CN1063755C - 血管内皮细胞生长因子反义寡聚脱氧核苷酸 - Google Patents
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血管内皮生长因子(VEGF)在各种与新生血管形成有关的疾病中起着重要的作用，本发明提供了用于抑制这种异常血管生成的五种反义寡聚脱氧核苷酸，及它们作用的靶位点。在细胞和整体实验中证明了这些化合物可抑制VEGF的表达，抑制新生血管的形成、生长和抑制肿瘤的生长。它们可应用于配制治疗肿瘤与新生血管形成的有关疾病的药物。
Description
本发明涉及血管内皮细胞生长因子(VEGF)反义寡聚脱氧核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，antisense ODN)及其应用。
目前治疗肿瘤的各种药物主要是针对肿瘤细胞本身进行的，但恶性肿瘤生长和转移依赖于血管，这主要表现在(1)肿瘤组织如无血管侵入，其体积不会超过2～3mm3；(2)快速生长的肿瘤常因血管生长滞后，局部营养减弱而发生缺血坏死；(3)肿瘤增殖程度与肿瘤新生血管形成呈正相关。故抑制肿瘤新生血管形成和生长可阻止肿瘤的生长与转移，开辟肿瘤治疗的第二战场。很多疾病，如糖尿病性视网膜病、化学损伤引起的失眩等也与VEGF异常表达、新生血管形成生长有关。抑制VEGF的异常表达和新生血管的形成生长，可为这类疾病的治疗提供新的方法。
已发现的血管生长抑制剂已有数十种之多，但由于治疗时剂量毒副作用太大而不能用于临床，如TNP和烟酰胺等。此外，虽然发现至少有十四种生长因子具有刺激新生血管形成的作用，但只有VEGF专一作用于血管内皮细胞。VEGF是一类新发现的于1979年首次从肿瘤分泌物中分出的生长因子(DvorakHF,et al.J.Immunol.1979,122：166-174)。它高效，特异性地作用于血管内皮细胞，对血管内皮细胞具有强烈的促有丝分裂作用和趋化作用，在体内可刺激血管的发生与生长，并可提高血管壁的通透性。它在正常组织中不表达或表达很小，在恶性实体瘤则高表达，表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。而且现已发现有许多生长因子，如TGF-β，刺激新生血管形成的作用是全部或部分通过诱导VEGF表达而实现的(Harold F,et al.American J.Pathology.1995,146：1029-39)。
已有研究用VEGF的单克隆或多克隆抗体有效抑制新生血管形成和肿瘤的生长。(Asano M,et al.Cancer Res.1995,55：5296-301；Warren RS,et al.J.Clin.
Invest.1995,95：1789-97；Borgstrom P,et al.Cancer Res.1996,56：4032-9)。该药是一种蛋白质类药物。
反义寡聚脱氧核苷酸技术(Agraival,Trends in Biotech,1992,10：152)的作用机理已经清楚。它可通过碱基互补配对与双链DNA形成三链，或与RNA形成杂交双链，从而阻断基因的复制，转录，转录后加工或翻译。它也可以激发RNaseH活力，降解RNA、DNA杂交双链中的RNA链或以其它的方式最终阻断基因的表达。采用反义寡聚脱氧核苷酸技术，设计合成VEGF的反义寡聚脱氧核苷酸。由于反义ODN只能与反向互补的靶序列结合，因此具有比上述单抗、多抗更高的专一性，更低的毒副作用。
海布里顿公司的发明专利申请公开说明书(公开号CN 1131437A，1996年)，题目为反义寡核苷酸对血管内皮生长因子表达的抑制作用。报道了八种反义寡聚脱氧核苷酸。作用于人和小鼠VEGF mRNA的-16-3,8-24,72-88,688-708四个位点，他们仅做了RNA酶H消化试验，对鼠VEGF蛋白质表达抑制试验。他们并未进行反义寡聚脱氧核苷酸在整体生物体内抑制新生血管的生长试验和反义寡聚脱氧核苷酸在整体生物体内抑制肿瘤生长的试验。因此，合成新的反义寡聚脱氧核苷酸，深入地进行上述两个试验工作，以更清楚地证明反义寡聚脱氧核苷酸可抑制新生血管的生长和抑制肿瘤的生长，是一个很有意义的研究课题。
为此，本发明的目的是提供一类血管内皮细胞生长因子反义寡聚脱氧核苷酸，它们是可与血管内皮细胞生长因子mRNA反向互补的五种反义寡聚脱氧核苷酸，可有效地抑制细胞内血管内皮细胞生长因子的表达，抑制整体动物体内和人体内新生血管的形成与生长，抑制肿瘤的生长。
根据人血管内皮细胞生长因子cDNA顺序，进行计算机模拟，选择mRNA中高级结构松散部位的53-73位和138-156位作为靶位点。五种反义ODN的序列见表1。
表1反义寡聚脱氧核苷酸的序列，修饰和作用部位
| 编号 | 核酸序列 | 长度 | 修饰 | 作用部位 |
| 1(No.158) | 5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′ | 25nt | 大环 | 53-73 |
| 2(No.176) | 5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′ | 19nt | 线性 | 138-156 |
| 3(No.182) | 5′G*C*A* GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3′ | 22nt | 硫代，大环 | 138-156 |
| 4(No.157) | 5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GTGC 3′ | 22nt | 大环 | 138-156 |
| 5(No.177) | 5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GCGC 3′ | 22nt | 小环 | 138-156 |
据此设计作用于VEGF mRNA 53-73位和138-156位的五种反义寡聚脱氧核苷酸。No.158(5＇*TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3＇)作用于53-73位，它的5＇末端带不能与mRNA反向互补的TCCA序列，该四核苷酸可与3＇末端的TGGA反向互补，形成大环。No.176(5′GCA GTA GCT GCGCTG ATA G 3＇)作用于138-156位，为线性结构，不含任何修饰，No.182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3’)作用于138-156位，在No.176的核酸序列上加了3＇三核苷酸，形成大环修饰，并且其5＇及3＇各三个磷酸根上有一个氧原子被硫取代(phosphorothiate)。No.157(5’GCA GTA GCTGCG CTG ATA GTGC 3＇)作用于138-156位，与No.182的序列完全相同，5＇末端形成大环。No.177(5'GCA GTA GCT GCG CTG ATA GCGC 3＇)作用于138-156位，为No.176的3＇端加了CGC三核苷酸，可与片段中的GCG形成小环。所有修饰均可起到保护反义寡聚脱氧核苷酸的作用，使其不易被体内核酸酶降解。
另外作为药效试验的对照，设计了正义片段，即与mRNA序列相同的片段(No.102，5′CTA TCA GCG CAG CTA CTG C3＇)和组成与No.176完全相同而序列不同的错义片段(No.101，5'CCT CGT CAT GAG ACA CGT C3＇)。
上述各种反义寡聚脱氧核苷酸，用ABI 392型DNA合成仪合成(按照ABI392型DNA合成仪说明书进行)，用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，或用快速高效液相色谱(FPLC)纯化。
在牛脐血管内皮细胞测VEGF活力系统中，测定上述各种反义寡聚脱氧核苷酸抑制S180肿瘤细胞VEGF表达的情况。结果表明，正义寡聚脱氧核苷酸(No.102)和错义寡聚脱氧核苷酸(No.101)对S180细胞VEGF表达无抑制作用，而本发明的五种反义寡聚脱氧核苷酸(No.158，No.176，No.182，No.157，No.177)或No.157与No.158及No.182与No.158的混合物均可抑制S180细胞VEGF的表达。在小鼠角膜S180肉瘤模型上，测定各种反义寡聚脱氧核苷酸对新生血管生长和对肿瘤生长的影响，结果表明正义寡聚脱氧核苷酸(No.102)和错义寡聚脱氧核苷酸(No.101)对新生血管的生长、肿瘤的生长均无抑制作用，而本发明五种反义寡聚脱氧核苷酸(No.158，No.176，No.182，No.157，No.177)及No.182与No.158的混合物均有抑制作用。结果表明本发明的所有反义寡聚脱氧核苷酸均可有效地抑制VEGF的表达，新生血管的生长和肿瘤的生长。
本发明的优点：本发明根据VEGF cDNA序列设计合成的5种VEGF反义寡聚脱氧核苷酸，与海布里顿公司的VEGF反义寡聚脱氧核苷酸相比，作用位点不同，化合物种类不同，可有效地抑制细胞内VEGF的表达，抑制整体动物内新生血管的形成和生长，抑制整体动物体内肿瘤的生长。它比VEGF单克隆抗体或多克隆抗体有更高的底物专一性和更低的毒副作用。并经整体动物试验表明本发明可应用于配制成治疗肿瘤与新生血管形成的有关疾病的药物。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图1．五种反义寡聚脱氧核苷酸及两种混合物对VEGF表达的抑制曲线图。
实施例1 VEGF反义寡聚脱氧核苷酸片段的设计和合成
根据人血管内皮细胞生长因子cDNA顺序，进行计算机模拟，选择VEGFmRNA中高级结构松散的53-73位和138-156位作为靶位点。据此设计作用于VEGF mRNA 53-73位和138-156位的五种反义寡聚脱氧核苷酸。1．No.158(5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3＇)作用于53-73位，它的5＇末端带不能与mRNA反向互补的TCCA序列，该四核苷酸可与3＇末端的TGGA反向互补，形成大环。2．No.176(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3＇)作用于138-156位，不含任何修饰，3．No.182(5’G*C*A*GTA GCT GCG CTGATA G*T*G*C 3＇)作用于138-156位，与No.157的核酸序列完全相同，但5＇及3＇各三个磷酸根被硫取代(Phosphorothiate)，4．No.157(5′GCAGTAGCTGCGCTGA TAGTGC 3′)作用于138-156位，在No.176的3＇端加了TGC三核苷酸，使其可与5＇末端形成大环。5．No.177(5’GCAGTAGCT GCGCTGATAGCGC 3＇)作用于138-156位，为No.176的3＇端加了CGC三核苷酸，可与片段中的GCG形成小环。所有修饰(No.158，No.182，No.157，No.177.)均可起到保护寡聚脱氧核苷酸的作用，使其不易被体内核酸酶降解。另外作为药效试验的对照，设计了正义片段，即与VEGF mRNA138-156位序列相同的片段(No.102，5’CTA TCA GCG CAG CTA CTG C3＇)和组成与No.176完全相同而序列不同的错义片段(No.101,5’CCT CGT CAT GAG ACA CGT C3＇)。用ABI 392型DNA合成仪合成(按照ABI 392型DNA合成仪说明书进行)，10％PAGE纯化，或FPLC纯化。
实施例2反义寡聚脱氧核苷酸抑制小鼠S180细胞表达VEGF
1．S180肿瘤细胞培养实验
S180肿瘤细胞在含10％小牛血清的DMEM培养基内繁殖到一定数目，离心收集，PBS洗三次，改换无血清培养基，种至96孔板上，每孔为200μl体积，含有10×104个细胞。分别加入不同剂量的不同反义寡聚脱氧核苷酸(体积均为5μl)，每12小时加一次，相同条件下培养，第三天收集培养液，4℃离心收集上清。组别：共9个大组，每大组包括对照共5个浓度组。No.157(5＇GCAGTA GCTGCGCTGA TAGTGC 3＇)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.158(5＇TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3＇)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.177(5＇CAGTAGCT GCGCT GAT AGCGC 3＇)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.176(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3＇)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.182(5＇G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3＇)，浓度分别为0,0.50,5.00
10.00,20.00μmol/LNo.157+No.158，两片段等比例混合，总浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.182+No.158，两片段等比例混合，总浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.101(5＇CT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/LNo.102(5＇TA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)，浓度分别为0,0.50,5.00 10.00,
20.00μmol/L
2．VEGF的测活实验
将该上清加入96孔板牛血管内皮细胞培养基中，每孔50μl，72小时后收集牛血管内皮细胞，MTT染色法检测内皮细胞生长情况，以下式计算生长抑制率。抑制率=(N-Nn)/(Nn-N0)×100％，其中N为未处理细胞数(仅加S180条件培养基)，Nn为处理后细胞数(加ODN)，N0为初始细胞数。
实验结果
共获得九条ODN抑制VEGF表达的剂量-生长抑制率曲线(见图1)。图1所示经反义ODN处理的S180肿瘤细胞条件培养基对牛血管内皮细胞的刺激作用明显减小，反义ODN的剂量与抑制效应呈线性关系，抑制作用最强的三个组为No.177、No.157+No.158，No.182+No.158组，在低浓度时即能有效抑制VEGF的表达，统计显示它们三者之间的作用无明显差别，但与对照组相比P＜0.01。No.176、No.182、No.157、No.158组抑制效果相近，与对照组相比亦有明显差异(P＜0.05)。正义(No.101)和错义(No.102)ODN处理的条件培养基基本上没有抑制作用。
实施例3反义寡聚脱氧核苷酸抑制新生血管的生长
BALB/c小鼠S180肉瘤细胞腹水传代，抽取肿瘤腹水腋下皮下接种，4周后取实体S180肉瘤，切成小块，在带标尺的手术显微镜下将肿瘤种植于BALB/c小鼠眼睛角膜内，每只动物只用一眼，共用164鼠，成功117眼(反义寡聚脱氧核苷酸用生理盐水配制成下述不同浓度的药物)。术后1天开始给药，每天3次，每次每眼5μl，记录角膜边缘血管距肿瘤的距离变化情况。
实验组别：共17组，每组5-7眼。对照：不用任何药物No.157(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA GTGC 3)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.158(5＇TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.177(5＇CA GTA GCT GCG CTG AT A GCGC 3＇)，浓度分别为5.00,10.00,20.00μmol/LNo.176(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.182(5＇G*C*A*GTA GCT GCG CTG A G*T*G*C 3＇)，浓度分别为5.00 10.00,20.00μmol/LNo.182+No.158，两片段等比例混合，总浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.101(5＇CT CGT CAT GAG ACA CGT C3＇)，浓度为20.00μmol/LNo.102(5＇TA TCA GCG CAG CTA CTG C3＇)，浓度为20.00μmol/L
所有测量均在手术显微镜下进行，测量精度为0.01mm。按下公式计算ODN对新生血管形成的影响：血管生长率=(D1-D2)/D1×100％。其中D1为肿瘤距结膜血管缘的距离，D2为新生血管距肿瘤的距离。
表2 ODNs对新生血管生长的影响
| ODN | 对照 | 正义 | 错义 | 182+158 | 182 | 177 | 158 | 157 | 176 | ||||||||
| 浓度(μM) | 20 | 20 | 10 | 20 | 5 | 10 | 20 | 5 | 10 | 20 | 10 | 20 | 10 | 20 | 10 | 20 | |
| 生长率％ | |||||||||||||||||
| 一周 | 3.3 | 3.5 | 1.2 | 1.5 | 3.0 | 4.0 | 2.1 | 1.0 | 2.4 | 4.0 | 3.0 | 5.1 | 2.5 | 1.5 | 4.0 | 4.0 | 7.0 |
| 三周 | 21.2 | 18.6 | 30.0 | 10.0 | 16.2 | 24.5 | 16.2 | 16.2 | 27.6 | 15.6 | 16.2 | 24.5 | 19.5 | 11.0 | 21.6 | 32.0 | 30.1 |
| 五周 | 96.2 | 95.0 | 90.0 | 25.2 | 36.0 | 77.5 | 39.0 | 30.0 | 87.5 | 46.2 | 34.0 | 65.0 | 40.0 | 57.5 | 48.8 | 72.6 | 72.6 |
所有数据为各组平均值，表明新生血管长度占肿瘤距结膜血管缘长度的百分数。182+158为两种ODN等量混合组，浓度为两者的总浓度。
实验结果
ODN抑制新生血管形成的结果见表2。所有反义寡聚脱氧核苷酸药物对新生血管的生长均有明显的抑制。所有小鼠均治疗8周，显效者经治疗后肿瘤未能诱导新生血管形成和长入，部分有效者在8周治疗过程中肿瘤仍然发展，有新生血管形成或长入，正义组(5眼)、错义组(5眼)均未见治疗效果，其病情发展与未经治疗的对照组(5眼)相同。无效者角膜新生血管形成并长入瘤体。证明反义寡聚脱氧核苷酸药物确实可抑制新生血管的形成与生长。它有望用于与新生血管生长有关的疾病治疗。
实施例4反义寡聚脱氧核苷酸抑制肿瘤生长
BALB/c小鼠S180肉瘤细胞腹水传代，抽取肿瘤腹水腋下皮下接种，4周后取实体S180肉瘤，切成小块，在带标尺的手术显微镜下将肿瘤种植于BALB/c小鼠眼睛角膜内，每只动物只用一眼，共用164鼠，成功117眼(反义寡聚脱氧核苷酸用生理盐水配制成下述不同浓度的药物)。术后1天开始给药，每天3次，每次每眼5μl，记录种植肿瘤的长径、短径的变化情况。
实验组别：共16组，每组5-7眼。对照：不用任何药物No.157(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA GTGC 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.158(5＇TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.177(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA GCGC 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.176(5＇GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3＇)，浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3＇)，浓度分别为5.00，10.00,20.00μmol/LNo.182+No.158，两片段等比例混合，总浓度分别为10.00,20.00μmol/LNo.101(5＇CT CGT CAT GAG ACA CGT C3＇)，浓度为20.00μmol/LNo.102(5＇TA TCA GCG CAG CTA CTG C3＇)，浓度为20.00μmol/L
所有测量均在手术显微镜下进行，测量精度为0.01mm。按下公式计算ODN对肿瘤生长的影响：肿瘤生长率=(V1-V2)/V2×100％。其中V1为肿瘤生长体积，V2为肿瘤植入体积。
表3 ODNs抑制肿瘤的生长
| ODNs | 对照 | 正义 | 错义 | 182+158 | 182 | 158 | 157 | 177 | 176 | |||||||
| 浓度(μM) | 20 | 20 | 10 | 20 | 5 | 10 | 20 | 10 | 20 | 10 | 20 | 10 | 20 | 10 | 20 | |
| 肿瘤生长率％ | ||||||||||||||||
| 三周 | 0 | 0 | 30 | -13 | -25 | 0 | -13 | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 220 | 6 | 0 | 0 |
| 五周 | 360 | 400 | 300 | -30 | -60 | 400 | -25 | -30 | 300 | -17 | 120 | 0 | 670 | -13 | 120 | 300 |
| 七周 | 1400 | 1550 | 1330 | -40 | -83 | 1000 | -30 | -60 | 800 | -17 | 440 | 13 | 1200 | -35 | 1200 | 950 |
所有数据为各组平均值。负值表明肿瘤缩小体积占原植入体积的百分数，正值表示肿瘤生长体积占原植入体积的百分数。182+158为两种ODN等量混合组，浓度为两者的总浓度。
实验结果
反义ODN抑制肿瘤生长的结果见表3。所有小鼠均治疗8周。所有反义寡聚脱氧核苷酸药物治疗组，肿瘤生长均受到明显抑制。显效者经治疗后肿瘤未能诱导新生血管形成和长入，肿瘤因缺乏营养供应而逐渐消退吸收，显微镜下观察可见治疗过程中肿瘤边界模糊，瘤体缩小成片状。在治疗晚期(6周以上)植入肿瘤随表层角膜坏死脱落，角膜修复如初。有些小鼠在8周治疗过程中肿瘤仍然发展，有新生血管形成或长入，但瘤体与未经治疗者相比仍有明显减小。正义组(5眼)、错义组(5眼)均未见治疗效果，其病情发展与未经治疗的对照组(5眼)相同。无效者角膜新生血管形成并长入瘤体，肿瘤一旦穿破角膜突入前房则迅速生长，眼睛失明，肿瘤最终占据整个眼眶，表面坏死变黑，呈菜花状。实验结果证明，本发明的反义寡聚脱氧核苷酸确实对肿瘤有抑制作用。它们确实可配制成抗肿瘤的药物。
Claims (2)
1．一类血管内皮细胞生长因子反义寡聚脱氧核苷酸，它与血管内皮细胞生长因子mRNA反向互补，其特征在于它包括五种反义寡聚脱氧核苷酸，它们的序列及作用部位如下：a．5’TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3’,25核苷酸。作用于人VEGFmRNA 53-73位，大环修饰；b．5’GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3’,19核苷酸，作用于人VEGF mRNA138-156位，成线性；
c．5’G*C*A* GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3’,22核苷酸，作用于人VEGF mRNA 138-156位，硫代，大环修饰；
d．5’GCA GTA GCT GCG CTG ATA G TGC 3’,22核苷酸，作用于人VEGFmRNA 138-156位，大环修饰；
e．5’GCA GTA GCT GCG CTG ATA G CGC 3’,22核苷酸，作用于人VEGFmRNA 138-156位，小环修饰。
2．权利要求1所述一类反义寡聚脱氧核苷酸的用途，其特征在于该反义寡聚脱氧核苷酸在制备治疗肿瘤与新生血管形成的有关疾病的药物中的用途。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1131437A (zh) * | 1993-07-27 | 1996-09-18 | 海布里顿公司 | 反义寡核苷酸对血管内皮生长因子表达的抑制作用 |
-
1997
- 1997-07-24 CN CN97106532A patent/CN1063755C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| CN1206714A (zh) | 1999-02-03 |
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