JP2002542805A

JP2002542805A - アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法

Info

Publication number: JP2002542805A
Application number: JP2000615402A
Authority: JP
Inventors: アルフレッドエス．ルゥーイン，; ニコラスムジツカ，; ウィリアムダブリュー．ハースワース，; クリスチャンテッセンドルフ，; コリンナバーガー，
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2002-12-17
Also published as: CA2368194A1; US20060248604A1; EP1183389A2; WO2000066780A2; WO2000066780A3; US7342111B2; AU4807400A

Abstract

(57)【要約】本発明は、網膜変性、癌、記憶、および学習を含む種々の細胞プロセスに関与する新規の遺伝子の同定、ならびに未知の機能を有する種々の遺伝子および遺伝子フラグメントの機能の同定に関する。そのようにして同定された遺伝子ならびにその同定方法に使用される組成物もまた、開示される。本発明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されているヒト以外の動物モデルを作製するための方法を提供する。これによって同定された遺伝子および同定方法において使用される組成物がまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（１．０発明の背景）本出願は、１９９９年４月３０日に出願された米国仮出願番号６０／１３１，
９４２（その内容の全部が、全体として本明細書中で参考として具体的に援用さ
れる）に対して優先権を主張する継続出願である。米国政府は、国立保健衛生研
究所からの補助金番号ＥＹ１１５９６に準じて本発明において特定の権利を有す
る。（１．１発明の分野）本発明は、一般に、遺伝学、分子細胞生物学、および医学の分野に関する。よ
り詳細には、本発明は、網膜変性、癌、記憶、および学習を含む種々の細胞プロ
セスに関与する新規の遺伝子の同定、ならびに未知の機能を有する種々の遺伝子
および遺伝子フラグメントの機能の同定に関する。そのようにして同定された遺
伝子ならびにその同定方法に使用される組成物もまた、開示される。

【０００２】（１．２関連分野の説明）自動化ＤＮＡ配列決定法の進歩に助けられたヒトゲノム研究における最近の進
歩は、ヒト遺伝子およびタンパク質についての知識の富をもたらしている。遺伝
子配列決定および遺伝子の単離における進歩は、コンピュータに基づく生体情報
システムおよび分析と組み合わせて、多くの新たなトレンドに対する可能性を提
供する。

【０００３】ゲノム学およびコンビナトリアルケミストリーにおける進歩は、薬物が発見さ
れる方法を進化させた。わずか数年前の１００，０００個のヒト遺伝子の配列決
定および特徴づけにより、ランダム化合物スクリーニングが、疾患関連遺伝子の
同定およびそれに続く疾患経路に関与する遺伝子産物を特異的に標的化するため
の合理的な薬物設計によって置き換わられている。しかし、全くの多量の遺伝子
情報が産生されることは、新たな遺伝子標的を発見する問題が、多くの新たな標
的のどれが最良かを決定する問題に置き換わられることを意味する。

【０００４】ヒトゲノムプロジェクト、学術センターおよびバイオ製薬産業の努力により、
今や、研究者に利用可能な有意な量の遺伝子配列情報が存在する。しかし、この
情報がアクセス可能である一方、生物学的機能を理解せずに、遺伝子配列のみを
知ることは、通常、効果的な薬物開発を可能にするには充分ではない。必要なこ
と、および現在当該分野に欠けていることは、選択された生物学的および生理学
的プロセスに関与する特定の遺伝子を同定する方法である。インビボでの標的の
確認を達成する適切な技術が欠如していることは、現在、ヒトゲノムプロジェク
トから出現する遺伝子配列情報を、新たな治療標的に翻訳することにおける主要
なバリケードを代表している。

【０００５】（２．０発明の要旨）本発明は、当該分野におけるこれらおよびその他の欠損を、種々の細胞性、生
物学的、および生理学的プロセスに直接的または間接的のいずれかで関与する新
規な遺伝子を同定するための方法を提供することによって克服する。さらに、本
発明は、当該分野のその他の欠点を、以前に同定された遺伝子または遺伝子フラ
グメント（例えば、発現された配列タグ（ＥＳＴ））の機能を同定するための方
法を提供することによって克服する。それらは、これまでは、困難であり、かつ
非常に時間のかかりそして労力を要するものであった。本発明は、任意の細胞、
またはより重要には体細胞組織において未知の機能を有する遺伝子を「ノックア
ウト」または不活性化し、そして得られる「ノックアウト」表現型に基づいて遺
伝子の機能の証拠を得る方法を提供する。これらの方法はまた、疾患を引き起こ
すそれらの能力についての公知のまたは予想された機能の遺伝子を試験し、それ
により、新たな疾患を引き起こす遺伝子を同定することにおいて有用である。本
発明は、胚幹細胞における伝統的な遺伝子破壊に対して有意な利点を提供する。
なぜなら、発生において重要であり、そして胚を死に導く遺伝子は、成体動物に
おいて「ノックアウト」され得、そして本明細書に提供される方法を使用して研
究され得るからである。したがって、本発明はまた、当該分野でのさらなる欠点
を、種々の異なる生理学的条件（先天異常および疾患を含む）の動物モデルを提
供することによって克服する。

【０００６】本発明は、選択された機能を有する１つ以上の遺伝子を同定する方法であって
、その遺伝子を含有すると疑われる複数の遺伝子を、リボザイムの複数のライブ
ラリーと接触させる工程、および１つ以上の遺伝子の選択された機能を変更する
複数のライブラリーからの１つ以上のリボザイムを同定し、それにより、選択さ
れた機能を有する１つ以上の遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。

【０００７】本発明の好ましい局面において、同定されるべき遺伝子は、１つ以上の細胞性
、生物学的および／または生理学的プロセスに関与する。そのプロセスは、生命
を脅かすもの（例えば、癌のような後天性および先天性の疾患、網膜変性のよう
な変性、学習障害、または長期もしくは短期の記憶喪失、または目的の任意の他
の正常もしくは異常なプロセス）であり得る。

【０００８】種々の実施形態において、複数の遺伝子は、動物（例えば、哺乳動物またはヒ
ト被験体）内に含まれる。しかし、これは、必須ではなく、そしてしたがって、
他の実施形態において、その複数の遺伝子は、エキソビボの設定（例えば、組織
培養物または細胞培養物）またはインビトロの設定で（粗製の、部分的に単離さ
れたかまたは精製された核酸を使用して）提供される。

【０００９】リボザイムのライブラリーは、標的認識およびリボザイムのその標的核酸への
結合に関与するリボザイムの領域内に縮重塩基を包含する複数のリボザイムを包
含する。本発明の特定の局面において、そのリボザイムは、これらの認識および
結合位置で完全に縮重しており、配列番号１に示される配列を有する。一方、本
発明の他の局面において、そのリボザイムは、１、２、３、４、５、６、７、８
、９、または１０個などの可能な位置で、完全にかまたは部分的に（可能な４リ
ボヌクレオチド塩基の２または３のみ）縮重した塩基を有する。ハンマーヘッド
、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、Ｉ群イントロン、またはＲＮａｓｅＰＲＮＡ
（ＲＮＡガイド配列を関連する）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡモ
チーフを含むリボザイムの全ての型は、本発明の用途のために意図されるが、特
定の好ましい局面において、そのリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムであ
る。本発明の種々の局面において、そのリボザイムは、インビトロまたはインビ
ボで化学的に合成されているか、または転写されている。

【００１０】リボザイムは、本明細書以下に記載されるように種々の異なる方法によって送
達され得るが、本発明の好ましい局面では、リボザイムまたはリボザイムのライ
ブラリーは、アデノ随伴ウイルス発現ベクターにクローニングされ、そして複数
のアデノ随伴ウイルス粒子内に包含される。

【００１１】本発明の好ましい局面において、本発明の方法によって同定される１つ以上の
リボザイムおよび／または１つ以上の遺伝子が単離され、そして本発明の特定の
局面では、リボザイムの全部または一部のヌクレオチド配列および／または遺伝
子が得られる。

【００１２】したがって、本発明は、網膜変性に関与する少なくとも第１の遺伝子を同定す
る方法であって、該少なくとも第１の遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝
子を、リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および網膜変性を変更する
ライブラリーから少なくとも第１のリボザイムを同定し、それにより網膜変性に
関与する少なくとも第１の遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。網
膜変性に関与する遺伝子を同定するにおける使用のために意図される１つのリボ
ザイムは、配列番号２９のヌクレオチド配列を有する。このように同定され得る
遺伝子のなかには、ロドプシン遺伝子およびｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβ
サブユニットをコードする遺伝子がある。

【００１３】本発明はまた、少なくとも第１の腫瘍抑制遺伝子を同定する方法であって、該
少なくとも第１の腫瘍抑制遺伝子を包含することが予想される複数の遺伝子を、
リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および腫瘍抑制を変更するライブ
ラリーから少なくとも第１のリボザイムを同定し、それにより、少なくとも第１
の腫瘍抑制遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。腫瘍抑制遺伝子を
同定するにおける使用のために意図されるリボザイムには、配列番号３、配列番
号５、配列番号７、および配列番号９のヌクレオチド配列を有するリボザイムが
含まれるがこれらに限定されない。これらに方法によって同定され得る遺伝子の
例には、ｐ５３遺伝子、ｐ１６遺伝子、網膜芽細胞遺伝子、およびｐ１９ＡＲＦ
遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

【００１４】本発明はさらに、記憶または学習に関与する少なくとも第１の遺伝子を同定す
る方法であって、該少なくとも第１の遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝
子を、リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および記憶または学習を変
更するライブラリーから少なくとも第１のリボザイムを同定することにより、記
憶または学習に関与する少なくとも第１の遺伝子を同定する工程を包含する方法
を提供する。記憶または学習に関与する遺伝子を同定するにおける使用のために
意図されるリボザイムには、配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号１７の
ヌクレオチド配列、および配列番号２３のヌクレオチド配列を有するリボザイム
が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法によって同定され得る遺伝
子の１つの非限定的な例は、ＣＲＥＢ遺伝子である。

【００１５】本発明はまた、本明細書に提供される方法によって同定される、単離された遺
伝子およびリボザイムを提供する。したがって、これらの方法によって同定され
る、網膜変性、記憶、学習に関与するかまたは変更する遺伝子およびリボザイム
、ならびに腫瘍抑制遺伝子が、本発明によって提供される。

【００１６】本発明の特定の局面において、リボザイムは、遺伝子の小フラグメント（例え
ば、ＥＳＴ）に基づいて設計され、ここで、そのＥＳＴが由来する遺伝子の機能
は、既知であるかまたは未知であるかのいずれかであり、そして全長遺伝子はい
まだクローニングされていない。本発明は、選択された機能を有する本質的に全
長の遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、本質的に全長の遺伝子を包含
すると予想される複数の遺伝子を、該本質的に全長の遺伝子のリボ核酸を切断す
る少なくとも第１のリボザイムと接触させ、それにより、その選択された機能を
有する本質的に全長の遺伝子を同定する工程を包含する。

【００１７】本発明によって提供される特定のリボザイムは、特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）
または特定の（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）遺伝子を標的化するように設計されてい
るため、本発明は、これらの特定または特異的の遺伝子を同定する方法を提供し
、この方法は、その特異的遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝子を、その
特異的遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第１のリボザイムと接触させ、そ
れによりその特異的または特定の遺伝子を同定する工程を包含する。したがって
、本発明は、ロドプシン遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβサブユニッ
トをコードする遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ１６遺伝子、網膜芽細胞遺伝子、ｐ１
９ＡＲＦ遺伝子および／またはＣＲＥＢ遺伝子を同定するための方法を提供する
。

【００１８】さらに、本発明は、選択された遺伝子の機能を同定する方法であって、該選択
された遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝子を、その選択された遺伝子の
リボ核酸を切断するリボザイムと接触させる工程、およびそのリボザイムの効果
を同定し、それにより、その選択された遺伝子の機能を同定する工程を包含する
方法を提供する。

【００１９】本発明はまた、動物において選択された生理学的に異常な状態を誘導する方法
を提供し、この方法は、その動物に、該選択された生理学的に異常な状態を予防
することに関与する少なくとも第１の遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第
１のリボザイムを投与する工程、それにより、その動物において該選択された生
理学的に異常な状態を誘導する工程を包含する。特定の方法において、その生理
学的に異常な状態は、網膜変性、癌、記憶喪失、または学習障害である。したが
って、本発明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されている動物を提供
し、それにより種々の異なる異常な状態および疾患についての動物モデルを提供
する。同様に、本発明は、動物において選択された生理学的に異常な状態を誘導
するための方法を提供し、この方法は、その動物に、該選択された生理学的に異
常な状態を引き起こすことに関与する少なくとも第１の遺伝子のリボ核酸を切断
する少なくとも第１のリボザイムを投与する工程、それにより該動物において該
選択された生理学的に異常な状態を誘導する工程を包含する。したがって、本発
明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されているヒト以外の動物モデル
を作製するための方法を提供し、それにより、種々の異なる異常な状態および疾
患を研究するための道具を提供する。

【００２０】（４．０例証的実施形態の説明）本発明の例証的実施形態を以下に記載する。明快さのために、実際の実施のす
べての特徴を、本明細書において記載するわけではない。当然のことながら、い
かなるこのような実施形態の開発においても、一方の実施と他方の実施で変化す
る開発者の特定の目標（例えば、システムに関連した制約およびビジネスに関連
した制約への追従）を達成するために、多数の実施で特異的な判断がなされなけ
ればならないことが理解される。さらに、このような開発努力は、複雑かつ時間
浪費的であり得るが、それにもかかわらず、本開示の恩恵を有する当業者には慣
用的な仕事であることが理解される。

【００２１】本発明は、種々の細胞プロセス、生物学的プロセス、および生理的プロセスに
おいて、直接的または間接的のいずれかで関与する新規遺伝子を同定する方法、
ならびに、以前に同定されていた遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、発
現配列タグ（ＥＳＴ））の機能を同定する方法を提供する。本発明は、すべての
体細胞性組織において未知の機能の遺伝子を「ノックアウト」する方法、および
その結果生じた「ノックアウト」表現型に基づいて、その遺伝子の機能の証拠を
得る方法を提供する。本発明はまた、疾患の原因となる潜在能力について、既知
または疑わしい機能の遺伝子を試験し、それによって、新たな疾患原因遺伝子を
同定するための方法を提供する。本発明はまた、種々の異なる生理的状態（特定
の先天的異常を含む）および疾患の動物モデルを提供する。

【００２２】本発明の方法は、特定の遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのいずれかを標的
化するように設計されたリボザイムの使用、または、標的認識および結合に関与
する塩基中の縮重を通して、無作為の遺伝子を標的化するリボザイムのライブラ
リーの使用を包含する。さらに、本発明は、アデノ随伴ウイルスベクターおよび
ウイルス粒子を使用して、細胞または動物にリボザイム構築物を送達または提供
する方法を提供する。

【００２３】（４．１リボザイムのアデノ随伴ウイルス送達）有用であるヒトゲノムプロジェクトによって作成された膨大な量のデータにつ
いて、同定された遺伝子の機能が推定されなければならず、そしてもし存在する
ならば、ヒト疾患におけるそれらの役割を確立しなければならない。しかし、現
在まで、５０，０００〜１００，０００個のヒト遺伝子のうちのわずか約６，０
００個しか、表現型と関連付けられていない。従って、疾患原因遺伝子の全スペ
クトルを詳細に示すこと、および病原性の機構を理解し、そして治療を開発する
ための動物モデルを作製することは、ヒト遺伝学の次の主要な努力目標である。
本発明は、ウイルスベクター化遺伝子治療とプロモーター制御リボザイムのツー
ルを組合せて、このような遺伝子を機能的に同定し、そして遺伝病の動物モデル
を作製する。リボザイムは、ＲＮＡ酵素であり、これは、特定の遺伝子の発現を
ブロックする能力を有する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、優性遺伝病の動
物モデルにおける治療としてリボザイムを送達するために、首尾良く用いられて
きた。本発明は、このアプローチを、実験動物において疾患を作製し、従って、
疾患の動物モデルを確立するために拡張する。ＡＡＶ−リボザイムアプローチは
、胚の致死の問題、および現在の遺伝子破壊ストラテジーで典型的な小動物への
制限の問題を回避しつつ、体細胞性遺伝子ノックアウトの作製を可能にする。

【００２４】１００を超える遺伝子座が、ヒトにおける網膜疾患と連鎖している。当然のこ
とながら、いくつかは、網膜タンパク質について関連付けられた遺伝子であると
十分に証拠が示されているが、大半は、ヒト遺伝地図上の単純な区画である。さ
らに、いくつかの主要な網膜疾患（加齢性黄斑変性を含む）の遺伝的病因は、不
明である。加齢性黄斑変性は、７０歳を超える３個体において１個体に罹患する
。特定の網膜細胞（光受容体および網膜色素上皮を含む）において高度に発現さ
れる遺伝子のクローンを含む、ディファレンシャルディスプレイライブラリーお
よび発現配列タグライブラリーが利用可能である。これらの高度に発現される遺
伝子の中でどれが網膜機能に必要とされ得るかを同定するために、ハンマーヘッ
ド型およびヘアピン型リボザイムが、コードするメッセンジャーＲＮＡ分子を切
断するために設計されている。次いで、どれが網膜退化へと導くかを決定するた
めに、ＡＡＶを使用して、これらを実験動物に送達する。

【００２５】それぞれｐ５３およびＲｂ遺伝子によって特徴付けられる２つの主要な遺伝的
経路における変異によって、癌に関連する無秩序な細胞分裂へと導かれることが
実証された。関連した（そしておそらく、これらの経路とは独立した）他の遺伝
子もまた、腫瘍細胞の複製および拡散の制御に関与し得る。部分的に無作為化さ
れた標的ドメインを含むリボザイムのライブラリーを、特定の組織に送達し、予
め同定されていない癌抑制遺伝子の発現における欠損に起因して腫瘍化し易い動
物を作製した。次いで、これらのリボザイムに基づいた配列タグを使用して、潜
在的癌抑制遺伝子を同定し、そしてクローン化した。

【００２６】（４．２リボザイム）伝統的に、タンパク質は、核酸の触媒のために使用されてきたが、別のクラス
の高分子が、この試みにおいて有用であるとして明らかにされた。リボザイムは
、ＲＮＡ−タンパク質複合体であり、これは部位特異的様式で核酸を切断する。
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特定の触媒ドメインを有する
（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；Ｆｏｒｓｔ
ｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度
の特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基
質中のいくつかのリン酸エステルのうちのわずか１つを切断する（Ｃｅｃｈら、
１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−
ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、化学反応の前のリボザ
イムの内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌｇｕｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）（
「ＩＧＳ」）に対する特異的塩基対形成相互作用を介して、基質に結合する必要
条件に起因している。

【００２７】リボザイム触媒は、本来、核酸が関与する配列特異的切断／連結反応の一部と
して観察された（Ｊｏｙｃｅ，１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米
国特許第５，３５４，８５５号（特に、本明細書中で参考として援用される）は
、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼよりも大きな配列特異性、およ
びＤＮＡ制限酵素にほぼ等しい配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作
用し得ることを報告する。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻
害は、治療的適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒ
ｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが、適用されたいくつかの細胞株にお
ける遺伝的変化を誘発することが報告された；変化した遺伝子は、癌遺伝子Ｈ−
ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶ遺伝子を含んだ。この研究の大半は、特定のリ
ボザイムによって切断される特定の変異コドンに基づいた、標的ｍＲＮＡの改変
に関与した。

【００２８】天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的な多様性が現在公知である。各々
は、生理学的条件下で、トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触
媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般的に、酵素的核酸は、
標的ＲＮＡに第一に結合することによって作用する。このような結合は、酵素的
核酸の標的結合部分を介して生じ、このような部分は、標的ＲＮＡを切断するよ
うに作用する分子の酵素的部分に非常に近接して保持される。従って、酵素的核
酸は、相補的塩基対形成を介して、標的ＲＮＡを第一に認識し、次いでこの標的
ＲＮＡを結合する。そして、一旦正しい部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断す
るように、酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの巧みな切断は、コードタ
ンパク質の合成を指向する能力を破壊する。酵素的核酸が、そのＲＮＡ標的を結
合し、そして切断した後、このＲＮＡから解離して、別の標的を探し、そして新
規の標的を繰り返し結合し、そして切断し得る。

【００２９】リボザイムの酵素的性質は、多くの技術に渡って有利である（例えば、アンチ
センス技術（核酸分子が、核酸標的に単に結合して、その翻訳をブロックする場
合））。なぜなら、治療的処置に影響を及ぼすために必要なリボザイムの濃度が
、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は、
リボザイムの酵素的に作用する能力を反映する。従って、１つのリボザイム分子
が、多くの標的ＲＮＡ分子を切断し得る。さらに、リボザイムは、非常に特異的
なインヒビターであり、阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成機構
に依存するばかりでなく、標的ＲＮＡ切断の機構にも依存する。切断部位付近の
１つのミスマッチまたは塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除し得る
。アンチセンス分子の類似のミスマッチは、この作用を妨げない（Ｗｏｏｌｆら
、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位を結合す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性よりも大きい。

【００３０】酵素的核酸分子は、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グルー
プＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連して）あ
るいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマー
ヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）によって記載される。ヘアピ
ンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６０２５７
）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）
ならびに米国特許第５，６３１，３５９号（特に、本明細書中で参考として援用
される）によって記載される。デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏ
ｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）によって記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの
例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）によって記載され；Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａ
ｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉ
ｎｓ，１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，１９９３）によって記載さ
れ；そしてグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号（特
に、本明細書中で参考として援用される）に記載される。本発明の酵素的核酸分
子に重要なものすべては、１つ以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である、特
異的基質結合部位を有するものであり、そして分子にＲＮＡ切断活性を付与する
基質結合部位の内部または周囲にヌクレオチド配列を有するものである。従って
、リボザイム構築物は、本明細書中で言及される特定のモチーフに限定される必
要はない。

【００３１】特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中で開示さ
れる配列のうちの１つ）について高度の特異性を示す酵素的切断因子を産生する
ことが重要であり得る。酵素的核酸分子は、好ましくは、標的ｍＲＮＡの高度に
保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素的核酸分子は、必要
とされるような特定の細胞に外因的に送達され得るが、好ましい実施形態におい
て、リボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクタ
ーから発現される。

【００３２】小さい酵素的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造のモチーフまたはヘ
アピン構造のモチーフ）がまた、外因性送達のために使用され得る。これらの分
子の単純な構造は、酵素的核酸のｍＲＮＡ構造の標的化領域に侵入する能力を増
大する。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、真核生物プロモーターから細胞内部に発
現され得る（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅ
ｔら、１９９２；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、
１９９１；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｓａｒｖｅｒら
、１９９０）。当業者は、任意のリボザイムが、適切なＤＮＡベクターから真核
生物細胞において発現され得ることを理解する。このようなリボザイムの活性は
、第二のリボザイムによる一次転写物からの放出によって増強され得る（国際特
許出願公開番号ＷＯ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ９４
／０２５９５、これらの両方は、本明細書によって参考として援用される；Ｏｈ
ｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；およびＶｅｎｔｕｒａら、１
９９３）。

【００３３】リボザイムは、直接添加され得るか、または陽イオン性脂質と複合体化され得
るか（脂質複合体）、リポソーム内部にパッケージされるか、あるいはそうでな
ければ標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、その生体高分子
への取り込みを伴うかまたは伴わずに、注入、エアロゾル吸入、注入ポンプまた
はステントを介して、エキソビボまたはインビボで、関連する組織へ局所的に投
与され得る。

【００３４】リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／２３５６９および国際特許
出願公開番号ＷＯ９４／０２５９５（各々は、特に、本明細書中で参考として
援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるように、インビ
トロおよびインビボで試験されるように合成され得る。このようなリボザイムは
また、送達に最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種にお
いて等価なＲＮＡ標的物が、必要な場合に利用され得ることを認識する。

【００３５】ハンマーヘッド型リボザイムまたはヘアピン型リボザイムは、本明細書中に記
載のように、このリボザイム配列が適切な二次構造にフォールドしているか否か
を評価するために、コンピューターフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８
９）により個々に分析され得る。結合アームと触媒コアとの間の好ましくない分
子内相互作用を有するリボザイムは、考慮から排除される。種々の結合アーム長
が、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくと
も５などの塩基が、標的ＲＮＡと結合し得るか、または他の様式で相互作用し得
る。

【００３６】ハンマーヘッド型モチーフまたはヘアピン型モチーフのリボザイムは、ｍＲＮ
Ａメッセージにおける種々の部位にアニーリングするために設計され得、そして
化学的に合成され得る。使用される合成方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およ
びＳｃａｒｉｎｇｅら（１９９０）に記載されるような通常のＲＮＡ合成のため
の手順に従い、そして通常の核酸保護基およびカップリング基（例えば、５’末
端のジメトキシトリチルおよび３’末端のホスホロアミダイト）を利用する。段
階ごとの平均のカップリング収率は、代表的に９８％より高い。ヘアピン型リボ
ザイムは、２つの部分で合成され得、そしてアニーリングされて、活性リボザイ
ムを再構築し得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイ
ムは、広範にわたって改変されて、ヌクレアーゼ耐性基（例えば、２’−アミノ
、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ）での改変
により、安定性を増強し得る（総説については、例えば、ＵｓｍａｎおよびＣｅ
ｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと）。リボザイムは、一般的な方法を使用
するゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーおよび水への再懸濁によ
り、精製され得る。

【００３７】リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させること、または血
清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する改変（例えば、国際特許出願
公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、
１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２；国際特許出願公開
ＷＯ９３／１５１８７；国際特許出願公開ＷＯ９１／０３１６２；欧州特許出願
公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号；ならびに国
際特許出願公開ＷＯ９４／１３６８８を参照のこと。これらは、酵素ＲＮＡ分子
の糖部分になされ得る種々の化学修飾を記載する）、これらの細胞における効力
を増強する改変、ならびにＲＮＡ合成時間を短縮し、そして化学的要件を減少さ
せるための、幹ＩＩ塩基の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによ
り、最適化され得る。

【００３８】高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する好ましい手段は、リボザイムコード配
列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核
生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のためのプロモ
ーターにより駆動される。ｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロ
モーターからの転写物は、全ての細胞内で高濃度で発現される；所定の細胞型に
おける所定のｐｏｌＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節
配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメ
ラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎおよび
Ｍｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１
９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザ
イムは、哺乳動物細胞において機能し得る（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１
９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３
；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。
本発明のリボザイム構築物をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込むことが好ま
しいが、このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベ
クター（プラスミドＤＮＡベクター、他のウイルスＤＮＡベクター（例えば、ア
デノウイルスベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイ
ルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこ
れらに限定されない）に組み込まれ得る。

【００３９】Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開ＷＯ９４／０２５９５）は、酵素Ｒ
ＮＡ分子の送達のための一般的方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の
種々の方法により、細胞に投与され得、これには、リポソームへのカプセル化、
イオン導入、または他のビヒクル（例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、
生分解性ナノカプセル、および生物接着性ミクロスフィア）への取り込みが挙げ
られるが、これらに限定されない。いくつかの指標のために、リボザイムは、上
記ビヒクルありまたはなしで、細胞または組織にエキソビボで直接送達され得る
。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接の吸入、直接の注入、またはカ
テーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により、局所的に送達され得る。
他の送達経路としては、脈管内、筋内、皮下または関節注射、エアロゾル吸入、
経口（錠剤または丸剤の形態）、局所、全身、眼、腹腔内および／または鞘内の
送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムの送達および投与のさ
らに詳細な記載は、国際特許出願公開ＷＯ９４／０２５９５および国際特許出願
公開ＷＯ９３／２３５６９（各々が特に本明細書中に参考として援用される）に
提供される。

【００４０】本発明のリボザイムを使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行に
おける特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝
子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、組
合せ治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知
の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／また
は他の化学分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）を提供するこ
とにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。

【００４１】（４．３プロモーターおよびエンハンサー）組換えベクターは、本発明の重要な局面を形成する。用語「発現ベクターまた
は構築物」とは、核酸コード配列の一部または全てが転写され得る、核酸を含む
任意の型の遺伝子構築物を意味する。好ましい実施形態において、発現は、例え
ばリボザイム構築物を生成するための、核酸の転写のみを含む。

【００４２】特に有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御
下に位置するベクターであることが、意図される。「プロモーター」とは、遺伝
子の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構または導入された合成機
構により認識される、ＤＮＡ配列をいう。句「作動可能に配置された」「制御下
」または「転写制御下」とは、そのプロモーターが、遺伝子のＲＮＡポリメラー
ゼ開始および発現を制御するための核酸に関して、正確な位置および方向にある
ことを意味する。

【００４３】好ましい実施形態において、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制
御下にコードＤＮＡを配置することにより特定の利点が得られることが、意図さ
れる。本明細書中で使用される場合、組換えプロモーターまたは異種プロモータ
ーは、その天然の環境ではリボザイム構築物と通常には関係しないプロモーター
をいうことが、意図される。このようなプロモーターは、他の遺伝子と通常は関
係しているプロモーター、および／または他の任意の細菌細胞、ウイルス細胞、
真核生物細胞、または哺乳動物細胞から単離されたプロモーターが、挙げられ得
る。

【００４４】本来、発現のために選択された細胞型、生物、または動物中さえ、そのＤＮＡ
セグメントの発現を有効に指令するプロモーターを使用することが重要である。
タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型の組み合わせの使用は、一般的に
、分子生物学の当業者には周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９
）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。使用されるプロモータ
ーは、構成的であってもまたは誘導性であってもよく、そして導入されたＤＮＡ
セグメントの高レベル発現を指令するに適切な条件下で使用され得る。

【００４５】プロモーター中の少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のために開始部
位を位置決めするように機能する。このことの公知の最良の例は、ＴＡＴＡボッ
クスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳
動物末端ジオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモー
ター、およびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーター）において、開始部位
自体の上にある別のエレメントが、開始位置を定めるのを補助する。

【００４６】さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。代表的には
、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロ
モーターが、開始部位の下流に機能的エレメントも含むことが示されている。プ
ロモーターエレメント間の間隔はしばしば融通がきき、その結果、プロモーター
機能が、エレメントが互いに対して逆点しているかまたは移動している場合に保
存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活
性が減少しはじめる前に、５０ｂｐ離れるように増加され得る。そのプロモータ
ーに依存して、個々のエレメントは、同時作動的にかまたは独立してかのいずれ
かで、転写を活性化するように機能し得るようである。

【００４７】核酸の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的と
なる細胞中で核酸を発現し得る限り、重要であるとは考えられない。従って、ヒ
ト細胞が標的である場合、ヒト細胞中で発現され得るプロモーターに隣接しかつ
そのプロモーターの制御下にある核酸コード領域を配置することが、好ましい。
一般的に言うと、このようなプロモーターとしては、ヒトまたはウイルスいずれ
かのプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＨＳＶプロモーター）が
挙げられ得る。本発明の特定の局面において、テトラサイクリンに制御されるプ
ロモーターが、意図される。

【００４８】種々の他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺
伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス長末端
反復が、導入遺伝子の高レベル発現を得るために使用され得る。導入遺伝子の発
現を達成することが当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳
動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた意図される
が、ただし、発現のレベルが所定の目的に十分である場合である。下記表１およ
び表２は、本発明の状況において、本発明のリボザイム構築物の発現を制御する
ために使用され得るいくつかのエレメント／プロモーターを列挙する。この列挙
は、導入遺伝子発現の促進に関与する可能なエレメントすべてを網羅することは
意図されず、単にその例示であることが意図される。

【００４９】エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子上の異なる位置に位置するプロモーターか
らの転写を増強した遺伝エレメントとして元々検出された。大きな距離を超えて
作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究において、ほとんど先例を
有さなかった。後の研究によって、エンハンサー活性を有するＤＮＡの領域が、
プロモーターのようにたくさん組織化されていることが示された。すなわち、そ
れらは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写タ
ンパク質に結合する。

【００５０】エンハンサーとプロモーターとの間の基本的差異は、作動可能であることであ
る。エンハンサー領域は全体として、離れて転写を刺激し得なければならない；
この必要は、プロモーター領域またはその構成成分エレメントには当てはまらな
い。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向でのＲＮＡ合成の開始
を指令する１つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこ
れらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複および
連続し、しばしば、非常に類似するモジュラー組成を有するようである。

【００５１】さらなる任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせが（Ｅｕｋａｒｙｏ
ｔｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａＢａｓｅ、ＥＰＤＢによる）もまた、発
現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用
が、別の可能な実施形態である。真核生物は、特定のプロモーターからの細胞質
転写を、その適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部またはさらなる遺伝子
発現構築物のいずれかとして提供されている場合に、支持し得る。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【表２】本明細書中で使用される場合、用語「操作された」および「組換え」細胞とは
、外因性ＤＮＡセグメント（例えば、リボザイムの転写を導くＤＮＡセグメント
）が導入された細胞を言及することが意図される。従って、操作された細胞は、
組換え導入された外因性ＤＮＡセグメントを含まない、天然に存在する細胞とは
区別される。従って、操作された細胞は、人間の手を介して導入されたＤＮＡセ
グメントを有する細胞である。

【００５４】本発明に従ってリボザイムを発現させるために、１以上のプロモーターの制御
下のリボザイムコード核酸を含む、発現ベクターを調製する。配列をプロモータ
ーの「制御下」に置くとは、転写されるオープンリーディングフレームの転写開
始部位の５’末端側に位置付けることであり、これは、一般に、その選択された
プロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち、３’側）である
。この「上流」のプロモーターは、このＤＮＡの転写を刺激し、そのコードされ
るリボザイムの発現を促進する。これは、この状況下で「組換え発現」を意味す
る。

【００５５】（４．４アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子移入に特に魅力的である。なぜなら
、これは、いかなる病原性応答をも誘導せず、そして宿主細胞染色体に組み込み
得るからである（Ｋｏｔｉｎら、１９９０）。これらのＡＡＶ末端反復（ＴＲ）
は、染色体組み込みのための、ただ１つの必須のシス作用性成分（ｃｉｓ−ｃｏ
ｍｐｏｎｅｎｔ）である（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃｌａｕｇｈｉｎ、１９８
８）。これらのＴＲは、プロモーター活性を有することが報告されている（Ｆｌ
ｏｔｔｅら、１９９３）。これらは、細胞質から核への効率的な遺伝子移入を促
進し得るか、またはプラスミドＤＮＡの安定性を増加し、そしてより長期間継続
性の遺伝子発現を可能にし得る（Ｂａｒｔｌｅｔｔら、１９９６）。ＡＡＶＴ
Ｒを含む組換えプラスミドＤＮＡを使用する研究は、かなりの関心を引き寄せた
。ＡＡＶベースのプラスミドは、ほとんどの細胞型において、ＡＡＶのＴＲを欠
失している同じプラスミドよりも、より高度かつ長期の導入遺伝子発現を駆動す
ることが示されている（Ｐｈｉｌｉｐら、１９９４；Ｓｈａｆｒｏｎら、１９９
８；Ｗａｎｇら、１９９９）。

【００５６】ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９９８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚ
ｋａ、１９８４）は、パルボウイルスであり、アデノウイルス株の夾雑物として
発見された。これは、いかなる疾患にも関連しない遍在性のウイルスである（抗
体は、米国人口の８５％中に存在する）。その複製が、ヘルパーウイルス（例え
ば、アデノウイルス）の存在に依存することから、デペンド（依存）ウイルスと
しても分類される。５つの血清型が単離されており、なかでも、ＡＡＶ−２が、
特に特徴付けられている。ＡＡＶは、一本鎖の直鎖状ＤＮＡであり、これは、キ
ャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３内にキャプシド化され、２０〜
２４ｎｍ直径の正二十面体ビリオンを形成する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬ
ａｕｇｈｌｉｎ、１９８８）。

【００５７】ＡＡＶＤＮＡは、約４．７キロベース長である。これは、２つのオープンリ
ーディングフレームを含み、２つのＩＴＲによって隣接されている。ＡＡＶゲノ
ム中には、以下の２つの主要な遺伝子が存在する：ｒｅｐおよびｃａｐ。ｒｅｐ
遺伝子は、ウイルス複製を担うタンパク質をコードし、一方、ｃａｐ遺伝子は、
キャプシドタンパク質ＶＰ１〜３をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ字型のヘアピン
構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みのための、ＡＡＶのただ
１つの必須のシス作用性成分である。従って、ＡＡＶは、全てのウイルスコード
配列が除去され、そして送達する遺伝子のカセットで置換されたベクターとして
使用され得る。３つのウイルスプロモーターが同定されており、それらの地図位
置に従って、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０と命名されている。ｐ５およびｐ１９か
らの転写は、ｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写は、キャ
プシドタンパク質を生じる（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８
４）。

【００５８】ｒＡＡＶを発現ベクターとして使用する可能性の研究を研究者に促す、いくつ
かの要因が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達するた
めの要件が、非常に少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲを有することが必要
であるが、これは、ＡＡＶゲノムのたった６％である。このことは、このベクタ
ー中に、４．５ｋｄのＤＮＡ挿入物を構築するための余地を残す。この保持能力
は、ＡＡＶに大きい遺伝子を送達することを妨げるかもしれないが、本発明のア
ンチセンス構築物を送達するためには、十分に適している。

【００５９】ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルとしての１つの良い選択
肢である。野生型アデノウイルスだけでなく、ＡＡＶ遺伝子もまたｒＡＡＶを動
員するために必要であるという、比較的複雑な補助機構が存在する。同様に、Ａ
ＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード
配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫応答を最小化し、そして従って
、ｒＡＡＶは、炎症応答を誘発しない。従って、ＡＡＶは、本発明のハンマーヘ
ッドリボザイム構築物の送達に理想的な候補体であることを示す。

【００６０】（４．５薬学的組成物およびキット）本発明の薬学的組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒
体中に溶解または分散された、アデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれた、有
効量の少なくとも第１のリボザイムまたはリボザイムライブラリー、あるいは、
少なくとも第１のリボザイムまたはリボザイムライブラリーを含有する、有効量
のアデノ随伴ウイルス粒子を含む。

【００６１】句「薬学的または薬理学的に受容可能」とは、適切には、哺乳動物（または、
ヒト）に投与された場合に、有害な、アレルギー性または他の都合の悪い反応を
生じない、分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「薬学
的に受容可能なキャリア」とは、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティン
グ、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活
性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。
任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と適合性でない場合を除いて、治療組
成物におけるそれらの使用が、意図される。補助的な活性成分もまた、組成物中
に組み込まれ得る。

【００６２】（４．５．１非経口処方物）本発明の薬剤は、しばしば、非経口投与のために処方され、例えば、静脈内経
路、筋内経路、皮下経路または他のこのような経路を介する注射用に処方される
。１以上の薬剤（例えば、リボザイム、リボザイムライブラリー、あるいはリボ
ザイムまたはリボザイムライブラリーを含むアデノ随伴ウイルス）を含む水性組
成物の調製は、現在の開示を考慮して当業者に周知である。代表的に、このよう
な組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製され
得；注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な、
固体形態もまた調製され得；そしてこれらの調製物はまた、乳化され得る。

【００６３】遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活
性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製
され得る。分散液（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）もまた、グリセロール、液体ポリエ
チレングリコールおよびそれらの混合物、ならびにオイル中に調製され得る。保
存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するた
めに保存剤を含む。

【００６４】注射剤用途に適切な薬学的形態としては、以下が挙げられる：滅菌の水溶液ま
たは分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む処方
物；ならびに滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末。全ての
場合において、この形態は、滅菌であるべきであり、かつ容易に注射可能な程度
の流体であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定であるべきで
あり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用を防止されるべきであ
る。

【００６５】本発明の薬剤を含む組成物は、中性または塩形態の組成物に処方され得る。薬
学的に受容可能な塩としては、酸付加塩、ならびに無機酸（例えば、塩酸または
リン酸）および有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）で
形成された塩が挙げられる。塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（Ｉ
ＩＩ））または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒ
スチジン、プロカインなど）から誘導され得る。

【００６６】キャリアはまた、溶媒または分散媒体であり得、これらには、例えば、水、エ
タノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および
液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、それ
らの適切な混合物、および植物油が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コー
ティング（例えば、レシチン）の使用、分散液の場合において必要とされる粒子
サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物作用の
防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって引き起こされ得る。多く
の場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ま
しい。注射用組成物の長期の吸収は、その組成物における吸収を遅延する薬剤（
例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって引き起
こされ得る。

【００６７】滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後、
濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、種々の滅菌した活
性成分を滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製され、このビヒクルは、基
本となる（ｂａｓｉｃ）分散媒体および上記に列挙された成分からの他の必要と
される成分を含む。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ま
しい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、予め滅菌濾過
した活性成分の溶液から、活性成分の粉末および任意のさらなる所望の成分を生
じる。

【００６８】処方に際して、溶液は、投薬処方物に適合性の様式かつ生物学的または治療的
に有効な量で、投与され得る。処方物は、種々の投薬形態（例えば、上記の注射
用溶液の型）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、使用され得
る。

【００６９】本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または
賦形剤（例えば、滅菌水溶液）と混合された、意図される用途に依存して最終濃
度の範囲を与えるように、ある量の１以上の本発明の薬剤を含む。調製の技術は
、一般に、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９８０（参考として本明細書中に援用される）に
例示される。内毒素の混入は、安全なレベルで最小に（例えば、０．５ｎｇ／ｍ
ｇタンパク質）維持されることが理解されるべきである。さらに、ヒト投与のた
めに、調製物は、ＦＤＡＯｆｆｉｃｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａ
ｎｄａｒｄｓに要求される、滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準
を満たすべきである。

【００７０】非経口投与（例えば、静脈内注射および筋内注射）のために処方される化合物
に加えて、例えば、以下の他の薬学的に受容可能な形態もまた意図される：経口
投与のための錠剤または他の固体、時限放出性カプセル、リポソーム形態など。
他の薬学的処方物もまた、処置される状態に依存して使用され得る。もちろん、
このような状態についての最適な投薬量を決定するための方法は、本明細書の観
点および当業者の知識から、当業者に明らかである。

【００７１】本発明の薬剤を操作して、それらの薬剤により長いインビボ半減期を提供する
ことから、特定の利点が得られることが意図される。徐放性処方物は、一般に、
長期にわたって一定の薬物レベルを与えるように設計される。薬物（例えば、本
発明の薬剤）の半減期を増加することは、投与の際に高い細胞内濃度を生じるこ
とを意図され、そのレベルは、長期間維持されるが、一般に、その構築物の薬物
動態学に依存して減衰する。

【００７２】（４．５．２治療用キット）本発明はまた、本明細書中に記載の本発明の薬剤を含む治療用キットを提供す
る。このようなキットは、一般に、適切な容器中に、本発明に従う、少なくとも
第１のリボザイム、リボザイムライブラリー、あるいは少なくとも第１のリボザ
イムまたはリボザイムライブラリーを含有するアデノ随伴ウイルス粒子の薬学的
に受容可能な処方物を備える。これらのキットはまた、他の薬学的に受容可能な
処方物を備える。

【００７３】キットは、薬剤を含む（任意のさらなる成分を含むか、または含まない）単一
の容器を有し得るか、または各所望の薬剤について別個の容器手段を有し得る。
このようなキットにおいて、成分は、等モル量の組み合わせで、または一方の成
分が他方の成分よりも過剰に存在して、予め混合され得るか；あるいは、キット
の各成分が、患者への投与前に、別個の容器に別々に維持され得る。

【００７４】キットの成分が、１以上の液体溶液中で提供される場合、この液体溶液は、水
溶液であり、特に、滅菌水溶液が好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末
として提供されてもよい。試薬または成分が、乾燥粉末として提供される場合、
この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒はまた、別の
容器手段中に提供され得ることが理解される。キットの成分の１つは、経口投与
用のカプセル剤で提供されてもよい。

【００７５】キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ
、ビン、シリンジまたは他の容器手段を含み得、これらの中に、リボザイム、リ
ボザイムライブラリー、あるいはリボザイムまたはリボザイムライブラリーを含
有するアデノ随伴ウイルス粒子、および任意の他の所望の薬剤を配置し得、そし
て好ましくは、適切に分量化されている。さらなる成分が含まれる場合、一般に
、このキットはまた、これらが配置される第２のバイアルまたは他の容器を備え
得、別々に設計された用量の投与を可能にする。これらのキットはまた、滅菌の
薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための、第２／第３の容器手
段を備え得る。

【００７６】キットはまた、リボザイム、リボザイムライブラリー、あるいはリボザイムま
たはリボザイムライブラリーを含有するアデノ随伴ウイルス粒子を、動物または
患者に投与するための手段（例えば、１以上の針または注射器、あるいは点眼器
、ピペット、または他のこのような装置）を備え得、それらから、処方物が、動
物に注入され得るか、または体の疾患領域に適用され得る。本発明のキットはま
た、代表的に、バイアルなど、および他の成分を市販用に厳重に拘束して含むた
めの手段（例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器）を含み、
この中に、所望のバイアルおよび他の装置が、配置および保持される。

【００７７】（４．６変異誘発）部位特異的変異誘発は、ＤＮＡに１以上のヌクレオチド配列変化を導入するこ
とによって、配列改変体を調製および試験するのに有用な技術である。部位特異
的変異誘発は、特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を介して、変異体の生成を
可能にし、このオリゴヌクレオチド配列は、所望の変異のＤＮＡ配列、および十
分な数の隣接ヌクレオチドをコードし、この隣接ヌクレオチドは、交差される欠
失交差部上の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分はサイズおよび配列複雑性
のプライマー配列を提供する。代表的に、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライ
マーが好ましく、その変更される配列の交差部の両側に約５〜１０残基を含む。

【００７８】一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知である。理解されるよ
うに、この技術は、代表的に、一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するバク
テリオファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発に有用な代表的なベク
ターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファー
ジベクターは、市販されており、そしてそれらの使用は、一般に、当業者に周知
である。二本鎖プラスミドもまた、部位特異的変異誘発に慣用的に使用され、こ
れは、ファージからプラスミドへの目的の遺伝子の転移工程を排除する。

【００７９】一般に、部位特異的変異誘発は、最初に、一本鎖ベクターを得る工程、すなわ
ち二本鎖ベクターの２つの鎖を融解する工程によって実施される。この二本鎖ベ
クターは、その配列内に、所望のリボザイムをコードするＤＮＡ配列または他の
核酸構築物を含む。この所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、合成的に調製する。次いで、このプライマーを、この一本鎖ＤＮＡ調製物
にアニーリングさせ、そしてＤＮＡ重合化酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラ
ーゼＩクレノウフラグメント）に供し、変異保有鎖の合成を完了する。従って、
１つの鎖が、元の非変異配列をコードし、第２の鎖が、所望の変異を保有する、
ヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、適
切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換し、そしてこの変異配列の配
列を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。

【００８０】部位特異的変異誘発を使用する、選択されたリボザイムの配列改変体の調製は
、潜在的に有用な種を生成する手段として提供され、かつ配列改変体が得られ得
る他の方法が存在するように、限定されることを意図されない。例えば、所望の
遺伝子をコードする組換えベクターを、変異薬剤（例えば、ヒドロキシルアミン
）で処理し、配列改変体を獲得し得る。

【００８１】（４．７核酸増幅）核酸（増幅のためのテンプレートとして使用される）は、標準的な方法（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、生物学的サンプルに含まれる細胞から単
離され得る。この核酸は、ゲノムＤＮＡであってもよく、あるいは分画されたＲ
ＮＡまたは全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡが使用される場合、このＲＮＡ
を相補的ＤＮＡに変換することが所望され得る。１つの実施形態において、この
ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり、そして増幅のためのテンプレートとして直接的
に使用される。

【００８２】リボザイムまたは保存された隣接領域に対応する核酸に選択的にハイブリダイ
ズするプライマー対を、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、
この単離された核酸に接触させる。本明細書中で定義される場合、用語「プライ
マー」は、テンプレート依存性のプロセスにおいて、新生の核酸の合成を開始し
得る、任意の核酸を包含することが意味される。代表的に、プライマーは、１０
〜２４塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が、使用され得る
。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供されるが、二本鎖形態が好
ましい。

【００８３】一旦ハイブリダイズされると、この核酸：プライマー複合体に、テンプレート
依存性の核酸合成を促進する１以上の酵素を接触させる。「サイクル」とも呼ば
れる、複数回の増幅を、十分量の増幅産物が生成されるまで実施する。

【００８４】次に、この増幅産物を検出する。特定の適用において、検出は、可視的手段に
よって行われ得る。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれた放射標識の放射
活性シンチグラフィー、または蛍光標識を介するか、あるいは電気パルスシグナ
ルまたは熱パルスシグナルを使用する系（Ａｆｆｙｍａｘ技術）を介する、その
産物の間接的な同定を含み得る。

【００８５】多くのテンプレート依存性プロセスが、所定のテンプレートサンプル中に存在
するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も知られている増幅方法
の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ^TMともまた呼ばれる）であり、これは
、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号および米
国特許第４，８００，１５９号（これらの各々は、その全体が参考として本明細
書中に援用される）に詳細に記載される。

【００８６】手短に言うと、ＰＣＲ^TMにおいて、このマーカー配列の相対する相補鎖上の領
域に相補的な、２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド
三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と共に反応混
合物に添加する。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、このプライマーが
マーカーに結合し、そしてポリメラーゼが、このプライマーを、ヌクレオチドを
付加することによって、このマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合物の温
度を上昇または低下させることによって、伸長されたプライマーが、マーカーか
ら解離して反応産物を形成し、過剰なプライマーが、そのマーカーおよび反応産
物に結合し、そしてこのプロセスが繰り返される。

【００８７】逆転写酵素ＰＣＲ^TM増幅手段は、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために行
われ得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、そしてＳａｍｂｒ
ｏｏｋら（１９８９）に記載される。逆転写の代替的方法は、熱安定性のＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの方法は、国際特許出願公開番号
ＷＯ９０／０７６４１（参考として本明細書中に詳細に援用される）に記載され
る。ポリメラーゼ連鎖反応方法は、当該分野で周知である。

【００８８】増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）であり、これは、
ＥＰＡ３２０，３０８（その全体が参考として本明細書中に援用される）に開示
される。ＬＣＲにおいて、２つの相補的プローブ対を調製し、そして標的配列の
存在下で、各対が、標的の相対する相補鎖にそれらが隣接するように結合する。
リガーゼの存在下で、この２つのプローブ対は連結して、単一のユニットを形成
する。ＰＣＲ^TMのような温度サイクリングによって、結合した連結ユニットが、
標的から解離し、次いで、過剰なプローブ対の連結のための「標的配列」として
作用する。米国特許第４，８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列に結合す
るためのＬＣＲに類似する方法を記載する。

【００８９】Ｑβレプリカーゼ（ＱβＲ）（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８
０（参考として本明細書中に援用される）に記載される）もまた、本発明におけ
る、なお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的ＲＮＡの複
製配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在
下でサンプルに添加する。このポリメラーゼは、この複製配列をコピーし、次い
で、これを検出し得る。

【００９０】等温性の増幅方法もまた、本発明の核酸増幅において有用であり得、ここでは
、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖にヌ
クレオチド５’−［α−チオ］−三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する。

【００９１】鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，４５５，１６６号、米国特許第５，６
４８，２１１号、米国特許第５，７１２，１２４号および米国特許第５，７４４
，３１１号（各々は、参考として本明細書中に援用される））は、複数回の鎖の
置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む、核酸の等温性
増幅を行う別の方法である。類似の方法（修復鎖反応（ＲＣＰ）と呼ばれる）は
、増幅の標的領域にわたって、いくつかのプローブをアニーリングさせて、その
後、４塩基中のただ２塩基の存在下での修復反応を行う工程を包含する。他の２
つの塩基を、ビオチン化誘導体として付加させ、検出を容易にし得る。類似のア
プローチが、ＳＤＡにおいて使用される。標的特異的配列はまた、サイクリック
プローブ反応（ＣＰＲ）を使用して検出される。ＣＰＲにおいて、非特異的ＤＮ
Ａの３’および５’配列、ならびに特異的ＲＮＡの中間の配列を有するプローブ
を、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーシ
ョンの際に、この反応を、ＲＮａｓｅＨで処理し、そしてこのプローブの産物
を、消化後に放出される別個の産物として同定する。元のテンプレートは、別の
サイクリングプローブにアニーリングさせ、そして反応を繰り返す。

【００９２】なお別の増幅方法（ＧＢ出願番号２２０２３２８および国際特許出願番号
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（各々は、その全体が参考として本明細書中に援
用される）に記載される）が、本発明に従って使用され得る。前者の出願におい
て、「改変型プライマー」が、ＰＣＲ^TM様のテンプレート依存性かつ酵素依存性
の合成において使用される。これらのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチ
ン）および／または検出部分（例えば、酵素）で標識することによって、改変さ
れ得る。後者の出願において、過剰の標識プローブをサンプルに添加する。標識
配列の存在下で、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的
配列はインタクトで放出され、過剰のプローブによって結合される。標識したプ
ローブの切断は、標的配列の存在をシグナル化する。

【００９３】他の核酸増幅手段としては、トランスポゾンベースの増幅系（ＴＡＳ）が挙げ
られ、これらには、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ（Ｇｉｎ
ｇｒら、国際特許出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５（参考として本明細書中に
援用される））が含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール
／クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、溶解緩衝液での処理、ならびにＤ
ＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジ
ン抽出によって、増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的
配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合化後、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡハイブリッドを、ＲＮａｓｅＨで消化しながら、二本鎖ＤＮＡ分子
を、再度熱変性させる。いずれの場合において、一本鎖ＤＮＡを、第２の標的特
異的プライマーの付加、および、その後の重合化によって完全に二本鎖にする。
次いで、この二本鎖ＤＮＡ分子を、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳ
Ｐ６）によって多重転写（ｍｕｌｔｉｐｌｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）させる
。等温性サイクリック反応において、ＲＮＡを、一本鎖ＤＮＡに逆転写し、次い
で、このＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡに変換し、次いで、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７
またはＳＰ６）でもう一回転写させる。この得られた産物（短縮型または完全型
のいずれに関わらず）は、標的特異的配列を示す。

【００９４】Ｄａｖｅｙら、ＥＰＡ番号３２９８２２（その全体が本明細書中に参考とし
て援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖
ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）をサイクル合成する工程を包含する、核酸増幅プロセ
スを開示し、これは、本発明に従って使用され得る。このｓｓＲＮＡは、第１の
プライマーオリゴヌクレオチドのテンプレートであり、これらのプライマーは、
逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、
このＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのい
ずれかとの二重鎖にあるＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、得られ
たＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から除去する。この得られたｓｓＤＮＡは、第２のプラ
イマーのテンプレートであり、これらのプライマーはまた、このテンプレートの
相同体の５’側に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼによって例示される）の配列を含む。次いで、このプライマーを、ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大きい「クレノウ」フラグメ
ントによって例示される）によって伸長し、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分
子を生じ、これは、プライマー間で元のＲＮＡの配列に同一の配列を有し、そし
て一端で、プロモーター配列をさらに有する。このプロモーター配列は、適切な
ＲＮＡポリメラーゼによって使用され、このＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製
し得る。次いで、これらのコピーを、このサイクルに再導入し、非常に迅速な増
幅を導く。酵素を適切に選択して、この増幅は、各サイクルで酵素の添加するこ
となく、等温的に行われ得る。このプロセスのサイクリングの性質から、この開
始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの形態においても選択され得る。

【００９５】Ｍｉｌｌｅｒら（国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６７００（その全体が参
考として本明細書中に援用される）は、標的の一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）
へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、その後の、この
配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく、核酸配列増幅スキームを開示する。
このスキームは、サイクル化されず、すなわち、新生のテンプレートが、得られ
たＲＮＡ転写物から生成されない。他の増幅方法としては、「ＲＡＣＥ」および
「方側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ^TM」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０（参考と
して本明細書中に詳細に援用される））が挙げられる。

【００９６】２つ（以上の）オリゴヌクレオチドの、その得られた「二オリゴヌクレオチド
（ｄｉ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」の配列を有する核酸の存在下での
連結に基づき、これによって、二オリゴヌクレオチドを増幅する方法もまた、本
発明の増幅工程において使用され得る。

【００９７】任意の増幅後、特異的増幅が生じたか否かを決定する目的のために、増幅産物
をテンプレートおよび過剰のプライマーから分離することが所望され得る。１つ
の実施形態において、増幅産物を、標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９）を使用して、アガロースゲル電気泳動、アガロース−アクリルアミ
ドゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。

【００９８】あるいは、クロマトグラフィー技術を用いて、分離を行い得る。多種のクロマ
トグラフィーが本発明において使用され得る：吸着、分配、イオン交換および分
子ふるい、ならびに多くのカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを含む技術を使用
するための特異化された技術。

【００９９】増幅産物をマーカー配列の増幅を確認するために、可視化しなければならない
。１つの代表的な可視化方法としては、エチジウムブロミドを用いたゲルの染色
およびＵＶ光の下での可視化が挙げられる。あるいは、増幅産物が放射性標識ヌ
クレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドと一体化して標識されているならば、こ
の増幅産物は、分離後に適切な刺激スペクトルの下でｘ線フィルムに曝され得る
か、または可視化され得る。

【０１００】１つの実施形態において、可視化は間接的に行われる、増幅産物の分離後に、
標識された核酸プローブは、増殖したマーカー配列と接触される。このプローブ
は、放射性標識され得る以外は、好ましくは、色素原と結合体化され得る。別の
実施形態において、このプローブは、結合パートナー（例えば、抗体またはビオ
チン）と結合体化され、そして結合対の他のメンバーが検出可能な部分を有する
。

【０１０１】１つの実施形態において、検出は、サザンブロッティングおよび標識プローブ
とのハイブリダイゼーションにより行われる。サザンブロッティングに関連する
技術は、当業者に周知であり、そして分子プロトコルに関する多くの標準的書籍
により見出され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋｓら、１９８９を参照のこと。簡潔には
、増幅産物は、ゲル電気泳動により分離される。次いで、このゲルを膜（例えば
、ニトロセルロース）と接触させ、核酸の転写および非共有結合を可能にする。
続いて、この膜を、標的増幅産物とハイブリダイズし得る色素原結合体化プロー
ブとともにインキュベートする。検出をｘ線フィルムまたはイオン放射検出デバ
イスに膜を曝すことにより行う。

【０１０２】前述の１つの例は、本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，２７
９，７２１号に記載される。この米国特許は、自動化された電気泳動および核酸
の転写のための装置および方法を開示する。この装置は、ゲルの外部操作なしで
電気泳動およびブロッティングを可能にし、そして本発明に従う方法を行うため
に理想的に適している。

【０１０３】（５．０実施例）以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下に続
く実施例に開示された技術が、本発明の実施に際して十分に機能するように本発
明者らにより発見された技術を示し、従って、その実施のために好ましい態様を
構築するために考慮され得ることは当業者に明らかであある。しかし、本開示を
鑑みて、多くの変更が開示された特定の実施形態において行われ得、そしてなお
本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく類似の結果を得ることを当業者は
理解する。

【０１０４】（５．１実施例１−リボザイムの調製およびリボザイム標的の選択）リボザイムの標的を、光受容細胞または網膜色素上皮細胞において高度に発現
される遺伝子の中の完全なｃＤＮＡ配列または１００〜３００ｎｔの発現された
標的タグから選択する。標的は、ヌクレオチドトリプレットＧＵＣ、ＣＵＣ、Ｕ
ＵＣまたはＡＵＣの５’側の４ヌクレオチドおよび３’側の６ヌクレオチドから
なる。標的部位を含む２５ｎｔ配列のあり得る二次構造の分析を、ＭＦＯＬＤア
ルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ２．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ．ｒｎａ／ｆｏ
ｒｍ．ｃｇｉ）を用いて行い、そして局所的ステム構造に埋め込まれているよう
である標的を避ける。リボザイム接近可能部位はまた、単鎖ＲＮＡ特異的改変試
薬での処理により検出され得る（ＳｈａｗおよびＬｅｗｉｎ、１９９５）図６に示される一般的構造のハンマーヘッドリボザイムを設計し、ここで、Ｎ
は、任意のリボヌクレオチドを表し得、そして標的配列のリボヌクレオチドに相
補的である。図６に示されるものと同様に機能するようであることが示されたス
テム−ループ構造の別の形態（およびフラグメント）が存在し、従って、本発明
における使用もまた意図される。

【０１０５】１４ヌクレオチドの標的配列およびコグネイトリボザイムは、化学的に合成さ
れ、そして商業的供給元から得られる（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕ
ｌｄｅｒ，ＣＯ）。保護基を、製造業者の説明書に従って、ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドの２’位置からはずし、そしてオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキ
ナーゼおよび［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いて３７℃で３０分間標識し、次いで、滅
菌水で１００μｌに希釈し、そしてフェノール：クロロホルム：イソアミルアル
コール（５０：５０：１）で抽出して、酵素を不活化する。取り込まれていない
ヌクレオチドを、Ｇ−２５セファデックススピンカラムに対して水相を通過させ
ることにより除去する。リボザイムまたは大きな標的（３０ヌクレオチドを超え
る）を８％アクリルアミド、８Ｍ尿素の配列決定ゲルにおいて、ＴＢＥ緩衝液（
８９ｍＭＴｒｉｓホウ酸、ｐＨ８．３、２０ｍＭＥＤＴＡ）中で泳動させて
精製する。標識した分子をオートラジオグラフィーで可視化し、滅菌したメスで
切り出し、そして１ＭＮＨ₄ＯＡｃ、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．
５、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ中、ゲルから３７℃で１〜４時間溶
出する。ゲル精製を省略する実施形態においては、転写物をＲＮａｓｅを含まな
いＤＮａｓｅＩで処理して、標的またはリボザイムにアニールし得るＤＮＡ配列
を除去する。

【０１０６】各分子の比放射活性を用いて、標的分子およびリボザイム分子の濃度を計算す
る。マルチターンオーバー速度論定数を決定する分析を、代表的には、短時間間
隔で２０ｍＭＭｇＣｌ₂、４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、３７
℃で行う。適切な間隔を、マルチターンオーバー条件（すなわち、基質過剰）の
下で時間経過実験により決定する。インビボでの転写により精製される標的ＲＮ
Ａの切断産物を８また１０％アクリルアミド、８Ｍ尿素の配列決定ゲルにおいて
ＴＢＥ中で電気泳動することにより分析する。切断の量が時間に対して線形的で
あり、そして基質のわずか１０％が産物に転換される場合に、最初の速度を測定
する。線形性を確実にするために、いくつかの間隔（例えば、５、１０および２
０分）で速度を測定する。サンプルを切断の開始前に３７℃でプレインキュベー
トし、そして１〜１０ｎＭリボザイムおよび基質ＲＮＡの漸増濃度を含めて、
一定のリボザイム濃度を維持する。基質濃度は、リボザイム濃度に対して大きく
過剰であり、最も低い濃度は、５倍過剰である。速度論パラメーターを、基質濃
度に対する速度の二重逆数プロット（ｄｏｕｂｌｅｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｐ
ｌｏｔ）（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロット）により、または速度
対基質濃度の比に対する反応速度のプロット（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプ
ロット）により得る。０．５分未満のｋ_catまたはＫ_M＞５μＭを有するリボザイ
ムを、捨てる。

【０１０７】速度論的に競合性のリボザイムをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ａ
ＡＶベクターｐＴＲ−ＧＳ−ＨＰの誘導体にクローニングする（図１）。オリゴ
ヌクレオチドは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ５’およびＮｓｉＩ３’についての切
断部位を含み、このベクターへの挿入を可能にする。この７−ｋｂベクターは、
ＲＮＡの３’末端で目的の標的に指向するハンマーヘッドリボザイムを最初に切
断し、そしてこのハンマーヘッドリボザイムを現すヘアピンリボザイムをコード
する。一次転写物はまた、ヒト化ＧＦＰ遺伝子（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、１９
９６）、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐
性についての遺伝子、続いてウシ成長ホルモンポリＡ部位を含む。本来のベクタ
ーに存在するＣＭＶプロモーターは、桿体光受容細胞における発現のために、４
７２塩基対のマウスオプシン近位プロモーター（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、１９９７
）により置換され、赤色網膜錐体（ｒｅｄｃｏｎｅ）特異的プロモーターの欠
失バージョン（Ｎａｔｈａｎｓら、１９８６）またはＣＲＡＬＢＰ遺伝子由来の
２．６−ｋｂＲＰＥ特異的プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８４
６３８）を用いて交換されている。

【０１０８】（５．１．１ベクター骨格の構築）ＡＡＶベクターを、２プラスミドトランスフェクション系およびＥＫ２９３細
胞を用いて以下のようにパッケージングする。ｒＡＡＶを生成するために、三重
同時トランスフェクション手順を用いて、ｒＡＡＶベクタープラスミドを、ｐＡ
ＣＧ２ＡＡＶヘルパープラスミドおよびｐＸＸ６Ａｄヘルパープラスド（Ｘ
ｉａｏら、１９９８）とともに１：１：１の分子比で導入する。あるいは、ｒＡ
ＡＶベクタープラスミドを、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有するヘルパー
プラスミドｐＤＧ、ならびにｒＡＡＶ複製およびパッケージングを必要とするＡ
ｄヘルパー遺伝子で同時トランスフェクトする（Ｇｒｉｍｍら、１９９８）。
トランスフェクションで用いるプラスミドＤＮＡを、従来のアルカリ性溶解／Ｃ
ｓＣｌ勾配プロトコルにより精製する。トランスフェクションを以下の通りに行
う：トランスフェクトする場合に、細胞コンフルエンシーが約７５〜８０％であ
るように、２９３細胞を実験の前日に１：２で分割する。１０個の１５ｃｍプレ
ートを１つのバッチとしてトランスフェクトする。ＣａＰＯ₄沈澱物を作製する
ために、１８０μｇのｐＡＣＧ２を１８０μｇのｒＡＡＶベクタープラスミドお
よび５４０μｇのｐＸＸ６を、総量１２．５ｍｌの０．２５ＭＣａＣｌ₂中で
混合する。あるいは、０．７ｍｇのｐＤＧおよび１８０μｇのｒＡＡＶベクター
プラスミドを同じ容量で混合する。古い培地を細胞から除去し、そしてＣａＰＯ ₄ 沈澱物の形成を、３７℃に予め温めた１２．５ｍｌの２×ＨＢＳ（ｐＨ７．０
５）をＤＮＡ−ＣａＣｌ₂溶液に添加することにより開始する。このＤＮＡを１
分間インキュベートする；そして予め温めた２００ｍｌのＤＭＥＭ−１０％Ｆ
ＢＳに混合物を移すことにより沈澱物の形成を停止させる。２２ｍｌの培地を各
プレートから直ぐに分配し、そして細胞を３７℃で４８時間インキュベートする
。ＣａＰＯ₄沈澱物を、細胞生存性に欠陥を生じさせることなく、インキュベー
ション期間全体の間にわたり細胞に静置させる。トランスフェクションの４８時
間後に、細胞を１，１４０×ｇで１０分間遠心分離することにより回収し；培地
を除去する。次いで、細胞を、ドライアイス−エタノールおよび３７℃浴中での
３回の凍結／融解サイクルにより、１５ｍｌの０．１５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶解する。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^TM（Ｎｙ
ｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａＡ／Ｓ，純粋等級，ＢｅｎｚｏｎＰｈａｒｍａ
Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を混合物（５０Ｕ／ｍｌ、最終濃
度）に添加し、そして溶解物を３７℃で３０分間インキュベートする。溶解物を
、３，７００×ｇで２０分間遠心分離することにより清澄化し、そしてウイルス
含有上清を粗溶解物とみなす。これから高力価ストックを標準的プロトコルを用
いて調製し得る。ヘルパーアデノウイルスはこの調製物においては使用しない。
感染力価は、慣用的には、１０¹⁰〜１０¹¹ウイルス／ｍｌである。

【０１０９】（５．１．２リボザイム活性のアッセイ）標的遺伝子の機能を試験するために、２μｌのＡＡＶ発現リボザイムを、一般
的な局所麻酔下で、１５日齢のマウスの右目に網膜下注射する。このことにより
、数分内に消散する局所的網膜剥離を導く。各リボゾーム構築物のために８匹の
マウスの群を用い、そしてこれらの動物の左目は処置せず、コントロールとして
供する。注射の結果として白内障を発症するか、または傷害または炎症の徴候を
示す動物を、この研究からはずし、そして安楽死させる。

【０１１０】６週齡で（注射して４週間）、動物を網膜電図検査（ＥＲＧ）により網膜機能
について、および光学的可干渉断層放射線写真（ｏｐｔｉｃａｌｃｏｈｅｒｅ
ｎｃｅｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＯＣＴ）により網膜厚についてアッセイする
（Ｒｉｐａｎｄｅｌｌｉら，１９９８；Ｊａｃｏｂｓｏｎら，１９９８）。ＥＲ
Ｇについては、マウスを一晩暗順応させ、次いで、薄暗い赤色光に順応させ、キ
シラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で
麻酔する。全視野暗順応ＥＲＧを、白色光の１０μ秒のフラッシュで誘発し、そ
して応答をＵＴＡＳ−２０００ＶｉｓｕａｌＥｌｅｃｔｒｏｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃＳｙｓｔｅｍ（ＬＫＣＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて記録する。マウスの角膜を０．５％塩酸プ
ロパラカインの滴下により麻酔し、そして瞳孔を１％アトロピンおよび２．５％
塩酸フェニレフリンで拡大させる。金のワイヤループを備えた小さなコンタク
トレンズを２．５％メチルセルロースを滴下して両方の角膜に配置して、角膜
水分補給を維持する。銀ワイヤ基準電極を眼の間に皮下で配置し、そして接地電
極を後肢に皮下で配置する。１０秒、３０秒および１分間隔で、それぞれ、−１
．１、０．９および１．９ｌｏｇｃｄｍ^-2の強度で刺激を与える。応答を４，
０００の増大で増幅し、０．３〜５００Ｈｚの間でフィルターにかけ、そして２
チャンネルで２，０００Ｈｚの割合でデジタル処理する。各強度について３つの
応答で平均をとる。ａ波は、基底からピークまで角膜陰性方向で測定する。そし
てｂ波は、角膜陰性ピークから主要な角膜陽性ピークまで測定する。マウスの２
つの眼の間の差異の定量的比較に関しては、刺激強度全ての値を所定の動物につ
いて平均する。

【０１１１】この分析を、１６週齢で繰り返し、このとき、全ての動物を安楽死させる。網
膜変性の証拠を示す（ＥＲＧまたはＯＣＴのいずれかによる）動物の左目および
右目を、混合アルデヒド（２％ホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデ
ヒド）の混合物中で固定する。目をエポキシ樹脂に埋め込み、１μｍの厚みの組
織学的な切片を、垂直経線に沿って作製する。ＲＯＳおよび内部網状層を横切る
Ｍｕｌｌｅｒ細胞プロセスが、切片が傾斜しないことを確実にするために切片の
平面中にわたって連続であり、ＯＮＬの厚みおよびＲＩＳおよびＲＯＳの長さが
測定される（Ｆａｋｔｏｒｏｖｉｃｈら、１９９０）ように、組織切片を整列さ
せる。ＲＰＥおよび脈絡膜層を、新生血管形成、ＲＰＥ細胞死または異常沈着の
証拠について試験する。

【０１１２】網膜変性を導くＡＡＶ−リボザイムを、結果を確かめるために２度目の類似の
プロトコルで試験する。ＥＳＴクローンを、リボザイム標的を含むとして同定し
、その切断が、動物において網膜ジストロフィーに導く。ＣｌａｍｐｅｄＰＣ
Ｒ^TM方法（５’および３’ＲＡＣＥ）を使用して、これらの標的を含むＥＳＴに
ついて全ｃＤＮＡを配列決定する。ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベース
の探索を行い、公知の遺伝子または公知の機能の遺伝子に対する類似性を同定す
る。目的のＥＳＴの遺伝子発現の組織分布を、種々のマウス組織から抽出された
ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーションによって決定する。

【０１１３】（５．１．３候補遺伝子の同定）インサイチュハイブリダイゼーション分析を使用して、以前において公知では
ない遺伝子のおよそのゲノム位置をマッピングする。これは、ＹＡＣ、ＢＡＣお
よびマウスゲノムのコスミドクローンへのハイブリダイゼーションによる遺伝子
のマッピングによって従われる。ヒトゲノムとマウスゲノムとの間のシンテニー
に基づいて、この情報を使用して、ヒトゲノムの間隔における目的の遺伝子をマ
ッピングする。これらの方法で、遺伝性の網膜疾患に対する候補遺伝子を含む領
域が同定される。網膜変性の原因である未知の遺伝子を含むヒトゲノム上でマッ
ピングされる遺伝子座が特に興味深い（Ｄａｉｇｅｒら、１９９８）。

【０１１４】同様な分析を、全ての３つの網膜特異的なプロモーターについて実施する。こ
れらのプロモーターが種々の哺乳動物において網膜特異的な様式で機能するので
、他の動物モデルを使用して類似の分析が行われる。例えば、ＡＡＶ−リゾザイ
ムを、ブタの網膜錐体の多い網膜において、およびアカゲザルマカクの黄斑網膜
において試験する。

【０１１５】７ｋｂベクターｐＴＲ−ＧＳ−ＨＰ（図１）は、２つのＥｃｏＲＶ部位の間に
ヘアピンリボザイムを含む。ヘアピンリボザイムは、その位置の上流を直接切断
し、それによってハンマーヘッドリボザイムを明らかにし得る。このリボザイム
は、ＨｉｎｄＩＩＩ（５’）部位とＮｓｉＩ（３’）部位との間で方向性を持っ
てクローン化される。リボザイムライブラリーおよび「ポジティブコントロール
」リボザイム（ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、ｐ１９ＡＲＦ）がクローン化された。転
写物の下流部分は、ＩＲＥＳエレメントを含み、ここで、ヒト化ｇｆｐ遺伝子の
翻訳が開始する（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、１９９６）。ＨＳＶ−ＴＫプロモー
ターは、ネオマイシン耐性遺伝子を誘導する。

【０１１６】ｐＴＲ−ＵＦ３３−ＨＰ（図２）において、ＣＭＶプロモーター（これは、肝
臓においてサイレントである）は、ＥＦ１プロモーター（ヒト延長因子１α、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｅ０２６２７；Ｋｉｍら、１９９０）によって置換さ
れている。このプロモーターは、種々の組織においてインビボで非常に活性であ
り、いずれのサイレンシングも示さない。ベクターｐＴＲ−ＵＦ１２−ＨＰ（図
３）は、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー−ニワトリ−β−アクチンハイブリッドプロ
モーター（Ｓａｗｉｃｋｉら、１９９８；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｅ０３０
１１）を、ＣＭＶプロモーターの代わりに含む。

【０１１７】（５．２実施例２−網膜変性についての候補遺伝子）（５．２．１マウスｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβサブユニット）インビボで十分に特徴付けられた杆体オプシン（ｒｏｄｏｐｓｉｎ）プロモ
ーターを使用して、色素性網膜炎（ＲＰ）様杆体変性を、ｒｄ／＋マウスにおい
て作製した（Ｂｏｗｅｒｓら、１９９０；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９８）。これ
らのマウスは、１つのｒｄ対立遺伝子およびｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβ
サブユニット（βＰＤＥ；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｘ５５９６８）に対する
１つの野生型対立遺伝子を有し、そして全ての年齢において明かに正常な網膜を
有する。ホモ接合性の条件下で、ｒｄ／ｒｄマウスは、生後１または２か月以内
に全ての杆体を失う、劣性ＲＰについての古典的な動物モデルである。

【０１１８】正常な対立遺伝子ＲＮＡを十分インビトロで消化するが、ｒｄＲＮＡを切断し
ないリボザイムが設計された（図１５）。このリボザイムはまた、合計の網膜Ｒ
ＮＡ調製物において全長の正常なβＰＤＥｍＲＮＡを特異的に切断した。次い
で、このリボザイムを、本明細書中以下に記載されるように、近位杆体オプシン
プロモーターのｒＡＡＶ下流にパッケージングし、一連のｒｄ／＋マウスの１つ
の目に注射した。注射４か月後に、対側側のコントロールの目と比較して、リボ
ザイム処理された目の外核層において、約５０％少ない光受容体核が見出された
（図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、および図１６Ｄ）。コントロールの目を、同
様にＰＢＳキャリア（図１６Ａ）または不活性リボザイムを含むｒＡＡＶ（図１
６Ｃ）のいずれかを用いて注射した。これらの研究は、光受容体特異的野生型ｍ
ＲＮＡに対するリボザイムが網膜変性を作り出し得るという形態学的な証拠を提
供する。

【０１１９】（５．２．２マウスｃＧＭＰホスホジエステラーゼのγ−サブユニット）環状ＧＭＰホスホジエステラーゼのγサブユニットを標的とする２つの新規な
リボザイムが生成された。これらを、ＨＨＲＺ３５およびＨＨＲＺ４２（図１８
Ａおよび図１８Ｂ、それぞれ）と呼ぶ。両方ともが、γ−ＰＤＥに対するｍＲＮ
Ａを効率的に切断し、そしてマウスにおいて網膜変性に導く。２つのリボザイム
はまた、上記のように得られた光受容体細胞ＥＳＴクローンに対して設計された
。これらを、ＨＨＲＺ５２（図３４）およびＨＨＲＺ２８２（図３５）と呼んだ
。これらを、ｐＴ７Ｔ３−１９．３においてクローン化した。野生型ＡＢＣＲ遺
伝子に対する２つのさらなるリボザイム（ヒトＡＢＣＲＲｚ１１４（図１７Ａ
）およびマウスＡＢＣＲＲｚ（図１７Ｂ））（これは、シュタルガルト黄斑変
性において変異される）もまた、調製され、これらは、黄斑疾患の動物モデルを
作製する際に有用である。１つのリボザイムは、ラットに対して特異的であり、
他のリボザイムは、ヒト、マカクおよびラットのｍＲＮＡを切断する。この後者
のリボザイムは、インビトロで広範に試験され、インビボでの網膜変性の誘発を
示すためにマウスオプシンプロモーターを含んで、ＡＡＶベクターを使用してア
カゲザルマカクに注射された。

【０１２０】（５．３実施例３−候補腫瘍サプレッサ遺伝子）悪性腫瘍から単離されたＤＮＡの分析は、腫瘍形成、オンコジーンおよび腫瘍
サプレッサ遺伝子に関する遺伝子の２つの主要なグループを同定した（Ｋｎｕｄ
ｓｏｎ１９９３）。前者は、特定の変異に起因して過剰活性であるかまたは本
質的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）活性であり、そして制御されない細胞
増殖を導く遺伝子のグループである。これらの遺伝子は、しばしばｒａｓファミ
リーのような転写因子であるか、または細胞周期をＧ１期またはＳ期に推進する
遺伝子である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９７）。後者のグループ、腫瘍サプレッ
サ遺伝子は、細胞周期の進行を阻害する。腫瘍形成におけるｐ５３、ｐ１６、Ｓ
ｍａｄ４（ＤＰＣ４）またはＲｂのような腫瘍サプレッサ遺伝子の主要な役割は
、広く認識されている。これらはまた、悪性腫瘍の生物学的挙動（転移（ｍｅｔ
ａｔｓｔａｓｉｓ）、増殖動力学、侵襲）を決定する際に重要な役割を演じる（
ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３）。およそ２０個の腫瘍
サプレッサ遺伝子が公知であるが、推定１００個が存在する。現在、新規な強力
な腫瘍サプレッサ遺伝子の探索および発見は、長く骨の折れるプロセスである。

【０１２１】悪性腫瘍の発生における腫瘍サプレッサ遺伝子の原因となる役割は、さらに、
この遺伝子に対するノックアウトマウスの生成によって確認されている。これら
のマウス（例えば、ｐ５３ノックアウトマウスまたはｐ１６ノックアウトマウス
）は、自発性の腫瘍発生に非常に感受性である（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、１９９
２；Ｊａｃｋｓら、１９９４；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９６）。さらに、これら
の遺伝子の２つ（ｐ５３、ｐ１６）が同時に不活性化されるマウスが癌に対して
なおさらに感受性になる（Ｈａｒｖｅｙら、１９９５、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１
９９４）。

【０１２２】ハンマーヘッドリボザイムのライブラリーは、組換えＡＡＶによっていくつか
の組織（肝臓、骨格筋、小腸および大腸の上皮、網膜）に送達される。組換えＡ
ＡＶは、１８か月までの間に種々の組織（脳、肝臓、骨格筋、網膜、腸の上皮）
において高いレベルでトランスジーンを安定に発現することが示されている（Ｋ
ｌｅｉｎら、１９９８；Ｓｏｎｇら、１９９８；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、１９９７
；Ｈｅｒｚｏｇら、１９９７；Ｄｕｒｉｎｇら、１９９８；Ｆｉｓｈｅｒら、１
９９７）。腫瘍サプレッサ遺伝子を標的とするライブラリーに含まれるリボザイ
ムによって、腫瘍がその特定の細胞から生じ得る。腫瘍増殖自身は、その個々の
リボザイムの単離をより簡単にする増幅工程である。これらのリボザイムの特異
的な認識配列を使用して、新規で強力な腫瘍サプレッサ遺伝子が発見される。

【０１２３】悪性腫瘍の誘導を促進するために、公知の腫瘍サプレッサ遺伝子（ｐ５３、ｐ
１６、ｐ１９ＡＦＲおよび網膜芽細胞腫（Ｒｂ）；「ポジティブコントロール」
リボザイム）に対するリボザイムが、ライブラリーと組み合わせて注射される。
単一の細胞を２つの組換えＡＡＶベクターで同時に（例えば、肝臓において）感
染する確立は、約５〜１０％である。公知の腫瘍サプレッサ遺伝子を標的とする
「ポジティブコントロール」リボザイムとして例えば含まれる。

【０１２４】腫瘍形成は、一連の遺伝的変更および変異を含む多工程のプロセスである（Ｖ
ｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３）。このプロセスに含まれ
る遺伝子の２つの主要なグループは、オンコジーンおよび腫瘍サプレッサ遺伝子
である（Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３）。ｐ５３および網膜芽細胞腫タンパク質（
Ｒｂ）をコードする２つの腫瘍サプレッサ遺伝子（これらは、細胞周期の重要な
制御因子として機能する）における変異は、細胞の形質転換および最終的には自
律的な腫瘍増殖に導く（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９７）。悪性腫瘍の発生におけ
る腫瘍サプレッサ遺伝子の原因となる役割は、さらに、これらの遺伝子について
のノックアウトマウスの生成によって確認された。ｐ５３ノックアウトマウスま
たはｐ１６ノックアウトマウスは、自発的な腫瘍発生に対して非常に感受性であ
る（Ｊａｃｋｓら、１９９４；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９６）。さらに、２つの
腫瘍サプレッサ遺伝子（例えば、ｐ５３およびＲｂ）が同時に不活性化される場
合、マウスは癌に対してなおより感受性になる（Ｈａｒｖｅｙら、１９９５）。
腫瘍サプレッサ遺伝子はまた、悪性腫瘍の生物学的挙動（増殖動力学、侵襲、転
移）を決定する際に重要な役割を演じる。

【０１２５】細胞周期および細胞複製の調節に関係する多くの遺伝子および経路が腫瘍サプ
レッサ遺伝子として同定されているが、現在まで、これらの経路に関連するか、
またはおそらくこれらの経路と独立した未知の遺伝子が、これらのプロセスを制
御する際に確かに役割を演じる。腫瘍サプレッサ遺伝子の合計数の見積は、数百
にわたる。

【０１２６】（５．３．１方法）組換えＡＡＶにパッケージングしたリボザイムのライブラリーを、マウスの種
々の組織に送達した。ライブラリーに含まれる１（またはそれ以上）のリボザイ
ムが、腫瘍サプレッサー遺伝子を標的する場合、このリボザイムを産生する細胞
は、腫瘍を生じ得る。この腫瘍の増殖は、このライブラリーのバックグラウンド
に対する特定のリボザイムの増幅を継続させ、リボザイムの単離を可能にする。
次いで、この特異的標的配列は、新規の腫瘍サプレッサー遺伝子を同定するため
のプローブとして決定および使用される。

【０１２７】この目的のために、縮重ハンマーヘッドリボザイム（ライブラリー）を示した
（図５）。効果的な切断に必要である標的配列におけるヌクレオチドＧＵＣは、
全１１個の縮重ヌクレオチド（両サイドの５および／または６）により隣接され
る。従って、このライブラリーの複雑性は、４．１９×１０⁶である。このリボ
ザイムライブラリーは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにクローン化される
。伸長因子１プロモーターまたはＣＭＶ中間体のいずれかは、初期エンハンサー
／チキンアクチンプロモーターのいずれかを使用して、２種もしくは同一ライブ
ラリー中のリボザイムの転写を誘導する。これらのプロモーターは両方とも、広
範の組織における標識遺伝子の持続性高レベル発現に関して公知である。ハンマ
ーヘッドリボザイムのすぐ下流は、転写物を内部で切断しそして良好な活性のハ
ンマーヘッドリボザイムを作用させるヘアピンリボザイムである。

【０１２８】パッケージング後、組換えウイルスを、マウス（骨格筋、肝臓、ニューロン組
織、乳腺）の種々の組織に送達する。パッケージングおよびｒＡＡＶの精製のプ
ロトコールは、１ｍｌ当たり１０¹²の感染ユニットのタイターを慣用的に提供し
、組織が高い多様性で感染されることを意味する。組換えＡＡＶは、２４ヶ月ま
での間、これらの組織中において高いレベルで標的遺伝子を安定して発現するこ
とを示した（Ｋｌｅｉｎら、１９９８；Ｓｏｎｇら、１９９８；Ｈｅｒｚｏｇら
、１９９７）。インビボでの腫瘍の誘導を容易にするために、パッケージングし
たリボザイムライブラリーを、公知の腫瘍サプレッサー遺伝子に対するリボザイ
ムを運ぶウイルスを有する混合物として注射する。Ｒｂ（図１０Ａおよび図１０
Ｂ）、ｐ５３、ｐ１６およびｐ１９を標的するハンマーヘッドリボザイムが設計
され、そしてインビトロで首尾良く試験される（図６）。これらのリボザイムは
また、ポジティブコントロールとして組み合わせて使用される。

【０１２９】一旦、腫瘍が注射したマウスに展開された場合、標準的な組織学的技術によっ
て分析され、細胞株が可能であれば確立される。このリボザイム自体は、腫瘍Ｒ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって増幅され得る。あるいは、リボザイムを含むベクタ
ーの一部は、ＤＮＡの標準的なＰＣＲによって増幅され得る。このリボザイムを
発現するＡＡＶを、このウイルスが単独で、特定の組織中の腫瘍を誘導し得るこ
とを確認するために産生し得る。塩基配列決定により、このリボザイムの１４個
の塩基対の認識配列を同定し、そしてこの配列タグを使用して、ＤＮＡデータベ
ース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）をスクリーンし得る。この配列が細胞増殖調節
に随伴する公知の遺伝子または実際に公知の腫瘍サプレッサー遺伝子と一致する
場合、この結果は、内部ポジティブコントロールとして役に立ち、そして全方法
を確認する。

【０１３０】いくつかの場合において、腫瘍が発生し得る。なぜならば、１以上の腫瘍サプ
レッサー遺伝子が不活性化されたからである。このアプローチの潜在的な強さの
１つは、ライブラリー内の数種のリボザイムが同じ細胞に同時に送達され、そし
て組み合わせた様式で作用するという事実である。従って、スクリーニングされ
る初期腫瘍は、リボザイムの濃縮した母集団から単離される。次いで、腫瘍の誘
導に応答したリボザイムを同定するために、濃縮した母集団をＡＡＶベクター中
で再クローン化し、そして動物に再び注射される。この方法において、腫瘍誘導
に必要とされる最小のリボザイム（すなわち、腫瘍サプレッサー）の組み合わせ
が、各標的組織について同定される。

【０１３１】（５．３．２ハンマーヘッドリボザイムライブラリーの構造／クローニング
）縮重ハンマーヘッドリボザイム（ライブラリーリボザイム）は、図６に示され
る構造を有する。塩基ＧＵＣは、切断部位を含むように固定される。５’末端の
６つの塩基および３’末端の５つの塩基が縮重される。従って、ライブラリーの
任意の所与のリボザイムの特定の認識配列は、１４塩基である。１１の縮重ヌク
レオチドが存在するので、ライブラリーの複雑性は、４¹¹（これは、４．２×１
０⁶に等しい）である。

【０１３２】２種のＤＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、各々ヌクレオチドが縮重する
ように設計される。このセンスおよびアンチセンスオリゴは、１２塩基対と重な
る。このオリゴを、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのジチオトレイトール（ｐＨ７．９）を含む緩衝液中で
アニーリングする。このオーバーヘッド末端を、０．１ｍＭのｄＮＴＰの存在下
のＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントで充填する。次いでこれらを、
２種の酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｓｉＩ）で消化する。この二重鎖ライブラ
リーリボザイムオリゴを、１２％の非変性ポリアシルアミドゲルで精製する。

【０１３３】次いで、この骨格ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｓｉＩで切断し、そし
てアガロースゲルで精製する。３００ｎｇのベクターを、１つのライゲーション
反応に使用する。インサート（ライブラリーリボザイム）オリゴの最適量を、イ
ンサートの滴定を用いる１セットの試験ライゲーションにより決定する。一旦、
最適のベクター：インサート比を見出すと、十分な数のライゲーション反応が設
定される。

【０１３４】このライゲーションは、ＳｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔＳｕｒｅｃｅｌｌｓ
（ＥｐｉｃｕｒａｎＣｏｌｉ（登録商標）ＳＵＲＥ（登録商標）Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｏｒａｔｏｉｎＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ，Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ
，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換される。１回の形質転換当たり最適のベ
クター：インサート比（約２．０〜２．５×１０６クローン）で実施される。

【０１３５】十分に多いライブラリーの複雑性は、２０回の形質転換を実施した場合にえら
得る。形質転換が、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天上に貯蔵さ
れそしてプレート化され、そして３７℃で一晩増殖される。このコロニーを１セ
ットの希釈剤で計数し、正確な数のコロニーを得る。このコロニーを、全部で１
００ｍｌのＬＢ媒体中のプレートに洗い流す。２ｍｌのアリコートをグリセロー
ルストックとして凍結させる。

【０１３６】プラスミドＤＮＡを、標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって十
分な量でＣｓＣｌグラジエント上で単離する。

【０１３７】（５．３．３ＡＡＶベクターのパッケージング）ＡＡＶベクターを、上記の実施例１に記載される通りにパッケージングする。

【０１３８】（５．３．４動物への組換えＡＡＶの注射）各動物を、１０¹⁰感染単位で注射する。各手順について、マウスを、吸入用麻
酔であるメトキシフルラン（Ｍｅｔｏｆａｎｅ^TM、ＴＨＥＤｏｗＣｈｅｍｉ
ｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ；Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ、ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）で軽度に麻酔する。この適用部
位は、骨格筋、静脈内（尾静脈）、経口適用およびペラナル（ｐｅｒａｎａｌ）
適用である。

【０１３９】骨格筋注射については、５０μｌ容量の組換えＡＡＶを、両方の後肢のハムス
トリング筋群に注射する。２８ゲージ針を取り付けた１ｍｌシリンジを使用する
。より良好な可視化のために、注射部位上の覆いを、カミソリで取り除く。尾静
脈注射のために、各マウスを、注射の持続時間についてマウスをその尾によって
保持することにより、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ^TM（Ｒｏｈｍ＆ＨａａｓＣｏｍ
ｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）ボックスに拘束する。総容量１０
０μｌのＡＡＶ懸濁液を、尾静脈の１つにゆっくりと注射する。経口適用につい
ては、オロガストリック（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃ）チューブを、注意深く挿入す
る。ＡＡＶ懸濁液を、総容量１００μｌにてこのチューブを通じて投与する。次
いで、マウスを、回復させ、そして水および標準的なマウス食餌に対して任意に
接種するように戻す。ペラナル適用については、１００μｌの組換えＡＡＶを、
注腸によって注入する。合計５０匹の動物を、各投与経路について注射する。

【０１４０】注射されたマウスを、秤量することによって、かつ「臨床的評価」によって規
則的な様式（１週間に２回）モニターする。明白な腫瘍の任意の徴候が発見され
るか、またはマウスが、２０％を超えるその体重を失う場合、マウスを屠殺し、
そして部検を行なう。全ての関連器官（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、注射
した骨格筋、胃、大腸および小腸）を回収し、そして血液サンプルを採取する。
注射部位を、任意の腫瘍について注意深く試験する。腫瘍を３片に分割し、そし
て図１４に示されるフローシートに記載される通りに分析する。

【０１４１】（５．３．５腫瘍分析）腫瘍を、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ（ｐＨ７．５）にて、２日間固定
し、そして平衡化されるまで、３０％のスクロースのＰＢＳ（ｐＨ７．５）にて
平衡化する。サンプルを−２０℃で凍結し、そしてクリオスタット（ｃｒｙｏｓ
ｔａｔ）にて凍結切片化する。ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡下で分析する。

【０１４２】初代組織培養のために、腫瘍組織を、機械的に剥離し、そしてＲＰＭＩ１６４
０培地（１５％ＦＣＳ）に置く。細胞を、必要に応じて分割する。必要な場合
、腫瘍細胞を、選択的にトリプシン処理することによって線維芽細胞から分離す
る。ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡下で、またはＦＡＣＳｃａｎ^TM（Ｂｅｃｔｏｎ
ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＦａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、
ＮＪ）分析によって分析する。

【０１４３】ゲノムＲＮＡおよび総ＤＮＡの単離を、標準的な手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９）に従って実施する。ＤＮＡ分析（サザンブロット）およびＲＮＡ分析
（ノーザンブロット）を、標準的な手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従
って実施する。

【０１４４】ＲＴ−ＰＣＴ^TM分析のために、ｃＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、
逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により合成する。ＰＣＲ^TMを、製造業者の使
用説明書に従って、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＰＣＲ^TMにより実施する。ゲノ
ムＤＮＡのＰＣＲ^TMについては、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＰＣＲ^TMキットを
、ｐｆｕポリメラーゼとともに使用する。製造業者の使用説明書に従う。以下の
プライマーを使用する：センス５’−ＧＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧ−３’
（配列番号２７）；アンチセンス５’−ＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴ
ＧＡ−３’（配列番号２８）。

【０１４５】ＰＣＲ^TMフラグメントを、配列分析のための標準的な技術によって、ｐＴ７／
Ｔ３−１９の制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｓｉＩにサブクローニングす
る。標準的Ｔ７配列決定プライマーを使用する。配列決定のために、ＢｉｇＤ
ｙｅ配列決定キットを使用する。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、標
準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって実施する。

【０１４６】あるいは、ＢａｌｂＣ３Ｔ３線維芽細胞を使用して、潜在的に癌原生のリ
ボザイムのサブライブラリーを選択し得、次いで、これを、上記の方法によって
、マウスにおいて再試験する。

【０１４７】（５．４実施例４−−記憶および学習に関与する候補遺伝子）長期記憶の形成は、遺伝子の発現に関与する：ｍＲＮＡおよびタンパク質合成
の破壊は、記憶形成に影響する（Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ、１９９６）。過去２０
年間、科学者達は、薬理学的技術および遺伝子技術を使用してこのプロセスに関
与する候補遺伝子について調べてきた。海馬は、記憶のための位置であることが
示されている。なぜなら、この領域中の位置は、空間的な記憶の獲得を損なうか
らである（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９０）。ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答性エレメント
を結合する遍在的転写因子）（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９８９）は、Ａｐｌｙｓ
ｉａ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、マウスおよびラットにおける短期から長期への記
憶の切り替えにおいて役割を果たすことが示されている（Ｓｉｌｖａら、１９９
８）。ＣＲＥＢ欠損ノックアウトマウス、およびアンチセンスＣＲＥＢ注射ラッ
トは、記憶異常を示す（Ｓｉｌｖａら、１９９８；Ｇｕｚｏｗｓｋｉら、１９９
７）。ウイルス標的化リボザイムは、学習および記憶を研究するために十分に適
しており、ここで時間的および空間的な特異性が重要であり、ＣＲＥＢｍＲＮ
Ａに対して指向されるリボザイムは、ＣＲＥＢ発現をノックアウトするように選
択される。このアプローチはまた、ＣＲＥＢの多数の下流標的、および新規遺伝
子の発現を変化させるために使用される。これらのニューロン性機能を破壊する
能力は、神経学的障害についての動物モデルの開発において重要である。

【０１４８】簡潔には、ＣＲＥＢｍＲＮＡを標的とする適切なリボザイムを設計し、そし
てクローニングし、そしてこれらのリボザイムは、インビトロおよびインボボの
両方で、それらの標的ＲＮＡ基質を切断することが示される。次いで、海馬ＣＲ
ＥＢタンパク質のレベルを、ＣＲＥＢリボザイム注射動物における減少を検出す
るために分析する。ラットにおける長期記憶（ＬＴＭ）の機能の喪失を、Ｍｏｒ
ｒｉｓ水迷路−学習パラダイム（ｗａｔｅｒｍａｚｅ−ｌｅａｒｎｉｎｇｐ
ｒａｄｉｇｍ）（Ｍｏｒｒｉｓ、１９８９）を使用して研究する。ディファレン
シャルディスプレイ方法を使用して、学習および記憶に関与する他の候補遺伝子
を同定し、そして上記で要約されたプロセスを、これらの新規に同定された遺伝
子について繰り返す。

【０１４９】多数のＣＲＥＢアイソフォームが特徴付けられている（Ｂｌｅｎｄｙら、１９
９６）。３つのリボザイムを、設計し、そしてＣＲＥＢ２３０（図１１）、ＣＲ
ＥＢ２８８（図１２）、およびＣＲＥＢ３８０（図１３）と呼んだ。これらは、
ＣＲＥＢの全てのアイソフォームを標的とする。これらのリボザイムの配列を示
す二本鎖オリゴヌクレオチドを、Ｔ７Ｔ３−１９発現ベクター（ＬｉｆｅＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にサブクロー
ニングした。リボザイムを、Ｔ７Ｔ３−１９からインビトロで転写させ、そして
本明細書中上記に詳述される通りに、インビトロでＣＲＥＢ基質の切断について
試験した。ＣＲＥＢ２３０およびＣＲＥＢ２８８の両方は、インビトロでＣＲＥ
ＢＲＮＡ基質を効率良く切断した。これらのリボザイムを、ベクターｐＴＲ−
ＵＦ３３^*−ＨＰにサブクローニングした（図２）。陰性コントロールとして、
触媒ドメイン中に２点での変異を含む２つのリボザイムを設計し：ＣＲＥＢ２３
０ｍ（図１１）およびＣＲＥＢ２８８ｍ（図１２）、そしてＴ７Ｔ３−１９およ
びｐＴＲ−ＵＦ３３^*−ＨＰにサブクローニングした。ＡＡＶベクターを、上記
実施例１に記載される通りにパッケージングする。

【０１５０】ラット海馬に、標準的な定位手順（Ｋｌｅｉｎら、１９９８）を使用して、Ａ
ＡＶ発現リボザイムを注射する。注射された脳におけるＣＲＥＢｍＲＮＡのレ
ベルの減少を、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９
８９）によって決定する。脳をまた、抗ＣＲＥＢ抗体を使用する免疫細胞化学に
よって、タンパク質レベルの減少について分析する。Ｍｏｒｒｉｓ水迷路パラダ
イム（ｗａｔｅｒｍａｚｅｐａｒａｄｉｇｍ）（Ｒｏｚｅｎｚｗｅｉｇ，１
９９６）を使用して、コントロールとリボザイム注射動物との間で、学習および
記憶における表現型の差異について調べる。

【０１５１】ディファレンシャルディスプレイ方法を使用して、記憶形成の硬化に関与する
新規遺伝子を同定する（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９７）。正常動物
および記憶欠損動物（ＣＲＥＢｈｈ）を、訓練パラダイムに供する。ｍＲＮＡを
、訓練後の異なる時間で、これらの動物の海馬から単離し、そして１連のプライ
マーセットを使用して、ＰＣＲ^TM増幅し、そして配列決定ゲル上で泳動させて、
ＣＲＥＢｈｈラット対正常ラットにおけるｍＲＮＡの発現の示差パターンを示す
。示差的に発現されたｍＲＮＡをクローニングし、そして特徴付ける。ＧｅｎＢ
ａｎｋの検索により、公知遺伝子を同定する。発現の示差的パターンを、ドット
ブロット分析によって確認し、そして海馬中のこれらのメッセージの存在を、Ｒ
Ｎａｓｅプロテクションアッセイ（Ｇｉｌｍａｎら、１９８７）によって、また
はインサイチュハイブリダイゼーション（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９８９）によっ
て決定する。候補遺伝子を、候補遺伝子特異的リボザイムを設計し、そしてそれ
らを、ＣＲＥＢについて上記の通りに試験することによって、学習および記憶に
おけるそれらの役割についてさらに評価する。

【０１５２】（５．５網膜疾患のための候補遺伝子）本実施例は、体網膜組織内の特異的な野生型（ｗｔ）対立遺伝子に対してリボ
ザイムを送達し、「身体ノックダウン（ｓｏｍａｔｉｃｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）
」を生成するのに十分な対応するｍＲＮＡレベルを低下させ、そしてフォトレセ
プター（ＰＲ）細胞損失および網膜疾患様表現型を導くための方法を記載する。
このアプローチは、網膜特異的なライブラリー由来の候補フォトレセプター制限
ＥＳＴ（発現された配列タグ、すなわち、ｍＲＮＡ配列）の哺乳動物における機
能的スクリーニングが、網膜疾患に関連した遺伝子の全てを同定することを可能
にする。

【０１５３】組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、げっ歯類網膜のフォトレセプター細胞内の遺伝
子を送達および発現するための効率的かつ非毒性の様式として証明されてきてい
る。ｒＡＡＶ内のレポーター遺伝子を調節する近位ロッドオプシンプロモーター
は、症状なしに、効率的かつ特異的にロッドフォトレセプターに発現を標的化す
ることが見出された（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、１９９７）。発現の期間は、長期で
あり、ラットの寿命は低下しなかった（３０分を超える）。さらに、導入遺伝子
を発現する多くのフォトレセプター、および形質導入された網膜のフラクション
は、網膜表現型の変更が可能であることを示唆した。実際に、トランスジェニッ
クラット（常染色体の優性ＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａのための
哺乳動物モデル）における変異体Ｐ２３Ｈロッドオプシン遺伝子（Ｄｒｅｎｓｅ
ｒら、１９９８）に対するｒＡＡＶ送達リボザイムは、それぞれ８ヶ月および３
ヶ月に損失された３０〜８０％のフォトレセプターを保存した（Ｌｅｗｉｎら、
１９９８）。レスキュー（Ｒｅｓｃｕｅ）は、網膜電図（ＥＲＧ）分析によって
機能的に、フォトレセプター形態の保存によって細胞的に、そして変異体ｍＲＮ
Ａレベルにおける特異的な低下によって分子的に、確証された。従って、ｒＡＡ
Ｖ送達リボザイムは、インビボで疾患表現型をレスキューし得る。

【０１５４】野生型対立遺伝子に対して標的化されたリボザイムがまた、フォトレセプター
機能不全を生じ得るかどうかを試験するために、ＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍ
ｅｎｔｏｓａ（ＲＰ）様ロッド変性が、ｒｄ／＋マウス内で産生された（Ｂｏｗ
ｓら、１９９０）。これらのマウスは、ＰＤＥ遺伝子の１つの変異体ｒｄ対立遺
伝子および１つのｗｔ対立遺伝子を有し、全ての年齢において、明らかに正常な
網膜を有する。ホモ接合状態において、ｒｄ／ｒｄマウスは、劣性ＲＰのための
古典的なモデルであり、１〜２ヶ月内に全てのロッドを失う。ｗｔ対立遺伝子に
対して設計されたリボザイムは、最初にインビトロで試験され、ｒｄｍＲＮＡで
はなく、正常なＰＤＥｍＲＮＡを十分に消化することが見出された。次いで、
このリボザイムは、近位ロッドオプシンプロモーターのｒＡＡＶ下流にパッケー
ジされ、一連のｒｄ／＋マウスの１個の眼内に注射された。注射の４ヶ月後、５
０％〜８０％少ないロッドフォトレセプターが、ＰＢＳ処置した対側性のコント
ロールの眼に対して、リボゾーム処置された眼に見出された。コントロールの眼
は、正常の数のフォトレセプターを示した。発明者らが各哺乳動物のリボザイム
処置した眼およびＰＢＳコントロールの眼における光惹起された電気的応答を同
時に測定したＥＲＧ分析は、処置された眼におけるロッド細胞の損失と並行した
著しい機能的視覚の欠乏が生じることを確証した。さらにこのアプローチを確証
するために、ホモ接合状態においてＲＰ様ＰＲ機能不全をも示す異なる遺伝子（
ＰＤＥ）における劣性変異を有する第２のヘテロ接合性マウスを、ｗｔＰＤＥ
遺伝子に対してｒＡＡＶ送達リボザイムを使用して試験した（図１８Ａおよび図
１８Ｂ）。これらの研究からの結果を、ＰＤＥリボザイムを用いて見られた結果
と並べた（図１９、図２０、および図２１）未知の網膜疾患有意性の候補遺伝子についてのインビボスクリーニングは、Ｐ
Ｒ特異的遺伝子、ならびにＰＲおよび幾つかの他の組織の両方において豊富に発
現される遺伝子の両方を同定するために、示差的ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングストラテジーの発展を通して達成される。使用される網膜のｃＤＮＡラ
イブラリー配列は、高密度フィルターでスクリーニングするために有用な、標準
化された指向的にクローン化されたヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーの４０，００
０ｃＤＮＡクローンを包括する。この配列は、数個以上ののコピー／細胞におい
て網膜内に発現された遺伝子の大部分を含むことが予想される。整列されたライ
ブラリーが効率的に標準化され、広範囲のレベルにわたって発現された公知の網
膜遺伝子のｃＤＮＡを含み、そしてこのｃＤＮＡ挿入物が長くかつしばしば完全
長であることが証明されている。この配列は、最初に正常なマウス由来、次いで
全てのＰＲを欠く５週齢のｒｄ／ｒｄマウス由来の全網膜ｃＤＮＡを用いて調査
された。ｒｄ／ｒｄプローブではなく、野生型プローブによって検出された網膜
ｃＤＮＡは、網膜内において、推測的にＰＲ特異的である。スクリーンされた１
５９６ｃＤＮＡの、１４４推定ＰＲ特異的ｃＤＮＡが同定されている。今日まで
、これらの１３０個が配列決定されており、２８個（２１％）は完全に新規であ
り、６２個（４６％）は、ＥＳＴのみとして公知であり（１８個の以前に公知の
網膜特異的ＥＳＴを含む）、そして４０個（３０％）が公知の遺伝子に対応する
。重要なことに、公知のｃＤＮＡの２個は、ロドプシンおよびアレスチンであり
、十分に研究されたフォトレセプター特異的ＲＰ誘発遺伝子であり、実際にこの
ストラテジーが網膜疾患に関連した遺伝子を選択することを証明する。予想され
たオープンリーディングフレームを有するこれらのヒトＥＳＴの８個（網膜のみ
において発現された３個、制限された発現の３個、２個のハウスキーピング遺伝
子）は、ヒト網膜疾患遺伝子座と関連し、相同のマウスＥＳＴを有する。

【０１５５】これらの配列は、マウスにおける結果の確証のための標的であった。各遺伝子
に対するリボザイムが設計され、そしてインビボで試験され、次いで、受容可能
な活性および特異性を示すものが上で概略されるようにインビボで試験される。
組織の光学コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）および顕微鏡分析によって、
哺乳動物が、視覚機能障害（ＥＲＧによって）および網膜形態障害について、月
１回の間隔で試験され得る。

【０１５６】（５．５．１哺乳動物の注射）以下の哺乳動物研究について、ｐＴＲ−ＵＦ３３−ＨＰ構築物を使用した。

【０１５７】新生Ｂａｌｂｃマウスを生後から２４時間以内に注射した。組換えウイルスを
側頭静脈を通して静脈内投与した。以下の群に従う５つの群の哺乳動物を、注射
した：Ａ：コントロール（ｐＴＲ−ＵＦ５）Ｂ：ｐ５３、ｐ１９、ｐ１６およびＲｂ（網膜芽細胞腫遺伝子）に対してリボ
ザイムを有するｒＡＡＶＣ：リボザイムライブラリーを有するｒＡＡＶＤ：リボザイムライブラリーを有するｒＡＡＶ＋ｐ５３に対してリボザイムを
有するウイルスＥ：リボザイムライブラリーを有するｒＡＡＶ＋ｐ１９、ｐ１６、およびＲｂ
に対してリボザイムを有するウイルス。

【０１５８】各群は、５つの哺乳動物から構成される。各ウイルスの全５×１０⁹感染性ユ
ニット（ＩＵ）を１マウスにつき注射した。このマウスを個々に標識し、（毎週
）定期的な重量測定を行った。さらに、それらを、腫瘍または腫瘍様病変につい
て１週間に少なくとも２回チェックした。

【０１５９】同様に、研究の第２の設定において、成体マウスの後脚のハムストリング筋肉
内に、筋肉内注射した。これらの群は、実施されなかったＣ群を除き、新生マウ
スについて、上記と同じであった。新生マウス研究において、各ウイルスの５×
１０⁹ＩＵを注射した。これらの哺乳動物は、新生時に注射されたマウスと同じ
様式で行なわれた。

【０１６０】（５．５．２．インビトロ形質転換アッセイ）培養細胞のインビトロ形質転換は、腫瘍の形成に必須の遺伝子変化を同定する
ために長らく用いられてきた。いくつかの増殖指標が悪性形質転換の兆候として
受け取られている。これらの兆候の１つは、いわゆる病巣の形成を導く、コンタ
クトインヒビション（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：接触阻害）の消
失である。正常細胞は、隣接細胞との接触により阻害される。この阻害は、ペト
リ皿上で増殖する培養細胞が、一旦、細胞の単層がプレートをカバーすれば（１
００％コンフルエンスまで増殖する）、分裂を停止することを意味する。その単
層において、細胞が形質転換され、そして接触阻害を失う場合、細胞は、増殖し
、そして細胞の小さい「パイル（堆積）」（病巣）を形成する。これらの病巣は
、裸眼で検出され得る。この現象／兆候は、インビトロにおけるリボザイムライ
ブラリーのスクリーニングのために、本明細書において使用された。

【０１６１】ＢａｌｂＣ３Ｔ３細胞は、形質転換されないマウス線維芽細胞である。Ｂａｌ
ｂＣ３Ｔ３細胞は、ｐＴＲ−ＵＦ２１−ＨＰウイルスにおけるリボザイムライ
ブラリーを用いて、１０００のＭＯＩ（感染多重度）で感染された。この細胞を
、１５ｃｍの皿で維持し、そして培地を週に２回交換した。４〜６週間後、病巣
の形成を観察した。ｐＴＲ−ＵＦ５（ＧＦＰのみを発現するＡＡＶ構築物）で感
染したコントロールのプレートと比較して、コントロールウイルスで処理したプ
レートにおける病巣よりも、ＡＡＶ−リボザイムで処理したプレートにおける病
巣は８〜１０倍であった（低率で生じる自発的形質転換は、コントロールプレー
トにおいてさえ病巣を生じる）。

【０１６２】３６の病巣全てを拾い上げ、そして増殖した（新鮮培養培地における再増殖）
。ゲノムＤＮＡを、増殖した各病巣から単離した。ライブラリーリボザイムの存
在下でＰＣＲ^TMにより、この病巣をスクリーニングした。スクリーニングした２
８の病巣のうち８までは、明白に陽性のＰＣＲ^TMシグナルを有した。８つのＰＣ
Ｒ^TM陽性病巣のうち３つのＰＣＲ^TMフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド（
ｐＴ７Ｔ３−１９）にサブクローニングした。各サブクローニングされたＰＣＲ
産物由来の８つまたは９つの個々のクローンを配列決定した。この結果を以下の
表に示す：

【０１６３】

【表３】なんらかの公知の腫瘍サプレッサー遺伝子（内部陽性コントロールとして働く
）に適合する配列は存在しなかった。しかし、これらの配列により、細胞増殖ま
たは分裂を制御する機能を有する新規な遺伝子を同定し得る。これらの遺伝子は
、腫瘍サプレッサー遺伝子の表題下に入る。

【０１６４】一旦病巣をスクリーニングし、そして全てのＰＣＲ^TM陽性細胞のサブクローニ
ングおよび配列決定を完了すれば、次いで、単離されたライブラリーリボザイム
を、ｐＴＲ−ＵＦ２１−ＨＰ中に再クローニングし、そしてウイルス中にパッケ
ージングし得る。これは、サブライブラリーの富化を示す。次いで、このライブ
ラリーを、第二のインビトロ形質転換アッセイにおいて用いる。一旦、ライブラ
リーおよびサブライブラリーを４〜６の異なるリボザイムに狭めれば、次に、こ
れらの配列を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。次いで、マウ
スの公知の腫瘍サプレッサー遺伝子（Ｒｂ、ｐ５３、ｐ１９^arf、ｐ１６^ink4a）
に対するリボザイムを保有するｒＡＡＶベクターとともに、リボザイムライブラ
リーおよびサブライブラリーを同時感染する。

【０１６５】（５．５．３．網膜疾患動物モデルの構築）本明細書に記載のアレイ発現分析方法により、一旦、候補疾患遺伝子が同定さ
れれば、研究を行い、よりヒトに似た眼（ブタおよびサル）を用いて、大動物に
おける網膜疾患関連を確認し得る。ＡＡＶベクター化リボザイムにより、適切な
治療の開発のための網膜疾患の新しい、より関連するモデルの作製が可能になる
。例示的な例において、ＡＢＣＲ遺伝子の分析を実行した。この遺伝子における
欠損は、ヒトにおける網膜中心欠損である．シュタルガルト病の原因である。こ
れは、現在、網膜錐体富化（ｃｏｎｅ−ｒｉｃｈ）網膜中心（網膜黄斑）という
最も解明された遺伝子病である。黄斑性疾患は、米国における加齢性盲目および
遺伝性盲目の主な原因であり、２〜５百万人が罹患している。シュタルガルト病
に加えて、主な黄斑性疾患は、加齢性黄斑変性（現在、西洋における正当な盲目
の原因を導く）およびＲＰの末期である（黄斑網膜錐体がほとんどの桿状細胞の
消失後に変性する場合）。現在、治療法または長期療法は存在しない。現在、利
用可能な、黄斑性疾患の動物モデルは存在しない。この理由は、主に、このよう
なモデルは必ずしも黄斑を発症しないはずだからである（網膜構造は霊長類にし
か存在しない）。

【０１６６】ＡＢＣＲ特異的リボザイムは、インビトロで構築され、そして試験された。こ
れらのリボザイムおよびそれらの標的配列は、図２８、図２９、図３０、図３１
、図３２および図３３に示される。野生型ＡＢＣＲ遺伝子に対するＡＡＶリボザ
イムが、黄斑性疾患のシュタルガルト病形態の霊長類モデルを提供するという仮
説を検証するため、本発明者らは、インビトロＡＢＣＲリボザイム（ヒトおよび
サルのＡＢＣＲ遺伝子の両方を標的する）を設計および試験し、そしてサル網膜
にＡＡＶリボザイムを送達した。４匹のアカゲザルの一方の眼の網膜下に、関連
ＡＡＶリボザイムを注射し、そして４カ月の間隔で、基底試験およびＥＲＧ記録
により、シュタルガルト病様疾患の指標として中心網膜機能を追跡した。これら
の結果により、黄斑性変性の霊長類モデルの作製のためのＡＡＶ誘導リボザイム
方法の成功が示された。

【０１６７】（５．６実施例６−ハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）に標的化された
リボザイム）ＣＡＧ反復がハンチントン病における発症した遺伝子において異常に広がる場
合に生じる、毒性機能の明白な獲得に起因して、生じる変異体タンパク質の発現
の減少（具体的に、新線条体における）は、この障害において有益であり得る。
本実施例は、ＲＮＡ切断分子を送達するｒＡＡＶベクターの作製および試験を記
載する。このＲＮＡ切断分子は、ハンチンチンの線条体の発現を減少する。正常
ハンチンチンの減少した発現は、宿主に対して毒性ではなく、そして変異体ハン
チンチンの減少した発現は有益であるので、この方法は、動物における変異体タ
ンパク質の蓄積の処置手段および／または予防手段を提供し、そしてこのような
過剰から生じる疾患を処置する第１のアプローチとして働く。

【０１６８】トランスジェニック動物モデルおよび広がったＣＡＧ反復を有するヒトハンチ
ンチン（ｈｔｔ）遺伝子を使用する細胞性モデルの比較的最近の確立は、以下の
ことを示唆した。変異体ｈｔｔは、タンパク質の異常な機能の欠失よりも、むし
ろ異常な機能の獲得を通じて神経病理学を誘導する、ことを示唆した。広がった
ポリグルタミン（ポリＱ）形質を有する変異体ｈｔｔのいくつかの新しい機能が
、長期間の細胞性病理学を誘導するという可能性は、以下の可能性を生じる。変
異体ｈｔｔの転写の減少はまた、進行中の病理学的プロセスを減少し得る、可能
性を生じる。実際、最近のデータは、変異体ｈｔｔの発現を駆動する誘導系の使
用を示し、変異体ｈｔｔ発現の逆転はまた、モーター表現型の逆転を導き得る。

【０１６９】最近、多数の線条体のニューロンを長期間、形質転換することが結論的に実証
されたウイルスベクターが記載された。線条体のニューロンの高い百分率が、ド
パミン欠失トランスジェニックマウス線条において形質転換され得、そしてこれ
は、Ｌ−ドパを送達する組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を使用
して１年を十分に超えて、表現型をレスキューし得る。さらに、ＡＡＶは、リボ
ザイムおよび神経組織に対してアンチセンスの両方を首尾よく送達し、遺伝子発
現を減少することが実証された。従って、線条における変異体ｈｔｔ発現を、ｒ
ＡＡＶ送達されたリボザイムを介して特異的に減少することによってＲ６／２ト
ランスジェニックマウスにおけるＨＤ様表現型を取り消す試みの可能性が現在存
在する。

【０１７０】（５．６．１実験方法）（５．６．１．１機能的リボザイムの構築および試験）ハンマー状の頭をしたリボザイムを使用して、トリプレットＧＵＣ、または一
般にＮＵＸ（ここでＮは、任意のヌクレオチドを表し、そしてＸはグアニジンを
除く任意のヌクレオチドである）を含むＲＮＡ内の領域を選択するためのストラ
テジーが、開発された（ヒトハンチントン病遺伝子は、１５ＧＵＣ部位を有する
）。次いで、アンチセンスヌクレオチド６〜８ヌクレオチド長の２つの伸展を作
製し、そして触媒ハンマー状の頭をしたリボザイムを形成する２１ヌクレオチド
配列をそれらの間に配置する。触媒コアが、より大きい（３４ヌクレオチド）こ
とを除いて、原理は、ヘアピンリボザイムと同じであり、そしてこの型のリボザ
イムは、標的部位におけるより特異性を必要とする。ヘアピンは、配列ＮＮＮＢ
ＮＧＵＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号６６）を認識し、ここでＮは、任意のヌクレオ
チドであり、そしてＢは、アデノシンでない任意のヌクレオチドである。４つの
機能的リボザイムを試験し、次いでｒＡＡＶベクターにパーッケージし、インビ
ボでの構築物の活性を試験した。これらのリボザイム（図２２、図２３、図２４
、および図２５に示される）は、ＩＴ１５ｍＲＮＡを切断する。ＩＴ１５遺伝
子は、ハンチンチンと呼ばれるタンパク質をコードし、ハンチントン病において
変異する。ＡＡＶは、これらのリボザイムを、マウスの線条および皮質に送達す
るために使用され、変異体タンパク質の蓄積によって最も影響される組織におけ
る疾患表現型を導くハンチンチンの発現を減少するか否かを決定する。この遺伝
子の生殖細胞系ノックアウトは、胚で致死であり、そして成体動物へのリボザイ
ムのＡＡＶ送達は、本明細書中に記載される理由のためにこの胚の致死を克服す
る。

【０１７１】（５．６．１．２合成標的のインビトロ試験）遺伝子療法に有効であるために、リボザイムはインビトロでいくつかの試験を
通過しなくてはならない。第１に、標準緩衝液条件下（１０ｍＭＭｇＣｌ₂、
４０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４）で、オリゴヌクレオチド標的（１３〜
１５ヌクレオチド）についてリボザイムは試験され、それらが高度に活性であり
、かつ特異的であることが確認される。このようなリボヌクレオチド標的は、種
々の供給源（Ｄｈａｒｍａｃａｎ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｅｒ，ＣＯ）を含む）か
ら購入され得、、そして製造者の指示に従って脱保護される。切断反応を定量す
るために、標的オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−³² Ｐ−ＡＴＰを使用して標識される。この段階で、リボザイムは、天然に存在する
ヘアピンまたはハンマー状の頭をしたリボザイムより有意により少ない回転数を
示す場合（１分あたり）、拒絶されるか、または再びデザインされる。リボザイ
ム反応の律速工程は、産物の放出であるから、これらの試験は、標的過剰、マル
チ回転条件下で行われる。リボザイムは、不完全にマッチした標的（すなわち、
切断部位でか、またはその近くでミスマッチを有するオリゴヌクレオチド）を切
断する場合にまた、拒絶される。

【０１７２】よい動力学的な特性および適切な基質特異性を有するリボザイムが、全長ｍＲ
ＮＡを切断する可能性があるかどうかを決定するために、ハンチンチンｍＲＮＡ
由来の５０〜８０ヌクレオチド長の転写物について、リボザイムは試験される。
これらの配列は、ハンチンチンｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンからＰＣＲによって
クローン化され、標的ＲＮＡ分子が産生され、そしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
を使用してインビトロで³²Ｐで標識される。標的は、アクリルアミドウレアゲル
上での電気泳動によって精製され、そしてマグネシウムの存在化での加熱および
緩やかな冷却によって再生される。長い標的の切断の速度は、オリゴヌクレオチ
ド標的についての速度よりも、有意に小さい（１０倍以下に減少される）ようで
あり、次いで標的部位は、アクセス可能ではなく、そして候補リボザイムは、リ
ボザイムが代替の標的部位を認識することを支持して廃棄され得る。

【０１７３】次いで、活性な選択リボザイムは、クローン化されたｃＤＮＡ由来の全長ＲＮ
Ａ転写物について試験され、標的部位が、９．３ｋｂのハンチンチンｍＲＮＡの
フォールディングされた構造内で、アクセス可能であることが確認される。リボ
ザイムは、ハンチンチンＲＮＡの有意な画分がインタクトなままである場合、こ
の段階で排除され得る。全長ｍＲＮＡの切断はまた、ハンチンチンを発現する細
胞を、適切なプロモーターを駆動する試験されるリボザイムをコードするプラス
ミドベクターで、トランスフェクトすることによって組織培養において検出され
得る。この目的で、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時の初期プロモーター
のためのエンハンサー要素およびβアクチンのためのチキン遺伝子の近位のプロ
モーターを含むハイブリッドプロモーターが使用され得る。ハンチンチンについ
てのｍＲＮＡにおける減少は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出される。動力学的
にコンピテントな、かつ全長ＲＮＡをカットし得るリボザイムは、遺伝子発現の
抑制が所望される遺伝子療法の一般的に有用な道具である。

【０１７４】（５．６．１．３ｒＡＡＶ−ｒｉｂｏ−ｈｔｔの産生）組換えウイルスを産生するために、ヒト２９３細胞が、ｒＡＡＶプラスミドを
コードするリボザイムおよびヘルパープラスミドｐＤＧで同時トランスフェクト
される。このプラスミドは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方、そして
ＡＡＶ増殖のために必要なアデノウイルス遺伝子を含む。複製コンピテントなア
デノウイルスは、この方法を使用して検出されない。大規模ＤＮＡ調製は、Ｉｏ
ｄｉｘａｎｏｌ密度勾配遠心分離およびヘパリンアガロースカラム上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用してなされる。ウイルスの従来的な収率は、
現在、１０¹⁰〜１０¹¹感染粒子／ｍｌであり、そして野生型ＡＡＶの混入はない
。

【０１７５】（５．６．１．４ｒＡＡＶ−ｒｉｂｏ−ｈｔｔ機能のインビボ試験）ｒＡＡＶ−ｒｉｂｏ−ｈｔｔは、２４匹の正常な６〜８週齢のＣＢＡマウスに
おける２位置（各部位に２μｌ）の右線条に注射される。これらのマウスは、ベ
クター注射後、４週間、８週間および２６週間に殺される（ｎ＝６／期間）。こ
れらは、断頭され、そしてそれらの線条体は、ドライアイス上で迅速に解剖され
る。ホモジェネートされた線条の定量的ノーザンブロット分析は、注射されてい
ない線条で測定されたレベルに比較してｈｔｔｍＲＮＡの有意な減少が存在す
るかどうかを決定するために使用され得る。ノーザンブロット方法が、十分に感
受性でない場合、マウスβアクチンｍＲＮＡレベルに対して標準化されたｒｔ−
ＰＣＲが、線条体のｈｔｔｍＲＮＡレベルのリボザイム誘導性の減少を決定す
るために使用され得る。サンプルはまた、免疫ブロットを介した減少したｔｈｈ
タンパク質レベルの観察のために保存される。その時点が、本明細書中に記載さ
れる行動性の研究のために重要な間隔に一致するために選択された。

【０１７６】（５．６．１．５長期の線条体内のｒｉｂｏ−ｈｔｔ機能の試験）２つの平行した研究が行われ得、正常マウスにおける抗ｈｔｔリボザイムの効
果を特徴付ける。８匹の６週齢の正常ＣＢＡマウスは、上記の右線条内の２位置
にｒＡＡＶ−ｒｉｂｏ−ｈｔｔを線条体内に注射される。さらなる８匹のマウス
は、ｒＡＡＶ−ＧＦＰコントロールベクターを同様に注射される。これらの片側
性の動物は、ベクター注射後４週間で始まる毎週の一連のドパミンアゴニストを
使用して、非対称性回転性行動について試験される。線条機能の破壊は、２つの
半球の間の非対称を作製するべきであり、回転例におけるリボザイム誘導性機能
不全を検出を可能にする。第２の研究は、マウスが両側のベクター注射を受ける
ことを除いて、第１の研究に同じである。次いで、これらのマウスは、一連の試
験（例えば、ビームウォーキング、ｒｏｔｏｒｏｄ、聴覚驚愕応答のプレパルス
阻害、およびフットプリントの歩行分析）でのベクター注射後４週間に始まる毎
週の試験を受ける。両方の研究において、マウスの５／８は、実験の終わりに殺
され、そして上記のｈｔｔｍＲＮＡレベルを評価するためにプロセスされる。
残りの３匹のマウス／グループは、４％パラホルムアルデヒドで灌流され、そし
て導入遺伝子発現を評価するためにＧＦＰ免疫組織化学についてプロセスされる
。

【０１７７】（５．７実施形態７−スーパーオキシドジスムターゼに標的化されたリボザ
イム）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脊髄、脳幹および皮質における運動ニュー
ロンの変性障害である（Ｂｒｏｗｎ、１９９７）。ほとんどの場合、その原因は
未知であるが、ＡＬＳは均一に致死（通常、診断の５年以内）である。約１０％
のＡＬＳの場合が、常染色体の優性形質として遺伝し、そして家族性ＡＬＳまた
はＦＡＬＳとして集団的に記載される。約２０％のＦＡＬＳの場合は、ＳＯＤ１
遺伝子の変異に関連し、ＳＯＤ１遺伝子はサイトゾルの酵素Ｃｕ／Ｚｎスーパー
オキシドジスムターゼをコードする（Ｒｏｓｅｎら、１９９３）。この１５３ア
ミノ酸タンパク質は、毒性スーパーオキシドアニオンを過酸化水素および分子状
酸素に転換する。ＳＯＤ１における２６以上のミスセンス変異が、ＦＡＬＳを導
くとして同定された。３つの主要な仮説が、ＳＯＤ１変異が、どのように神経変
性を導くかについて提案された（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、１９９９）：（ｉ）変異
体酵素は、変化された基質親和性を有し、毒性産物の蓄積を導く；（ｉｉ）減少
されたＳＯＤ活性は、増加された酸化ストレスを許容し、特に感受性の細胞の損
傷を導く；（ｉｉｉ）不十分にか、または不安定にフォールディングされた変異
体ＳＯＤタンパク質形態は凝集物を形成し、運動ニューロンに特異的に毒性であ
る。ヒトＳＯＳ１遺伝子の変異体形態を発現するいくつかの動物モデルが存在す
る（Ｂｕｉｊｎら、１９９８；Ｓｈｅｆｎｅｒら、１９９９；Ａｚｚｏｕｚら、
１９９７；Ｂｒｏｗｎｅら、１９９８；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９６；Ｒａｔ
ｏｖｉｔｓｋｉら、１９９９；Ｒｉｐｐｓら、１９９５）。これらは、上述のモ
デル間を完全に識別するが、神経病発生に寄与する凝集体の蓄積を示唆する。さ
らに、少なくともいくつかのミスセンス変異体は、触媒機能を保持し、減少され
た活性が、細胞死の原因ではないことを示唆する。ＳＯＤ１を欠くマウスは、Ａ
ＬＳを発達しないが、変異体ＳＯＤ１導入遺伝子の高い発現は、ＡＬＳ様疾患を
導く。

【０１７８】いくつかのリボザイムが設計され、そしてＡＬＳのマウスモデルにおいて存在
するヒトＳＯＤ１についてのｍＲＮＡの切断を試験された（図３６Ａ、図３６Ｂ
、図３６Ｃ、および図３６Ｄ）。これらのリボザイムは、変異体および野生型形
態のＳＯＤ１ｍＲＮＡの両方をインビトロで切断する。これらは、ベクターｐ
ＴＲ−ＵＦ３３ＨＰのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｓｉＩ部位に導入された（図２）。こ
れらはまた、同じベクター骨格内の神経特異的エノラーゼプロモーターと関連し
て試験された。このように送達されたこれらのリボザイムは、これらのウイルス
で感染された運動ニューロンにおける変異体Ｃｕ／ＺｎＳＯＤタンパク質の発
現を減少するはずである。これらのようなＡＡＶ構築物は、脊髄における運動ニ
ューロンの長期間の形質転換に使用されてきた（Ｐｅｅｌ、１９９７）。このア
プローチは、変異体ＳＯＤ１ｍＲＮＡの発現が、トランスジェニック動物にお
ける運動ニューロンに対する損傷に必要とされるかどうかを決定する。これらの
ベクターはまた、ＳＯＤ１変異体の発現が疾患を導く関連する細胞型の同定を許
容する。特定の細胞における野生型ＳＯＤ１の発現を減少することが、病因を導
くかどうかもまた、決定される。これらの実験は、発症した細胞におけるＳＯＤ
１の発現を減少することによって、ＦＡＬＳについての新規療法を導き得る。

【０１７９】マウスマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）について、ｍＲ
ＮＡを切断するリボザイムが、産生され、そして試験された（図２７）。この酵
素は、酸素毒性（ｏｘｙｇｅｎｔｏｘｉｃｉｔｙ）に対して保護性であり、そし
て多発性硬化症のマウスモデルにおいて、視覚神経を保護する。このリボザイム
はマウスにおけるこの遺伝子の発現をノックダウンするために使用され得、この
遺伝子が神経保護機能を有するかどうかを決定する。このリボザイムは、インビ
トロで活性である。

【０１８０】（５．８実施例８−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニットに標的化された
リボザイム）マウスミトコンドリア酵素ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＭＷＦＥサブユニット
に対するリボザイムが構築され、そして試験された（図２６）。この同じ酵素複
合体を発症するミトコンドリア変異体は、レーバー遺伝性視神経障害に関連する
。ミトコンドリア疾患のマウスモデルを確立することが可能でないので、このＡ
ＡＶリボザイムは、網膜神経節細胞を感染することによって動物モデルを作製す
るために使用される。好ましいベクターは、ｐＴＲＵＦ１２−ＨＰであり（図３
）、ＣＭＶ−βアクチンプロモーターを使用する。リボザイムは、独特なＨｉｎ
ｄＩＩＩとＮｓｉＩ制限部位との間に挿入される。このリボザイムは、インビト
ロで試験され、そしてＡＡＶ．７にクローン化された。

【０１８１】（６．０参考文献）以下の参考文献は、これらが例示的手順または本明細書中の記載についての他
の補遺を提供する程度まで、本明細書中でその全体の各々において参考として特
に援用される：米国特許第４，６８３，１９５号，１９８７年７月２８日公表。米国特許第４，６８３，２０２号，１９８７年７月２８日公表。米国特許第４，８００，１５９号，１９８９年１月２４日公表。米国特許第４，８８３，７５０号，１９８９年１１月２８日公表。米国特許第４，９８７，０７１号，１９９１年１月２２日公表。米国特許第５，２９７，７２１号，１９９４年１月１８日公表。米国特許第５，３３４，７１１号，１９９４年８月２日公表。米国特許第５，３５４，８５５号，１９９４年１０月１１日公表。米国特許第５，４５５，１６６号，１９９５年１０月３日公表。米国特許第５，６３１，３５９号，１９９７年３月２０日公表。米国特許第５，６４８，２１１号，１９９７年７月１５日公表。米国特許第５，７１２，１２４号，１９９８年１月２７日公表。米国特許第５，７４４，３１１号，１９９８年４月２８日公表。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／１０３１５。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５。国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６７００。国際特許出願公開番号ＷＯ９０／０７６４１。国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０３１６２。国際特許出願公開番号ＷＯ９２／０７０６５。国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１５１８７。国際特許出願公開番号ＷＯ９３／２３５６９。国際特許出願公開番号ＷＯ９４／０２５９５。国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１３６８８。欧州特許出願公開番号ＥＰ０３２９８２２。欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６０２５７。欧州特許出願公開番号ＥＰ３２０３０８。欧州特許出願公開番号ＥＰ９２１１０２９８．４。英国特許出願番号第２２０２３２８号。

【０１８２】

【表４】本明細書中で開示および特許請求される全ての組成物および方法は、本開示の
見地において、過度の実験なくなされ、そして実行され得る。本発明の組成物お
よび方法は好ましい実施形態の条件によって記載されるが、本発明の概念、精神
および範囲から逸脱することなく、組成物および方法、ならびに本明細書中に記
載される方法の工程または工程の順序において変化が適用され得ることが当業者
に明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成される間、化学
的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が本明細書中に記載される薬剤で
置換され得ることが明らかである。本発明は種々の改変および代替形態に対して
感受性であるが、図において例示の目的で示されるその特定の実施形態は、本明
細書中に詳細に記載される。しかし、本明細書中の特定の実施形態の記載は、開
示された特定の形態に限定されるようには意図されないが、逆に、本発明は、添
付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内の全ての改変
、均等物、および代替を包含することが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

以下の図面は、本明細書の一部をなし、そして本発明の特定の局面をさらに示
すために含まれる。本発明は、１つ以上のこれらの図面を、本明細書中に記載さ
れる特定の実施形態の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解され
得る。

【図１】図１は、ｐＴＲ−ＧＳ−ＨＰのプラスミドマップを示す。

【図２】図２は、ｐＴＲ−ＵＦ３３^*−ＨＰのプラスミドマップを示す。

【図３】図３は、ｐＴＲ−ＵＦ１２−ＨＰのプラスミドマップを示す。

【図４】図４は、ｐＴＲ−ＵＦＣＲＥＢ２３０ｈｈのプラスミドマップを示す。

【図５】図５は、ｐＴＲ−ＵＦＣＲＥＢ２８８ｈｈのプラスミドマップを示す。

【図６】図６は、ヌクレオチド配列（配列番号１）、およびＲＮＡ標的配列（配列番号
２）を含む縮重ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図７】図７は、ヌクレオチド配列（配列番号３）、およびＲＮＡ標的配列（配列番号
４；マウスｐ１６）を含む抗ｐ１６ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図８】図８は、ヌクレオチド配列（配列番号５）、およびＲＮＡ標的配列（配列番号
６；マウスｐ１９ＡＲＦ）を含む抗ｐ１９ＡＲＦハンマーヘッドリボザイムの
構造を示す。

【図９】図９は、ヌクレオチド配列（配列番号７）、およびＲＮＡ標的配列（配列番号
８；マウスｐ５３）を含む抗ｐ５３ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図１０Ａ】図１０Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号９）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号１０；マウス網膜芽細胞腫）を含む抗網膜芽細胞腫ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。

【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ヌクレオチド配列（配列番号６３）、およびＲＮＡ標的配列（配
列番号６４；マウス網膜芽細胞腫）を含む抗網膜芽細胞腫ハンマーヘッドリボザ
イムの構造を示す。

【図１１】図１１は、ヌクレオチド配列（配列番号１１）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号１２；ＣＲＥＢ２３０）を含むＣＲＥＢ２３０ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、ＣＲＥＢ２３０リボザイム（配列番号１３、および配
列番号１４）をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチド、ならびに
変異体をクローン化しするために使用されるオリゴヌクレオチド、非活性形態の
ＣＲＥＢ２３０リボザイム（配列番号１５、および配列番号１６）が示される
。

【図１２】図１２は、ヌクレオチド配列（配列番号１７）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号１８；ＣＲＥＢ２８８）を含むＣＲＥＢ２８８ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、ＣＲＥＢ２８８リボザイム（配列番号１９、および配
列番号２０）をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチド、ならびに
変異体をクローン化しするために使用されるオリゴヌクレオチド、非活性形態の
ＣＲＥＢ２８８リボザイム（配列番号２１、および配列番号２２）が示される
。

【図１３】図１３は、ヌクレオチド配列（配列番号２３）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号２４；ＣＲＥＢ３８０）を含むＣＲＥＢ３８０ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、ＣＲＥＢ３８０リボザイム（配列番号２５、および配
列番号２６）をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチドが示される
。

【図１４】図１４は、候補腫瘍サプレッサ遺伝子のフローチャートを示す。

【図１５】図１５は、ヌクレオチド配列（配列番号２９）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号３０；マウスβＰＤＥのｎｔ１０３７−１０４９）を含むｃＧＭＰホスホ
ジエステラーゼの抗β−サブユニット（βＰＤＥ）の構造を示す。

【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１６Ｄは、処置した目およびコントロ
ール目の外側の核層の顕微鏡写真を示す。図１６Ａは、ＰＢＳを注射したコント
ロール目（左）である。図１６Ｂは、図１６Ａに示されるマウスと同じマウスの
右目であり、これはｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβサブユニット（βＰＤＥ
）に対するリボザイムを注射されている。図１６Ｃは、βＰＤＥに対するリボザ
イムの非活性形態を注射したコントロール目（左）である。図１６Ｄは、図１６
Ｃに示されるマウスと同じマウスの右目であり、これはβＰＤＥに対する活性リ
ボザイムを注射されている。

【図１７】図１７Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号３１）、およびＲＮＡ標的配列（ヒ
トＡＢＤＲ遺伝子の配列番号３２）を含む抗ＡＢＣＲハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。図１７Ｂは、ヌクレオチド配列（配列番号３３）、およびＲＮＡ
標的配列（マウスＡＢＤＲ遺伝子の配列番号３４）を含む抗ＡＢＣＲハンマーヘ
ッドリボザイムの構造を示す。

【図１８】図１８Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号３５）、およびＲＮＡ標的配列（マ
ウスγＰＤＥ遺伝子の配列番号３６）を含む抗γＰＤＥハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。図１８Ｂは、ヌクレオチド配列（配列番号３７）、およびＲＮ
Ａ標的配列（マウスγＰＤＥ遺伝子の配列番号３８）を含む抗γＰＤＥハンマー
ヘッドリボザイムの構造を示す。

【図１９】図９は、ＨＨＲＺ４２による切断の経過時間を示す。

【図２０】図２０は、網膜下注射の８週間後の野生型マウスＣ２７ＢＬ／６（＋／＋，Ｗ
Ｆ１２）由来の網膜の光顕微鏡写真を示す。Ｒ−目（ｐＨＲｚ３５＋ｐＨＲｚ４
２リボザイムを注射されている）は、Ｌ−目（ＰＢＳを注射したコントロール目
）と比較して、そのＯＮＬ、ＲＯＳおよびＲＩＳ厚が９０％より多く減少した。

【図２１】図２１は、６週間のｐ．ｉ．における＋／−マウスの、野生型γＰＤＥＲｚの
右目および左目についての暗順応（ＲＯＤ）ＥＲＧ波形を示す。フラッシュ強度
は、−１．１、−０．１、０．９、１．９ｌｏｇｃｄ−ｓ−ｍ²である。

【図２２】図２２は、ヌクレオチド配列（配列番号３９）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号４０）を含む抗ＩＴ１５−２Ｒｚハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図２３】図２３は、ヌクレオチド配列（配列番号４１）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号４２）を含む抗ＩＴ１５−４ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図２４】図２４は、ヌクレオチド配列（配列番号４３）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号４４）を含む抗ＩＴ１５−１２Ｒｚハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
。

【図２５】図２５は、ヌクレオチド配列（配列番号４５）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号４６）を含む抗ＩＴ１５−８Ｒｚハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図２６】図２６は、ヌクレオチド配列（配列番号４７）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号４８）を含むマウス抗ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＭＷＦＥサブユニットｎｔ
３３８ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。

【図２７】図２７は、ヌクレオチド配列（配列番号４９）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号５０）を含むマウス抗ＭｎＳＯＤｎｔ４３２ハンマーヘッドリボザイムの構
造を示す。

【図２８】図２８は、コード領域の１１４位におけるヒト網膜ＡＢＣＲの標的鎖を示す。
ＡＢＣＲリボザイムのヌクレオチド配列（配列番号８１）が示され、そしてＲＮ
Ａ標的配列が、配列番号８０として示される。

【図２９】図２９は、ヒト網膜光受容体ＡＢＣトランスポーター（ＡＢＣＲ）ｃＤＮＡ（
配列番号６５）のサブユニット配列を示す。

【図３０】図３０は、Ｒｚ１１４オリゴ標的の時間経過を示す。

【図３１】図３１は、Ｒｚオリゴ標的の時間経過を、ｔ_1/2＝２４０分、および半減期の
単指数崩壊を示す時間の関数として、基質の消失の半対数プロットとして示す。
Ｋ_obsは、ｔ_1/2＝０．６９３／ｋ_obs、およびＫ_obs＝０．００２８９ｍｉｎ^-1に
より得られる。

【図３２】図３２は、基質発現実験の切断対時間のプロットを示す。リボザイム濃度は２
０ｎＭであり、そして基質濃度は、１００から２０００ｎＭまで変動する。この
直線の傾きは、直線回帰により計算され、そして図の右側に示される

【図３３】図３３は、Ｒｘ１４４基質過剰研究を示す。

【図３４】図３４は、ヌクレオチド配列（配列番号５１）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号５２）を含むマウス抗Ｄ１−１−Ｔ７Ｒｚ５２ハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。

【図３５】図３５は、ヌクレオチド配列（配列番号５３）、およびＲＮＡ標的配列（配列
番号５４）を含むマウス抗Ｄ１−１−Ｔ７Ｒｚ８２ハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。

【図３６Ａ】図３６Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号５５）、およびＲＮＡ標的配列（配
列番号５６）を含む抗ＳＯＤ−１１８６ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
。

【図３６Ｂ】図３６Ｂは、ヌクレオチド配列（配列番号５７）、およびＲＮＡ標的配列（配
列番号５８）を含む抗ＳＯＤ−１２９５ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
。

【図３６Ｃ】図３６Ｃは、ヌクレオチド配列（配列番号５９）、およびＲＮＡ標的配列（配
列番号６０）を含む抗ＳＯＤ−１３５９ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
。

【図３６Ｄ】図３６Ｄは、ヌクレオチド配列（配列番号６１）、およびＲＮＡ標的配列（配
列番号６２）を含む抗ＳＯＤ−１４２９ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ハースワース，ウィリアムダブリュー．アメリカ合衆国フロリダ 32608，ゲインズビル，エスダブリュー 89ティーエイチストリート 12001 (72)発明者テッセンドルフ，クリスチャンアメリカ合衆国フロリダ 32608，ゲインズビル，エスダブリューウィリストンロード 2330 (72)発明者バーガー，コリンナアメリカ合衆国フロリダ 32608，ゲインズビル，アパートメントエス114，エスダブリュー 52エヌディーアベニュー 10000 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 CA04 CA11 CA12 EA02 HA17 4B050 CC04 LL01 LL03 4B063 QA08 QQ08 QQ43 QR32 QR35 QR77

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】選択した機能を有する少なくとも第１遺伝子を同定する方法
であって、該方法は、該少なくとも第１遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子と
、リボザイムのライブラリーとを接触させる工程、および少なくとも、該少なく
とも第１遺伝子の該選択した機能を変化させる、該ライブラリー由来の第１リボ
ザイムを同定し、これによって、該選択した機能を有する該少なくとも第１遺伝
子を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記複数の遺伝子が、動物内に含まれる、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】前記複数の遺伝子が、哺乳動物内に含まれる、請求項１また
は２に記載の方法。
【請求項４】前記複数の遺伝子が、ヒト遺伝子である、請求項１〜３のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記リボザイムの少なくとも１つが、ハンマーヘッドリボザ
イムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】前記リボザイムが、化学的に合成される請求項１〜５のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項７】前記リボザイムのライブラリーが、複数のアデノ随伴ウイル
スに含まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】同定された前記少なくとも第１リボザイムを単離する工程を
さらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】前記少なくとも第１リボザイムのヌクレオチド配列を得る工
程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】同定された前記少なくとも第１遺伝子を単離する工程をさ
らに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】前記少なくとも第１遺伝子のヌクレオチド配列を得る工程
をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】前記少なくとも第１遺伝子が、（ａ）網膜変性、（ｂ）網
膜疾患、（ｃ）学習または記憶、（ｄ）筋萎縮性側索硬化症、あるいは（ｅ）腫
瘍抑制に随伴する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】前記少なくとも第１遺伝子が、ロドプシン、（ｂ）ＮＡＤ
Ｈデヒドロゲナーゼのサブユニット、（ｃ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのサ
ブユニット、（ｄ）ｐ５３、（ｅ）ｐ１６，（ｆ）網膜芽細胞腫、（ｇ）ｐ１９
ＡＲＦ、（ｈ）スーパーオキシドジスムターゼ、（ｉ）マンガンスーパーオキシ
ドジスムターゼ、または（ｊ）ＣＲＥＢをコードする、請求項１〜１２のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１４】前記ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのサブユニットがβサ
ブユニットまたはγ−サブユニットである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記ＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼのサブユニットが、ＭＷ
ＦＥサブユニットである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前
記少なくとも第１遺伝子が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１
０、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３２
、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、
配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配
列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列
番号６４、配列番号６５、および配列番号８０からなる群から選択される、核酸
配列を含む、方法。
【請求項１７】請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前
記少なくともリボザイムが、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９
、配列番号１１、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、
配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配
列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列
番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番
号６３、および配列番号８１からなる群から選択される、ヌクレオシド配列を有
する、方法。
【請求項１８】請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって同定
される、単離された遺伝子。
【請求項１９】請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって同定
される、単離されたリボザイム。
【請求項２０】選択した機能を有する本質的に全長の遺伝子を同定する方
法であって、該方法は、該本質的に全長の遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子
を、該本質的に全長の遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第１リボザイムと
接触させ、これにより、該選択した機能を有する該本質的に全長の遺伝子を同定
する工程を包含する、方法。
【請求項２１】選択した遺伝子の機能を同定する方法であって、該方法は
、該選択した遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子を、該選択した遺伝子のリボ
核酸を切断するリボザイムと接触させる工程、および該リボザイムの効果を同定
し、これにより、該選択した遺伝子の機能を同定する工程を包含する、方法。
【請求項２２】非ヒト動物に選択した生理学的に異常な状態を誘導する方
法であって、該方法は、該選択した生理学的に異常な状態を予防することに随伴
する少なくとも第１遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第１リボザイムを、
該非ヒト動物に投与し、これにより、該非ヒト動物に該選択した生理学的に異常
な状態を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項２３】請求項２２に記載の方法であって、前記生理学的に異常な
状態が、（ａ）網膜変性、（ｂ）網膜疾患、（ｃ）癌、（ｄ）腫瘍形成、（ｅ）
記憶損失、（ｆ）学習障害、または（ｇ）筋萎縮性側索硬化症である、方法。
【請求項２４】ヒト疾患の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、該
方法は、（ａ）生理学的に異常な状態を有する動物を選択する工程、および（ｂ
）該選択した生理学的に異常な状態を予防することに随伴する少なくとも第１遺
伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第１リボザイムを、該動物に投与し、これ
により、該ヒト疾患の動物モデルを作製する工程を包含する、方法。
【請求項２５】請求項２４に記載の方法であって、前記動物由来の子孫を
得る工程をさらに包含し、該子孫が、前記生理学的に異常な状態の症状を示す、
方法。
【請求項２６】ヒト疾患の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、該
方法は、選択した生理学的に異常な状態を生じることに随伴する少なくとも第１
遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第１の選択したリボザイムを、該動物に
投与し、これにより、該ヒト疾患の動物モデルを作製する工程を包含する、方法
。
【請求項２７】請求項２６に記載の方法であって、前記動物由来の子孫を
得る工程をさらに包含し、該子孫が、前記生理学的に異常な状態の症状を示す、
方法。