽的寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯；以及Tang等人，Nucleic AcidsRes.21，2729(1993)公开了自身稳定化的反义寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯，其3′末端具发夹环结构。
许多经修饰的寡核苷酸能够耐受溶核降解，并仍能够与靶序列杂交，抑制蛋白质表达。这些经修饰的寡核苷酸更适合体内应用。Tang等人(文献同上)证明自我稳定化的反义寡核苷酸与其线性分子相比，在小鼠体内的稳定性更大。Simons等人，Nature 359，67(1992)报道了两种反义c-myb硫代磷酸酯寡核苷酸的使用，它们在体内抑制了大鼠颈动脉的平滑肌细胞在内膜的积累。
由Pederson等人在U.S.专利NO.5,220,007(′007)公开的寡核苷酸是另一种经修饰的反义寡核苷酸，这种寡核苷酸特别适用于体外和体内抑制蛋白质表达。该分子包括具有两个或两个以上连续的、经修饰或未经修饰的磷酸二酯链的内部序列。该内部序列两侧为经修饰的核酸序列。该内部序列激活RNA酶H，而两侧序列不能激活RNA酶H。结果是，当′007专利的寡核苷酸结合到靶mRNA序列上时，RNA酶H将切除与反义寡核苷酸的内部序列互补的靶序列区域。从而使靶mRNA失活而抑制了蛋白质的表达。
类似地，已经证明3′末端加帽(Temsamani等人，文献同上)和自我稳定化的3′发夹环(Tang等人，文献同上)反义寡核苷酸对溶核功击的稳定性提高，因而很适合于蛋白质表达的抑制。Tang等人的3′发夹环结构的特征为具有一个与一个内部序列互补并退火至该内部序列上的3′末端序列。
用反义寡核苷酸抑制VEGF表达以控制血管生成还有另一个令人信服的理由。诸如单克隆抗体的大分子在其有效浓度时可能难以到达其靶位点，而反义寡核苷酸可容易进入细胞/细胞群并且积累到抑制浓度。VEGF的反义抑制可能为改变异常血管的生成和发展提供了重要工具。
借助于反义寡核苷酸技术抑制VEGF的表达也适用于测定该细胞因子在涉及血管生成过程中的作用。已研制出了模拟血管形成/渗透性的体外系统。在该系统中利用反义寡核苷酸可以测出VEGF的作用。其它使用中的或正在设计的体外系统也可受惠于该技术。在几个领域内VEGF的作用还没有得到确定。如果VEGF的抑制作用没有降低肿瘤生长，并不意味着不应该研究其他系统(牛皮癣，授精-移植，子宫内膜血管化)。
已证明血管内皮生长因子(VEGF)在与各种各样病理状况相关的血管形成中起着必要的作用。本发明的一个目的是抑制与病理状况相关的血管形成。本发明另一目的是提供用于阻止与这些状态相关的VEGF的表达的化合物、组合物和方法。本发明再一目的是提供治疗这些病理状态的化合物、组合物和方法。
因此，本发明提供了已构建的反义寡核苷酸，这些寡核苷酸的目标在于结合至编码VEGF的核酸序列上，从而阻止该表达产物的产生。还提供了利用这些寡核苷酸在体内和体外抑制VEGF表达和血管生成的方法。
附图简单描述
根据下面描述，与附图一起阅读时可充分理解本发明的上述和其他目的、其各种特征以及发明本身，其中
图1显示RNA酶H结合性分析结果。
图2显示实施例2的免疫沉淀结果，显示在稳定表达VEGF的转染COS-1细胞中VEGF表达的体外抑制。
图3显示实施例3的免疫沉淀结果，证明在内源性地表达VEGF的鼠NB41细胞中VEGF表达的体外抑制。
已经发现了几种新的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，它们结合到鼠VEGF RNA上并在体外抑制VEGF表达。对于以转录起始和终止位点，以及VEGF mRNA的内部编码区为目标的反义寡核苷酸，发现其对VEGF表达有抑制作用。本发明公开的寡核苷酸长度范围为19-21个碱基，但正如预料的，在没有很大影响该分子的抗VEGF特性情况下可对该寡核苷酸的长度进行变改。本发明优选的反义寡核苷酸是5’-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3’(SEQ ID NO 2)(Vm)，5’-CATGGTTTCGGAGGGCGTC-3’(SEQ ID NO 3)(JG-4)，5’-CACCCAAGAGAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO 4)(JG-6)，和5’-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO 5)(JG-7)。
利用亚磷酰胺方法在Pharmacia Gene Assembler系列合成仪上合成本发明的寡核苷酸。参见例如Ulhmann和Peymann，pp.550-551及其引用的参考文献。在组装并脱保护之后，将寡核苷酸用乙醇沉淀二次，干燥并重新悬浮于磷酸盐缓冲液(1×PBS)中至所需浓度。但是这些相对短的寡核苷酸可用常规方法制备。几种这样的方法也是本领域内已知的，参见上文。
鼠VEGF的核酸序列是已知的，Claffey等人，见上文。序列5′-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3′(SEQ ID NO 2)(Vm)靶击转译终止位点周围的序列。序列5′-CATGGTTTTCGGAGGGCGTC-3′(SEQ ID NO 3)(JG-4)靶击鼠VEGF分子的含有ATG的转录起始位点5′端序列。序列5′-CACCCAAGAGAGCAGCAGAAAGT-3′(SEQ ID NO 4)(JG-6)靶击含鼠VEGF分子的第2-7个密码子的序列。序列5′-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3′(SEQ ID NO 5)(JG-7)靶击含鼠VEGF分子的第24-29密码子的序列。在所有四种VEGF的转录物中这些被靶击的VEGF核酸序列是保守的，导致对VEGF表达的完全抑制。
对鼠VEGF核酸序列的区域(其相应的反义寡核苷酸抑制了VEGF表达)的阳性鉴定暗示，靶击到人VEGF核酸序列中的相应区域的人反义寡核苷酸将抑制人细胞中VEGF的表达。种间的高度同源性支持了这种观点。相应的人VEGF反义寡核苷酸是5′-CAGCCCGGCTCACC-GCCTCGG-3′(SEQ ID NO：11)(靶击转译终止位点周围序列)，5′-CA-TGGTTTCGGAGGCCCGA-3′(SEQ ID NO：12)(靶击人VEGF分子包含ATG的转录起始位点5′端序列)，5′-CACCCAAGACAGCAGAAAGT-3′(SEQ IDNO：13)(靶击含有人VEGF分子的密码子2-7的序列)以及5′-CCA-TGGGTGCAGCCTGGGAC-3′(SEQ ID NO：17)靶击含有人VEGF分子的第24-29密码子的序列)。预期这些反义寡核苷酸能在人细胞中抑制VEGF表达，其抑制程度应相同于本发明的鼠反义寡核苷酸在鼠细胞中对VEGF表达的抑制。
对于VEGF表达的反义抑制，外显子-内含子分界线是潜在有用的目标。根据已公开的和本文提供的核酸序列，只需要最小量的试验，本领域内技术人员即可识别出抑制VEGF表达的那些反义核酸序列。
本领域技术人员还会明白，可以对反义寡核苷酸的核苷酸间连键进行修饰而不会对VEGF的抑制效果产生不利影响。实际上，某些修饰可以提高抑制效率。许多修饰类型是本领域内熟知的，并且，根据本发明的内容，可很容易生产那些既适用于体外又适用于体内抑制VEGF表达的寡核苷酸。本发明考虑到的修饰是3′末端加帽结构，自身稳定化的3′发夹型结构以及由不能活化RNA酶H的两侧序列和可活化RNA酶H的内部序列组成的修饰，所有这些修饰结构前文都有描述。其它适用于本发明的经修饰的核苷酸间连键是甲基膦酸酯以及亚磷酰胺连键，这些由Uhlmann和Peymann描述，文献同上。本领域技术人员将会看到，本发明也考虑到其他稳定化修饰。
预期，通过将本发明的反义寡核苷酸硫代磷酸酯施用给哺乳动物，可以达到对VEGF表达和异常血管生成的体内抑制。给药方法可采用慢速输注泵，以约0.5-3.0nMoles/小时(每公斤体重约0.15-1.0mg的20聚体寡核苷酸)施用给患肿瘤血管生成的小鼠。另一种可采用方法是静脉注射，以每公斤体重约1-5mg的寡核苷酸注注射到尾静脉。在约10-21天之后，切除肿瘤，通过观察肿瘤的重量和形态以及对VEGF表达进行分析。与用对照寡核苷酸治疗的小鼠的肿瘤和VEGF水平进行比较。预期，对照小鼠的肿瘤和VEGF水平比用本发明反义寡核苷酸治疗的小鼠要大。
可用几种方法监测反义寡核苷酸对VEGF表达的影响。在RNA水平上进行Northern印迹分析。采用Chirgwin等人，Biochmistry 185294(1979)的硫氰酸胍方法获得RNA。在1％甲醛琼脂糖凝胶上将10μg总RNA进行电泳并转移到带电的尼龙膜(ICN Biotrans)。用32p标记的VEGF cDNA片段探测该膜并用X-射线胶片曝光。
采用几种方法可测定生物活性，包括Miles脉管通透性分析。Miles和Miles，J.Physio1.(Lond)。118，228(1952)。将Hartley豚鼠(800克)剃毛，拔毛并用每100ml含有0.5克Evans蓝染料的1.0ml普通盐水进行静脉注射。将含有未知量的VEGF的无血清培养基进行皮下注射(250μl)。在该实验中还包括阳性(纯化VEGF)和阴性(普通盐水)对照。注射之后20分钟，将动物杀死，并切下检测和对照位点，对渗出的Evans蓝色染料进行定量。该分析检测极限值是500pM。
也可用内皮细胞有丝分裂显示生物活性。在该方法中，在EGM-UV培养基(Clonetics)上生长并维持人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。然后在含有1.4ml EBM培养基(Clonetics)加5％热灭活的胎牛血清的35mM组织培养平皿中平板培养1×104个细胞，设置一个重复。在细胞吸附之后(约4小时)，将两个细胞平皿用胰蛋白酶酶解，计数，并用作起始细胞数。然后向两个重复设置的剩余的平皿中在第0天和第2天加入含未知量的VEGF的检测样品。还使用了含有纯化VEGF(阳性)和PBS(阴性)的对照。在第4天，将细胞平皿用胰蛋白酶消化，计数，并与起始细胞数相比较。该分析的检测极限是10pM。
细胞内钙的释放是第三种测定生物活性的方法。参见，例如，Brock和Capasso，J.Cell Physiol.136，54(1988)。将人脐静脉上皮细胞(HUVEC)维持于EGM-UV培养基中。借助EDTA和胶原酶从平板上除去细胞，用钙敏感性染料Fura-2监测细胞内钙浓度的变化。简而言之，向预先加入了Fura-2的悬浮的HUVEC试样中加入含未知浓度VEGF的培养基。在Hitachi 2000F荧光计上检测荧光的变化。也对阳性(组胺，凝血酶)和阴性(EGTA)进行分析。(凝血酶和组胺通过佛波醇酯敏感性途径在人内皮细胞中激活磷脂酶c)。该方法十分灵敏，检测极限值为0.2pM。
仅仅利用常规实验操作，本领域内技术人员就能够认识或能够确认本发明描述的特定物质、方法和步骤的许多等同物。这些等同物也在本发明范围内，并由下文列出的权利要求所覆盖。
下面的实施例仅是为了描述，而不是为了限制本发明。
                       实施例1
                   RNA酶H消化试验
实验程序：
将鼠VEGF cDNA亚克隆到pBLuescript SK+质粒中。按照制造商的说明以有义(T3 RNA聚合酶)和反义(T7 RNA聚合酶)方向转录32p标记的RNA。在用苯酚/CHCl3萃取和乙醇沉淀之后，将RNA重悬于T.E.缓冲液(10mM tris，pH7.5，1mM EDTA，pH8.0)并且贮存于-80℃。通过用三氯醋酸(TCA)沉淀而测出比活性。检测条件如下：
杂交条件：
100-200ng寡核苷酸
10μg10×RNA酶H缓冲液
-50mM Tris，pH8.3
-10mM MgCl2
-50mM KCl
-5mM DTT
1×105-106dpm RNA
55°-60 ℃，5分钟
30分钟内冷至室温
在下列条件下将RNA-寡核苷酸双链体与RNA酶H相接触：
2μg RNA-寡核苷酸双链体
1μg 10×RNA酶H缓冲液
0.5μl(0.4-0.5单位)RNA酶H(Pharmacia)
37℃，15分钟
加入15μl甲酰胺/溴苯酚染料混合物并且在4％ Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)聚丙烯酰胺凝胶上电泳而进行分析。在电泳完成之后，将凝胶干燥并于X-射线胶片曝光进行分析。
寡核苷酸硫代磷酸酯：
V1：5′-CAGAAAGTTCATGGTTTCGGA-3′(SEQ ID NO：1)
V1是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击转译起始位点周围序列。
V2：5′-TCCGAAACCATGAACTTTCTG-3′(SEQ ID NO：10)
V2是V1的互补(有义)寡核苷酸(21聚体)。本试验中它用作寡核苷酸抑制作用的对照。
Vm：5′-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3′(SEQ ID NO：6)
Vm是一个反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击转译终止位点周围序列。
R(随机)：在每个位置有所有四种核苷酸(21聚体)
随机寡核苷酸用作实验中另外的寡核苷酸对照。
分析：
可看到RNA酶H能消化与反义寡核苷酸相杂交的VEGF有义RNA。参见图1。未被消化的探针长度为980个核苷酸。V1显示分别为830和150个核苷酸的预期的裂解产物。Vm显示分别为665和315核苷酸的预期的消化产物。没有任何对照寡核苷酸(V2，随机)导致VEGFRNA发生任何特异性裂解。对于所有寡核苷酸都不同程度地检测到了非特异性裂解。
作为该试验的对照，将这些寡核苷酸与VEGF反义RNA相杂交并将其进行RNA酶H消化。仅V2导致RNA的裂解，产生877和103核苷酸的裂解产物。根据这一结果，预期该寡核苷酸为有义方向。
该试验显示，反义寡核苷酸在靶击VEGF RNA的它们相应的序列中是有效的，并且得到的RNA-DNA双链体是RNA酶H消化的底物。
                      实施例2
     用抗-VEGF免疫沉淀反应检测反义寡核苷酸在
        COS-1细胞中对鼠VEGF蛋白质表达的抑制
实验程序：
将稳定表达鼠VEGF的COS-1细胞在Dulbecco′改良的伊格尔氏(DME)完全培养基中生长至90％汇合，所述培养基含有胎牛血清(10％)，谷氨酰胺(2mM)，青霉素/链霉素(100u/100μg)以及一种氨基糖苷类抗生素(geneticin)(200μg/m1)。用无血清DME将细胞清洗两次，然后加入含有浓度为10μg/ml脂转染试剂(Lipofect-in)的无血清培养基，该脂转染试剂是一种脂类介导的载体。将反义寡核苷酸重悬于蒸馏水中，并逐滴加入到培养基中至所需浓度。在16-20小时之后再加入寡核苷酸(存在于不含Lipofectin的新鲜DME＋10％胎牛血清中)。在首次加入寡核苷酸之后46小时，将细胞在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸的无血清培养基中清洗并在含150-200μCi 35S-Translabel(ICN)的1ml这种培养基中标记4个小时。收集带标记的培养基，并离心以便除去细胞和/或碎片，并在-80℃冷冻。
在BSA(100μg)和TCA(5％)存在下将已标记的蛋白质进行沉淀。在玻璃纤维滤纸上收集沉淀的蛋白质并且借助于闪烁计数器进行计数。在多克隆抗-VEGF(人)抗体存在下在4℃将等量的可TCA沉淀计数进行免疫沉淀过夜。已证明这种人抗体可与鼠VEGF蛋白发生交叉反应。利用蛋白质A琼脂糖从免疫沉淀液中除去抗体-VEGF复合物，在含有10mM Tris，pH8.0，140mM NaCl，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，0.01％叠氮化钠的溶液中将蛋白质A琼脂糖洗3次，并重悬于2×SDS PAGE载样缓冲液+7mM DTT中。在5.5％/12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上将免疫沉淀的样品进行电泳，利用Entensify溶液(New England Nuclear)加强，干燥并用胶片曝光。
寡核苷酸硫代磷酸酯：
V1：5′-CAGAAAGTTCATGGTTTCGGA-3′(SEQ ID NO：1)
V1是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击转译起始点周围序列。
V2：5′-TCCGAAACCATGAACTTTCTG-3′(SEQ ID NO 10)
V2是与V1互补(有义)的寡核苷酸(21聚体)。该实验中它被用作寡核苷酸抑制作用的对照。
Vm：5′-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3′(SEQ ID NO 6)
Vm是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击到转译终止位点周围的序列上。
R(随机)：在各个位置有所有四种核苷酸(21聚体)
随机寡核苷酸被用作本实验的另外的寡核苷酸对照。
分析：
在还原条件下在SDS聚丙烯酰胺凝胶上，VEGF蛋白以23KDa的单体形式迁移。在反义寡核苷酸抑制研究中，证明对活性分子，即对该蛋白质具有抑制作用是重要的。VEGF是一种分泌蛋白，并且对该蛋白质进行免疫沉淀是最有效的检测方法。该试验结果(图2)显示Vm具有对鼠VEGF的反义寡核苷酸抑制作用，Vm是一种靶击转译终止位点周围序列的寡核苷酸。两种对照寡核苷酸(V2和随机)以及另一种反义寡核苷酸(V1)并不抑制VEGF蛋白质的表达。最后得到的结果是重要的，因为它显示不是所有反义寡核苷酸都是有效的VEGF抑制剂。
                         实施例3
     用抗VEGF免疫沉淀法测定在NB41细胞中反义寡
         核苷酸对鼠VEGF蛋白质表达的抑制作用
实验程序：
在含有胎牛血清(10％)，谷氨酰胺(2mM)，青霉素/链霉素(100u/100μg)的Dulbecco′s改良的伊格尔氏(DME)完全培养基中将能内源性地表达鼠VEGF的鼠成神经细胞瘤细胞系NB41生长至90％汇合。在紧接开始实验之前的时间用新培养基再次喂养细胞。将寡核苷酸重悬于磷酸缓冲液(PBS)并与DOTAP(Boehringer-Mannheim)按所需的浓度进行混合，该DOTAP是一种新制备的脂转染(lipofection)试剂(2.5μg/ml培养基)。在16-20小时之后再加入寡核苷酸(新鲜DME＋10％胎牛血清，不含DOTAP)。在首次寡核苷酸加入之后36-40小时，将细胞于没有甲硫氨酸和半胱氨酸的无血清培养基中清洗，并在含有150-200μCi 35S-Translabel(ICN)的1ml该培养基中标记4小时。收集被标记的培养基，离心，除去细胞和/或碎片，并于-80℃冷冻。
在BSA(100μg)和TCA(5％)存在下将被标记蛋白质沉淀。在玻璃纤维滤纸上收集被沉淀的蛋白质并用闪烁计数器进行计数。在多克隆抗-VEGF(人)抗体存在下于4℃将等量可TCA沉淀的计数进行免疫沉淀过夜。该人抗体可与鼠VEGF蛋白质进行交叉反应。利用蛋白质A琼脂糖从免疫沉淀溶液中除去抗体-VEGF复合物。在含有10mM Tris，pH8.0，140mM NaCl，0.1％BSA，0.1％ Triton X-100，0.01％叠氮化钠的溶液中将蛋白质A琼脂糖洗3次，并重悬于2×SDS PAGE载样缓冲液+7mM DTT。将免疫沉淀样品在5.5％/12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用Entensify溶液(New Eng-land Nuclear)加强，干燥，并用胶片曝光。
寡核苷酸硫代磷酸酯：
JG-1：5′-CAACGGTGACGATGATGGCA-3′(SEQ ID NO：9)
JG1是一种反义寡核苷酸(20聚体)。它靶击鼠VEGF分子的3′非转译区的序列。
JG-3：5′-TCGCGCTCCCTCTCTCCGGC-3′(SEQ ID NO：8)
JG-3是反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击鼠VEGF分子的5′非转译区的序列。
JG-4：5′-CATGGTTTCGGAGGGCGTC-3′(SEQ ID NO：3)
JG-4是一种反义寡核苷酸(19聚体)，它靶击鼠VEGF分子的转译起始位点5′端并含有ATG的序列。
JG-5：5′-CAAGAGAGCAGAAAGTTCAT-3′(SEO ID NO：7)
JG-5是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含有ATG并延伸到鼠VEGF分子的编码区的序列。
JG-6：5′-CACCCAAGAGAGCAGAAAGT-3′(SEQ ID NO：4)
JG-6是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含有鼠VEGF分子的第2-7个编码子的序列。
JG-7：5′-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3′(SEQ ID NO：5)
JG-7是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含有鼠VEGF分子的第24-29个密码子的序列。
Vm：5′-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3′(SEQ ID NO：6)
Vm是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击转译终止位点周围序列。
分析：
该试验检测了几种寡核苷酸在抑制VEGF蛋白质表达中的活性。参见图3。这些寡核苷酸中有几种(即JG-4，JG-6，JG-7)能抑制VEGF蛋白质的产生。其他寡核苷酸(即JG-1，JG-3，JG-5)对VEGF蛋白质产生没有影响。该试验还再一次证明在前面实验中用Vm看到的抑制作用。
                      实施例4
    在鼠系统中对VEGF表达和肿瘤生长速率的体内抑制
按如下方式可证明VEGF表达和肿瘤生长速率的抑制作用，将已知能表达VEGF的肿瘤细胞系皮下注射到裸鼠中。通常在2-3星期内可观察到肿瘤形成。采用静脉注射方法将约2.5mg的JG-4反义寡核苷酸硫代磷酸酯/kg体重注射到患有肿瘤血管形成的一组15只裸鼠的尾静脉中。同样将对照反义寡核苷酸硫代磷酸酯注射到一组同样数量的裸鼠中。在21天之后，切下肿瘤并分析其重量和形态以及采用免疫组织学方法检测VEGF的表达。预期在那些接收注射JG-4的鼠中VEGF表达以及肿瘤生长速率低于那些接收注射对照寡核苷酸的鼠。
用JG-6，JG-7和Vm反义寡核苷酸硫代磷酸酯预期产生同样的结果。
                       实施例5
            对人细胞中VEGF表达的抑制作用
按照如下方式可证明对人细胞中VEGF表达的抑制作用。将MNNGHOS(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱导的成骨肉瘤)细胞在含有胎牛血清(10％)，谷氨酰胺(2mM)，青酶素/链酶素(100U/100μg)的Dulbecco′s改良的伊格尔氏(DME)完全培养基中生长至90％汇合。在紧接试验之前的时间用新培养基重新喂养细胞。将寡核苷酸重悬于磷酸缓冲液(PBS)中并且与一种新制备的脂转染试剂(2.5μg/ml培养基)DOTAP(Boehringer-Mannhein)按所需浓度混合。在16-20小时之后再次加入寡核苷酸(存在于新鲜DME＋10％胎牛血清，不含DOTAP)。在首次寡核苷酸加入之后36-40小时，在没有甲硫氨酸和半胱氨酸的无血清培养基中清洗细胞，在含有150-200μCi35S-Translabel(ICN)的1ml该培养基中将细胞标记4小时。收集被标记的培养基，离心以除去任何细胞和/或碎片，并冷冻至-80℃。
在BSA(100μg)和TCA(5％)存在下将标记蛋白沉淀。在玻璃纤维滤纸上，收集沉淀蛋白质，并借助于闪烁计数器计数。在多克隆抗-VEGF(人)抗体存在下在4℃将等同可TCA沉淀的计数免疫沉淀过夜。利用蛋白质A琼脂糖从免疫沉淀液中除去抗体VEGF复合物。在含有10mM Tris，pH8.0，140mM NaCl，0.11％BSA，0.1％ Trit-on X-100，0.01％叠氮化钠的溶液中将蛋白质A琼脂糖洗3次，并重叠悬于2×SDS PAGE载样缓冲液+7mM DTT中。将免疫沉淀的样品在5.5％/12.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用Entensify溶液(New England Nuclear)加强，干燥并用胶片曝光。
寡核苷酸硫代磷酸酯：
5′-TCCGAAACCATGAACTTTCTG-3′(SEQ ID NO：15)
这是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击人VEGF分子的3′未转译区的序列。
5′-TCGCGCTCCCTCTCCGGCTC-3′(SEQ ID NO：16)
这是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击人VEGF分子的5′未转译区的序列。
5′-CATGGTTTCGGAGGCCCGA-3′(SEQ ID NO：12)
这是一种反义寡核苷酸，它靶击人VEGF分子的转译起始位点5′端以及含有ATG的序列。
5′-CAAGACAGCAGAAAGTTCAT-3′(SEQ ID NO：14)
这是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含人VEGF分子的ATG和编码区的序列。
5′-CACCCAAGACAGCAGAAAGT-3′(SEQ ID NO：13)
这是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含有人VEGF分子的第2-7个密码子的序列。
5′-CCATGGGTGCAGCCTGGGAC-3′(SEQ ID NO：17)
这是一种反义寡核苷酸(20聚体)，它靶击含人VEGF分子的第24-29密码子的序列。
5′-CTGCCCGGCTCACCGCCTCGG-3′(SEO ID NO：11)
这是一种反义寡核苷酸(21聚体)，它靶击转译终止位点周围的序列。
分析：
该试验检测几种寡核苷酸抑制VEGF蛋白质表达的活性。预期这几种寡核苷酸，SEQ ID NOs 11-13和17，能抑制VEGF蛋白质的产生。预期其他寡核苷酸，SEQ ID NO：14-16，对VEGF蛋白质产生没有影响。
                         序列表
(1)综合信息
(i)申请人：Hybridon，Inc.
(ii)发明名称：抑制VEGF表达的反义寡核苷酸
(iii)序列数目：17
(iv)通信地址：
(A)收件人：Michael S.Greenfield
(B)街道：10S.Wacker Drive Suite 3000
(C)城市：Chicago
(D)州：Illinois
(E)国家：U.S.A.
(F)邮编：60606
(V)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)现今申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类号：(viii)律师/代理人资料：(A)姓名：Greenfield，Michael S.(B)登记号：P-37，142(C)参考/案号：93，538(ix)电讯资料：(A)电话：(312)715-1000(B)传真：(312)715-1234(2)SEQ ID NO：1的资料(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特点：(A)名称/关键词(NAME/KEY)：misc_feature(B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1   CAGAAAGTTC ATGGTTTCGG A                                          21(2)SEQ ID NO：2的资料(A)长度：21个碱基(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iV)反义：是(ix)特性：(A)名称/关键词misc_feature(B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：2CAGCCTGGCT CACCGCCTTG G                                          21(2)SEQ ID NO：3的资料(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iV)反义：是(ix)特性：(A)名称/关键词：misc_feature   (B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：3CATGGTTTCG GAGGGCGTC                                           19(2)SEQ ID NO：4的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：4CACCCAAGAG AGCAGAAAGT                                          20(2)SEQ ID NO：5的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性   (iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特性：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：5TCGTGGGTGC AGCCTGGGAC                                                  2O(2)SEQ ID NO：6的资料(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：6CAGCCTGGCT CACCGCCTTG G                                               21(2)SEQ ID NO：7的资料(i)序列特征：   (A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假设：否(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：7CAAGAGAGCA GAAAGTTCAT                                              20(2)SEQ ID NO：8的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”   (xi)序列描述：SEQ ID NO：8TCGCGCTCCC TCTCTCCGGC                                            20(2)SEQ ID NO：9的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：9CAACGGTGAC GATGATGGCA                                            20(2)SEQ ID NO：10的资料(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：否(iv)反义：否   (ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：10TCCGAAACCA TGAACTTTCT G                                              21(2)SEQ ID NO：11的资料(i)序列特征：(A)长度：21个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：11CTGCCCGGCT CACCGCCTCG G                                              21(2)SEQ ID NO：12的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸   (C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：18..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：12CATGGTTTCGGAGGCCCGA                                           20(2)SEQ ID NO：13的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假设：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：13CACCCAAGA CAGCAGAAAGT                                        20(2)SEQ ID NO：14的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：14CAAGACAGCA GAAAGTTCAT                                           20(2)SEQ ID NO：15的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假定：是(iv)反义：是(ix)特性：(A)名称/关键词：misc_feature   (B)位置：1..21(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：15TCCGAAACCA TGAACTTTCT G                                           21(2)SEQ ID NO：16的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假设：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID.NO：16TCGCGCTCCC TCTCCGGCTC                                            20(2)SEQ ID NO：17的资料(i)序列特征：(A)长度：20个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(iii)假设：是(iv)反义：是(ix)特征：(A)名称/关键词：misc_feature(B)位置：1..20(D)其它资料：/注＝“硫代磷酸酯核苷酸间连键”(xi)序列描述：SEQ ID NO：17CCATGGGTGC AGCCTGGGAC                                          20

Claims (42)

1、一种抑制VEGF的反义寡核苷酸，它与表达哺乳动物VEGF的mRNA或双链DNA相互补。
2、根据权利要求1所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，该反义寡核苷酸退火到表达VEGF的mRNA或双链DNA编码序列上。
3、根据权利要求2所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，所述编码序列含有VEGF的第2-7或第24-29密码子。
4、根据权利要求1所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸退火到表达VEGF的mRNA或双链DNA的起始或终止序列上。
5、根据权利要求1所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，该寡核苷酸是稳定化的。
6、根据权利要求5所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，该寡核苷酸通过甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键，硫代磷酸酯核苷酸间连键，甲基膦酸酯核苷酸间连键，氨基磷酸酯核苷酸间连键，一种3′末端帽子或3′发夹环结构而使寡核苷酸稳定化。
7、根据权利要求1所述的抑制VEGF的反义寡核苷酸，其中，该寡核苷酸是一种混合磷酸酯主链的寡核苷酸，它具有使RNA酶H活化的一个内部序列，在该序列的一侧或两侧存在不能活化RNA酶H的序列。
8、一种反义寡核苷酸，具有通式5′-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3′(SEQ ID NO：6)。
9、一种反义寡核苷酸，具有通式5′-CATGGTTTCGGAGGGGCGTC-3′(SEQ ID MO 3)。
10、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′-CACCCAAGAGAGCAGAA-AGT-3′(SEQ ID NO 4)。
11、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′TCGTGGGTGCAGCCTGG-GAC-3′(SEQ ID NO 5)。
12、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′CTGCCCGGCTCACCGCC-TCGG-3′(SEQ ID NO：11)
13、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′CATGGTTTCGGAGGCCC-GA-3′(SEQ ID NO：12)。
14、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′CACCCAAGACAGCAGAA-AGT-3′(SEQ ID NO；13)。
15、一种反义寡核苷酸，它具有通式5′-CCATGGGTGCAGCCTGG-GAC-3′(SEQ ID NO：17)。
16、一种抑制VEGF表达的方法，包括提供抑制VEGF表达的有效量的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸与VEGF mRNA相互补。
17、根据权利要求16所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸退火到VEGF mRNA的编码序列上。
18、根据权利要求17所述的抑制VEGF表达的方法，其中，VEGFmRNA的编码序列包括密码子2-7或24-29。
19、根据权利要求16所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸结合到VEGF mRNA的起始或终止序列上。
20、根据权利要求16所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸是稳定化的。
21、根据权利要求20所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸通过甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键，硫代磷酸酯核苷酸间连键，甲基膦酸酯核苷酸间连键，氨基磷酸酯核苷酸间连键，一种3′末端帽子或3′发夹环结构，使寡核苷酸稳定化。
22、根据权利要求16所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸一种混合磷酸酯主链的寡核苷酸，它具有使RNA酶H活化并且其一侧或两侧为不能使RNA酶H活化的序列的一个内部序列。
23、根据权利要求16所述方法，其中，该反义寡核苷酸选自于由下列寡核苷酸硫代磷酸酯组成的组及其混合物：5’-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3’(SEQ ID NO 6)，5’-CATGGTTTCGGAGGGCGTC-3’(SEQ ID NO 3)，5’-CACCCAAGAGAGCAAGAAGT-3’(SEQ ID NO 4)，5’-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO 5)。
24、根据权利要求16所述方法，其中，该反义寡核苷酸选自于由下列寡核苷酸硫代磷酸酯组成的组：5’-CTGCCCGGCTCACCGCCTCGG-3’(SEQ ID NO：11)，5’-CATGGTTTCGGAGGCCCGA-3’(SEQ ID NO：12)，5’-CACCCAAGACAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO：13)，5’-CCATGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO：17)。
25、一种治疗异常血管生成的方法，包括施用抑制VEGF表达有效量的一种反义寡核苷酸，它与VEGF mRNA相互补。
26、根据权利要求25所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸退火到VEGF mRNA编码序列上。
27、根据权利要求26所述抑制VEGF表达的方法，其中，该VEGFmRNA编码序列包括第2-7或第24-29个密码子。
28、根据权利要求25所述抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸退火到VEGF mRNA的起始或终止序列上。
29、根据权利要求25所述抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸是稳定化的。
30、根据权利要求29所述抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸是通过甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键，硫代磷酸酯核苷酸间连键，甲基膦酸酯核苷酸间连键，氨基磷酸酯核苷酸间连键，一种3′末端帽子，或一种3′发夹环结构而稳定化的。
31、根据权利要求25所述的抑制VEGF表达的方法，其中，该寡核苷酸是一种混合磷酸酯主链的寡核苷酸，它具有使RNA酶H活化并且其一侧或两侧为不能使RNA酶H活化的序列的一个内部序列。
32、根据权利要求25所述抑制VEGF表达的方法，其中，该反义寡核苷酸选自于下组及其混合物：5’-CAGCCTGGTTCACCGCCTTGG-3’(SEQ ID NO 6)，5’-CATGGTTTCGGAGGGCGTC-3’(SEQ ID NO 3)，5’-CACCCAAGAGAGCAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO 4)，5’-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO 5)。
33、根据权利要求25所述抑制VEGF表达的方法，其中，该反义寡核苷酸选自于下组：5’-CTGCCCGGCTCACCGCCTCGG-3’(SEQ ID NO：11)，5’-CATGGTTTCGGAGGCCCGA-3’(SEQ ID NO：12)，5’-CACCCAAGACAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO；13)，5’-CCATGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO：17)。
34、一种药物组合物，它包含有抑制VEGF表达有效量的一种反义寡核苷酸。
35、根据权利要求34所述的药物组合物，其中，该寡核苷酸退火到VEGF mRNA的编码序列。
36、根据权利要求35所述药物组合物，其中，VEGF mRNA编码序列包括第2-7或第24-29密码子。
37、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该寡核苷酸退火到VEGF mRNA的起始和终止序列上。
38、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该寡核苷酸是稳定化的。
39、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该寡核苷酸是通过甲基硫代膦酸酯核苷酸间连键，硫代磷酸酯核苷酸间连键，甲基膦酸酯核苷酸间连键，氨基磷酸酯核苷酸间连键，一种3′末端帽子或一种3′发夹环结构而稳定化的。
40、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该寡核苷酸是一种混合磷酸酯主链的寡核苷酸，它具有使RNA酶H活化并在其一侧或其两侧为不能使RNA酶H活化的序列的一个内部序列。
41、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该反义寡核苷酸选自于下组及其混合物：5’-CAGCCTGGCTCACCGCCTTGG-3’(SEQ ID NO 6)，5’-CATGGTTTCGGAGGGCGTC-3’(SEQ ID NO 3)，5’-CACCCAAGAGAGCAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO 4)，5’-TCGTGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO 5)。
42、根据权利要求34所述药物组合物，其中，该反义寡核苷酸选自于下组：5’-CTGCCCGGCTCACCGCCTCGG-3’(SEQ ID NO：11)，5’-CATGGTTTCGGAGGCCCGA-3’(SEQ ID NO：12)5’-CACCCAAGACAGCAGAAAGT-3’(SEQ ID NO：13)，5’-CCATGGGTGCAGCCTGGGAC-3’(SEQ ID NO：17)。
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