JP2002542805A - アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法 - Google Patents

アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法

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コリンナ バーガー,
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、網膜変性、癌、記憶、および学習を含む種々の細胞プロセスに関与する新規の遺伝子の同定、ならびに未知の機能を有する種々の遺伝子および遺伝子フラグメントの機能の同定に関する。そのようにして同定された遺伝子ならびにその同定方法に使用される組成物もまた、開示される。本発明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されているヒト以外の動物モデルを作製するための方法を提供する。これによって同定された遺伝子および同定方法において使用される組成物がまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (1.0 発明の背景) 本出願は、1999年4月30日に出願された米国仮出願番号60/131,
942(その内容の全部が、全体として本明細書中で参考として具体的に援用さ
れる)に対して優先権を主張する継続出願である。米国政府は、国立保健衛生研
究所からの補助金番号EY11596に準じて本発明において特定の権利を有す
る。 (1.1 発明の分野) 本発明は、一般に、遺伝学、分子細胞生物学、および医学の分野に関する。よ
り詳細には、本発明は、網膜変性、癌、記憶、および学習を含む種々の細胞プロ
セスに関与する新規の遺伝子の同定、ならびに未知の機能を有する種々の遺伝子
および遺伝子フラグメントの機能の同定に関する。そのようにして同定された遺
伝子ならびにその同定方法に使用される組成物もまた、開示される。
【0002】 (1.2 関連分野の説明) 自動化DNA配列決定法の進歩に助けられたヒトゲノム研究における最近の進
歩は、ヒト遺伝子およびタンパク質についての知識の富をもたらしている。遺伝
子配列決定および遺伝子の単離における進歩は、コンピュータに基づく生体情報
システムおよび分析と組み合わせて、多くの新たなトレンドに対する可能性を提
供する。
【0003】 ゲノム学およびコンビナトリアルケミストリーにおける進歩は、薬物が発見さ
れる方法を進化させた。わずか数年前の100,000個のヒト遺伝子の配列決
定および特徴づけにより、ランダム化合物スクリーニングが、疾患関連遺伝子の
同定およびそれに続く疾患経路に関与する遺伝子産物を特異的に標的化するため
の合理的な薬物設計によって置き換わられている。しかし、全くの多量の遺伝子
情報が産生されることは、新たな遺伝子標的を発見する問題が、多くの新たな標
的のどれが最良かを決定する問題に置き換わられることを意味する。
【0004】 ヒトゲノムプロジェクト、学術センターおよびバイオ製薬産業の努力により、
今や、研究者に利用可能な有意な量の遺伝子配列情報が存在する。しかし、この
情報がアクセス可能である一方、生物学的機能を理解せずに、遺伝子配列のみを
知ることは、通常、効果的な薬物開発を可能にするには充分ではない。必要なこ
と、および現在当該分野に欠けていることは、選択された生物学的および生理学
的プロセスに関与する特定の遺伝子を同定する方法である。インビボでの標的の
確認を達成する適切な技術が欠如していることは、現在、ヒトゲノムプロジェク
トから出現する遺伝子配列情報を、新たな治療標的に翻訳することにおける主要
なバリケードを代表している。
【0005】 (2.0 発明の要旨) 本発明は、当該分野におけるこれらおよびその他の欠損を、種々の細胞性、生
物学的、および生理学的プロセスに直接的または間接的のいずれかで関与する新
規な遺伝子を同定するための方法を提供することによって克服する。さらに、本
発明は、当該分野のその他の欠点を、以前に同定された遺伝子または遺伝子フラ
グメント(例えば、発現された配列タグ(EST))の機能を同定するための方
法を提供することによって克服する。それらは、これまでは、困難であり、かつ
非常に時間のかかりそして労力を要するものであった。本発明は、任意の細胞、
またはより重要には体細胞組織において未知の機能を有する遺伝子を「ノックア
ウト」または不活性化し、そして得られる「ノックアウト」表現型に基づいて遺
伝子の機能の証拠を得る方法を提供する。これらの方法はまた、疾患を引き起こ
すそれらの能力についての公知のまたは予想された機能の遺伝子を試験し、それ
により、新たな疾患を引き起こす遺伝子を同定することにおいて有用である。本
発明は、胚幹細胞における伝統的な遺伝子破壊に対して有意な利点を提供する。
なぜなら、発生において重要であり、そして胚を死に導く遺伝子は、成体動物に
おいて「ノックアウト」され得、そして本明細書に提供される方法を使用して研
究され得るからである。したがって、本発明はまた、当該分野でのさらなる欠点
を、種々の異なる生理学的条件(先天異常および疾患を含む)の動物モデルを提
供することによって克服する。
【0006】 本発明は、選択された機能を有する1つ以上の遺伝子を同定する方法であって
、その遺伝子を含有すると疑われる複数の遺伝子を、リボザイムの複数のライブ
ラリーと接触させる工程、および1つ以上の遺伝子の選択された機能を変更する
複数のライブラリーからの1つ以上のリボザイムを同定し、それにより、選択さ
れた機能を有する1つ以上の遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。
【0007】 本発明の好ましい局面において、同定されるべき遺伝子は、1つ以上の細胞性
、生物学的および/または生理学的プロセスに関与する。そのプロセスは、生命
を脅かすもの(例えば、癌のような後天性および先天性の疾患、網膜変性のよう
な変性、学習障害、または長期もしくは短期の記憶喪失、または目的の任意の他
の正常もしくは異常なプロセス)であり得る。
【0008】 種々の実施形態において、複数の遺伝子は、動物(例えば、哺乳動物またはヒ
ト被験体)内に含まれる。しかし、これは、必須ではなく、そしてしたがって、
他の実施形態において、その複数の遺伝子は、エキソビボの設定(例えば、組織
培養物または細胞培養物)またはインビトロの設定で(粗製の、部分的に単離さ
れたかまたは精製された核酸を使用して)提供される。
【0009】 リボザイムのライブラリーは、標的認識およびリボザイムのその標的核酸への
結合に関与するリボザイムの領域内に縮重塩基を包含する複数のリボザイムを包
含する。本発明の特定の局面において、そのリボザイムは、これらの認識および
結合位置で完全に縮重しており、配列番号1に示される配列を有する。一方、本
発明の他の局面において、そのリボザイムは、1、2、3、4、5、6、7、8
、9、または10個などの可能な位置で、完全にかまたは部分的に(可能な4リ
ボヌクレオチド塩基の2または3のみ)縮重した塩基を有する。ハンマーヘッド
、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、I群イントロン、またはRNaseP RNA
(RNAガイド配列を関連する)またはNeurospora VS RNAモ
チーフを含むリボザイムの全ての型は、本発明の用途のために意図されるが、特
定の好ましい局面において、そのリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムであ
る。本発明の種々の局面において、そのリボザイムは、インビトロまたはインビ
ボで化学的に合成されているか、または転写されている。
【0010】 リボザイムは、本明細書以下に記載されるように種々の異なる方法によって送
達され得るが、本発明の好ましい局面では、リボザイムまたはリボザイムのライ
ブラリーは、アデノ随伴ウイルス発現ベクターにクローニングされ、そして複数
のアデノ随伴ウイルス粒子内に包含される。
【0011】 本発明の好ましい局面において、本発明の方法によって同定される1つ以上の
リボザイムおよび/または1つ以上の遺伝子が単離され、そして本発明の特定の
局面では、リボザイムの全部または一部のヌクレオチド配列および/または遺伝
子が得られる。
【0012】 したがって、本発明は、網膜変性に関与する少なくとも第1の遺伝子を同定す
る方法であって、該少なくとも第1の遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝
子を、リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および網膜変性を変更する
ライブラリーから少なくとも第1のリボザイムを同定し、それにより網膜変性に
関与する少なくとも第1の遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。網
膜変性に関与する遺伝子を同定するにおける使用のために意図される1つのリボ
ザイムは、配列番号29のヌクレオチド配列を有する。このように同定され得る
遺伝子のなかには、ロドプシン遺伝子およびcGMPホスホジエステラーゼのβ
サブユニットをコードする遺伝子がある。
【0013】 本発明はまた、少なくとも第1の腫瘍抑制遺伝子を同定する方法であって、該
少なくとも第1の腫瘍抑制遺伝子を包含することが予想される複数の遺伝子を、
リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および腫瘍抑制を変更するライブ
ラリーから少なくとも第1のリボザイムを同定し、それにより、少なくとも第1
の腫瘍抑制遺伝子を同定する工程を包含する方法を提供する。腫瘍抑制遺伝子を
同定するにおける使用のために意図されるリボザイムには、配列番号3、配列番
号5、配列番号7、および配列番号9のヌクレオチド配列を有するリボザイムが
含まれるがこれらに限定されない。これらに方法によって同定され得る遺伝子の
例には、p53遺伝子、p16遺伝子、網膜芽細胞遺伝子、およびp19ARF
遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】 本発明はさらに、記憶または学習に関与する少なくとも第1の遺伝子を同定す
る方法であって、該少なくとも第1の遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝
子を、リボザイムのライブラリーと接触させる工程、および記憶または学習を変
更するライブラリーから少なくとも第1のリボザイムを同定することにより、記
憶または学習に関与する少なくとも第1の遺伝子を同定する工程を包含する方法
を提供する。記憶または学習に関与する遺伝子を同定するにおける使用のために
意図されるリボザイムには、配列番号11のヌクレオチド配列、配列番号17の
ヌクレオチド配列、および配列番号23のヌクレオチド配列を有するリボザイム
が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法によって同定され得る遺伝
子の1つの非限定的な例は、CREB遺伝子である。
【0015】 本発明はまた、本明細書に提供される方法によって同定される、単離された遺
伝子およびリボザイムを提供する。したがって、これらの方法によって同定され
る、網膜変性、記憶、学習に関与するかまたは変更する遺伝子およびリボザイム
、ならびに腫瘍抑制遺伝子が、本発明によって提供される。
【0016】 本発明の特定の局面において、リボザイムは、遺伝子の小フラグメント(例え
ば、EST)に基づいて設計され、ここで、そのESTが由来する遺伝子の機能
は、既知であるかまたは未知であるかのいずれかであり、そして全長遺伝子はい
まだクローニングされていない。本発明は、選択された機能を有する本質的に全
長の遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、本質的に全長の遺伝子を包含
すると予想される複数の遺伝子を、該本質的に全長の遺伝子のリボ核酸を切断す
る少なくとも第1のリボザイムと接触させ、それにより、その選択された機能を
有する本質的に全長の遺伝子を同定する工程を包含する。
【0017】 本発明によって提供される特定のリボザイムは、特異的(specific)
または特定の(particular)遺伝子を標的化するように設計されてい
るため、本発明は、これらの特定または特異的の遺伝子を同定する方法を提供し
、この方法は、その特異的遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝子を、その
特異的遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第1のリボザイムと接触させ、そ
れによりその特異的または特定の遺伝子を同定する工程を包含する。したがって
、本発明は、ロドプシン遺伝子、cGMPホスホジエステラーゼのβサブユニッ
トをコードする遺伝子、p53遺伝子、p16遺伝子、網膜芽細胞遺伝子、p1
9ARF遺伝子および/またはCREB遺伝子を同定するための方法を提供する
【0018】 さらに、本発明は、選択された遺伝子の機能を同定する方法であって、該選択
された遺伝子を包含すると予想される複数の遺伝子を、その選択された遺伝子の
リボ核酸を切断するリボザイムと接触させる工程、およびそのリボザイムの効果
を同定し、それにより、その選択された遺伝子の機能を同定する工程を包含する
方法を提供する。
【0019】 本発明はまた、動物において選択された生理学的に異常な状態を誘導する方法
を提供し、この方法は、その動物に、該選択された生理学的に異常な状態を予防
することに関与する少なくとも第1の遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第
1のリボザイムを投与する工程、それにより、その動物において該選択された生
理学的に異常な状態を誘導する工程を包含する。特定の方法において、その生理
学的に異常な状態は、網膜変性、癌、記憶喪失、または学習障害である。したが
って、本発明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されている動物を提供
し、それにより種々の異なる異常な状態および疾患についての動物モデルを提供
する。同様に、本発明は、動物において選択された生理学的に異常な状態を誘導
するための方法を提供し、この方法は、その動物に、該選択された生理学的に異
常な状態を引き起こすことに関与する少なくとも第1の遺伝子のリボ核酸を切断
する少なくとも第1のリボザイムを投与する工程、それにより該動物において該
選択された生理学的に異常な状態を誘導する工程を包含する。したがって、本発
明はまた、目的の任意の特定の遺伝子が不活化されているヒト以外の動物モデル
を作製するための方法を提供し、それにより、種々の異なる異常な状態および疾
患を研究するための道具を提供する。
【0020】 (4.0 例証的実施形態の説明) 本発明の例証的実施形態を以下に記載する。明快さのために、実際の実施のす
べての特徴を、本明細書において記載するわけではない。当然のことながら、い
かなるこのような実施形態の開発においても、一方の実施と他方の実施で変化す
る開発者の特定の目標(例えば、システムに関連した制約およびビジネスに関連
した制約への追従)を達成するために、多数の実施で特異的な判断がなされなけ
ればならないことが理解される。さらに、このような開発努力は、複雑かつ時間
浪費的であり得るが、それにもかかわらず、本開示の恩恵を有する当業者には慣
用的な仕事であることが理解される。
【0021】 本発明は、種々の細胞プロセス、生物学的プロセス、および生理的プロセスに
おいて、直接的または間接的のいずれかで関与する新規遺伝子を同定する方法、
ならびに、以前に同定されていた遺伝子または遺伝子フラグメント(例えば、発
現配列タグ(EST))の機能を同定する方法を提供する。本発明は、すべての
体細胞性組織において未知の機能の遺伝子を「ノックアウト」する方法、および
その結果生じた「ノックアウト」表現型に基づいて、その遺伝子の機能の証拠を
得る方法を提供する。本発明はまた、疾患の原因となる潜在能力について、既知
または疑わしい機能の遺伝子を試験し、それによって、新たな疾患原因遺伝子を
同定するための方法を提供する。本発明はまた、種々の異なる生理的状態(特定
の先天的異常を含む)および疾患の動物モデルを提供する。
【0022】 本発明の方法は、特定の遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのいずれかを標的
化するように設計されたリボザイムの使用、または、標的認識および結合に関与
する塩基中の縮重を通して、無作為の遺伝子を標的化するリボザイムのライブラ
リーの使用を包含する。さらに、本発明は、アデノ随伴ウイルスベクターおよび
ウイルス粒子を使用して、細胞または動物にリボザイム構築物を送達または提供
する方法を提供する。
【0023】 (4.1 リボザイムのアデノ随伴ウイルス送達) 有用であるヒトゲノムプロジェクトによって作成された膨大な量のデータにつ
いて、同定された遺伝子の機能が推定されなければならず、そしてもし存在する
ならば、ヒト疾患におけるそれらの役割を確立しなければならない。しかし、現
在まで、50,000〜100,000個のヒト遺伝子のうちのわずか約6,0
00個しか、表現型と関連付けられていない。従って、疾患原因遺伝子の全スペ
クトルを詳細に示すこと、および病原性の機構を理解し、そして治療を開発する
ための動物モデルを作製することは、ヒト遺伝学の次の主要な努力目標である。
本発明は、ウイルスベクター化遺伝子治療とプロモーター制御リボザイムのツー
ルを組合せて、このような遺伝子を機能的に同定し、そして遺伝病の動物モデル
を作製する。リボザイムは、RNA酵素であり、これは、特定の遺伝子の発現を
ブロックする能力を有する。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、優性遺伝病の動
物モデルにおける治療としてリボザイムを送達するために、首尾良く用いられて
きた。本発明は、このアプローチを、実験動物において疾患を作製し、従って、
疾患の動物モデルを確立するために拡張する。AAV−リボザイムアプローチは
、胚の致死の問題、および現在の遺伝子破壊ストラテジーで典型的な小動物への
制限の問題を回避しつつ、体細胞性遺伝子ノックアウトの作製を可能にする。
【0024】 100を超える遺伝子座が、ヒトにおける網膜疾患と連鎖している。当然のこ
とながら、いくつかは、網膜タンパク質について関連付けられた遺伝子であると
十分に証拠が示されているが、大半は、ヒト遺伝地図上の単純な区画である。さ
らに、いくつかの主要な網膜疾患(加齢性黄斑変性を含む)の遺伝的病因は、不
明である。加齢性黄斑変性は、70歳を超える3個体において1個体に罹患する
。特定の網膜細胞(光受容体および網膜色素上皮を含む)において高度に発現さ
れる遺伝子のクローンを含む、ディファレンシャルディスプレイライブラリーお
よび発現配列タグライブラリーが利用可能である。これらの高度に発現される遺
伝子の中でどれが網膜機能に必要とされ得るかを同定するために、ハンマーヘッ
ド型およびヘアピン型リボザイムが、コードするメッセンジャーRNA分子を切
断するために設計されている。次いで、どれが網膜退化へと導くかを決定するた
めに、AAVを使用して、これらを実験動物に送達する。
【0025】 それぞれp53およびRb遺伝子によって特徴付けられる2つの主要な遺伝的
経路における変異によって、癌に関連する無秩序な細胞分裂へと導かれることが
実証された。関連した(そしておそらく、これらの経路とは独立した)他の遺伝
子もまた、腫瘍細胞の複製および拡散の制御に関与し得る。部分的に無作為化さ
れた標的ドメインを含むリボザイムのライブラリーを、特定の組織に送達し、予
め同定されていない癌抑制遺伝子の発現における欠損に起因して腫瘍化し易い動
物を作製した。次いで、これらのリボザイムに基づいた配列タグを使用して、潜
在的癌抑制遺伝子を同定し、そしてクローン化した。
【0026】 (4.2 リボザイム) 伝統的に、タンパク質は、核酸の触媒のために使用されてきたが、別のクラス
の高分子が、この試みにおいて有用であるとして明らかにされた。リボザイムは
、RNA−タンパク質複合体であり、これは部位特異的様式で核酸を切断する。
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特定の触媒ドメインを有する
(KimおよびCech、1987;Gerlachら、1987;Forst
erおよびSymons、1987)。例えば、多数のリボザイムが、高い程度
の特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基
質中のいくつかのリン酸エステルのうちのわずか1つを切断する(Cechら、
1981;MichelおよびWesthof、1990;Reinhold−
HurekおよびShub、1992)。この特異性は、化学反応の前のリボザ
イムの内部ガイド配列(internal guide sequence)(
「IGS」)に対する特異的塩基対形成相互作用を介して、基質に結合する必要
条件に起因している。
【0027】 リボザイム触媒は、本来、核酸が関与する配列特異的切断/連結反応の一部と
して観察された(Joyce,1989;Cechら、1981)。例えば、米
国特許第5,354,855号(特に、本明細書中で参考として援用される)は
、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼよりも大きな配列特異性、およ
びDNA制限酵素にほぼ等しい配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作
用し得ることを報告する。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻
害は、治療的適用に特に適切であり得る(Scanlonら、1991;Sar
verら、1990)。最近、リボザイムが、適用されたいくつかの細胞株にお
ける遺伝的変化を誘発することが報告された;変化した遺伝子は、癌遺伝子H−
ras、c−fosおよびHIV遺伝子を含んだ。この研究の大半は、特定のリ
ボザイムによって切断される特定の変異コドンに基づいた、標的mRNAの改変
に関与した。
【0028】 天然に存在する酵素的RNAの6つの基本的な多様性が現在公知である。各々
は、生理学的条件下で、トランスでRNAホスホジエステル結合の加水分解を触
媒し得る(従って、他のRNA分子を切断し得る)。一般的に、酵素的核酸は、
標的RNAに第一に結合することによって作用する。このような結合は、酵素的
核酸の標的結合部分を介して生じ、このような部分は、標的RNAを切断するよ
うに作用する分子の酵素的部分に非常に近接して保持される。従って、酵素的核
酸は、相補的塩基対形成を介して、標的RNAを第一に認識し、次いでこの標的
RNAを結合する。そして、一旦正しい部位に結合すると、標的RNAを切断す
るように、酵素的に作用する。このような標的RNAの巧みな切断は、コードタ
ンパク質の合成を指向する能力を破壊する。酵素的核酸が、そのRNA標的を結
合し、そして切断した後、このRNAから解離して、別の標的を探し、そして新
規の標的を繰り返し結合し、そして切断し得る。
【0029】 リボザイムの酵素的性質は、多くの技術に渡って有利である(例えば、アンチ
センス技術(核酸分子が、核酸標的に単に結合して、その翻訳をブロックする場
合))。なぜなら、治療的処置に影響を及ぼすために必要なリボザイムの濃度が
、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は、
リボザイムの酵素的に作用する能力を反映する。従って、1つのリボザイム分子
が、多くの標的RNA分子を切断し得る。さらに、リボザイムは、非常に特異的
なインヒビターであり、阻害の特異性は、標的RNAに結合する塩基対形成機構
に依存するばかりでなく、標的RNA切断の機構にも依存する。切断部位付近の
1つのミスマッチまたは塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除し得る
。アンチセンス分子の類似のミスマッチは、この作用を妨げない(Woolfら
、1992)。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じRNA部位を結合す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性よりも大きい。
【0030】 酵素的核酸分子は、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グルー
プIイントロンまたはRNaseP RNA(RNAガイド配列と関連して)あ
るいはNeurospora VS RNAモチーフに形成され得る。ハンマー
ヘッドモチーフの例は、Rossiら(1992)によって記載される。ヘアピ
ンモチーフの例は、Hampelら(欧州特許出願公開番号EP0360257
)、HampelおよびTritz(1989)、Hampelら(1990)
ならびに米国特許第5,631,359号(特に、本明細書中で参考として援用
される)によって記載される。デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、Perro
ttaおよびBeen(1992)によって記載され;RNasePモチーフの
例は、Guerrier−Takadaら(1983)によって記載され;Ne
urospora VS RNAリボザイムモチーフは、Collins(Sa
villeおよびCollins,1990;SavilleおよびColli
ns,1991;CollinsおよびOlive,1993)によって記載さ
れ;そしてグループIイントロンの例は、米国特許第4,987,071号(特
に、本明細書中で参考として援用される)に記載される。本発明の酵素的核酸分
子に重要なものすべては、1つ以上の標的遺伝子RNA領域に相補的である、特
異的基質結合部位を有するものであり、そして分子にRNA切断活性を付与する
基質結合部位の内部または周囲にヌクレオチド配列を有するものである。従って
、リボザイム構築物は、本明細書中で言及される特定のモチーフに限定される必
要はない。
【0031】 特定の実施形態において、所望の標的のRNA(例えば、本明細書中で開示さ
れる配列のうちの1つ)について高度の特異性を示す酵素的切断因子を産生する
ことが重要であり得る。酵素的核酸分子は、好ましくは、標的mRNAの高度に
保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素的核酸分子は、必要
とされるような特定の細胞に外因的に送達され得るが、好ましい実施形態におい
て、リボザイムは、特定の細胞に送達されるDNAベクターまたはRNAベクタ
ーから発現される。
【0032】 小さい酵素的核酸モチーフ(例えば、ハンマーヘッド構造のモチーフまたはヘ
アピン構造のモチーフ)がまた、外因性送達のために使用され得る。これらの分
子の単純な構造は、酵素的核酸のmRNA構造の標的化領域に侵入する能力を増
大する。あるいは、触媒RNA分子は、真核生物プロモーターから細胞内部に発
現され得る(例えば、Scanlonら、1991;Kashani−Sabe
tら、1992;Dropulicら、1992;Weerasingheら、
1991;Ojwangら、1992;Chenら、1992;Sarverら
、1990)。当業者は、任意のリボザイムが、適切なDNAベクターから真核
生物細胞において発現され得ることを理解する。このようなリボザイムの活性は
、第二のリボザイムによる一次転写物からの放出によって増強され得る(国際特
許出願公開番号WO 93/23569および国際特許出願公開番号WO 94
/02595、これらの両方は、本明細書によって参考として援用される;Oh
kawaら、1992;Tairaら、1991;およびVenturaら、1
993)。
【0033】 リボザイムは、直接添加され得るか、または陽イオン性脂質と複合体化され得
るか(脂質複合体)、リポソーム内部にパッケージされるか、あるいはそうでな
ければ標的細胞に送達され得る。RNAまたはRNA複合体は、その生体高分子
への取り込みを伴うかまたは伴わずに、注入、エアロゾル吸入、注入ポンプまた
はステントを介して、エキソビボまたはインビボで、関連する組織へ局所的に投
与され得る。
【0034】 リボザイムは、国際特許出願公開番号WO 93/23569および国際特許
出願公開番号WO 94/02595(各々は、特に、本明細書中で参考として
援用される)に記載されるように設計され得、そして記載されるように、インビ
トロおよびインビボで試験されるように合成され得る。このようなリボザイムは
また、送達に最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種にお
いて等価なRNA標的物が、必要な場合に利用され得ることを認識する。
【0035】 ハンマーヘッド型リボザイムまたはヘアピン型リボザイムは、本明細書中に記
載のように、このリボザイム配列が適切な二次構造にフォールドしているか否か
を評価するために、コンピューターフォールディング(Jaegerら、198
9)により個々に分析され得る。結合アームと触媒コアとの間の好ましくない分
子内相互作用を有するリボザイムは、考慮から排除される。種々の結合アーム長
が、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくと
も5などの塩基が、標的RNAと結合し得るか、または他の様式で相互作用し得
る。
【0036】 ハンマーヘッド型モチーフまたはヘアピン型モチーフのリボザイムは、mRN
Aメッセージにおける種々の部位にアニーリングするために設計され得、そして
化学的に合成され得る。使用される合成方法は、Usmanら(1987)およ
びScaringeら(1990)に記載されるような通常のRNA合成のため
の手順に従い、そして通常の核酸保護基およびカップリング基(例えば、5’末
端のジメトキシトリチルおよび3’末端のホスホロアミダイト)を利用する。段
階ごとの平均のカップリング収率は、代表的に98%より高い。ヘアピン型リボ
ザイムは、2つの部分で合成され得、そしてアニーリングされて、活性リボザイ
ムを再構築し得る(ChowriraおよびBurke、1992)。リボザイ
ムは、広範にわたって改変されて、ヌクレアーゼ耐性基(例えば、2’−アミノ
、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−o−メチル、2’−H)での改変
により、安定性を増強し得る(総説については、例えば、UsmanおよびCe
dergren、1992を参照のこと)。リボザイムは、一般的な方法を使用
するゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーおよび水への再懸濁によ
り、精製され得る。
【0037】 リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させること、または血
清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する改変(例えば、国際特許出願
公開WO92/07065;Perraultら、1990;Piekenら、
1991;UsmanおよびCedergren、1992;国際特許出願公開
WO93/15187;国際特許出願公開WO91/03162;欧州特許出願
公開番号92110298.4;米国特許第5,334,711号;ならびに国
際特許出願公開WO94/13688を参照のこと。これらは、酵素RNA分子
の糖部分になされ得る種々の化学修飾を記載する)、これらの細胞における効力
を増強する改変、ならびにRNA合成時間を短縮し、そして化学的要件を減少さ
せるための、幹II塩基の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによ
り、最適化され得る。
【0038】 高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する好ましい手段は、リボザイムコード配
列をDNA発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核
生物のRNAポリメラーゼI(pol I)、RNAポリメラーゼII(pol
II)、またはRNAポリメラーゼIII(pol III)のためのプロモ
ーターにより駆動される。pol IIプロモーターまたはpol IIIプロ
モーターからの転写物は、全ての細胞内で高濃度で発現される;所定の細胞型に
おける所定のpol IIプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節
配列(エンハンサー、サイレンサーなど)の性質に依存する。原核生物のRNA
ポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物RNAポリメ
ラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される(Elroy−Steinおよび
Moss、1990;GaoおよびHuang、1993;Lieberら、1
993;Zhouら、1990)。このようなプロモーターから発現するリボザ
イムは、哺乳動物細胞において機能し得る(Kashani−Sabetら、1
992;Ojwangら、1992;Chenら、1992;Yuら、1993
;L’Huillierら、1992;Lisziewiczら、1993)。
本発明のリボザイム構築物をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込むことが好ま
しいが、このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベ
クター(プラスミドDNAベクター、他のウイルスDNAベクター(例えば、ア
デノウイルスベクター)、またはウイルスRNAベクター(例えば、レトロウイ
ルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスベクター)が挙げられるがこ
れらに限定されない)に組み込まれ得る。
【0039】 Sullivanら(国際特許出願公開WO 94/02595)は、酵素R
NA分子の送達のための一般的方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の
種々の方法により、細胞に投与され得、これには、リポソームへのカプセル化、
イオン導入、または他のビヒクル(例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、
生分解性ナノカプセル、および生物接着性ミクロスフィア)への取り込みが挙げ
られるが、これらに限定されない。いくつかの指標のために、リボザイムは、上
記ビヒクルありまたはなしで、細胞または組織にエキソビボで直接送達され得る
。あるいは、RNA/ビヒクルの組合せは、直接の吸入、直接の注入、またはカ
テーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により、局所的に送達され得る。
他の送達経路としては、脈管内、筋内、皮下または関節注射、エアロゾル吸入、
経口(錠剤または丸剤の形態)、局所、全身、眼、腹腔内および/または鞘内の
送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムの送達および投与のさ
らに詳細な記載は、国際特許出願公開WO94/02595および国際特許出願
公開WO93/23569(各々が特に本明細書中に参考として援用される)に
提供される。
【0040】 本発明のリボザイムを使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行に
おける特定の遺伝子産物の役割(必須性)を規定し得る。この様式で、他の遺伝
子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、組
合せ治療の可能性(例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知
の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび/また
は他の化学分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置)を提供するこ
とにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。
【0041】 (4.3 プロモーターおよびエンハンサー) 組換えベクターは、本発明の重要な局面を形成する。用語「発現ベクターまた
は構築物」とは、核酸コード配列の一部または全てが転写され得る、核酸を含む
任意の型の遺伝子構築物を意味する。好ましい実施形態において、発現は、例え
ばリボザイム構築物を生成するための、核酸の転写のみを含む。
【0042】 特に有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御
下に位置するベクターであることが、意図される。「プロモーター」とは、遺伝
子の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構または導入された合成機
構により認識される、DNA配列をいう。句「作動可能に配置された」「制御下
」または「転写制御下」とは、そのプロモーターが、遺伝子のRNAポリメラー
ゼ開始および発現を制御するための核酸に関して、正確な位置および方向にある
ことを意味する。
【0043】 好ましい実施形態において、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制
御下にコードDNAを配置することにより特定の利点が得られることが、意図さ
れる。本明細書中で使用される場合、組換えプロモーターまたは異種プロモータ
ーは、その天然の環境ではリボザイム構築物と通常には関係しないプロモーター
をいうことが、意図される。このようなプロモーターは、他の遺伝子と通常は関
係しているプロモーター、および/または他の任意の細菌細胞、ウイルス細胞、
真核生物細胞、または哺乳動物細胞から単離されたプロモーターが、挙げられ得
る。
【0044】 本来、発現のために選択された細胞型、生物、または動物中さえ、そのDNA
セグメントの発現を有効に指令するプロモーターを使用することが重要である。
タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型の組み合わせの使用は、一般的に
、分子生物学の当業者には周知であり、例えば、Sambrookら(1989
)(本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。使用されるプロモータ
ーは、構成的であってもまたは誘導性であってもよく、そして導入されたDNA
セグメントの高レベル発現を指令するに適切な条件下で使用され得る。
【0045】 プロモーター中の少なくとも1つのモジュールが、RNA合成のために開始部
位を位置決めするように機能する。このことの公知の最良の例は、TATAボッ
クスであるが、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーター(例えば、哺乳
動物末端ジオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモー
ター、およびSV40後期遺伝子についてのプロモーター)において、開始部位
自体の上にある別のエレメントが、開始位置を定めるのを補助する。
【0046】 さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。代表的には
、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロ
モーターが、開始部位の下流に機能的エレメントも含むことが示されている。プ
ロモーターエレメント間の間隔はしばしば融通がきき、その結果、プロモーター
機能が、エレメントが互いに対して逆点しているかまたは移動している場合に保
存される。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活
性が減少しはじめる前に、50bp離れるように増加され得る。そのプロモータ
ーに依存して、個々のエレメントは、同時作動的にかまたは独立してかのいずれ
かで、転写を活性化するように機能し得るようである。
【0047】 核酸の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的と
なる細胞中で核酸を発現し得る限り、重要であるとは考えられない。従って、ヒ
ト細胞が標的である場合、ヒト細胞中で発現され得るプロモーターに隣接しかつ
そのプロモーターの制御下にある核酸コード領域を配置することが、好ましい。
一般的に言うと、このようなプロモーターとしては、ヒトまたはウイルスいずれ
かのプロモーター(例えば、CMVプロモーターまたはHSVプロモーター)が
挙げられ得る。本発明の特定の局面において、テトラサイクリンに制御されるプ
ロモーターが、意図される。
【0048】 種々の他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺
伝子プロモーター、SV40初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス長末端
反復が、導入遺伝子の高レベル発現を得るために使用され得る。導入遺伝子の発
現を達成することが当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳
動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた意図される
が、ただし、発現のレベルが所定の目的に十分である場合である。下記表1およ
び表2は、本発明の状況において、本発明のリボザイム構築物の発現を制御する
ために使用され得るいくつかのエレメント/プロモーターを列挙する。この列挙
は、導入遺伝子発現の促進に関与する可能なエレメントすべてを網羅することは
意図されず、単にその例示であることが意図される。
【0049】 エンハンサーは、DNAの同じ分子上の異なる位置に位置するプロモーターか
らの転写を増強した遺伝エレメントとして元々検出された。大きな距離を超えて
作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究において、ほとんど先例を
有さなかった。後の研究によって、エンハンサー活性を有するDNAの領域が、
プロモーターのようにたくさん組織化されていることが示された。すなわち、そ
れらは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、1つ以上の転写タ
ンパク質に結合する。
【0050】 エンハンサーとプロモーターとの間の基本的差異は、作動可能であることであ
る。エンハンサー領域は全体として、離れて転写を刺激し得なければならない;
この必要は、プロモーター領域またはその構成成分エレメントには当てはまらな
い。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向でのRNA合成の開始
を指令する1つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこ
れらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複および
連続し、しばしば、非常に類似するモジュラー組成を有するようである。
【0051】 さらなる任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせが(Eukaryo
tic Promoter Data Base、EPDBによる)もまた、発
現を駆動するために使用され得る。T3、T7またはSP6細胞質発現系の使用
が、別の可能な実施形態である。真核生物は、特定のプロモーターからの細胞質
転写を、その適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部またはさらなる遺伝子
発現構築物のいずれかとして提供されている場合に、支持し得る。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】 本明細書中で使用される場合、用語「操作された」および「組換え」細胞とは
、外因性DNAセグメント(例えば、リボザイムの転写を導くDNAセグメント
)が導入された細胞を言及することが意図される。従って、操作された細胞は、
組換え導入された外因性DNAセグメントを含まない、天然に存在する細胞とは
区別される。従って、操作された細胞は、人間の手を介して導入されたDNAセ
グメントを有する細胞である。
【0054】 本発明に従ってリボザイムを発現させるために、1以上のプロモーターの制御
下のリボザイムコード核酸を含む、発現ベクターを調製する。配列をプロモータ
ーの「制御下」に置くとは、転写されるオープンリーディングフレームの転写開
始部位の5’末端側に位置付けることであり、これは、一般に、その選択された
プロモーターの約1〜約50ヌクレオチド「下流」(すなわち、3’側)である
。この「上流」のプロモーターは、このDNAの転写を刺激し、そのコードされ
るリボザイムの発現を促進する。これは、この状況下で「組換え発現」を意味す
る。
【0055】 (4.4 アデノ随伴ウイルス(AAV)) アデノ随伴ウイルス(AAV)は、遺伝子移入に特に魅力的である。なぜなら
、これは、いかなる病原性応答をも誘導せず、そして宿主細胞染色体に組み込み
得るからである(Kotinら、1990)。これらのAAV末端反復(TR)
は、染色体組み込みのための、ただ1つの必須のシス作用性成分(cis−co
mponent)である(MuzyczkaおよびMclaughin、198
8)。これらのTRは、プロモーター活性を有することが報告されている(Fl
otteら、1993)。これらは、細胞質から核への効率的な遺伝子移入を促
進し得るか、またはプラスミドDNAの安定性を増加し、そしてより長期間継続
性の遺伝子発現を可能にし得る(Bartlettら、1996)。AAV T
Rを含む組換えプラスミドDNAを使用する研究は、かなりの関心を引き寄せた
。AAVベースのプラスミドは、ほとんどの細胞型において、AAVのTRを欠
失している同じプラスミドよりも、より高度かつ長期の導入遺伝子発現を駆動す
ることが示されている(Philipら、1994;Shafronら、199
8;Wangら、1999)。
【0056】 AAV(Ridgeway、1998;HermonatおよびMuzycz
ka、1984)は、パルボウイルスであり、アデノウイルス株の夾雑物として
発見された。これは、いかなる疾患にも関連しない遍在性のウイルスである(抗
体は、米国人口の85%中に存在する)。その複製が、ヘルパーウイルス(例え
ば、アデノウイルス)の存在に依存することから、デペンド(依存)ウイルスと
しても分類される。5つの血清型が単離されており、なかでも、AAV−2が、
特に特徴付けられている。AAVは、一本鎖の直鎖状DNAであり、これは、キ
ャプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3内にキャプシド化され、20〜
24nm直径の正二十面体ビリオンを形成する(MuzyczkaおよびMcL
aughlin、1988)。
【0057】 AAV DNAは、約4.7キロベース長である。これは、2つのオープンリ
ーディングフレームを含み、2つのITRによって隣接されている。AAVゲノ
ム中には、以下の2つの主要な遺伝子が存在する:repおよびcap。rep
遺伝子は、ウイルス複製を担うタンパク質をコードし、一方、cap遺伝子は、
キャプシドタンパク質VP1〜3をコードする。各ITRは、T字型のヘアピン
構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みのための、AAVのただ
1つの必須のシス作用性成分である。従って、AAVは、全てのウイルスコード
配列が除去され、そして送達する遺伝子のカセットで置換されたベクターとして
使用され得る。3つのウイルスプロモーターが同定されており、それらの地図位
置に従って、p5、p19およびp40と命名されている。p5およびp19か
らの転写は、repタンパク質の産生を生じ、そしてp40からの転写は、キャ
プシドタンパク質を生じる(HermonatおよびMuzyczka、198
4)。
【0058】 rAAVを発現ベクターとして使用する可能性の研究を研究者に促す、いくつ
かの要因が存在する。1つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達するた
めの要件が、非常に少ないことである。145bpのITRを有することが必要
であるが、これは、AAVゲノムのたった6%である。このことは、このベクタ
ー中に、4.5kdのDNA挿入物を構築するための余地を残す。この保持能力
は、AAVに大きい遺伝子を送達することを妨げるかもしれないが、本発明のア
ンチセンス構築物を送達するためには、十分に適している。
【0059】 AAVはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルとしての1つの良い選択
肢である。野生型アデノウイルスだけでなく、AAV遺伝子もまたrAAVを動
員するために必要であるという、比較的複雑な補助機構が存在する。同様に、A
AVは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード
配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫応答を最小化し、そして従って
、rAAVは、炎症応答を誘発しない。従って、AAVは、本発明のハンマーヘ
ッドリボザイム構築物の送達に理想的な候補体であることを示す。
【0060】 (4.5 薬学的組成物およびキット) 本発明の薬学的組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒
体中に溶解または分散された、アデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれた、有
効量の少なくとも第1のリボザイムまたはリボザイムライブラリー、あるいは、
少なくとも第1のリボザイムまたはリボザイムライブラリーを含有する、有効量
のアデノ随伴ウイルス粒子を含む。
【0061】 句「薬学的または薬理学的に受容可能」とは、適切には、哺乳動物(または、
ヒト)に投与された場合に、有害な、アレルギー性または他の都合の悪い反応を
生じない、分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「薬学
的に受容可能なキャリア」とは、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティン
グ、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活
性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。
任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と適合性でない場合を除いて、治療組
成物におけるそれらの使用が、意図される。補助的な活性成分もまた、組成物中
に組み込まれ得る。
【0062】 (4.5.1 非経口処方物) 本発明の薬剤は、しばしば、非経口投与のために処方され、例えば、静脈内経
路、筋内経路、皮下経路または他のこのような経路を介する注射用に処方される
。1以上の薬剤(例えば、リボザイム、リボザイムライブラリー、あるいはリボ
ザイムまたはリボザイムライブラリーを含むアデノ随伴ウイルス)を含む水性組
成物の調製は、現在の開示を考慮して当業者に周知である。代表的に、このよう
な組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製され
得;注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な、
固体形態もまた調製され得;そしてこれらの調製物はまた、乳化され得る。
【0063】 遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活
性剤(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース)と適切に混合された水中で調製
され得る。分散液(dispersion)もまた、グリセロール、液体ポリエ
チレングリコールおよびそれらの混合物、ならびにオイル中に調製され得る。保
存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するた
めに保存剤を含む。
【0064】 注射剤用途に適切な薬学的形態としては、以下が挙げられる:滅菌の水溶液ま
たは分散液;ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む処方
物;ならびに滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末。全ての
場合において、この形態は、滅菌であるべきであり、かつ容易に注射可能な程度
の流体であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定であるべきで
あり、かつ微生物(例えば、細菌および真菌)の混入作用を防止されるべきであ
る。
【0065】 本発明の薬剤を含む組成物は、中性または塩形態の組成物に処方され得る。薬
学的に受容可能な塩としては、酸付加塩、ならびに無機酸(例えば、塩酸または
リン酸)および有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など)で
形成された塩が挙げられる。塩はまた、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄(I
II))または有機塩基(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒ
スチジン、プロカインなど)から誘導され得る。
【0066】 キャリアはまた、溶媒または分散媒体であり得、これらには、例えば、水、エ
タノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および
液体ポリエチレングリコールなど)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、それ
らの適切な混合物、および植物油が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コー
ティング(例えば、レシチン)の使用、分散液の場合において必要とされる粒子
サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物作用の
防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、
フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど)によって引き起こされ得る。多く
の場合において、等張剤(例えば、糖または塩化ナトリウム)を含むことが好ま
しい。注射用組成物の長期の吸収は、その組成物における吸収を遅延する薬剤(
例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)の使用によって引き起
こされ得る。
【0067】 滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後、
濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、種々の滅菌した活
性成分を滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製され、このビヒクルは、基
本となる(basic)分散媒体および上記に列挙された成分からの他の必要と
される成分を含む。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ま
しい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、予め滅菌濾過
した活性成分の溶液から、活性成分の粉末および任意のさらなる所望の成分を生
じる。
【0068】 処方に際して、溶液は、投薬処方物に適合性の様式かつ生物学的または治療的
に有効な量で、投与され得る。処方物は、種々の投薬形態(例えば、上記の注射
用溶液の型)で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた、使用され得
る。
【0069】 本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または
賦形剤(例えば、滅菌水溶液)と混合された、意図される用途に依存して最終濃
度の範囲を与えるように、ある量の1以上の本発明の薬剤を含む。調製の技術は
、一般に、当該分野で周知であり、例えば、Remington’s Phar
maceutical Sciences,第16版、Mack Publis
hing Company,1980(参考として本明細書中に援用される)に
例示される。内毒素の混入は、安全なレベルで最小に(例えば、0.5ng/m
gタンパク質)維持されることが理解されるべきである。さらに、ヒト投与のた
めに、調製物は、FDA Office of Biological Sta
ndardsに要求される、滅菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準
を満たすべきである。
【0070】 非経口投与(例えば、静脈内注射および筋内注射)のために処方される化合物
に加えて、例えば、以下の他の薬学的に受容可能な形態もまた意図される:経口
投与のための錠剤または他の固体、時限放出性カプセル、リポソーム形態など。
他の薬学的処方物もまた、処置される状態に依存して使用され得る。もちろん、
このような状態についての最適な投薬量を決定するための方法は、本明細書の観
点および当業者の知識から、当業者に明らかである。
【0071】 本発明の薬剤を操作して、それらの薬剤により長いインビボ半減期を提供する
ことから、特定の利点が得られることが意図される。徐放性処方物は、一般に、
長期にわたって一定の薬物レベルを与えるように設計される。薬物(例えば、本
発明の薬剤)の半減期を増加することは、投与の際に高い細胞内濃度を生じるこ
とを意図され、そのレベルは、長期間維持されるが、一般に、その構築物の薬物
動態学に依存して減衰する。
【0072】 (4.5.2 治療用キット) 本発明はまた、本明細書中に記載の本発明の薬剤を含む治療用キットを提供す
る。このようなキットは、一般に、適切な容器中に、本発明に従う、少なくとも
第1のリボザイム、リボザイムライブラリー、あるいは少なくとも第1のリボザ
イムまたはリボザイムライブラリーを含有するアデノ随伴ウイルス粒子の薬学的
に受容可能な処方物を備える。これらのキットはまた、他の薬学的に受容可能な
処方物を備える。
【0073】 キットは、薬剤を含む(任意のさらなる成分を含むか、または含まない)単一
の容器を有し得るか、または各所望の薬剤について別個の容器手段を有し得る。
このようなキットにおいて、成分は、等モル量の組み合わせで、または一方の成
分が他方の成分よりも過剰に存在して、予め混合され得るか;あるいは、キット
の各成分が、患者への投与前に、別個の容器に別々に維持され得る。
【0074】 キットの成分が、1以上の液体溶液中で提供される場合、この液体溶液は、水
溶液であり、特に、滅菌水溶液が好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末
として提供されてもよい。試薬または成分が、乾燥粉末として提供される場合、
この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒はまた、別の
容器手段中に提供され得ることが理解される。キットの成分の1つは、経口投与
用のカプセル剤で提供されてもよい。
【0075】 キットの容器手段は、一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ
、ビン、シリンジまたは他の容器手段を含み得、これらの中に、リボザイム、リ
ボザイムライブラリー、あるいはリボザイムまたはリボザイムライブラリーを含
有するアデノ随伴ウイルス粒子、および任意の他の所望の薬剤を配置し得、そし
て好ましくは、適切に分量化されている。さらなる成分が含まれる場合、一般に
、このキットはまた、これらが配置される第2のバイアルまたは他の容器を備え
得、別々に設計された用量の投与を可能にする。これらのキットはまた、滅菌の
薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための、第2/第3の容器手
段を備え得る。
【0076】 キットはまた、リボザイム、リボザイムライブラリー、あるいはリボザイムま
たはリボザイムライブラリーを含有するアデノ随伴ウイルス粒子を、動物または
患者に投与するための手段(例えば、1以上の針または注射器、あるいは点眼器
、ピペット、または他のこのような装置)を備え得、それらから、処方物が、動
物に注入され得るか、または体の疾患領域に適用され得る。本発明のキットはま
た、代表的に、バイアルなど、および他の成分を市販用に厳重に拘束して含むた
めの手段(例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器)を含み、
この中に、所望のバイアルおよび他の装置が、配置および保持される。
【0077】 (4.6 変異誘発) 部位特異的変異誘発は、DNAに1以上のヌクレオチド配列変化を導入するこ
とによって、配列改変体を調製および試験するのに有用な技術である。部位特異
的変異誘発は、特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を介して、変異体の生成を
可能にし、このオリゴヌクレオチド配列は、所望の変異のDNA配列、および十
分な数の隣接ヌクレオチドをコードし、この隣接ヌクレオチドは、交差される欠
失交差部上の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分はサイズおよび配列複雑性
のプライマー配列を提供する。代表的に、約17〜25ヌクレオチド長のプライ
マーが好ましく、その変更される配列の交差部の両側に約5〜10残基を含む。
【0078】 一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知である。理解されるよ
うに、この技術は、代表的に、一本鎖および二本鎖の両方の形態で存在するバク
テリオファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発に有用な代表的なベク
ターとしては、M13ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファー
ジベクターは、市販されており、そしてそれらの使用は、一般に、当業者に周知
である。二本鎖プラスミドもまた、部位特異的変異誘発に慣用的に使用され、こ
れは、ファージからプラスミドへの目的の遺伝子の転移工程を排除する。
【0079】 一般に、部位特異的変異誘発は、最初に、一本鎖ベクターを得る工程、すなわ
ち二本鎖ベクターの2つの鎖を融解する工程によって実施される。この二本鎖ベ
クターは、その配列内に、所望のリボザイムをコードするDNA配列または他の
核酸構築物を含む。この所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、合成的に調製する。次いで、このプライマーを、この一本鎖DNA調製物
にアニーリングさせ、そしてDNA重合化酵素(例えば、E.coliポリメラ
ーゼIクレノウフラグメント)に供し、変異保有鎖の合成を完了する。従って、
1つの鎖が、元の非変異配列をコードし、第2の鎖が、所望の変異を保有する、
ヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、適
切な細胞(例えば、E.coli細胞)を形質転換し、そしてこの変異配列の配
列を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【0080】 部位特異的変異誘発を使用する、選択されたリボザイムの配列改変体の調製は
、潜在的に有用な種を生成する手段として提供され、かつ配列改変体が得られ得
る他の方法が存在するように、限定されることを意図されない。例えば、所望の
遺伝子をコードする組換えベクターを、変異薬剤(例えば、ヒドロキシルアミン
)で処理し、配列改変体を獲得し得る。
【0081】 (4.7 核酸増幅) 核酸(増幅のためのテンプレートとして使用される)は、標準的な方法(Sa
mbrookら、1989)に従って、生物学的サンプルに含まれる細胞から単
離され得る。この核酸は、ゲノムDNAであってもよく、あるいは分画されたR
NAまたは全細胞RNAであってもよい。RNAが使用される場合、このRNA
を相補的DNAに変換することが所望され得る。1つの実施形態において、この
RNAは、全細胞RNAであり、そして増幅のためのテンプレートとして直接的
に使用される。
【0082】 リボザイムまたは保存された隣接領域に対応する核酸に選択的にハイブリダイ
ズするプライマー対を、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、
この単離された核酸に接触させる。本明細書中で定義される場合、用語「プライ
マー」は、テンプレート依存性のプロセスにおいて、新生の核酸の合成を開始し
得る、任意の核酸を包含することが意味される。代表的に、プライマーは、10
〜24塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が、使用され得る
。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供されるが、二本鎖形態が好
ましい。
【0083】 一旦ハイブリダイズされると、この核酸:プライマー複合体に、テンプレート
依存性の核酸合成を促進する1以上の酵素を接触させる。「サイクル」とも呼ば
れる、複数回の増幅を、十分量の増幅産物が生成されるまで実施する。
【0084】 次に、この増幅産物を検出する。特定の適用において、検出は、可視的手段に
よって行われ得る。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれた放射標識の放射
活性シンチグラフィー、または蛍光標識を介するか、あるいは電気パルスシグナ
ルまたは熱パルスシグナルを使用する系(Affymax技術)を介する、その
産物の間接的な同定を含み得る。
【0085】 多くのテンプレート依存性プロセスが、所定のテンプレートサンプル中に存在
するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も知られている増幅方法
の1つは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCRTMともまた呼ばれる)であり、これは
、米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号および米
国特許第4,800,159号(これらの各々は、その全体が参考として本明細
書中に援用される)に詳細に記載される。
【0086】 手短に言うと、PCRTMにおいて、このマーカー配列の相対する相補鎖上の領
域に相補的な、2つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド
三リン酸を、DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)と共に反応混
合物に添加する。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、このプライマーが
マーカーに結合し、そしてポリメラーゼが、このプライマーを、ヌクレオチドを
付加することによって、このマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合物の温
度を上昇または低下させることによって、伸長されたプライマーが、マーカーか
ら解離して反応産物を形成し、過剰なプライマーが、そのマーカーおよび反応産
物に結合し、そしてこのプロセスが繰り返される。
【0087】 逆転写酵素PCRTM増幅手段は、増幅されたmRNAの量を定量するために行
われ得る。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、そしてSambr
ookら(1989)に記載される。逆転写の代替的方法は、熱安定性のRNA
依存性DNAポリメラーゼを使用する。これらの方法は、国際特許出願公開番号
WO90/07641(参考として本明細書中に詳細に援用される)に記載され
る。ポリメラーゼ連鎖反応方法は、当該分野で周知である。
【0088】 増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応(「LCR」)であり、これは、
EPA320,308(その全体が参考として本明細書中に援用される)に開示
される。LCRにおいて、2つの相補的プローブ対を調製し、そして標的配列の
存在下で、各対が、標的の相対する相補鎖にそれらが隣接するように結合する。
リガーゼの存在下で、この2つのプローブ対は連結して、単一のユニットを形成
する。PCRTMのような温度サイクリングによって、結合した連結ユニットが、
標的から解離し、次いで、過剰なプローブ対の連結のための「標的配列」として
作用する。米国特許第4,883,750号は、プローブ対を標的配列に結合す
るためのLCRに類似する方法を記載する。
【0089】 Qβレプリカーゼ(QβR)(国際特許出願番号PCT/US87/0088
0(参考として本明細書中に援用される)に記載される)もまた、本発明におけ
る、なお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的RNAの複
製配列に相補的な領域を有するRNAの複製配列を、RNAポリメラーゼの存在
下でサンプルに添加する。このポリメラーゼは、この複製配列をコピーし、次い
で、これを検出し得る。
【0090】 等温性の増幅方法もまた、本発明の核酸増幅において有用であり得、ここでは
、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖にヌ
クレオチド5’−[α−チオ]−三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する。
【0091】 鎖置換増幅(SDA)(米国特許第5,455,166号、米国特許第5,6
48,211号、米国特許第5,712,124号および米国特許第5,744
,311号(各々は、参考として本明細書中に援用される))は、複数回の鎖の
置換および合成(すなわち、ニックトランスレーション)を含む、核酸の等温性
増幅を行う別の方法である。類似の方法(修復鎖反応(RCP)と呼ばれる)は
、増幅の標的領域にわたって、いくつかのプローブをアニーリングさせて、その
後、4塩基中のただ2塩基の存在下での修復反応を行う工程を包含する。他の2
つの塩基を、ビオチン化誘導体として付加させ、検出を容易にし得る。類似のア
プローチが、SDAにおいて使用される。標的特異的配列はまた、サイクリック
プローブ反応(CPR)を使用して検出される。CPRにおいて、非特異的DN
Aの3’および5’配列、ならびに特異的RNAの中間の配列を有するプローブ
を、サンプル中に存在するDNAにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーシ
ョンの際に、この反応を、RNase Hで処理し、そしてこのプローブの産物
を、消化後に放出される別個の産物として同定する。元のテンプレートは、別の
サイクリングプローブにアニーリングさせ、そして反応を繰り返す。
【0092】 なお別の増幅方法(GB出願番号2 202 328および国際特許出願番号
PCT/US89/01025(各々は、その全体が参考として本明細書中に援
用される)に記載される)が、本発明に従って使用され得る。前者の出願におい
て、「改変型プライマー」が、PCRTM様のテンプレート依存性かつ酵素依存性
の合成において使用される。これらのプライマーは、捕捉部分(例えば、ビオチ
ン)および/または検出部分(例えば、酵素)で標識することによって、改変さ
れ得る。後者の出願において、過剰の標識プローブをサンプルに添加する。標識
配列の存在下で、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的
配列はインタクトで放出され、過剰のプローブによって結合される。標識したプ
ローブの切断は、標的配列の存在をシグナル化する。
【0093】 他の核酸増幅手段としては、トランスポゾンベースの増幅系(TAS)が挙げ
られ、これらには、核酸配列ベースの増幅(NASBA)および3SR(Gin
grら、国際特許出願公開番号WO88/10315(参考として本明細書中に
援用される))が含まれる。NASBAにおいて、核酸は、標準的なフェノール
/クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、溶解緩衝液での処理、ならびにD
NAおよびRNAの単離のためのミニスピンカラムまたはRNAの塩化グアニジ
ン抽出によって、増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的
配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合化後、DN
A/RNAハイブリッドを、RNase Hで消化しながら、二本鎖DNA分子
を、再度熱変性させる。いずれの場合において、一本鎖DNAを、第2の標的特
異的プライマーの付加、および、その後の重合化によって完全に二本鎖にする。
次いで、この二本鎖DNA分子を、RNAポリメラーゼ(例えば、T7またはS
P6)によって多重転写(multiply transcribed)させる
。等温性サイクリック反応において、RNAを、一本鎖DNAに逆転写し、次い
で、このDNAを、二本鎖DNAに変換し、次いで、RNAポリメラーゼ(T7
またはSP6)でもう一回転写させる。この得られた産物(短縮型または完全型
のいずれに関わらず)は、標的特異的配列を示す。
【0094】 Daveyら、EPA番号329 822(その全体が本明細書中に参考とし
て援用される)は、一本鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNAおよび二本鎖
DNA(「dsDNA」)をサイクル合成する工程を包含する、核酸増幅プロセ
スを開示し、これは、本発明に従って使用され得る。このssRNAは、第1の
プライマーオリゴヌクレオチドのテンプレートであり、これらのプライマーは、
逆転写酵素(RNA依存性DNAポリメラーゼ)によって伸長される。次いで、
このRNAを、リボヌクレアーゼH(RNase H、DNAまたはRNAのい
ずれかとの二重鎖にあるRNAに特異的なRNase)の作用によって、得られ
たDNA:RNA二重鎖から除去する。この得られたssDNAは、第2のプラ
イマーのテンプレートであり、これらのプライマーはまた、このテンプレートの
相同体の5’側に、RNAポリメラーゼプロモーター(T7 RNAポリメラー
ゼによって例示される)の配列を含む。次いで、このプライマーを、DNAポリ
メラーゼ(E.coli DNAポリメラーゼIの大きい「クレノウ」フラグメ
ントによって例示される)によって伸長し、二本鎖DNA(「dsDNA」)分
子を生じ、これは、プライマー間で元のRNAの配列に同一の配列を有し、そし
て一端で、プロモーター配列をさらに有する。このプロモーター配列は、適切な
RNAポリメラーゼによって使用され、このDNAの多くのRNAコピーを作製
し得る。次いで、これらのコピーを、このサイクルに再導入し、非常に迅速な増
幅を導く。酵素を適切に選択して、この増幅は、各サイクルで酵素の添加するこ
となく、等温的に行われ得る。このプロセスのサイクリングの性質から、この開
始配列は、DNAまたはRNAのいずれの形態においても選択され得る。
【0095】 Millerら(国際特許出願公開番号WO89/06700(その全体が参
考として本明細書中に援用される)は、標的の一本鎖DNA(「ssDNA」)
へのプロモーター/プライマー配列のハイブリダイゼーション、その後の、この
配列の多くのRNAコピーの転写に基づく、核酸配列増幅スキームを開示する。
このスキームは、サイクル化されず、すなわち、新生のテンプレートが、得られ
たRNA転写物から生成されない。他の増幅方法としては、「RACE」および
「方側(one−sided)PCRTM」(Frohman、1990(参考と
して本明細書中に詳細に援用される))が挙げられる。
【0096】 2つ(以上の)オリゴヌクレオチドの、その得られた「二オリゴヌクレオチド
(di−oligonucleotide)」の配列を有する核酸の存在下での
連結に基づき、これによって、二オリゴヌクレオチドを増幅する方法もまた、本
発明の増幅工程において使用され得る。
【0097】 任意の増幅後、特異的増幅が生じたか否かを決定する目的のために、増幅産物
をテンプレートおよび過剰のプライマーから分離することが所望され得る。1つ
の実施形態において、増幅産物を、標準的な方法(例えば、Sambrookら
、1989)を使用して、アガロースゲル電気泳動、アガロース−アクリルアミ
ドゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。
【0098】 あるいは、クロマトグラフィー技術を用いて、分離を行い得る。多種のクロマ
トグラフィーが本発明において使用され得る:吸着、分配、イオン交換および分
子ふるい、ならびに多くのカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを含む技術を使用
するための特異化された技術。
【0099】 増幅産物をマーカー配列の増幅を確認するために、可視化しなければならない
。1つの代表的な可視化方法としては、エチジウムブロミドを用いたゲルの染色
およびUV光の下での可視化が挙げられる。あるいは、増幅産物が放射性標識ヌ
クレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドと一体化して標識されているならば、こ
の増幅産物は、分離後に適切な刺激スペクトルの下でx線フィルムに曝され得る
か、または可視化され得る。
【0100】 1つの実施形態において、可視化は間接的に行われる、増幅産物の分離後に、
標識された核酸プローブは、増殖したマーカー配列と接触される。このプローブ
は、放射性標識され得る以外は、好ましくは、色素原と結合体化され得る。別の
実施形態において、このプローブは、結合パートナー(例えば、抗体またはビオ
チン)と結合体化され、そして結合対の他のメンバーが検出可能な部分を有する
【0101】 1つの実施形態において、検出は、サザンブロッティングおよび標識プローブ
とのハイブリダイゼーションにより行われる。サザンブロッティングに関連する
技術は、当業者に周知であり、そして分子プロトコルに関する多くの標準的書籍
により見出され得る。Sambrooksら、1989を参照のこと。簡潔には
、増幅産物は、ゲル電気泳動により分離される。次いで、このゲルを膜(例えば
、ニトロセルロース)と接触させ、核酸の転写および非共有結合を可能にする。
続いて、この膜を、標的増幅産物とハイブリダイズし得る色素原結合体化プロー
ブとともにインキュベートする。検出をx線フィルムまたはイオン放射検出デバ
イスに膜を曝すことにより行う。
【0102】 前述の1つの例は、本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,27
9,721号に記載される。この米国特許は、自動化された電気泳動および核酸
の転写のための装置および方法を開示する。この装置は、ゲルの外部操作なしで
電気泳動およびブロッティングを可能にし、そして本発明に従う方法を行うため
に理想的に適している。
【0103】 (5.0 実施例) 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下に続
く実施例に開示された技術が、本発明の実施に際して十分に機能するように本発
明者らにより発見された技術を示し、従って、その実施のために好ましい態様を
構築するために考慮され得ることは当業者に明らかであある。しかし、本開示を
鑑みて、多くの変更が開示された特定の実施形態において行われ得、そしてなお
本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく類似の結果を得ることを当業者は
理解する。
【0104】 (5.1 実施例1−リボザイムの調製およびリボザイム標的の選択) リボザイムの標的を、光受容細胞または網膜色素上皮細胞において高度に発現
される遺伝子の中の完全なcDNA配列または100〜300ntの発現された
標的タグから選択する。標的は、ヌクレオチドトリプレットGUC、CUC、U
UCまたはAUCの5’側の4ヌクレオチドおよび3’側の6ヌクレオチドから
なる。標的部位を含む25nt配列のあり得る二次構造の分析を、MFOLDア
ルゴリズム(http://mfold2.wustl.edu.rna/fo
rm.cgi)を用いて行い、そして局所的ステム構造に埋め込まれているよう
である標的を避ける。リボザイム接近可能部位はまた、単鎖RNA特異的改変試
薬での処理により検出され得る(ShawおよびLewin、1995) 図6に示される一般的構造のハンマーヘッドリボザイムを設計し、ここで、N
は、任意のリボヌクレオチドを表し得、そして標的配列のリボヌクレオチドに相
補的である。図6に示されるものと同様に機能するようであることが示されたス
テム−ループ構造の別の形態(およびフラグメント)が存在し、従って、本発明
における使用もまた意図される。
【0105】 14ヌクレオチドの標的配列およびコグネイトリボザイムは、化学的に合成さ
れ、そして商業的供給元から得られる(Dharmacon,Inc.,Bou
lder,CO)。保護基を、製造業者の説明書に従って、RNAオリゴヌクレ
オチドの2’位置からはずし、そしてオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキ
ナーゼおよび[γ−32P]ATPを用いて37℃で30分間標識し、次いで、滅
菌水で100μlに希釈し、そしてフェノール:クロロホルム:イソアミルアル
コール(50:50:1)で抽出して、酵素を不活化する。取り込まれていない
ヌクレオチドを、G−25セファデックススピンカラムに対して水相を通過させ
ることにより除去する。リボザイムまたは大きな標的(30ヌクレオチドを超え
る)を8%アクリルアミド、8M尿素の配列決定ゲルにおいて、TBE緩衝液(
89mM Trisホウ酸、pH8.3、20mM EDTA)中で泳動させて
精製する。標識した分子をオートラジオグラフィーで可視化し、滅菌したメスで
切り出し、そして1M NH4OAc、50mM Tris HCl、pH7.
5、20mM EDTA、0.5% SDS中、ゲルから37℃で1〜4時間溶
出する。ゲル精製を省略する実施形態においては、転写物をRNaseを含まな
いDNaseIで処理して、標的またはリボザイムにアニールし得るDNA配列
を除去する。
【0106】 各分子の比放射活性を用いて、標的分子およびリボザイム分子の濃度を計算す
る。マルチターンオーバー速度論定数を決定する分析を、代表的には、短時間間
隔で20mM MgCl2、40mM Tris−HCl、pH7.5中、37
℃で行う。適切な間隔を、マルチターンオーバー条件(すなわち、基質過剰)の
下で時間経過実験により決定する。インビボでの転写により精製される標的RN
Aの切断産物を8また10%アクリルアミド、8M尿素の配列決定ゲルにおいて
TBE中で電気泳動することにより分析する。切断の量が時間に対して線形的で
あり、そして基質のわずか10%が産物に転換される場合に、最初の速度を測定
する。線形性を確実にするために、いくつかの間隔(例えば、5、10および2
0分)で速度を測定する。サンプルを切断の開始前に37℃でプレインキュベー
トし、そして1〜10nM リボザイムおよび基質RNAの漸増濃度を含めて、
一定のリボザイム濃度を維持する。基質濃度は、リボザイム濃度に対して大きく
過剰であり、最も低い濃度は、5倍過剰である。速度論パラメーターを、基質濃
度に対する速度の二重逆数プロット(double reciprocal p
lot)(Lineweaver−Burkeプロット)により、または速度
対 基質濃度の比に対する反応速度のプロット(Eadie−Hofsteeプ
ロット)により得る。0.5分未満のkcatまたはKM>5μMを有するリボザイ
ムを、捨てる。
【0107】 速度論的に競合性のリボザイムをコードするDNAオリゴヌクレオチドを、A
AVベクターpTR−GS−HPの誘導体にクローニングする(図1)。オリゴ
ヌクレオチドは、制限酵素HindIII5’およびNsiI3’についての切
断部位を含み、このベクターへの挿入を可能にする。この7−kbベクターは、
RNAの3’末端で目的の標的に指向するハンマーヘッドリボザイムを最初に切
断し、そしてこのハンマーヘッドリボザイムを現すヘアピンリボザイムをコード
する。一次転写物はまた、ヒト化GFP遺伝子(Zolotukhinら、19
96)、HSVチミジンキナーゼプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐
性についての遺伝子、続いてウシ成長ホルモンポリA部位を含む。本来のベクタ
ーに存在するCMVプロモーターは、桿体光受容細胞における発現のために、4
72塩基対のマウスオプシン近位プロモーター(Flanneryら、1997
)により置換され、赤色網膜錐体(red cone)特異的プロモーターの欠
失バージョン(Nathansら、1986)またはCRALBP遺伝子由来の
2.6−kb RPE特異的プロモーター(GenBank登録番号AF084
638)を用いて交換されている。
【0108】 (5.1.1 ベクター骨格の構築) AAVベクターを、2プラスミドトランスフェクション系およびEK293細
胞を用いて以下のようにパッケージングする。rAAVを生成するために、三重
同時トランスフェクション手順を用いて、rAAVベクタープラスミドを、pA
CG2 AAVヘルパープラスミドおよびpXX6 Adヘルパープラスド(X
iaoら、1998)とともに1:1:1の分子比で導入する。あるいは、rA
AVベクタープラスミドを、AAVrepおよびcap遺伝子を有するヘルパー
プラスミドpDG、ならびにrAAV複製およびパッケージングを必要とするA
d ヘルパー遺伝子で同時トランスフェクトする(Grimmら、1998)。
トランスフェクションで用いるプラスミドDNAを、従来のアルカリ性溶解/C
sCl勾配プロトコルにより精製する。トランスフェクションを以下の通りに行
う:トランスフェクトする場合に、細胞コンフルエンシーが約75〜80%であ
るように、293細胞を実験の前日に1:2で分割する。10個の15cmプレ
ートを1つのバッチとしてトランスフェクトする。CaPO4沈澱物を作製する
ために、180μgのpACG2を180μgのrAAVベクタープラスミドお
よび540μgのpXX6を、総量12.5mlの0.25M CaCl2中で
混合する。あるいは、0.7mgのpDGおよび180μgのrAAVベクター
プラスミドを同じ容量で混合する。古い培地を細胞から除去し、そしてCaPO 4 沈澱物の形成を、37℃に予め温めた12.5mlの2×HBS(pH7.0
5)をDNA−CaCl2溶液に添加することにより開始する。このDNAを1
分間インキュベートする;そして予め温めた200mlのDMEM−10% F
BSに混合物を移すことにより沈澱物の形成を停止させる。22mlの培地を各
プレートから直ぐに分配し、そして細胞を37℃で48時間インキュベートする
。CaPO4沈澱物を、細胞生存性に欠陥を生じさせることなく、インキュベー
ション期間全体の間にわたり細胞に静置させる。トランスフェクションの48時
間後に、細胞を1,140×gで10分間遠心分離することにより回収し;培地
を除去する。次いで、細胞を、ドライアイス−エタノールおよび37℃浴中での
3回の凍結/融解サイクルにより、15mlの0.15M NaCl、50mM
Tris HCl(pH8.5)中に溶解する。BenzonaseTM(Ny
comed Pharma A/S,純粋等級,Benzon Pharma
A/S,Roskilde,Denmark)を混合物(50U/ml、最終濃
度)に添加し、そして溶解物を37℃で30分間インキュベートする。溶解物を
、3,700×gで20分間遠心分離することにより清澄化し、そしてウイルス
含有上清を粗溶解物とみなす。これから高力価ストックを標準的プロトコルを用
いて調製し得る。ヘルパーアデノウイルスはこの調製物においては使用しない。
感染力価は、慣用的には、1010〜1011ウイルス/mlである。
【0109】 (5.1.2 リボザイム活性のアッセイ) 標的遺伝子の機能を試験するために、2μlのAAV発現リボザイムを、一般
的な局所麻酔下で、15日齢のマウスの右目に網膜下注射する。このことにより
、数分内に消散する局所的網膜剥離を導く。各リボゾーム構築物のために8匹の
マウスの群を用い、そしてこれらの動物の左目は処置せず、コントロールとして
供する。注射の結果として白内障を発症するか、または傷害または炎症の徴候を
示す動物を、この研究からはずし、そして安楽死させる。
【0110】 6週齡で(注射して4週間)、動物を網膜電図検査(ERG)により網膜機能
について、および光学的可干渉断層放射線写真(optical cohere
nce tomography)(OCT)により網膜厚についてアッセイする
(Ripandelliら,1998;Jacobsonら,1998)。ER
Gについては、マウスを一晩暗順応させ、次いで、薄暗い赤色光に順応させ、キ
シラジン(13mg/kg)およびケタミン(87mg/kg)の筋肉内注射で
麻酔する。全視野暗順応ERGを、白色光の10μ秒のフラッシュで誘発し、そ
して応答をUTAS−2000 Visual Electrodiagnos
tic System(LKC Technologies,Inc.,Gai
thersburg,MD)を用いて記録する。マウスの角膜を0.5%塩酸プ
ロパラカインの滴下により麻酔し、そして瞳孔を1%アトロピンおよび2.5%
塩酸フェニレフリンで拡大させる。金のワイヤループを備えた小さなコンタク
トレンズを2.5% メチルセルロースを滴下して両方の角膜に配置して、角膜
水分補給を維持する。銀ワイヤ基準電極を眼の間に皮下で配置し、そして接地電
極を後肢に皮下で配置する。10秒、30秒および1分間隔で、それぞれ、−1
.1、0.9および1.9log cdm-2の強度で刺激を与える。応答を4,
000の増大で増幅し、0.3〜500Hzの間でフィルターにかけ、そして2
チャンネルで2,000Hzの割合でデジタル処理する。各強度について3つの
応答で平均をとる。a波は、基底からピークまで角膜陰性方向で測定する。そし
てb波は、角膜陰性ピークから主要な角膜陽性ピークまで測定する。マウスの2
つの眼の間の差異の定量的比較に関しては、刺激強度全ての値を所定の動物につ
いて平均する。
【0111】 この分析を、16週齢で繰り返し、このとき、全ての動物を安楽死させる。網
膜変性の証拠を示す(ERGまたはOCTのいずれかによる)動物の左目および
右目を、混合アルデヒド(2%ホルムアルデヒドおよび2.5%グルタルアルデ
ヒド)の混合物中で固定する。目をエポキシ樹脂に埋め込み、1μmの厚みの組
織学的な切片を、垂直経線に沿って作製する。ROSおよび内部網状層を横切る
Muller細胞プロセスが、切片が傾斜しないことを確実にするために切片の
平面中にわたって連続であり、ONLの厚みおよびRISおよびROSの長さが
測定される(Faktorovichら、1990)ように、組織切片を整列さ
せる。RPEおよび脈絡膜層を、新生血管形成、RPE細胞死または異常沈着の
証拠について試験する。
【0112】 網膜変性を導くAAV−リボザイムを、結果を確かめるために2度目の類似の
プロトコルで試験する。ESTクローンを、リボザイム標的を含むとして同定し
、その切断が、動物において網膜ジストロフィーに導く。Clamped PC
TM方法(5’および3’RACE)を使用して、これらの標的を含むESTに
ついて全cDNAを配列決定する。GenBankおよび他の配列データベース
の探索を行い、公知の遺伝子または公知の機能の遺伝子に対する類似性を同定す
る。目的のESTの遺伝子発現の組織分布を、種々のマウス組織から抽出された
RNAのノーザンハイブリダイゼーションによって決定する。
【0113】 (5.1.3候補遺伝子の同定) インサイチュハイブリダイゼーション分析を使用して、以前において公知では
ない遺伝子のおよそのゲノム位置をマッピングする。これは、YAC、BACお
よびマウスゲノムのコスミドクローンへのハイブリダイゼーションによる遺伝子
のマッピングによって従われる。ヒトゲノムとマウスゲノムとの間のシンテニー
に基づいて、この情報を使用して、ヒトゲノムの間隔における目的の遺伝子をマ
ッピングする。これらの方法で、遺伝性の網膜疾患に対する候補遺伝子を含む領
域が同定される。網膜変性の原因である未知の遺伝子を含むヒトゲノム上でマッ
ピングされる遺伝子座が特に興味深い(Daigerら、1998)。
【0114】 同様な分析を、全ての3つの網膜特異的なプロモーターについて実施する。こ
れらのプロモーターが種々の哺乳動物において網膜特異的な様式で機能するので
、他の動物モデルを使用して類似の分析が行われる。例えば、AAV−リゾザイ
ムを、ブタの網膜錐体の多い網膜において、およびアカゲザルマカクの黄斑網膜
において試験する。
【0115】 7kbベクターpTR−GS−HP(図1)は、2つのEcoRV部位の間に
ヘアピンリボザイムを含む。ヘアピンリボザイムは、その位置の上流を直接切断
し、それによってハンマーヘッドリボザイムを明らかにし得る。このリボザイム
は、HindIII(5’)部位とNsiI(3’)部位との間で方向性を持っ
てクローン化される。リボザイムライブラリーおよび「ポジティブコントロール
」リボザイム(p53、p16、Rb、p19ARF)がクローン化された。転
写物の下流部分は、IRESエレメントを含み、ここで、ヒト化gfp遺伝子の
翻訳が開始する(Zolotukhinら、1996)。HSV−TKプロモー
ターは、ネオマイシン耐性遺伝子を誘導する。
【0116】 pTR−UF33−HP(図2)において、CMVプロモーター(これは、肝
臓においてサイレントである)は、EF1プロモーター(ヒト延長因子1α、G
enBank受け入れ番号E02627;Kimら、1990)によって置換さ
れている。このプロモーターは、種々の組織においてインビボで非常に活性であ
り、いずれのサイレンシングも示さない。ベクターpTR−UF12−HP(図
3)は、CMV−IEエンハンサー−ニワトリ−β−アクチンハイブリッドプロ
モーター(Sawickiら、1998;GenBank受け入れ番号E030
11)を、CMVプロモーターの代わりに含む。
【0117】 (5.2 実施例2−網膜変性についての候補遺伝子) (5.2.1 マウスcGMPホスホジエステラーゼのβサブユニット) インビボで十分に特徴付けられた杆体オプシン(rod opsin)プロモ
ーターを使用して、色素性網膜炎(RP)様杆体変性を、rd/+マウスにおい
て作製した(Bowersら、1990;Bennettら、1998)。これ
らのマウスは、1つのrd対立遺伝子およびcGMPホスホジエステラーゼのβ
サブユニット(βPDE;GenBank受け入れ番号X55968)に対する
1つの野生型対立遺伝子を有し、そして全ての年齢において明かに正常な網膜を
有する。ホモ接合性の条件下で、rd/rdマウスは、生後1または2か月以内
に全ての杆体を失う、劣性RPについての古典的な動物モデルである。
【0118】 正常な対立遺伝子RNAを十分インビトロで消化するが、rdRNAを切断し
ないリボザイムが設計された(図15)。このリボザイムはまた、合計の網膜R
NA調製物において全長の正常なβPDE mRNAを特異的に切断した。次い
で、このリボザイムを、本明細書中以下に記載されるように、近位杆体オプシン
プロモーターのrAAV下流にパッケージングし、一連のrd/+マウスの1つ
の目に注射した。注射4か月後に、対側側のコントロールの目と比較して、リボ
ザイム処理された目の外核層において、約50%少ない光受容体核が見出された
(図16A、図16B、図16C、および図16D)。コントロールの目を、同
様にPBSキャリア(図16A)または不活性リボザイムを含むrAAV(図1
6C)のいずれかを用いて注射した。これらの研究は、光受容体特異的野生型m
RNAに対するリボザイムが網膜変性を作り出し得るという形態学的な証拠を提
供する。
【0119】 (5.2.2 マウスcGMPホスホジエステラーゼのγ−サブユニット) 環状GMPホスホジエステラーゼのγサブユニットを標的とする2つの新規な
リボザイムが生成された。これらを、HHRZ35およびHHRZ42(図18
Aおよび図18B、それぞれ)と呼ぶ。両方ともが、γ−PDEに対するmRN
Aを効率的に切断し、そしてマウスにおいて網膜変性に導く。2つのリボザイム
はまた、上記のように得られた光受容体細胞ESTクローンに対して設計された
。これらを、HHRZ52(図34)およびHHRZ282(図35)と呼んだ
。これらを、pT7T3−19.3においてクローン化した。野生型ABCR遺
伝子に対する2つのさらなるリボザイム(ヒトABCR Rz114(図17A
)およびマウスABCR Rz(図17B))(これは、シュタルガルト黄斑変
性において変異される)もまた、調製され、これらは、黄斑疾患の動物モデルを
作製する際に有用である。1つのリボザイムは、ラットに対して特異的であり、
他のリボザイムは、ヒト、マカクおよびラットのmRNAを切断する。この後者
のリボザイムは、インビトロで広範に試験され、インビボでの網膜変性の誘発を
示すためにマウスオプシンプロモーターを含んで、AAVベクターを使用してア
カゲザルマカクに注射された。
【0120】 (5.3 実施例3−候補腫瘍サプレッサ遺伝子) 悪性腫瘍から単離されたDNAの分析は、腫瘍形成、オンコジーンおよび腫瘍
サプレッサ遺伝子に関する遺伝子の2つの主要なグループを同定した(Knud
son 1993)。前者は、特定の変異に起因して過剰活性であるかまたは本
質的に(constitutively)活性であり、そして制御されない細胞
増殖を導く遺伝子のグループである。これらの遺伝子は、しばしばrasファミ
リーのような転写因子であるか、または細胞周期をG1期またはS期に推進する
遺伝子である(Collinsら、1997)。後者のグループ、腫瘍サプレッ
サ遺伝子は、細胞周期の進行を阻害する。腫瘍形成におけるp53、p16、S
mad4(DPC4)またはRbのような腫瘍サプレッサ遺伝子の主要な役割は
、広く認識されている。これらはまた、悪性腫瘍の生物学的挙動(転移(met
atstasis)、増殖動力学、侵襲)を決定する際に重要な役割を演じる(
VogelsteinおよびKinzler、1993)。およそ20個の腫瘍
サプレッサ遺伝子が公知であるが、推定100個が存在する。現在、新規な強力
な腫瘍サプレッサ遺伝子の探索および発見は、長く骨の折れるプロセスである。
【0121】 悪性腫瘍の発生における腫瘍サプレッサ遺伝子の原因となる役割は、さらに、
この遺伝子に対するノックアウトマウスの生成によって確認されている。これら
のマウス(例えば、p53ノックアウトマウスまたはp16ノックアウトマウス
)は、自発性の腫瘍発生に非常に感受性である(Donehowerら、199
2;Jacksら、1994;Serranoら、1996)。さらに、これら
の遺伝子の2つ(p53、p16)が同時に不活性化されるマウスが癌に対して
なおさらに感受性になる(Harveyら、1995、Williamsら、1
994)。
【0122】 ハンマーヘッドリボザイムのライブラリーは、組換えAAVによっていくつか
の組織(肝臓、骨格筋、小腸および大腸の上皮、網膜)に送達される。組換えA
AVは、18か月までの間に種々の組織(脳、肝臓、骨格筋、網膜、腸の上皮)
において高いレベルでトランスジーンを安定に発現することが示されている(K
leinら、1998;Songら、1998;Flanneryら、1997
;Herzogら、1997;Duringら、1998;Fisherら、1
997)。腫瘍サプレッサ遺伝子を標的とするライブラリーに含まれるリボザイ
ムによって、腫瘍がその特定の細胞から生じ得る。腫瘍増殖自身は、その個々の
リボザイムの単離をより簡単にする増幅工程である。これらのリボザイムの特異
的な認識配列を使用して、新規で強力な腫瘍サプレッサ遺伝子が発見される。
【0123】 悪性腫瘍の誘導を促進するために、公知の腫瘍サプレッサ遺伝子(p53、p
16、p19AFRおよび網膜芽細胞腫(Rb);「ポジティブコントロール」
リボザイム)に対するリボザイムが、ライブラリーと組み合わせて注射される。
単一の細胞を2つの組換えAAVベクターで同時に(例えば、肝臓において)感
染する確立は、約5〜10%である。公知の腫瘍サプレッサ遺伝子を標的とする
「ポジティブコントロール」リボザイムとして例えば含まれる。
【0124】 腫瘍形成は、一連の遺伝的変更および変異を含む多工程のプロセスである(V
ogelsteinおよびKinzler、1993)。このプロセスに含まれ
る遺伝子の2つの主要なグループは、オンコジーンおよび腫瘍サプレッサ遺伝子
である(Knudson、1993)。p53および網膜芽細胞腫タンパク質(
Rb)をコードする2つの腫瘍サプレッサ遺伝子(これらは、細胞周期の重要な
制御因子として機能する)における変異は、細胞の形質転換および最終的には自
律的な腫瘍増殖に導く(Collinsら、1997)。悪性腫瘍の発生におけ
る腫瘍サプレッサ遺伝子の原因となる役割は、さらに、これらの遺伝子について
のノックアウトマウスの生成によって確認された。p53ノックアウトマウスま
たはp16ノックアウトマウスは、自発的な腫瘍発生に対して非常に感受性であ
る(Jacksら、1994;Serranoら、1996)。さらに、2つの
腫瘍サプレッサ遺伝子(例えば、p53およびRb)が同時に不活性化される場
合、マウスは癌に対してなおより感受性になる(Harveyら、1995)。
腫瘍サプレッサ遺伝子はまた、悪性腫瘍の生物学的挙動(増殖動力学、侵襲、転
移)を決定する際に重要な役割を演じる。
【0125】 細胞周期および細胞複製の調節に関係する多くの遺伝子および経路が腫瘍サプ
レッサ遺伝子として同定されているが、現在まで、これらの経路に関連するか、
またはおそらくこれらの経路と独立した未知の遺伝子が、これらのプロセスを制
御する際に確かに役割を演じる。腫瘍サプレッサ遺伝子の合計数の見積は、数百
にわたる。
【0126】 (5.3.1 方法) 組換えAAVにパッケージングしたリボザイムのライブラリーを、マウスの種
々の組織に送達した。ライブラリーに含まれる1(またはそれ以上)のリボザイ
ムが、腫瘍サプレッサー遺伝子を標的する場合、このリボザイムを産生する細胞
は、腫瘍を生じ得る。この腫瘍の増殖は、このライブラリーのバックグラウンド
に対する特定のリボザイムの増幅を継続させ、リボザイムの単離を可能にする。
次いで、この特異的標的配列は、新規の腫瘍サプレッサー遺伝子を同定するため
のプローブとして決定および使用される。
【0127】 この目的のために、縮重ハンマーヘッドリボザイム(ライブラリー)を示した
(図5)。効果的な切断に必要である標的配列におけるヌクレオチドGUCは、
全11個の縮重ヌクレオチド(両サイドの5および/または6)により隣接され
る。従って、このライブラリーの複雑性は、4.19×106である。このリボ
ザイムライブラリーは、組換えAAV(rAAV)ベクターにクローン化される
。伸長因子1プロモーターまたはCMV中間体のいずれかは、初期エンハンサー
/チキンアクチンプロモーターのいずれかを使用して、2種もしくは同一ライブ
ラリー中のリボザイムの転写を誘導する。これらのプロモーターは両方とも、広
範の組織における標識遺伝子の持続性高レベル発現に関して公知である。ハンマ
ーヘッドリボザイムのすぐ下流は、転写物を内部で切断しそして良好な活性のハ
ンマーヘッドリボザイムを作用させるヘアピンリボザイムである。
【0128】 パッケージング後、組換えウイルスを、マウス(骨格筋、肝臓、ニューロン組
織、乳腺)の種々の組織に送達する。パッケージングおよびrAAVの精製のプ
ロトコールは、1ml当たり1012の感染ユニットのタイターを慣用的に提供し
、組織が高い多様性で感染されることを意味する。組換えAAVは、24ヶ月ま
での間、これらの組織中において高いレベルで標的遺伝子を安定して発現するこ
とを示した(Kleinら、1998;Songら、1998;Herzogら
、1997)。インビボでの腫瘍の誘導を容易にするために、パッケージングし
たリボザイムライブラリーを、公知の腫瘍サプレッサー遺伝子に対するリボザイ
ムを運ぶウイルスを有する混合物として注射する。Rb(図10Aおよび図10
B)、p53、p16およびp19を標的するハンマーヘッドリボザイムが設計
され、そしてインビトロで首尾良く試験される(図6)。これらのリボザイムは
また、ポジティブコントロールとして組み合わせて使用される。
【0129】 一旦、腫瘍が注射したマウスに展開された場合、標準的な組織学的技術によっ
て分析され、細胞株が可能であれば確立される。このリボザイム自体は、腫瘍R
NAのRT−PCRによって増幅され得る。あるいは、リボザイムを含むベクタ
ーの一部は、DNAの標準的なPCRによって増幅され得る。このリボザイムを
発現するAAVを、このウイルスが単独で、特定の組織中の腫瘍を誘導し得るこ
とを確認するために産生し得る。塩基配列決定により、このリボザイムの14個
の塩基対の認識配列を同定し、そしてこの配列タグを使用して、DNAデータベ
ース(例えば、GenBank)をスクリーンし得る。この配列が細胞増殖調節
に随伴する公知の遺伝子または実際に公知の腫瘍サプレッサー遺伝子と一致する
場合、この結果は、内部ポジティブコントロールとして役に立ち、そして全方法
を確認する。
【0130】 いくつかの場合において、腫瘍が発生し得る。なぜならば、1以上の腫瘍サプ
レッサー遺伝子が不活性化されたからである。このアプローチの潜在的な強さの
1つは、ライブラリー内の数種のリボザイムが同じ細胞に同時に送達され、そし
て組み合わせた様式で作用するという事実である。従って、スクリーニングされ
る初期腫瘍は、リボザイムの濃縮した母集団から単離される。次いで、腫瘍の誘
導に応答したリボザイムを同定するために、濃縮した母集団をAAVベクター中
で再クローン化し、そして動物に再び注射される。この方法において、腫瘍誘導
に必要とされる最小のリボザイム(すなわち、腫瘍サプレッサー)の組み合わせ
が、各標的組織について同定される。
【0131】 (5.3.2 ハンマーヘッドリボザイムライブラリーの構造/クローニング
) 縮重ハンマーヘッドリボザイム(ライブラリーリボザイム)は、図6に示され
る構造を有する。塩基GUCは、切断部位を含むように固定される。5’末端の
6つの塩基および3’末端の5つの塩基が縮重される。従って、ライブラリーの
任意の所与のリボザイムの特定の認識配列は、14塩基である。11の縮重ヌク
レオチドが存在するので、ライブラリーの複雑性は、411(これは、4.2×1
6に等しい)である。
【0132】 2種のDNAオリゴヌクレオチド(オリゴ)は、各々ヌクレオチドが縮重する
ように設計される。このセンスおよびアンチセンスオリゴは、12塩基対と重な
る。このオリゴを、50mMのNaCl、10mMのTris−HCl、10m
MのMgCl2、1mMのジチオトレイトール(pH7.9)を含む緩衝液中で
アニーリングする。このオーバーヘッド末端を、0.1mMのdNTPの存在下
のDNAポリメラーゼKlenowフラグメントで充填する。次いでこれらを、
2種の酵素(HindIIIおよびNsiI)で消化する。この二重鎖ライブラ
リーリボザイムオリゴを、12%の非変性ポリアシルアミドゲルで精製する。
【0133】 次いで、この骨格ベクターを、HindIIIおよびNsiIで切断し、そし
てアガロースゲルで精製する。300ngのベクターを、1つのライゲーション
反応に使用する。インサート(ライブラリーリボザイム)オリゴの最適量を、イ
ンサートの滴定を用いる1セットの試験ライゲーションにより決定する。一旦、
最適のベクター:インサート比を見出すと、十分な数のライゲーション反応が設
定される。
【0134】 このライゲーションは、Supercompetent Surecells
(Epicuran Coli(登録商標)SURE(登録商標)Electr
oporatoin Competent Cells,Stragagene
,La Jolla,CA)に形質転換される。1回の形質転換当たり最適のベ
クター:インサート比(約2.0〜2.5×106クローン)で実施される。
【0135】 十分に多いライブラリーの複雑性は、20回の形質転換を実施した場合にえら
得る。形質転換が、50μg/mlのアンピシリンを含むLB−寒天上に貯蔵さ
れそしてプレート化され、そして37℃で一晩増殖される。このコロニーを1セ
ットの希釈剤で計数し、正確な数のコロニーを得る。このコロニーを、全部で1
00mlのLB媒体中のプレートに洗い流す。2mlのアリコートをグリセロー
ルストックとして凍結させる。
【0136】 プラスミドDNAを、標準技術(Sambrookら、1989)によって十
分な量でCsClグラジエント上で単離する。
【0137】 (5.3.3 AAVベクターのパッケージング) AAVベクターを、上記の実施例1に記載される通りにパッケージングする。
【0138】 (5.3.4 動物への組換えAAVの注射) 各動物を、1010感染単位で注射する。各手順について、マウスを、吸入用麻
酔であるメトキシフルラン(MetofaneTM、THE Dow Chemi
cal Company、Midland、MI;Johnson & Joh
nson、New Brunswick、NJ)で軽度に麻酔する。この適用部
位は、骨格筋、静脈内(尾静脈)、経口適用およびペラナル(peranal)
適用である。
【0139】 骨格筋注射については、50μl容量の組換えAAVを、両方の後肢のハムス
トリング筋群に注射する。28ゲージ針を取り付けた1mlシリンジを使用する
。より良好な可視化のために、注射部位上の覆いを、カミソリで取り除く。尾静
脈注射のために、各マウスを、注射の持続時間についてマウスをその尾によって
保持することにより、PlexiglasTM(Rohm & Haas Com
pany、Philadelphia、PA)ボックスに拘束する。総容量10
0μlのAAV懸濁液を、尾静脈の1つにゆっくりと注射する。経口適用につい
ては、オロガストリック(orogastric)チューブを、注意深く挿入す
る。AAV懸濁液を、総容量100μlにてこのチューブを通じて投与する。次
いで、マウスを、回復させ、そして水および標準的なマウス食餌に対して任意に
接種するように戻す。ペラナル適用については、100μlの組換えAAVを、
注腸によって注入する。合計50匹の動物を、各投与経路について注射する。
【0140】 注射されたマウスを、秤量することによって、かつ「臨床的評価」によって規
則的な様式(1週間に2回)モニターする。明白な腫瘍の任意の徴候が発見され
るか、またはマウスが、20%を超えるその体重を失う場合、マウスを屠殺し、
そして部検を行なう。全ての関連器官(脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、注射
した骨格筋、胃、大腸および小腸)を回収し、そして血液サンプルを採取する。
注射部位を、任意の腫瘍について注意深く試験する。腫瘍を3片に分割し、そし
て図14に示されるフローシートに記載される通りに分析する。
【0141】 (5.3.5 腫瘍分析) 腫瘍を、4%パラホルムアルデヒドのPBS(pH7.5)にて、2日間固定
し、そして平衡化されるまで、30%のスクロースのPBS(pH7.5)にて
平衡化する。サンプルを−20℃で凍結し、そしてクリオスタット(cryos
tat)にて凍結切片化する。GFP発現を、蛍光顕微鏡下で分析する。
【0142】 初代組織培養のために、腫瘍組織を、機械的に剥離し、そしてRPMI164
0培地(15% FCS)に置く。細胞を、必要に応じて分割する。必要な場合
、腫瘍細胞を、選択的にトリプシン処理することによって線維芽細胞から分離す
る。GFP発現を、蛍光顕微鏡下で、またはFACScanTM(Becton
Dickinson and Company,Fanklin Lakes、
NJ)分析によって分析する。
【0143】 ゲノムRNAおよび総DNAの単離を、標準的な手段(Sambrookら、
1989)に従って実施する。DNA分析(サザンブロット)およびRNA分析
(ノーザンブロット)を、標準的な手段(Sambrookら、1989)に従
って実施する。
【0144】 RT−PCTTM分析のために、cDNAを、製造業者の使用説明書に従って、
逆転写酵素(Gibco BRL)により合成する。PCRTMを、製造業者の使
用説明書に従って、Perkin−Elmer PCRTMにより実施する。ゲノ
ムDNAのPCRTMについては、Perkin−Elmer PCRTMキットを
、pfuポリメラーゼとともに使用する。製造業者の使用説明書に従う。以下の
プライマーを使用する:センス5’−GGACTGTCAGATATCG−3’
(配列番号27);アンチセンス5’−ACTGAGTGGGTGGAGACT
GA−3’(配列番号28)。
【0145】 PCRTMフラグメントを、配列分析のための標準的な技術によって、pT7/
T3−19の制限酵素部位HindIIIおよびNsiIにサブクローニングす
る。標準的T7配列決定プライマーを使用する。配列決定のために、Big D
ye配列決定キットを使用する。cDNAライブラリーのスクリーニングを、標
準的な手順(Sambrookら、1989)によって実施する。
【0146】 あるいは、Balb C 3T3線維芽細胞を使用して、潜在的に癌原生のリ
ボザイムのサブライブラリーを選択し得、次いで、これを、上記の方法によって
、マウスにおいて再試験する。
【0147】 (5.4 実施例4−−記憶および学習に関与する候補遺伝子) 長期記憶の形成は、遺伝子の発現に関与する:mRNAおよびタンパク質合成
の破壊は、記憶形成に影響する(Rosenzweig、1996)。過去20
年間、科学者達は、薬理学的技術および遺伝子技術を使用してこのプロセスに関
与する候補遺伝子について調べてきた。海馬は、記憶のための位置であることが
示されている。なぜなら、この領域中の位置は、空間的な記憶の獲得を損なうか
らである(Morrisら、1990)。CREB(cAMP応答性エレメント
を結合する遍在的転写因子)(Gonzalezら、1989)は、Aplys
ia、drosophila、マウスおよびラットにおける短期から長期への記
憶の切り替えにおいて役割を果たすことが示されている(Silvaら、199
8)。CREB欠損ノックアウトマウス、およびアンチセンスCREB注射ラッ
トは、記憶異常を示す(Silvaら、1998;Guzowskiら、199
7)。ウイルス標的化リボザイムは、学習および記憶を研究するために十分に適
しており、ここで時間的および空間的な特異性が重要であり、CREB mRN
Aに対して指向されるリボザイムは、CREB発現をノックアウトするように選
択される。このアプローチはまた、CREBの多数の下流標的、および新規遺伝
子の発現を変化させるために使用される。これらのニューロン性機能を破壊する
能力は、神経学的障害についての動物モデルの開発において重要である。
【0148】 簡潔には、CREB mRNAを標的とする適切なリボザイムを設計し、そし
てクローニングし、そしてこれらのリボザイムは、インビトロおよびインボボの
両方で、それらの標的RNA基質を切断することが示される。次いで、海馬CR
EBタンパク質のレベルを、CREBリボザイム注射動物における減少を検出す
るために分析する。ラットにおける長期記憶(LTM)の機能の喪失を、Mor
ris水迷路−学習パラダイム(water maze−learning p
radigm)(Morris、1989)を使用して研究する。ディファレン
シャルディスプレイ方法を使用して、学習および記憶に関与する他の候補遺伝子
を同定し、そして上記で要約されたプロセスを、これらの新規に同定された遺伝
子について繰り返す。
【0149】 多数のCREBアイソフォームが特徴付けられている(Blendyら、19
96)。3つのリボザイムを、設計し、そしてCREB230(図11)、CR
EB288(図12)、およびCREB380(図13)と呼んだ。これらは、
CREBの全てのアイソフォームを標的とする。これらのリボザイムの配列を示
す二本鎖オリゴヌクレオチドを、T7T3−19発現ベクター(Life Bi
otechnologies,Gaithersburg,MD)にサブクロー
ニングした。リボザイムを、T7T3−19からインビトロで転写させ、そして
本明細書中上記に詳述される通りに、インビトロでCREB基質の切断について
試験した。CREB230およびCREB288の両方は、インビトロでCRE
B RNA基質を効率良く切断した。これらのリボザイムを、ベクターpTR−
UF33*−HPにサブクローニングした(図2)。陰性コントロールとして、
触媒ドメイン中に2点での変異を含む2つのリボザイムを設計し:CREB23
0m(図11)およびCREB288m(図12)、そしてT7T3−19およ
びpTR−UF33*−HPにサブクローニングした。AAVベクターを、上記
実施例1に記載される通りにパッケージングする。
【0150】 ラット海馬に、標準的な定位手順(Kleinら、1998)を使用して、A
AV発現リボザイムを注射する。注射された脳におけるCREB mRNAのレ
ベルの減少を、インサイチュハイブリダイゼーション(Simmonsら、19
89)によって決定する。脳をまた、抗CREB抗体を使用する免疫細胞化学に
よって、タンパク質レベルの減少について分析する。Morris水迷路パラダ
イム(water maze paradigm)(Rozenzweig,1
996)を使用して、コントロールとリボザイム注射動物との間で、学習および
記憶における表現型の差異について調べる。
【0151】 ディファレンシャルディスプレイ方法を使用して、記憶形成の硬化に関与する
新規遺伝子を同定する(LiangおよびPardee、1997)。正常動物
および記憶欠損動物(CREBhh)を、訓練パラダイムに供する。mRNAを
、訓練後の異なる時間で、これらの動物の海馬から単離し、そして1連のプライ
マーセットを使用して、PCRTM増幅し、そして配列決定ゲル上で泳動させて、
CREBhhラット対正常ラットにおけるmRNAの発現の示差パターンを示す
。示差的に発現されたmRNAをクローニングし、そして特徴付ける。GenB
ankの検索により、公知遺伝子を同定する。発現の示差的パターンを、ドット
ブロット分析によって確認し、そして海馬中のこれらのメッセージの存在を、R
Naseプロテクションアッセイ(Gilmanら、1987)によって、また
はインサイチュハイブリダイゼーション(Simmonsら、1989)によっ
て決定する。候補遺伝子を、候補遺伝子特異的リボザイムを設計し、そしてそれ
らを、CREBについて上記の通りに試験することによって、学習および記憶に
おけるそれらの役割についてさらに評価する。
【0152】 (5.5 網膜疾患のための候補遺伝子) 本実施例は、体網膜組織内の特異的な野生型(wt)対立遺伝子に対してリボ
ザイムを送達し、「身体ノックダウン(somatic knockdown)
」を生成するのに十分な対応するmRNAレベルを低下させ、そしてフォトレセ
プター(PR)細胞損失および網膜疾患様表現型を導くための方法を記載する。
このアプローチは、網膜特異的なライブラリー由来の候補フォトレセプター制限
EST(発現された配列タグ、すなわち、mRNA配列)の哺乳動物における機
能的スクリーニングが、網膜疾患に関連した遺伝子の全てを同定することを可能
にする。
【0153】 組換えAAV(rAAV)は、げっ歯類網膜のフォトレセプター細胞内の遺伝
子を送達および発現するための効率的かつ非毒性の様式として証明されてきてい
る。rAAV内のレポーター遺伝子を調節する近位ロッドオプシンプロモーター
は、症状なしに、効率的かつ特異的にロッドフォトレセプターに発現を標的化す
ることが見出された(Flanneryら、1997)。発現の期間は、長期で
あり、ラットの寿命は低下しなかった(30分を超える)。さらに、導入遺伝子
を発現する多くのフォトレセプター、および形質導入された網膜のフラクション
は、網膜表現型の変更が可能であることを示唆した。実際に、トランスジェニッ
クラット(常染色体の優性Retinitis Pigmentosaのための
哺乳動物モデル)における変異体P23Hロッドオプシン遺伝子(Drense
rら、1998)に対するrAAV送達リボザイムは、それぞれ8ヶ月および3
ヶ月に損失された30〜80%のフォトレセプターを保存した(Lewinら、
1998)。レスキュー(Rescue)は、網膜電図(ERG)分析によって
機能的に、フォトレセプター形態の保存によって細胞的に、そして変異体mRN
Aレベルにおける特異的な低下によって分子的に、確証された。従って、rAA
V送達リボザイムは、インビボで疾患表現型をレスキューし得る。
【0154】 野生型対立遺伝子に対して標的化されたリボザイムがまた、フォトレセプター
機能不全を生じ得るかどうかを試験するために、Retinitis Pigm
entosa(RP)様ロッド変性が、rd/+マウス内で産生された(Bow
sら、1990)。これらのマウスは、PDE遺伝子の1つの変異体rd対立遺
伝子および1つのwt対立遺伝子を有し、全ての年齢において、明らかに正常な
網膜を有する。ホモ接合状態において、rd/rdマウスは、劣性RPのための
古典的なモデルであり、1〜2ヶ月内に全てのロッドを失う。wt対立遺伝子に
対して設計されたリボザイムは、最初にインビトロで試験され、rdmRNAで
はなく、正常なPDE mRNAを十分に消化することが見出された。次いで、
このリボザイムは、近位ロッドオプシンプロモーターのrAAV下流にパッケー
ジされ、一連のrd/+マウスの1個の眼内に注射された。注射の4ヶ月後、5
0%〜80%少ないロッドフォトレセプターが、PBS処置した対側性のコント
ロールの眼に対して、リボゾーム処置された眼に見出された。コントロールの眼
は、正常の数のフォトレセプターを示した。発明者らが各哺乳動物のリボザイム
処置した眼およびPBSコントロールの眼における光惹起された電気的応答を同
時に測定したERG分析は、処置された眼におけるロッド細胞の損失と並行した
著しい機能的視覚の欠乏が生じることを確証した。さらにこのアプローチを確証
するために、ホモ接合状態においてRP様PR機能不全をも示す異なる遺伝子(
PDE)における劣性変異を有する第2のヘテロ接合性マウスを、wt PDE
遺伝子に対してrAAV送達リボザイムを使用して試験した(図18Aおよび図
18B)。これらの研究からの結果を、PDEリボザイムを用いて見られた結果
と並べた(図19、図20、および図21) 未知の網膜疾患有意性の候補遺伝子についてのインビボスクリーニングは、P
R特異的遺伝子、ならびにPRおよび幾つかの他の組織の両方において豊富に発
現される遺伝子の両方を同定するために、示差的ハイブリダイゼーションスクリ
ーニングストラテジーの発展を通して達成される。使用される網膜のcDNAラ
イブラリー配列は、高密度フィルターでスクリーニングするために有用な、標準
化された指向的にクローン化されたヒト網膜cDNAライブラリーの40,00
0cDNAクローンを包括する。この配列は、数個以上ののコピー/細胞におい
て網膜内に発現された遺伝子の大部分を含むことが予想される。整列されたライ
ブラリーが効率的に標準化され、広範囲のレベルにわたって発現された公知の網
膜遺伝子のcDNAを含み、そしてこのcDNA挿入物が長くかつしばしば完全
長であることが証明されている。この配列は、最初に正常なマウス由来、次いで
全てのPRを欠く5週齢のrd/rdマウス由来の全網膜cDNAを用いて調査
された。rd/rdプローブではなく、野生型プローブによって検出された網膜
cDNAは、網膜内において、推測的にPR特異的である。スクリーンされた1
596cDNAの、144推定PR特異的cDNAが同定されている。今日まで
、これらの130個が配列決定されており、28個(21%)は完全に新規であ
り、62個(46%)は、ESTのみとして公知であり(18個の以前に公知の
網膜特異的ESTを含む)、そして40個(30%)が公知の遺伝子に対応する
。重要なことに、公知のcDNAの2個は、ロドプシンおよびアレスチンであり
、十分に研究されたフォトレセプター特異的RP誘発遺伝子であり、実際にこの
ストラテジーが網膜疾患に関連した遺伝子を選択することを証明する。予想され
たオープンリーディングフレームを有するこれらのヒトESTの8個(網膜のみ
において発現された3個、制限された発現の3個、2個のハウスキーピング遺伝
子)は、ヒト網膜疾患遺伝子座と関連し、相同のマウスESTを有する。
【0155】 これらの配列は、マウスにおける結果の確証のための標的であった。各遺伝子
に対するリボザイムが設計され、そしてインビボで試験され、次いで、受容可能
な活性および特異性を示すものが上で概略されるようにインビボで試験される。
組織の光学コヒーレンストモグラフィー(OCT)および顕微鏡分析によって、
哺乳動物が、視覚機能障害(ERGによって)および網膜形態障害について、月
1回の間隔で試験され得る。
【0156】 (5.5.1 哺乳動物の注射) 以下の哺乳動物研究について、pTR−UF33−HP構築物を使用した。
【0157】 新生Balbcマウスを生後から24時間以内に注射した。組換えウイルスを
側頭静脈を通して静脈内投与した。以下の群に従う5つの群の哺乳動物を、注射
した: A:コントロール(pTR−UF5) B:p53、p19、p16およびRb(網膜芽細胞腫遺伝子)に対してリボ
ザイムを有するrAAV C:リボザイムライブラリーを有するrAAV D:リボザイムライブラリーを有するrAAV+p53に対してリボザイムを
有するウイルス E:リボザイムライブラリーを有するrAAV+p19、p16、およびRb
に対してリボザイムを有するウイルス。
【0158】 各群は、5つの哺乳動物から構成される。各ウイルスの全5×109感染性ユ
ニット(IU)を1マウスにつき注射した。このマウスを個々に標識し、(毎週
)定期的な重量測定を行った。さらに、それらを、腫瘍または腫瘍様病変につい
て1週間に少なくとも2回チェックした。
【0159】 同様に、研究の第2の設定において、成体マウスの後脚のハムストリング筋肉
内に、筋肉内注射した。これらの群は、実施されなかったC群を除き、新生マウ
スについて、上記と同じであった。新生マウス研究において、各ウイルスの5×
109IUを注射した。これらの哺乳動物は、新生時に注射されたマウスと同じ
様式で行なわれた。
【0160】 (5.5.2.インビトロ形質転換アッセイ) 培養細胞のインビトロ形質転換は、腫瘍の形成に必須の遺伝子変化を同定する
ために長らく用いられてきた。いくつかの増殖指標が悪性形質転換の兆候として
受け取られている。これらの兆候の1つは、いわゆる病巣の形成を導く、コンタ
クトインヒビション(contact inhibition:接触阻害)の消
失である。正常細胞は、隣接細胞との接触により阻害される。この阻害は、ペト
リ皿上で増殖する培養細胞が、一旦、細胞の単層がプレートをカバーすれば(1
00%コンフルエンスまで増殖する)、分裂を停止することを意味する。その単
層において、細胞が形質転換され、そして接触阻害を失う場合、細胞は、増殖し
、そして細胞の小さい「パイル(堆積)」(病巣)を形成する。これらの病巣は
、裸眼で検出され得る。この現象/兆候は、インビトロにおけるリボザイムライ
ブラリーのスクリーニングのために、本明細書において使用された。
【0161】 BalbC3T3細胞は、形質転換されないマウス線維芽細胞である。Bal
bC 3T3細胞は、pTR−UF21−HPウイルスにおけるリボザイムライ
ブラリーを用いて、1000のMOI(感染多重度)で感染された。この細胞を
、15cmの皿で維持し、そして培地を週に2回交換した。4〜6週間後、病巣
の形成を観察した。pTR−UF5(GFPのみを発現するAAV構築物)で感
染したコントロールのプレートと比較して、コントロールウイルスで処理したプ
レートにおける病巣よりも、AAV−リボザイムで処理したプレートにおける病
巣は8〜10倍であった(低率で生じる自発的形質転換は、コントロールプレー
トにおいてさえ病巣を生じる)。
【0162】 36の病巣全てを拾い上げ、そして増殖した(新鮮培養培地における再増殖)
。ゲノムDNAを、増殖した各病巣から単離した。ライブラリーリボザイムの存
在下でPCRTMにより、この病巣をスクリーニングした。スクリーニングした2
8の病巣のうち8までは、明白に陽性のPCRTMシグナルを有した。8つのPC
TM陽性病巣のうち3つのPCRTMフラグメントを、E.coliプラスミド(
pT7T3−19)にサブクローニングした。各サブクローニングされたPCR
産物由来の8つまたは9つの個々のクローンを配列決定した。この結果を以下の
表に示す:
【0163】
【表3】 なんらかの公知の腫瘍サプレッサー遺伝子(内部陽性コントロールとして働く
)に適合する配列は存在しなかった。しかし、これらの配列により、細胞増殖ま
たは分裂を制御する機能を有する新規な遺伝子を同定し得る。これらの遺伝子は
、腫瘍サプレッサー遺伝子の表題下に入る。
【0164】 一旦病巣をスクリーニングし、そして全てのPCRTM陽性細胞のサブクローニ
ングおよび配列決定を完了すれば、次いで、単離されたライブラリーリボザイム
を、pTR−UF21−HP中に再クローニングし、そしてウイルス中にパッケ
ージングし得る。これは、サブライブラリーの富化を示す。次いで、このライブ
ラリーを、第二のインビトロ形質転換アッセイにおいて用いる。一旦、ライブラ
リーおよびサブライブラリーを4〜6の異なるリボザイムに狭めれば、次に、こ
れらの配列を用いてcDNAライブラリーをスクリーニングする。次いで、マウ
スの公知の腫瘍サプレッサー遺伝子(Rb、p53、p19arf、p16ink4a
に対するリボザイムを保有するrAAVベクターとともに、リボザイムライブラ
リーおよびサブライブラリーを同時感染する。
【0165】 (5.5.3. 網膜疾患動物モデルの構築) 本明細書に記載のアレイ発現分析方法により、一旦、候補疾患遺伝子が同定さ
れれば、研究を行い、よりヒトに似た眼(ブタおよびサル)を用いて、大動物に
おける網膜疾患関連を確認し得る。AAVベクター化リボザイムにより、適切な
治療の開発のための網膜疾患の新しい、より関連するモデルの作製が可能になる
。例示的な例において、ABCR遺伝子の分析を実行した。この遺伝子における
欠損は、ヒトにおける網膜中心欠損である.シュタルガルト病の原因である。こ
れは、現在、網膜錐体富化(cone−rich)網膜中心(網膜黄斑)という
最も解明された遺伝子病である。黄斑性疾患は、米国における加齢性盲目および
遺伝性盲目の主な原因であり、2〜5百万人が罹患している。シュタルガルト病
に加えて、主な黄斑性疾患は、加齢性黄斑変性(現在、西洋における正当な盲目
の原因を導く)およびRPの末期である(黄斑網膜錐体がほとんどの桿状細胞の
消失後に変性する場合)。現在、治療法または長期療法は存在しない。現在、利
用可能な、黄斑性疾患の動物モデルは存在しない。この理由は、主に、このよう
なモデルは必ずしも黄斑を発症しないはずだからである(網膜構造は霊長類にし
か存在しない)。
【0166】 ABCR特異的リボザイムは、インビトロで構築され、そして試験された。こ
れらのリボザイムおよびそれらの標的配列は、図28、図29、図30、図31
、図32および図33に示される。野生型ABCR遺伝子に対するAAVリボザ
イムが、黄斑性疾患のシュタルガルト病形態の霊長類モデルを提供するという仮
説を検証するため、本発明者らは、インビトロABCRリボザイム(ヒトおよび
サルのABCR遺伝子の両方を標的する)を設計および試験し、そしてサル網膜
にAAVリボザイムを送達した。4匹のアカゲザルの一方の眼の網膜下に、関連
AAVリボザイムを注射し、そして4カ月の間隔で、基底試験およびERG記録
により、シュタルガルト病様疾患の指標として中心網膜機能を追跡した。これら
の結果により、黄斑性変性の霊長類モデルの作製のためのAAV誘導リボザイム
方法の成功が示された。
【0167】 (5.6 実施例6−ハンチンチン(Huntingtin)に標的化された
リボザイム) CAG反復がハンチントン病における発症した遺伝子において異常に広がる場
合に生じる、毒性機能の明白な獲得に起因して、生じる変異体タンパク質の発現
の減少(具体的に、新線条体における)は、この障害において有益であり得る。
本実施例は、RNA切断分子を送達するrAAVベクターの作製および試験を記
載する。このRNA切断分子は、ハンチンチンの線条体の発現を減少する。正常
ハンチンチンの減少した発現は、宿主に対して毒性ではなく、そして変異体ハン
チンチンの減少した発現は有益であるので、この方法は、動物における変異体タ
ンパク質の蓄積の処置手段および/または予防手段を提供し、そしてこのような
過剰から生じる疾患を処置する第1のアプローチとして働く。
【0168】 トランスジェニック動物モデルおよび広がったCAG反復を有するヒトハンチ
ンチン(htt)遺伝子を使用する細胞性モデルの比較的最近の確立は、以下の
ことを示唆した。変異体httは、タンパク質の異常な機能の欠失よりも、むし
ろ異常な機能の獲得を通じて神経病理学を誘導する、ことを示唆した。広がった
ポリグルタミン(ポリQ)形質を有する変異体httのいくつかの新しい機能が
、長期間の細胞性病理学を誘導するという可能性は、以下の可能性を生じる。変
異体httの転写の減少はまた、進行中の病理学的プロセスを減少し得る、可能
性を生じる。実際、最近のデータは、変異体httの発現を駆動する誘導系の使
用を示し、変異体htt発現の逆転はまた、モーター表現型の逆転を導き得る。
【0169】 最近、多数の線条体のニューロンを長期間、形質転換することが結論的に実証
されたウイルスベクターが記載された。線条体のニューロンの高い百分率が、ド
パミン欠失トランスジェニックマウス線条において形質転換され得、そしてこれ
は、L−ドパを送達する組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)を使用
して1年を十分に超えて、表現型をレスキューし得る。さらに、AAVは、リボ
ザイムおよび神経組織に対してアンチセンスの両方を首尾よく送達し、遺伝子発
現を減少することが実証された。従って、線条における変異体htt発現を、r
AAV送達されたリボザイムを介して特異的に減少することによってR6/2ト
ランスジェニックマウスにおけるHD様表現型を取り消す試みの可能性が現在存
在する。
【0170】 (5.6.1 実験方法) (5.6.1.1 機能的リボザイムの構築および試験) ハンマー状の頭をしたリボザイムを使用して、トリプレットGUC、または一
般にNUX(ここでNは、任意のヌクレオチドを表し、そしてXはグアニジンを
除く任意のヌクレオチドである)を含むRNA内の領域を選択するためのストラ
テジーが、開発された(ヒトハンチントン病遺伝子は、15GUC部位を有する
)。次いで、アンチセンスヌクレオチド6〜8ヌクレオチド長の2つの伸展を作
製し、そして触媒ハンマー状の頭をしたリボザイムを形成する21ヌクレオチド
配列をそれらの間に配置する。触媒コアが、より大きい(34ヌクレオチド)こ
とを除いて、原理は、ヘアピンリボザイムと同じであり、そしてこの型のリボザ
イムは、標的部位におけるより特異性を必要とする。ヘアピンは、配列NNNB
NGUCNNNNNN(配列番号66)を認識し、ここでNは、任意のヌクレオ
チドであり、そしてBは、アデノシンでない任意のヌクレオチドである。4つの
機能的リボザイムを試験し、次いでrAAVベクターにパーッケージし、インビ
ボでの構築物の活性を試験した。これらのリボザイム(図22、図23、図24
、および図25に示される)は、IT15 mRNAを切断する。IT15遺伝
子は、ハンチンチンと呼ばれるタンパク質をコードし、ハンチントン病において
変異する。AAVは、これらのリボザイムを、マウスの線条および皮質に送達す
るために使用され、変異体タンパク質の蓄積によって最も影響される組織におけ
る疾患表現型を導くハンチンチンの発現を減少するか否かを決定する。この遺伝
子の生殖細胞系ノックアウトは、胚で致死であり、そして成体動物へのリボザイ
ムのAAV送達は、本明細書中に記載される理由のためにこの胚の致死を克服す
る。
【0171】 (5.6.1.2 合成標的のインビトロ試験) 遺伝子療法に有効であるために、リボザイムはインビトロでいくつかの試験を
通過しなくてはならない。第1に、標準緩衝液条件下(10mM MgCl2
40mM TrisHCl、pH7.4)で、オリゴヌクレオチド標的(13〜
15ヌクレオチド)についてリボザイムは試験され、それらが高度に活性であり
、かつ特異的であることが確認される。このようなリボヌクレオチド標的は、種
々の供給源(Dharmacan,Inc.(Bouler,CO)を含む)か
ら購入され得、、そして製造者の指示に従って脱保護される。切断反応を定量す
るために、標的オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−32 P−ATPを使用して標識される。この段階で、リボザイムは、天然に存在する
ヘアピンまたはハンマー状の頭をしたリボザイムより有意により少ない回転数を
示す場合(1分あたり)、拒絶されるか、または再びデザインされる。リボザイ
ム反応の律速工程は、産物の放出であるから、これらの試験は、標的過剰、マル
チ回転条件下で行われる。リボザイムは、不完全にマッチした標的(すなわち、
切断部位でか、またはその近くでミスマッチを有するオリゴヌクレオチド)を切
断する場合にまた、拒絶される。
【0172】 よい動力学的な特性および適切な基質特異性を有するリボザイムが、全長mR
NAを切断する可能性があるかどうかを決定するために、ハンチンチンmRNA
由来の50〜80ヌクレオチド長の転写物について、リボザイムは試験される。
これらの配列は、ハンチンチンmRNAのcDNAクローンからPCRによって
クローン化され、標的RNA分子が産生され、そしてT7 RNAポリメラーゼ
を使用してインビトロで32Pで標識される。標的は、アクリルアミドウレアゲル
上での電気泳動によって精製され、そしてマグネシウムの存在化での加熱および
緩やかな冷却によって再生される。長い標的の切断の速度は、オリゴヌクレオチ
ド標的についての速度よりも、有意に小さい(10倍以下に減少される)ようで
あり、次いで標的部位は、アクセス可能ではなく、そして候補リボザイムは、リ
ボザイムが代替の標的部位を認識することを支持して廃棄され得る。
【0173】 次いで、活性な選択リボザイムは、クローン化されたcDNA由来の全長RN
A転写物について試験され、標的部位が、9.3kbのハンチンチンmRNAの
フォールディングされた構造内で、アクセス可能であることが確認される。リボ
ザイムは、ハンチンチンRNAの有意な画分がインタクトなままである場合、こ
の段階で排除され得る。全長mRNAの切断はまた、ハンチンチンを発現する細
胞を、適切なプロモーターを駆動する試験されるリボザイムをコードするプラス
ミドベクターで、トランスフェクトすることによって組織培養において検出され
得る。この目的で、サイトメガロウイルス(CMV)の即時の初期プロモーター
のためのエンハンサー要素およびβアクチンのためのチキン遺伝子の近位のプロ
モーターを含むハイブリッドプロモーターが使用され得る。ハンチンチンについ
てのmRNAにおける減少は、RT−PCR分析によって検出される。動力学的
にコンピテントな、かつ全長RNAをカットし得るリボザイムは、遺伝子発現の
抑制が所望される遺伝子療法の一般的に有用な道具である。
【0174】 (5.6.1.3 rAAV−ribo−httの産生) 組換えウイルスを産生するために、ヒト293細胞が、rAAVプラスミドを
コードするリボザイムおよびヘルパープラスミドpDGで同時トランスフェクト
される。このプラスミドは、AAV repおよびcap遺伝子の両方、そして
AAV増殖のために必要なアデノウイルス遺伝子を含む。複製コンピテントなア
デノウイルスは、この方法を使用して検出されない。大規模DNA調製は、Io
dixanol密度勾配遠心分離およびヘパリンアガロースカラム上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用してなされる。ウイルスの従来的な収率は、
現在、1010〜1011感染粒子/mlであり、そして野生型AAVの混入はない
【0175】 (5.6.1.4 rAAV−ribo−htt機能のインビボ試験) rAAV−ribo−httは、24匹の正常な6〜8週齢のCBAマウスに
おける2位置(各部位に2μl)の右線条に注射される。これらのマウスは、ベ
クター注射後、4週間、8週間および26週間に殺される(n=6/期間)。こ
れらは、断頭され、そしてそれらの線条体は、ドライアイス上で迅速に解剖され
る。ホモジェネートされた線条の定量的ノーザンブロット分析は、注射されてい
ない線条で測定されたレベルに比較してhtt mRNAの有意な減少が存在す
るかどうかを決定するために使用され得る。ノーザンブロット方法が、十分に感
受性でない場合、マウスβアクチンmRNAレベルに対して標準化されたrt−
PCRが、線条体のhtt mRNAレベルのリボザイム誘導性の減少を決定す
るために使用され得る。サンプルはまた、免疫ブロットを介した減少したthh
タンパク質レベルの観察のために保存される。その時点が、本明細書中に記載さ
れる行動性の研究のために重要な間隔に一致するために選択された。
【0176】 (5.6.1.5 長期の線条体内のribo−htt機能の試験) 2つの平行した研究が行われ得、正常マウスにおける抗httリボザイムの効
果を特徴付ける。8匹の6週齢の正常CBAマウスは、上記の右線条内の2位置
にrAAV−ribo−httを線条体内に注射される。さらなる8匹のマウス
は、rAAV−GFPコントロールベクターを同様に注射される。これらの片側
性の動物は、ベクター注射後4週間で始まる毎週の一連のドパミンアゴニストを
使用して、非対称性回転性行動について試験される。線条機能の破壊は、2つの
半球の間の非対称を作製するべきであり、回転例におけるリボザイム誘導性機能
不全を検出を可能にする。第2の研究は、マウスが両側のベクター注射を受ける
ことを除いて、第1の研究に同じである。次いで、これらのマウスは、一連の試
験(例えば、ビームウォーキング、rotorod、聴覚驚愕応答のプレパルス
阻害、およびフットプリントの歩行分析)でのベクター注射後4週間に始まる毎
週の試験を受ける。両方の研究において、マウスの5/8は、実験の終わりに殺
され、そして上記のhtt mRNAレベルを評価するためにプロセスされる。
残りの3匹のマウス/グループは、4%パラホルムアルデヒドで灌流され、そし
て導入遺伝子発現を評価するためにGFP免疫組織化学についてプロセスされる
【0177】 (5.7 実施形態7−スーパーオキシドジスムターゼに標的化されたリボザ
イム) 筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脊髄、脳幹および皮質における運動ニュー
ロンの変性障害である(Brown、1997)。ほとんどの場合、その原因は
未知であるが、ALSは均一に致死(通常、診断の5年以内)である。約10%
のALSの場合が、常染色体の優性形質として遺伝し、そして家族性ALSまた
はFALSとして集団的に記載される。約20%のFALSの場合は、SOD1
遺伝子の変異に関連し、SOD1遺伝子はサイトゾルの酵素Cu/Znスーパー
オキシドジスムターゼをコードする(Rosenら、1993)。この153ア
ミノ酸タンパク質は、毒性スーパーオキシドアニオンを過酸化水素および分子状
酸素に転換する。SOD1における26以上のミスセンス変異が、FALSを導
くとして同定された。3つの主要な仮説が、SOD1変異が、どのように神経変
性を導くかについて提案された(Cleveland、1999):(i)変異
体酵素は、変化された基質親和性を有し、毒性産物の蓄積を導く;(ii)減少
されたSOD活性は、増加された酸化ストレスを許容し、特に感受性の細胞の損
傷を導く;(iii)不十分にか、または不安定にフォールディングされた変異
体SODタンパク質形態は凝集物を形成し、運動ニューロンに特異的に毒性であ
る。ヒトSOS1遺伝子の変異体形態を発現するいくつかの動物モデルが存在す
る(Buijnら、1998;Shefnerら、1999;Azzouzら、
1997;Browneら、1998;Morrisonら、1996;Rat
ovitskiら、1999;Rippsら、1995)。これらは、上述のモ
デル間を完全に識別するが、神経病発生に寄与する凝集体の蓄積を示唆する。さ
らに、少なくともいくつかのミスセンス変異体は、触媒機能を保持し、減少され
た活性が、細胞死の原因ではないことを示唆する。SOD1を欠くマウスは、A
LSを発達しないが、変異体SOD1導入遺伝子の高い発現は、ALS様疾患を
導く。
【0178】 いくつかのリボザイムが設計され、そしてALSのマウスモデルにおいて存在
するヒトSOD1についてのmRNAの切断を試験された(図36A、図36B
、図36C、および図36D)。これらのリボザイムは、変異体および野生型形
態のSOD1 mRNAの両方をインビトロで切断する。これらは、ベクターp
TR−UF33HPのHindIII/NsiI部位に導入された(図2)。こ
れらはまた、同じベクター骨格内の神経特異的エノラーゼプロモーターと関連し
て試験された。このように送達されたこれらのリボザイムは、これらのウイルス
で感染された運動ニューロンにおける変異体Cu/Zn SODタンパク質の発
現を減少するはずである。これらのようなAAV構築物は、脊髄における運動ニ
ューロンの長期間の形質転換に使用されてきた(Peel、1997)。このア
プローチは、変異体SOD1 mRNAの発現が、トランスジェニック動物にお
ける運動ニューロンに対する損傷に必要とされるかどうかを決定する。これらの
ベクターはまた、SOD1変異体の発現が疾患を導く関連する細胞型の同定を許
容する。特定の細胞における野生型SOD1の発現を減少することが、病因を導
くかどうかもまた、決定される。これらの実験は、発症した細胞におけるSOD
1の発現を減少することによって、FALSについての新規療法を導き得る。
【0179】 マウスマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)について、mR
NAを切断するリボザイムが、産生され、そして試験された(図27)。この酵
素は、酸素毒性(oxygentoxicity)に対して保護性であり、そし
て多発性硬化症のマウスモデルにおいて、視覚神経を保護する。このリボザイム
はマウスにおけるこの遺伝子の発現をノックダウンするために使用され得、この
遺伝子が神経保護機能を有するかどうかを決定する。このリボザイムは、インビ
トロで活性である。
【0180】 (5.8 実施例8−NADHデヒドロゲナーゼサブユニットに標的化された
リボザイム) マウスミトコンドリア酵素NADHデヒドロゲナーゼのMWFEサブユニット
に対するリボザイムが構築され、そして試験された(図26)。この同じ酵素複
合体を発症するミトコンドリア変異体は、レーバー遺伝性視神経障害に関連する
。ミトコンドリア疾患のマウスモデルを確立することが可能でないので、このA
AVリボザイムは、網膜神経節細胞を感染することによって動物モデルを作製す
るために使用される。好ましいベクターは、pTRUF12−HPであり(図3
)、CMV−βアクチンプロモーターを使用する。リボザイムは、独特なHin
dIIIとNsiI制限部位との間に挿入される。このリボザイムは、インビト
ロで試験され、そしてAAV.7にクローン化された。
【0181】 (6.0 参考文献) 以下の参考文献は、これらが例示的手順または本明細書中の記載についての他
の補遺を提供する程度まで、本明細書中でその全体の各々において参考として特
に援用される: 米国特許第4,683,195号,1987年7月28日公表。 米国特許第4,683,202号,1987年7月28日公表。 米国特許第4,800,159号,1989年1月24日公表。 米国特許第4,883,750号,1989年11月28日公表。 米国特許第4,987,071号,1991年1月22日公表。 米国特許第5,297,721号,1994年1月18日公表。 米国特許第5,334,711号,1994年8月2日公表。 米国特許第5,354,855号,1994年10月11日公表。 米国特許第5,455,166号,1995年10月3日公表。 米国特許第5,631,359号,1997年3月20日公表。 米国特許第5,648,211号,1997年7月15日公表。 米国特許第5,712,124号,1998年1月27日公表。 米国特許第5,744,311号,1998年4月28日公表。 国際特許出願番号PCT/US87/00880。 国際特許出願番号PCT/US88/10315。 国際特許出願番号PCT/US89/01025。 国際特許出願公開番号WO 89/06700。 国際特許出願公開番号WO 90/07641。 国際特許出願公開番号WO 91/03162。 国際特許出願公開番号WO 92/07065。 国際特許出願公開番号WO 93/15187。 国際特許出願公開番号WO 93/23569。 国際特許出願公開番号WO 94/02595。 国際特許出願公開番号WO 94/13688。 欧州特許出願公開番号EP 0329822。 欧州特許出願公開番号EP 0360257。 欧州特許出願公開番号EP 320308。 欧州特許出願公開番号EP 92110298.4。 英国特許出願番号第2202328号。
【0182】
【表4】 本明細書中で開示および特許請求される全ての組成物および方法は、本開示の
見地において、過度の実験なくなされ、そして実行され得る。本発明の組成物お
よび方法は好ましい実施形態の条件によって記載されるが、本発明の概念、精神
および範囲から逸脱することなく、組成物および方法、ならびに本明細書中に記
載される方法の工程または工程の順序において変化が適用され得ることが当業者
に明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成される間、化学
的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が本明細書中に記載される薬剤で
置換され得ることが明らかである。本発明は種々の改変および代替形態に対して
感受性であるが、図において例示の目的で示されるその特定の実施形態は、本明
細書中に詳細に記載される。しかし、本明細書中の特定の実施形態の記載は、開
示された特定の形態に限定されるようには意図されないが、逆に、本発明は、添
付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内の全ての改変
、均等物、および代替を包含することが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、そして本発明の特定の局面をさらに示
すために含まれる。本発明は、1つ以上のこれらの図面を、本明細書中に記載さ
れる特定の実施形態の詳細な説明と共に参照することにより、より良く理解され
得る。
【図1】 図1は、pTR−GS−HPのプラスミドマップを示す。
【図2】 図2は、pTR−UF33*−HPのプラスミドマップを示す。
【図3】 図3は、pTR−UF12−HPのプラスミドマップを示す。
【図4】 図4は、pTR−UFCREB230hhのプラスミドマップを示す。
【図5】 図5は、pTR−UFCREB288hhのプラスミドマップを示す。
【図6】 図6は、ヌクレオチド配列(配列番号1)、およびRNA標的配列(配列番号
2)を含む縮重ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図7】 図7は、ヌクレオチド配列(配列番号3)、およびRNA標的配列(配列番号
4;マウス p16)を含む抗p16ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図8】 図8は、ヌクレオチド配列(配列番号5)、およびRNA標的配列(配列番号
6;マウス p19ARF)を含む抗p19ARFハンマーヘッドリボザイムの
構造を示す。
【図9】 図9は、ヌクレオチド配列(配列番号7)、およびRNA標的配列(配列番号
8;マウス p53)を含む抗p53ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図10A】 図10Aは、ヌクレオチド配列(配列番号9)、およびRNA標的配列(配列
番号10;マウス網膜芽細胞腫)を含む抗網膜芽細胞腫ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。
【図10B】 図10Bは、ヌクレオチド配列(配列番号63)、およびRNA標的配列(配
列番号64;マウス網膜芽細胞腫)を含む抗網膜芽細胞腫ハンマーヘッドリボザ
イムの構造を示す。
【図11】 図11は、ヌクレオチド配列(配列番号11)、およびRNA標的配列(配列
番号12;CREB 230)を含むCREB 230ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、CREB 230リボザイム(配列番号13、および配
列番号14)をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチド、ならびに
変異体をクローン化しするために使用されるオリゴヌクレオチド、非活性形態の
CREB 230リボザイム(配列番号15、および配列番号16)が示される
【図12】 図12は、ヌクレオチド配列(配列番号17)、およびRNA標的配列(配列
番号18;CREB 288)を含むCREB 288ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、CREB 288リボザイム(配列番号19、および配
列番号20)をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチド、ならびに
変異体をクローン化しするために使用されるオリゴヌクレオチド、非活性形態の
CREB 288リボザイム(配列番号21、および配列番号22)が示される
【図13】 図13は、ヌクレオチド配列(配列番号23)、およびRNA標的配列(配列
番号24;CREB 380)を含むCREB 380ハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。また、CREB 380リボザイム(配列番号25、および配
列番号26)をクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチドが示される
【図14】 図14は、候補腫瘍サプレッサ遺伝子のフローチャートを示す。
【図15】 図15は、ヌクレオチド配列(配列番号29)、およびRNA標的配列(配列
番号30;マウスβPDEのnt 1037−1049)を含むcGMPホスホ
ジエステラーゼの抗β−サブユニット(βPDE)の構造を示す。
【図16】 図16A、図16B、図16Cおよび図16Dは、処置した目およびコントロ
ール目の外側の核層の顕微鏡写真を示す。図16Aは、PBSを注射したコント
ロール目(左)である。図16Bは、図16Aに示されるマウスと同じマウスの
右目であり、これはcGMPホスホジエステラーゼのβサブユニット(βPDE
)に対するリボザイムを注射されている。図16Cは、βPDEに対するリボザ
イムの非活性形態を注射したコントロール目(左)である。図16Dは、図16
Cに示されるマウスと同じマウスの右目であり、これはβPDEに対する活性リ
ボザイムを注射されている。
【図17】 図17Aは、ヌクレオチド配列(配列番号31)、およびRNA標的配列(ヒ
トABDR遺伝子の配列番号32)を含む抗ABCRハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。図17Bは、ヌクレオチド配列(配列番号33)、およびRNA
標的配列(マウスABDR遺伝子の配列番号34)を含む抗ABCRハンマーヘ
ッドリボザイムの構造を示す。
【図18】 図18Aは、ヌクレオチド配列(配列番号35)、およびRNA標的配列(マ
ウスγPDE遺伝子の配列番号36)を含む抗γPDEハンマーヘッドリボザイ
ムの構造を示す。図18Bは、ヌクレオチド配列(配列番号37)、およびRN
A標的配列(マウスγPDE遺伝子の配列番号38)を含む抗γPDEハンマー
ヘッドリボザイムの構造を示す。
【図19】 図9は、HHRZ42による切断の経過時間を示す。
【図20】 図20は、網膜下注射の8週間後の野生型マウスC27BL/6(+/+,W
F12)由来の網膜の光顕微鏡写真を示す。R−目(pHRz35+pHRz4
2リボザイムを注射されている)は、L−目(PBSを注射したコントロール目
)と比較して、そのONL、ROSおよびRIS厚が90%より多く減少した。
【図21】 図21は、6週間のp.i.における+/−マウスの、野生型γPDERzの
右目および左目についての暗順応(ROD)ERG波形を示す。フラッシュ強度
は、−1.1、−0.1、0.9、1.9log cd−s−m2である。
【図22】 図22は、ヌクレオチド配列(配列番号39)、およびRNA標的配列(配列
番号40)を含む抗IT15−2Rzハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図23】 図23は、ヌクレオチド配列(配列番号41)、およびRNA標的配列(配列
番号42)を含む抗IT15−4ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図24】 図24は、ヌクレオチド配列(配列番号43)、およびRNA標的配列(配列
番号44)を含む抗IT15−12Rzハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
【図25】 図25は、ヌクレオチド配列(配列番号45)、およびRNA標的配列(配列
番号46)を含む抗IT15−8Rzハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図26】 図26は、ヌクレオチド配列(配列番号47)、およびRNA標的配列(配列
番号48)を含むマウス抗NADHデヒドロゲナーゼMWFEサブユニットnt
338ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す。
【図27】 図27は、ヌクレオチド配列(配列番号49)、およびRNA標的配列(配列
番号50)を含むマウス抗MnSODnt432ハンマーヘッドリボザイムの構
造を示す。
【図28】 図28は、コード領域の114位におけるヒト網膜ABCRの標的鎖を示す。
ABCRリボザイムのヌクレオチド配列(配列番号81)が示され、そしてRN
A標的配列が、配列番号80として示される。
【図29】 図29は、ヒト網膜光受容体ABCトランスポーター(ABCR)cDNA(
配列番号65)のサブユニット配列を示す。
【図30】 図30は、Rz114オリゴ標的の時間経過を示す。
【図31】 図31は、Rzオリゴ標的の時間経過を、t1/2=240分、および半減期の
単指数崩壊を示す時間の関数として、基質の消失の半対数プロットとして示す。
obsは、t1/2=0.693/kobs、およびKobs=0.00289min-1
より得られる。
【図32】 図32は、基質発現実験の切断対時間のプロットを示す。リボザイム濃度は2
0nMであり、そして基質濃度は、100から2000nMまで変動する。この
直線の傾きは、直線回帰により計算され、そして図の右側に示される
【図33】 図33は、Rx144基質過剰研究を示す。
【図34】 図34は、ヌクレオチド配列(配列番号51)、およびRNA標的配列(配列
番号52)を含むマウス抗D1−1−T7 Rz52ハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。
【図35】 図35は、ヌクレオチド配列(配列番号53)、およびRNA標的配列(配列
番号54)を含むマウス抗D1−1−T7 Rz82ハンマーヘッドリボザイム
の構造を示す。
【図36A】 図36Aは、ヌクレオチド配列(配列番号55)、およびRNA標的配列(配
列番号56)を含む抗SOD−1186ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
【図36B】 図36Bは、ヌクレオチド配列(配列番号57)、およびRNA標的配列(配
列番号58)を含む抗SOD−1295ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
【図36C】 図36Cは、ヌクレオチド配列(配列番号59)、およびRNA標的配列(配
列番号60)を含む抗SOD−1359ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
【図36D】 図36Dは、ヌクレオチド配列(配列番号61)、およびRNA標的配列(配
列番号62)を含む抗SOD−1429ハンマーヘッドリボザイムの構造を示す
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EE ,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR, HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,K P,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU ,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX, NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,S G,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ ,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ハースワース, ウィリアム ダブリュ ー. アメリカ合衆国 フロリダ 32608, ゲ インズビル, エスダブリュー 89ティー エイチ ストリート 12001 (72)発明者 テッセンドルフ, クリスチャン アメリカ合衆国 フロリダ 32608, ゲ インズビル, エスダブリュー ウィリス トン ロード 2330 (72)発明者 バーガー, コリンナ アメリカ合衆国 フロリダ 32608, ゲ インズビル, アパートメント エス114, エスダブリュー 52エヌディー アベニ ュー 10000 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA07 CA04 CA11 CA12 EA02 HA17 4B050 CC04 LL01 LL03 4B063 QA08 QQ08 QQ43 QR32 QR35 QR77

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 選択した機能を有する少なくとも第1遺伝子を同定する方法
    であって、該方法は、該少なくとも第1遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子と
    、リボザイムのライブラリーとを接触させる工程、および少なくとも、該少なく
    とも第1遺伝子の該選択した機能を変化させる、該ライブラリー由来の第1リボ
    ザイムを同定し、これによって、該選択した機能を有する該少なくとも第1遺伝
    子を同定する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項2】 前記複数の遺伝子が、動物内に含まれる、請求項1に記載の
    方法。
  3. 【請求項3】 前記複数の遺伝子が、哺乳動物内に含まれる、請求項1また
    は2に記載の方法。
  4. 【請求項4】 前記複数の遺伝子が、ヒト遺伝子である、請求項1〜3のい
    ずれか1項に記載の方法。
  5. 【請求項5】 前記リボザイムの少なくとも1つが、ハンマーヘッドリボザ
    イムである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記リボザイムが、化学的に合成される請求項1〜5のいず
    れか1項に記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記リボザイムのライブラリーが、複数のアデノ随伴ウイル
    スに含まれる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 【請求項8】 同定された前記少なくとも第1リボザイムを単離する工程を
    さらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 【請求項9】 前記少なくとも第1リボザイムのヌクレオチド配列を得る工
    程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 【請求項10】 同定された前記少なくとも第1遺伝子を単離する工程をさ
    らに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 【請求項11】 前記少なくとも第1遺伝子のヌクレオチド配列を得る工程
    をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 【請求項12】 前記少なくとも第1遺伝子が、(a)網膜変性、(b)網
    膜疾患、(c)学習または記憶、(d)筋萎縮性側索硬化症、あるいは(e)腫
    瘍抑制に随伴する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 【請求項13】 前記少なくとも第1遺伝子が、ロドプシン、(b)NAD
    Hデヒドロゲナーゼのサブユニット、(c)cGMPホスホジエステラーゼのサ
    ブユニット、(d)p53、(e)p16,(f)網膜芽細胞腫、(g)p19
    ARF、(h)スーパーオキシドジスムターゼ、(i)マンガンスーパーオキシ
    ドジスムターゼ、または(j)CREBをコードする、請求項1〜12のいずれ
    か1項に記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記cGMPホスホジエステラーゼのサブユニットがβサ
    ブユニットまたはγ−サブユニットである、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項15】 前記NADH−デヒドロゲナーゼのサブユニットが、MW
    FEサブユニットである、請求項13に記載の方法。
  16. 【請求項16】 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法であって、前
    記少なくとも第1遺伝子が、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号1
    0、配列番号12、配列番号18、配列番号24、配列番号30、配列番号32
    、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、
    配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配
    列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列
    番号64、配列番号65、および配列番号80からなる群から選択される、核酸
    配列を含む、方法。
  17. 【請求項17】 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法であって、前
    記少なくともリボザイムが、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9
    、配列番号11、配列番号17、配列番号23、配列番号29、配列番号31、
    配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配
    列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列
    番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番
    号63、および配列番号81からなる群から選択される、ヌクレオシド配列を有
    する、方法。
  18. 【請求項18】 請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法によって同定
    される、単離された遺伝子。
  19. 【請求項19】 請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法によって同定
    される、単離されたリボザイム。
  20. 【請求項20】 選択した機能を有する本質的に全長の遺伝子を同定する方
    法であって、該方法は、該本質的に全長の遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子
    を、該本質的に全長の遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第1リボザイムと
    接触させ、これにより、該選択した機能を有する該本質的に全長の遺伝子を同定
    する工程を包含する、方法。
  21. 【請求項21】 選択した遺伝子の機能を同定する方法であって、該方法は
    、該選択した遺伝子を含むと疑われる複数の遺伝子を、該選択した遺伝子のリボ
    核酸を切断するリボザイムと接触させる工程、および該リボザイムの効果を同定
    し、これにより、該選択した遺伝子の機能を同定する工程を包含する、方法。
  22. 【請求項22】 非ヒト動物に選択した生理学的に異常な状態を誘導する方
    法であって、該方法は、該選択した生理学的に異常な状態を予防することに随伴
    する少なくとも第1遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第1リボザイムを、
    該非ヒト動物に投与し、これにより、該非ヒト動物に該選択した生理学的に異常
    な状態を誘導する工程を包含する、方法。
  23. 【請求項23】 請求項22に記載の方法であって、前記生理学的に異常な
    状態が、(a)網膜変性、(b)網膜疾患、(c)癌、(d)腫瘍形成、(e)
    記憶損失、(f)学習障害、または(g)筋萎縮性側索硬化症である、方法。
  24. 【請求項24】 ヒト疾患の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、該
    方法は、(a)生理学的に異常な状態を有する動物を選択する工程、および(b
    )該選択した生理学的に異常な状態を予防することに随伴する少なくとも第1遺
    伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第1リボザイムを、該動物に投与し、これ
    により、該ヒト疾患の動物モデルを作製する工程を包含する、方法。
  25. 【請求項25】 請求項24に記載の方法であって、前記動物由来の子孫を
    得る工程をさらに包含し、該子孫が、前記生理学的に異常な状態の症状を示す、
    方法。
  26. 【請求項26】 ヒト疾患の非ヒト動物モデルを作製する方法であって、該
    方法は、選択した生理学的に異常な状態を生じることに随伴する少なくとも第1
    遺伝子のリボ核酸を切断する少なくとも第1の選択したリボザイムを、該動物に
    投与し、これにより、該ヒト疾患の動物モデルを作製する工程を包含する、方法
  27. 【請求項27】 請求項26に記載の方法であって、前記動物由来の子孫を
    得る工程をさらに包含し、該子孫が、前記生理学的に異常な状態の症状を示す、
    方法。
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