JPH07509133A - 動物疾患の処置のための方法および剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９、該細胞がヒトの細胞である請求の範囲８記載の細胞。

１０、請求の範囲１．２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を哺乳動物の細胞内 で発現させる方式で、該酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含有している発現 ベクター。

１１、請求の範囲１．２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与するこ とによって、炎症疾患、関節炎の症状、狭窄の症状または心血管病の症状を治療 する方法。

１２　該患者がヒトである請求の範囲１１記載の方法。

明細書 動物疾患の処置のための方法および剤 発明の背景 本発明は、以下を包含する様々な動物疾患を抑制するための方法に関する：ａ） 炎症性疾患、特に、炎症または前炎症状態における免疫性細胞増殖の削減または 排除をもたらす遺伝子の発現の抑制＋ｂ）骨関節炎、特に、マトリックス金属プ ロティナーゼによる細胞外のマトリックス消化作用の削減または排除をもたらす 遺伝子の発現の抑制；Ｃ）狭窄症状、特に、再狭窄血小板領域中での細胞増殖の 削減または排除をもたらす遺伝子の発現の抑制；およびｄ）高血圧症等の心血管 病、特に、アンギオテンシン転換酵素の活性によ°り媒介される高血圧症。

炎症性疾患 炎症は、局部的な発熱、腫れ、発赤、痛みおよび時には機能の低下を特徴とする 刺激、感染または損傷に対する組織の反応である。組織が生理学上の損傷を受け る場合、損傷を受けた細胞は、リンパ細胞を引き付け、治療するのに必要な細胞 の成長を促進する化学物質（サイトカインおよび細胞接着分子）を合成および／ または放出する。挫傷部へのリンパ細胞の侵入は、より多くの生物学的応答を変 化させる分子の放出をもたらすが、これにはブラジキニン、蛋白質のインターロ イキンファミリーにより例示される免疫調節分子等の血管調節物質を包含する。

治療が起こると、免疫細胞の侵入は弱まり、炎症の進行がとまる。乾田、喘息、 頭部外傷および全身性炎症応答症候群（ＳｉＨ２）において観察される状態等の 生理学上のある状態下では、その状態は不適当な細胞制御のため持続する。持続 性の炎症状態は急性でも、慢性でも一般に炎症性疾患と呼ばれる。

炎症性疾患は、乾田により例示されるが、乾田は表皮での基底ケラチノサイトの 過度の成長により起こる皮膚疾患である。ケラチノサイトの制御されないこの成 長は、Ｔ−細胞が侵入することによる刺激により起こると考えられる。組織が傷 つきその後循環している免疫細胞によりその損傷が認識されることにより、正常 皮膚の乾田病変への転化が始まる。急性炎症反応が続いて起こり、様々なサイト カイン、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１ （ＩＬ−１）を包含する成長因子がその結果放出される。白血球が侵入すること により放出される多くのサイトカインは、ケラチノサイトの表面での細胞接着分 子の生産を誘発し、一方で他は基底ケラチノサイトの増殖を誘発し、そしてさら なる成長の自己刺激となるかまたはケラチノサイトの増殖を制限する正常な制御 を抑制するケラチノサイト因子を結果として放出する。さらにその損傷は、循環 に復帰するＴ−細胞の局部的な活性化を引き起こし、その後、損傷のあった最初 の場所からかなり離れている乾田状態の原因となり得る。

急性相炎症作用物質の誘導は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファの生産を引き起 こす；これらの両方の分子は、ケラチノサイトの細胞表面でＴ−細胞ホーミング 蛋白質、Ｉ−ＣＡＭ、ＥＬＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１１７＋出現を誘発する。

ＴＮＦ−αもまた、ケラチノサイトによるＴＧＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８ の生産を誘発する。サイトカインならびにケラチノサイトおよび侵入する白血球 により生産される成長因子は、制御されないケラチノサイトの増殖の原因となる 。

基底層ケラチノサイトが増殖するにつれて、基底上ケラチノサイトは、ケラチノ サイトが一般的に角質化エンベロブ層および皮膚角質層を形成する皮膚の表面に 接近して押される。基底ケラチノサイトによる異常な増殖速度は、表皮および皮 膚角質層の不適切な形成を引き起こし、乾田の皮膚の特性である赤く、鱗状の症 状の発生を引き起こす。ケラチノサイトの成長規制の欠乏は、ケラチノサイトが 挫傷治療に対する終了シグナルに応答しなくなる、１つの遺伝子または遺伝子群 における同定されない突然変異が原因であるとされている。

米国には、乾田に悩む患者は３００万人いる。乾田に役立つ処置にコルチコステ ロイドがある。最も広く処方されているものには、局所的塗布用として開発され たテモベート（ＴＥＭＯＶＡＴＥ）’（クロベタゾールプロピオン酸）、リデッ クス（ＬＩＤＥＸ）（フルオノノニド）、ジブロレン（ＤＩＰＲＯＬＥＮＥ）（ ベタメタシンプロピオン酸）、ブソルコン（ＰＳＯＲＣＯＮ）（ジフロラゾンジ アセテート（ｄｉｆｌｏｒａｓｏｎｅ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ）　）およびトリア ムシノロン（ＴＲＩ　ＡＭＣｌＮ０ＬＯＮＥ）がある。コルチコステロイドの作 用のメカニズムは多要素からなり、おそらく細胞応答の単なる抑制が原因ではな い。疾患の潜在的な原因は残存しており、処置を中止すると元の状態に戻るため 、これは緩和療法である。消耗症、毛細管拡張症および紫斑病等の副作用が現れ ることにより、しばしば処置の中止が促される。コルチコステロイドは、長期治 療、または広くおよび／または炎症が起きた領域の処置が必要な場合、勧められ ない。代わりの処１には、エトレチ不−）　（６ｉｒｅｔｉｎａｔｅ）等のレチ ノイドがあるが、それは重症の難治性転宿を処置するために是認されている。代 わりのレチノイドを基礎とした処置は進んだ臨床試験において用いられる。レチ ノイドは、ケラチノサイトを分化した状態に換え、正常な皮膚の生育を回復させ ることにより作用する。サイクロスポリン等の免疫抑制薬もまた、臨床試験の発 展段階にある。コルチコステロイド、レチノイドおよび免疫抑制薬の作用の非特 異的なメカーニズムのため、現在の全ての読癖の処置は重篤な副作用を示し、生 命を脅かしたり不興の健康状態でない限り、長期間の使用をするべきでない。読 癖患者には、毒性のほとんどない、効果的な治療薬の要求がある。

先進工業国の人口の約５％が喘息にかかっており、依然として診断され処置され ている。喘息の発生および流行が増加しているという証拠がある。喘息に役立つ 療法が増えているにもかかわらず、このような傾向が起こるが、これは現在の喘 息の処置法が不十分であるかまたは適切に利用されていないということを示唆す る。最近では、慢性の喘息は、気道で特有の炎症応答を伴うと理解されている。

命取りとなる喘息は気道の粘膜上組織表面での炎症性変化と関連があると長い間 理解されてきたが、現在では非常に軽い喘息の患者の中では炎症が問題となると いうことが明らかである。免疫細胞、特に好酸球およびリンパ球、の侵入ならび に上皮剥離は重要な特徴であることが患者の生検により示された。さらに、好酸 球増多症の度合いと気管支過敏度の間には強い相互関係がある。好酸球は患者の 気道上皮のダメージ領域に局在する。その好酸球により放出される基本蛋白質は 、これらの患者に観察されるそのダメージに實任を果たせるかもしれない。疾患 における肥満細胞および好中球の役目は不確定である。リンパ球は組織ダメージ の場所に存在するが、それらの役目は好酸球増多症応答を増幅する媒介物質のよ うであるかもしれない。実際には、Ｔ−リンパ球により放出されるインターロイ キン−５は、気道での好酸球の作用を維持し準備する際は重要である。

盟邑合 関節炎にはいく種かのタイプがあり、骨関節炎およびリウマトイド関節炎（ｒｈ ｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）が主流をなす。骨関節炎はゆっくり進 行する疾患であり、準軟骨の増殖や作り直しをする関節の軟骨の退化により特徴 付けられる。痛み、歪みおよび関節の動きの低下のための臨床的症状として現れ る。リウマトイド関節炎は、慢性の全身炎症疾患である。リウマトイド関節炎は 、軽くて再発する場合も、重くて進行する場合も、関節の歪みをもたらし無能力 にする。

関節炎は主に、高齢者の間で機能的な損傷の原因となる。関節炎は身体障害の主 な理由の１つであり、初老人の入院費用およｉ健康管理費の大部分を占める理由 となる。関節炎は、５５才以上の高齢の人々約１００万人にとって無能力の主要 な原因であると評価され、約１００万Å以上の人々にとって重要な原因であると 考えられる。

骨関節炎の発症の診断は幾つかの理由のため困難である。第１番目に、骨関節炎 はレントゲン写真の読み取りを基に客観的に診断されるが、レントゲン上で疾患 の形跡が認められる人々の中には明らかな症状を示さない人が多い。第２番目に 、罹患している関節すべてののレントゲン写真は入手出来ないため、流行の評価 は臨床的評価に基づく。１９８９年のナネシ（ＮＨＡＮＥＳＩ）調査でのデータ は、背骨、ひざ、腰、および末梢の関節のいかなる異常も他の特別の診断と同様 に示される完全な筋骨評価に基づ（ものである。この所見に基づくと、２５〜７ ４才の米国国民の１２％は骨関節炎であった。

リウマトイド関節炎は世界に広く分布し、全ての人種および民族グループに影響 を与えていることは、一般に同意されている。米国での正確な罹患率は不明であ るが、０．５〜１．５％の範囲であると評価される。リウマトイド関節炎は全て の年齢で起こり、一般に年齢が進むと罹患率が増加する。男性においてより女性 においてのほうが２〜３倍はやっており、発症のピークは４０〜６０才で起こる 。免疫学的要因に加えて、環境的、職業的および心理的・社会的双方からの要因 が、疾患における潜在的な因果関係学の役割のために研究されている。

多細胞有機体の細胞外マトリックスは、組織の形成および維持において重要な役 割を果す。細胞外マトリックスの網構造は内在する細胞により蓄積され、細胞− 細胞伝達における透過性関門であるのと同様、細胞接着および移動に対する骨格 構造を提供する。正常な成長および分化または病的状態下で、結合組織のターン オーバーは、中性の金属ブロティナーゼファミリーにより媒介されると考えられ るが、これは、十分な活性のためにはカルシウムを必要とする亜鉛含有酵素であ る。金属プロティナーゼ発現の調節は細胞タイプに特有であり、種の間で異なる かもしれない。

最も特徴的なマトリックス金属プロティナーゼ、間質性コラゲナーゼ（ＭＭＰ− １）はコラーゲンタイブエ、■および■にとって特異的である。ＭＶＰ−１は、 間質性コラーゲンの続いて起こる分解が始まる１点で３重螺旋の３つのα鎖全て を切断する。間質性コラゲナーゼ活性は、炎症関節炎を患う患者の滑液と同様に 、リウマトイド関節滑液中で観察された。ゲラチナーゼ（ＭＭＰ−２）は、２つ の異なる遺伝子生成物からなる金属ブロティナーゼのサブグループを示す、すな わちほとんどの結合組繊細胞により発現される７０ｋＤａゲラチナーゼ、ならび に炎症性食細胞および腫瘍細胞により発現される９２ｋＤａゲラチナーゼである 。

より大きな酵素は、マクロファージ、５Ｖ−４０で形質転換したフィブロブラス トおよび好中球により発現される。より小さな酵素は、正常な人間の皮膚フィブ ロブラストと同様に、Ｈ−ラスで形質転換した気管支上皮細胞および腫瘍細胞に より分秘される。これらの酵素は、天然コラーゲンタイプＸと同様に、ゼラチン （変性コラーゲン）を分解する。ストロムライシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ） 　（ＭＭ　Ｐ　−３）には、細胞外マトリックスを構成する分子において広い範 囲の作用がある。

ストロムライノンは、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、タイプ ■および■コラーゲンならびにゼラチンを消化し、プロコラーゲンからＮ−末端 プロペプチド部を取り去ることができ、このようにしてコラゲナーゼを活性化さ せる。これは、人間の軟骨抽出物、リウマトイド関節滑液中、およびコラーゲン 誘発関節炎のラットの清液および軟骨細胞中で見いだされた。

骨関節炎およびリウマトイド関節炎の両方は、これらの疾患で観察される細胞外 マトリックスの破壊に包含されるマトリックス金属プロティナーゼの合成を誘発 するサイトカインまたは成長因子を抑制する化合物で主に処置される。現在の臨 床処置はデキサメサゾンおよびレチノイド化合物に依存しているが、これらは様 々な金属ブロティナーゼの抑制剤である。処置された細胞における遺伝子の発現 に対するデキサメサゾンおよびレチノイド処置による広範な影響は、代替なる、 特に長期間の処置にとって好ましい療法を発達させる。最近、ガンマ−インター フェロンは、培養マクロファージ中でコラゲナーゼおよびストロムライシン生成 を誘発するりポポリサッカライドを抑制することが示された。また、組織成長因 子−β（ＴＧＦ−β）は、インビトロにおいてストロムライシン合成を誘導する 上皮成長因子（ＥＧＦ）をブロックすることが示された。遺伝子治療のアプロー チを伴う実験プロトコルには、金属ブロティナーゼ抑制因子ＴＩＭＰ−１および ＴＩＭＰ−２の発現を制御すること包含する。最近の３つのアプローチの中で、 現在ではガンマ−インターフェロン処置だけしか臨床応用で実行できない。

狭窄症 狭窄症は血管での閉塞の発生が原因である。そのような閉塞は、機能の損傷また は死さえもたらす場合があるが、それは閉塞の生じる血管とその大きさによる。

これらを以下に述べるようにして防止することができる。この状況の例の１つに 再狭窄がある。再狭窄とは、経皮トランスルミナル血管形成術（ｐｅｒｃｕｔａ ｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ　ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）　（Ｐ　ＣＴ Ａ）または冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）の後に続発症として発症する症状で ある。主に、血管壁の内膜の固有層中で平滑筋細胞（アテロフィル（ａｔｈｅｒ ｏｐｈｉｌｓ）　）の増殖および固有層中で存在する他の細胞タイプの増殖によ りこのような状況が起こる。細胞増殖の第２の影響は、コラーゲンおよびマトリ ンラス蛋白質合成の増加である。動脈内膜および周囲の接続組織の細胞増殖によ り、内膜が厚くなり、血管の伸縮性が低下し、罹患している血管の部位通過する 血液量が少な（なる。　炎症は再狭窄の病理学においである役割を勤めているか もしれないが、再狭窄の病理には他の病理学的なメカニズムも含有され、そして これがおそらくこの疾患の根源的な原因を示す。再狭窄と関連する病理学的なメ カニズムを、いつ再狭窄が起こるかに基づいて３つのカテゴリーに分けることが できる。３つのカテゴリーおよび３つのメカニズムは、１）ＰＣＴＡの前および 後、血栓症、血小板活性化および血栓症発生：　２）ＰＣＴＡの後即時：伸縮性 反動；３）ＰＣＴＡの後遅延：繊維細胞の増殖である。ＰＣＴＡを経験した患者 の約１０％に急性または即時の再狭窄が起こり、その患者の約３０％にゆっくり と進行する再狭窄（６力月で発病）が発生する。１９９０年に調べられたＰＣＴ Ａ患者の数は３００，０００〜４００，０００であった。従って、米国には１年 当たり約１５０．０００人の再狭窄患者がいる。

現在では好ましい化学療法での患者の処置には、ストレプトキナーゼ、ウロキナ ーゼ、または魚油、抗凝固剤、ＡＣＥ　（アンギオテンシン転換酵素）抑制剤、 アスピリンおよびコレステロール低下化合物等の他の血栓溶解性化合物が使用さ れる；これらに代わる処置にはエンドルミナル・ステンツ（ｅｎｄｏｌｕＩｌｉ ｎａｌ　５ｔｅｎｔｓ）の外科的な埋め込みを含む。現在の療法には、再狭窄の 発生率に有意な効果を与えるものはないと報告されている。多（の化合物は現在 、前臨床評価中である。

血小板抑制剤には、ＧＲ３２１９１、スルトロパン（Ｓｕｌｔｒｏｂａｎ）　、 ケタンセリン（Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ）　、および魚油を含む。アンギオペプチ ンは、成長因子抑制剤として試験中であり、ロボスタチン（Ｌｏｖｏｓｔａｔｉ ｎ）、ニックサバリン（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）、ＲＤヘパリル（Ｂｅｐａｒｉ ｌ）　、シラザブリル（Ｃｉｌａｚａｐｒｉｌ）およびホシノブリル（Ｆｏｓｉ ｎｏｐｒｉｌ）は平滑筋細胞増殖防止剤として研究中である。血小板防止剤は再 狭窄を防止するためのテスト中であるが、これらの化合物は短期間の処置では有 効でないようである。現在の治療による最も大きな問題の１つには薬理学的副作 用の発生がある。これらの影響は、生理学的問題をうむだけでなく、患者の承諾 の水準を低下させ、それにより処置の治療的効能を減少させる。

アンセロフィル（ａｎｔｈｅｒｏｐｈｉｌｓ）の増殖は、様々な遺伝的な活性化 を通して誘発されるかもしれないが、平滑筋増殖を標的とする最も有力な候補は ｃ−ｍｙｂ遺伝子である。ｃ−ｍｙｂ蛋白質はＤＮＡと結合し、ＤＮＡの複製お よび細胞の成長を活性化する。平滑筋細胞の複製におけるｃ−ｍｙｂの役割は、 牛の細胞で証明され、ｃ−ｍｙｂの発現は鶏の初期繊維芽細胞および人間のＴ− リンパ球で細胞の複製をを活性化すると示された。

細胞成長因子もまた、動脈内膜細胞の局部的な増殖において、ある役割を勤めて いるかもしれない。その領域への外傷は、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ。

内皮細胞誘導弛緩因子、Ｃ０ＲＰおよびアンギオテンシンｎ等の多くの因子の放 出を誘発するかもしれない。これらの因子のどれもが再狭窄の血小板中の細胞増 殖の誘発において、ある役割を勤めることができるが、これらの因子は標的細胞 における二次伝達子系を通じてそれらの影響を及ぼす水溶性蛋白質である。かか る伝達子系のひとつはＮＦ−にＢカスケードである。ＮＦ−にＢ蛋白質は細胞転 写を活性化し、細胞合成経路において増殖を誘発する。休止細胞中では、この蛋 白質は細胞質に認められ、抑制剤ＩにＢと配位している。■にＢ分子のリン酸化 により、その錯体は解離し、ＮＦにＢは、ＮＦにＢがＤＮＡと結合しくＮＦ−に Ｂ）一応答遺伝子中で転写活性を誘発する核への移送のため放出される。（ＮＦ −にＢ）一応答遺伝子のうちの１つにＮＦ−にＢ遺伝子がある。このように、錯 体からのＮＦ−にＢ蛋白質の放出の結果、自己誘発される遺伝子の発現のカスケ ードが動（。

発明の要旨 本発明はりボザイムの様々な動物の疾病、特に上記に記載したヒトの疾病の治療 または予防への使用に関する。

かかる疾病のひとつは乾田であり、これは例えば活性化されたリンパ球内におけ る腫瘍壊死因子の合成を抑制することにより治療し得る。本発明は、またリボザ イムを、例えばリンパ球内におけるＩＬ−５合成を抑制し、そして好酸球の供給 および活性化を阻害することによって慢性喘息を治療することにも用い得る。

ケラチノサイト、Ｔ−リンパ球、単核球またはマクロファージ上に発現した標的 とするｍＲＮＡ　（腫瘍壊死因子およびＩＬ−５のｍ　ＲＮ　Ａ　）の切断は、 腫瘍壊死因子およびＩＬ−５それぞれの合成を抑制する。

多くの他のサイトカインもまた、喘息患者における炎症の活性化の要因に含まれ 、これには血小板活性化因子、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−Ｃ３Ｆ。

ＴＮＦα；ガンマ・インターフェロン、ＩＬＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１およびＥ。

Ｃ３Ｆを含む。これらのサイトカイン類に加えて、サイトカイン類の活性を媒介 するいずれの細胞レセプター類もまた、炎症性疾患に干渉する際に良い標的とな ることが期待される。これらの標的には、気道内のケラチノサイト、上皮細胞お よび内皮細胞上のＩＬ−ＩＲおよびＴＮＦαＲが含まれるが、これに限定される ものではない。最近のデータはある特定のニューロペプチドが喘息の症状におい である役割を果していることが示唆されている。これらのペプチドにはサブスタ ンスＰ、ニューロキニンＡおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチドが含まれる。

これらの標的遺伝子は炎症性疾患においてより一般的な役割を果しているかもし れないが、現在のところ喘息においてのみ役割を果すと仮定されている。喘息に おいである役割をはだすと考えられている他の遺伝子はｃ−ｍｙｂおよびｃ　− ｍｙｃ遺伝子であるが、これらは内皮細胞の増殖誘導のトリガーとなり、その結 果として気道が閉塞する。当業者であれば上述の他の標的となり得るものもまた リボザイムによる治療に適し、これによって炎症性疾患の発生の危険性を減少さ せることを認識するであろう、これにはインターロイキン類（１，３，４，６， および８）、グリセロールトランスフェラーゼ、セレクチン（Ｅ−セレクチン、 ＭＥＬ−１４）、細胞接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、 ＧＭＰ−１４０、ＭＡＭ）ＴＧＦ−α、ＩＬ−ＩＲＳＴＧＦαＲＳＥｏＣＳＦ、 α−１β−１γ−インターフェロン、ＥｏＣ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、プロティンキ ナーゼＣ（ＰＫＣ）が例示される。

特に好ましい態様において、ＴＮＦαのヌクレオチド３７４から２８２に対する リボザイムはＴＮＦα蛋白質産生の抑制に用い得る。この領域内のＲＮＡの二次 構造のため、この領域は標的とするには非常に良い領域ではないかもしれない。

先行文献のヌクレオチド３８０からはじまり、ヌクレオチド４１２までの（以下 に記載の我々の配列表では４０８〜４４０）の隣接領域は、比較的アクセスしゃ すいＲＮＡ槙造を含み、そしてそれゆえヌクレオチド３７４〜３９３（我々の配 列表のヌクレオチド番号では４０２〜４２１）の領域よりさらに改善された標的 となる。

他の疾患としては関節炎があり、これは間接の滑膜内におけるコラゲナーゼおよ びストロムライシン産生を抑制することによって治療し得る。リボザイム処置は 、基本的に発生前の組織のダメージに作用する免疫細胞を標的とする現在の治療 においてパートナ−となり得る。コラゲナーゼまたはストロムライシン誘導性の ダメージを減弱する初期のりボザイム処置の後に、必要に応じて抗炎症剤または 抗レチノイドを投与してもよい。この方法では、プロテアーゼの発現を転写およ び翻訳レベルで制御し得る。リポザイム処置は、患者に臨床的に症状が発現する 前に、骨関節炎の放射性標識を発現させるのに用い得る。リボザイム処置はスト ロムライシンの発現に対し、レチノイドおよびデキサメサゾンを投与した場合に 生じるような、遺伝子発現に対する非特異的影響を与えることなく衝撃を与え得 る。ストロムライシンにプロコラゲナーゼ活性化能があることから、ストロムラ イシンの発現を減弱させるリボザイムが骨関節炎（主にストロムライシンの関与 する病理である）およびリウマトイド関節炎（主にコラゲナーゼ活性の増強が関 与する）の両方に対して有効であることが示される。

多くのサイトカインおよび成長因子が、傷の治癒過程およびプレ骨関節炎の組織 の損傷において金属プロテアーゼ活性を誘導するが、これらの分子は治療のため の干渉に対する好ましい標的とはならない。基本的に重要なのは、細胞外マトリ ックスの破壊を司る分子の抑制である、というのはほとんどの場合レントゲンま たは臨床的な症候を示した後の処置であるからである。金属プロテアーゼ（制御 されていない場合には細胞外マトリックス最も強い構造的ダメージを与え得る） を最も変化させ得るのはストロムライシンである。加えて、この分子はプロコラ ゲナーゼを活性化し得、これによって細胞外マトリックスのコラーゲンバックボ ーンにさらなるダメージが与えられる。正常条件下においてプロストロムライシ ンから活性ストロムライシンへの転換はＴＩＭＰ（ＭＶＰの組織抑制剤）と呼ば れる抑制剤の存在によって調整される。溝膜細胞内のＴＩＭＰのレベルはプロス トロムライシンのレベルより過剰であり、ストロムライシンの活性は滑液の関与 する非関節炎細胞には無いため、非標的細胞におけるストロムライシン活性の抑 制による毒性は無視し得るものである。

従って、本発明はりポザイムを使用して、例えば溝膜細胞におけるプロストロム ライシン分子合成を抑制し、又は上述の他のマトリックス金属プロテイナーゼを 抑制することによって関節炎、特に骨関節炎の処置または予防する方法を提供す る。マクロファージ、好中球および溝膜細胞内に発現した標的とするｍＲＮＡ（ ストロムライシンのｍＲＮＡ）を切断すると、ストロムライシンおよびプロスト ロムライシンからのザイモザン合成が抑制される。当業者には、上述の標的とな る可能性のある他のものもまたリボザイムによる処置に適しており、これによっ てコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ等の金属プロテイナーゼ、または滑液もしく は軟骨細胞内のこの金属プロテイナーゼのプロエンザイム型を活性化さる他のプ ロテイナーゼ、この金属プロテイナーゼの発現を活性化するサイトカインおよび 成長因子、およびマクロファージおよび好中球を組織損傷領域へ引き寄せる接着 分子のごとき、病原となる細胞外マトリックスあ分解を引き起こすものを生じさ せる危険性がないことが認識されるであろう。

その他の疾患としては狭窄があり、これは例えば平滑筋の増殖の活性化を細胞ｃ −ｍｙｂ遺伝子の発現を抑制することによって抑制し得る。標的とした、内皮細 胞および平滑筋細胞内で発現しているｍＲＮＡ　（ｃ−ｍｙｂのｍＲＮＡ）の切 断により、平滑筋もしくは内皮細胞の細胞の複製および正常でない細胞の増殖が 抑えられる。再狭窄の危険性のある領域における細胞増殖の発生の危険性を減少 するための、リボザイム処置に適した標的となり得る他のものは、ＴＧＦ−β、 ＮＦ−にＢＳＰＤＧＦＳｂＦＧＦ、内皮細胞由来弛緩因子、ＣＧＲＦおよびアン ギオテンノンＩＩをコードするｍＲＮＡである。

その他の疾轡としては、心血管病があり、これは例えばアンギオテンシン変換酵 素（Ａ　ＣＥ）によるアンギオテシンンの活性化を抑制する、またはエンドセリ ン変換酵素（ＥＣＥ）の活性を抑制することによって治療し得る。内皮細胞に発 現した標的としたｍＲＮＡ　（ＡＣＥのｍＲＮＡ）を切断すると、アンギオテン シンの血管活性形の水準が減少する。当業者であれば、心血管病の発生を減少さ せるためのりボザイム処理の標的となり得る他の多くのｍ　ＲＮ　Ａ　、例えば ＨＭＧＣｏＡ還元酵素、レニン、ブラジキニン、プラスミノーゲン、第１Ｘ、Ｘ Ｉおよび■因子、２−５Ａ合成酵素、ＡＤＨおよびフィブリノーゲンをコード化 するｍＲＮＡを認識し得る。

リボザイムはヌクレオチド塩基配列内において、ヌクレオチド塩基配列に特異的 な方法によって、別個の独立したＲＮＡ分子を繰り返し切断し得る酵素活性を有 するＲＮＡ分子である。かかる酵素的ＲＮＡ分子は、実質的に全てのＲＮＡ転写 の標的とされ得、そしてインビトロでは効果的な切断が得られている。キムら、 （８４）ブロン−ディング・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ニー ニスニー８７８８．１９８７；ヘーゼロフとゲルラッハ、（３３４）ネイチャー ５８５．１９８８　＋セーフ、（２６０）ジェイエイエムエイ３０３１．１９８ ８およびンエフェリースら、（１７）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ１３７ １．１９８９゜ リポザイムは最初に標的ＲＮＡに結合することによって働く。かかる結合は、標 的ＲＮＡを切断するように働＜ＲＮＡの酵素部位にきわめて近接した位置に保持 されている、リボザイムの標的ＲＮＡ結合蛋白質を介して生じる。即ち、リポザ イムは最初に標的ＲＮＡを認識し、その後標的ＲＮＡと相補的塩基対の形成を介 して結合し、そして一旦正確な位置に結合した後は標的ＲＮＡを切断するように 酵素的に働く。かかる標的ＲＮＡの切断戦略は、そのコード化する蛋白質の合成 を制御する能力を破壊する。リポザイムが結合し、そのＲＮＡ標的を切断した後 、切断されたＲＮＡからリポザイムが遊離して他の標的を探し、そして繰り返し て新しい標的に結合および切断し得る。

リボザイムの酵素的性質は、アンチセンス技術（核酸分子が単に核酸標的へ結合 してその翻訳をブロックするもの）のごとき他の技術より有利である、というの は治療のための処置に必要なりポザイムの効果的な濃度は、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドより低いからである。°この有利性はりボザイムが酵素的に働く際 の能力に反映されている。すなわち、１個のりボザイムが多くの標的ＲＮＡ分子 を切断し得るのである。加えて、リボザイムは高度に特異的な抑制剤であり、こ の抑制の特異性は結合の際の塩基対形成機構のみならずこの分子が結合するＲＮ Ａの発現の抑制機構にも由来するものである。即ち、抑制はＲＮＡ標的の切断に よって生じ、このため特異性は、切断された標的ＲＮＡと切断された非標的ＲＮ Ａの比として規定される。この切断機構は塩基対形成に含まれるものに加えてさ らに他の要因に依存している。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮ Ａ部位に結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチドより高いと考えられる。

このクラスの化学物質は、目的とする標的ｍＲＮＡの切断に対して高い特異性を 示す。その結果、リボザイム剤は特定の遺伝子を発現している細胞のみに影響を 及ぼし、正常組織に対して毒性ではないものとなる。

本発明は転層、喘息および他の炎症性疾患、および再狭窄もしくは他の高血圧を 含む心血管病を処置または防止（予防）するのに用い得る。好ましい投与方法は これらの遺伝子およびコード化された上述のｍＲＮＡのレベルを下げるための全 身投与である。

従って、第一の観点において、本発明は転層または喘息症状の発現もしくは維持 に関与するｍＲＮＡを切断するｍＲＮＡ、これは例えばＴＮＦ−ａ、ＩＬ−５、 ＬＬ−１，１１，−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＬ−８、グリセロールトランス フェラーゼ、セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＭＥＬ−１４、ＩＣＡＭ−１、ＥＬ ＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＧＭＰ−１４０，ＭＡＭ、ＴＧＦα、ＴＧＦαＲ，Ｉ Ｌ−ＩＲ１α−１β−もしくはγ−インターフェロン、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよびプロ ティンキナーゼＣをコードするｍＲＮＡが例示されるが、特に表１に示したｍＲ ＮＡ標的、を切断する酵素的ＲＮＡ分子（またはりポザイム）を提供する。

表１ 薗−ａ　ａＩＲＮ＾　配列番号 ７２．オ＋１、番号　（■Ｌ些ユ ２７　ＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＩＪＡ　ＩＤ、ＮＯ，０１５６ＧＣＭＣ ＵＡＣＡＧＡＣＣＣより、ＮＯ，０２７０ＣＣＣＣＩＪＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＣ ＩＪＣＡＧＡＣＧＣＩＤ、ＮＯ，０３９４ＣＡＣＡｔＪＣＣＣＣｔＪＧＡＣＡＡ ＧＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧ　ＩＤ、Ｎｏ、０４１３４　ＣＡＣＡＵＡＣｌＪＧ ＡＣＣＣＡ　より、ＮＯ，０５１５７ＣＣυＣｔｌＣｔｌＣＣＣＣＩＪＧＧＡＡ ＡＧＧ　より、Ｎｏ、０６１７６　ＡＣＡＣＣＡＵＧＡＧＣＡＣＵＧＡＡＡＧＣ ＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡＣＩＤ、ＮＯ，０７２５３ＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＵＣＣ ＡＧＧＣＩＤ、ＮＯ，０８２７０ＧＧＵＧＣ［ＪＵＧＬｒＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵ ＣＵＵＣより、ＮＯ，０９３１１ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＵＣＵＵＣより、ＮＯ，１ ０３６２ＭＧＡＧＵＵＣＣＣＣＡＧ　ＩＤ、ＮＯ，１１４０８ＡＧＵＣＡＧＡＵ ＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＭＣＣＣＣＧＡＧＵＧＡＣＭ　より、ＮＯ，１２４４６Ｕ ＡＧＣＣＣＡＵＧＵＩＪＧυ八ＧＣＡＡＡＣＣＣＵＣＭＧへＩＪＧＡＧＧＧ　Ｉ Ｄ、ＮＯ，１３５７４υＡＣＣＵＣＡＵＣ１ＪＡＣＵＣＣより、ＮＯ，１４５９ ９ＵＣＡＡＧＧＧＣＣＭＧＧＣＵＧＣＣＣＣＵＣＩＤ、ＮＯ，１５６２１ＣＡＣ ＣＣＡＬＩＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ　より、ＮＯ，１６６５２ＣＧＣＡＵ ＣＧＣＣＧＵＣＵＣＣＵＡＣＣＡＧＡＣＣＭ　より、ＮＯ，１７６９４ＧＣＣＡ ＵＣＡＡＧＡＧ　ＩＤ、ＮＯ，１８Ｂ２４　ＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ ＵＧＣＣより、ＮＯ，１９８６９ＵＣＡ（ＪＵＧＣＣＣＵＧＵＧＡＧＧＡＧＧＡ ＣＧＡＡＣＡＵＣＣＭＣＣＵ　より、ＮＯ，２０９９１ＣＵＵＡＧＧＧＵＣＧＧ ＡＡＣＣＣＭ　より、ＮＯ，２１１０４３ＡＡＡＣＣＵＧＧＧＡＵＩＪＣＡＧＧ 八Ａ　へ　より、ＮＯ，２２１０８４ＣＵＧＧＣＭＣＣＡＣＵＭＧＭＵ　より、 ＮＯ，２３１１１５ＵＣＣＡＧＭＣＵＣＡＣＵＧＧ　より、ＮＯ，２４１１８７ ＵＧＧＣＣＡＧＡＡＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＣＵＵＧＡＧＡ　より、Ｎ００２５１ ２１３　ＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡＡＵＵＧＡＣＡＣＭＧＵ　ＩＤ、ＮＯ ，２６１２７６ＣＵｔ）ＣＣｔｒＩＪＧＡＧＡ　ＩＤ、ＮＯ，２７Ｄ２２　ＵＣ ＵＡＭＡＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵｔＪＧＵＧ　より、ＮＯ，２８１３４４ＡＵＵＡ ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡｔ几ルＡＵＵＡＩ几刀Ａ頃川Ａ頭ルＡ　ＩＤ、ＮＯ，用 ９１３７８　ＣＡＧＡＵＧＡＡＵＧＵＡＵＵｔＪＡ′ＵＵＵ　より、ＮＯ，３０ ’１４０２　ＡＣＣＧＧＧＧυ八υＣＣへ　ＸＤ、ＮＯ，３１１４１９ＧＡＣＣ ＣＭＵＧＵＡＧＧＡＧＣＵＧＣＣＩＪＩＪＧＧＣＵＣＡＧ　ＸＤ、ＮＯ，３２１ ４９５ＡＧＣＣＣＣＣＵＧＧＣより、ＮＯ，３３１５１３ＣＣＬＩｔ７ＣＵＷＵ ＧＡＵＵＡＵＧＵｔＪＵＵＵＵＡＡＡＡＵＡｔｌｔＪＵＡＵＣより、ＮＯ，３４ １５５７ＧＵＣＩＪＡＡＡＣＡＡυＧＣｔＪ　ＩＤ、ＮＯ，３５１５８７ＧＵＣ ＡＣＵＣＡＵｔＪＧＣＵＧＡＧ　より、ＮＯ，３６１６３９ＣＵＡＣＵＡＵＵＣ ＡＧＵ　より、ＮＯ，３７１６５６ＧＡＡＡＵＡＡＡＧＵＵＵＧＣＵＵ　ＩＤ、 ＮＯ，３８ＩＬ−５ｌｌＲＮＡ　配列番号 ヌクレオチド番号　Σ烈　（ＴＤ、　Ｎｏ、　）１０　ＣＵＵｔＪＧＣＣＡＡＡ ＧＧＣＡＭＣＩＤ、ＮＯ，３９３３　ＣＧＵＩＪｔＪＣＡＧＡＧＣＣＡＵＧＡＧ ＧＡＵＧＣより、ＮＯ・４０６１　ＡＭＧＡＧＩＪＵＵＧＣＵＡＧＣＵＣＵＵＧ ＧＡＧＣＩＪＧ　より、ＮＯ，４１８８ＣＣＵＡＣＧＵＧＵＡＵＧＣＣＡＵＣＣ より、ＮＯ・　４２Ｄ９　ＡＧＡＣＣＵＵＧＧＣＡＣＵＧ　より、ＮＯ，４３１ ５ａ　ＵＡＣＵＣＡＵＣＧ晶ＣＵＣＵＧＣＵＧＡＵＡ　より、ＮＯ，４４２０９ ＵＧＵＡＣＡＵＡＡＡＡＡ　より、ＮＯ・４５２７５　ＡＡＡＣＵＧＵＧＣＡＡ 　ＩＤ、ＮＯ，４６２９９人ＡＡＧＡＣＵＡＵＵＣＡＡＡＡＡＣｔｎＪＧＵＣＣ より、ＮＯ，４７３７０ＡＧＡＣＧＧＡＧＡＧＵＡＡＡＣＣＭＵＵＣＣＵＡＧＡ ＣＵＡＣＣＵＧＣＩＤ、ＮＯ，４８５２２ＭＧＡＡＡＧＡＧＵＣＡ　ＩＤ、ＮＯ ，４９５５８ＡＣＬｒＵＣＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧ　より、ＮＯ，５０５７８ＡＵ ＵＵＣＡＧＧＣＡＵＡＣＵＧＡＣＡＣＭＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡ　より、ＮＯ， ５１６３５ＡＵＡＵＣＡＧＭＵＣＡ　より、ＮＯ，５２６６７ＣＡＡＡＡＵＵＧ ＡＵＡＵＡＣＵＵＵＩＪＬｒＵＣＵｔＪＡＵυＬＩＡＡ　より、ＮＯ，５３７３ ８ＧＭＡＵＧＧＩＪＵＭＧＭＵＵＵＧ　ＸＤ、ＮＯ，５４第２の観点において、 本発明は骨関節炎または他の金属プロテイナーゼの活性化により媒介される骨関 節炎または他の病的症状の発現および維持に関与するｍＲＮＡを切断する酵素的 ＲＮＡ分子を提供する。好ましい投与方法はストロムライシン活性のレベルを低 下させるためのインビボ投与である。

従って、本観点においては、本発明は関節炎症状の発現および維持に関与するｍ ＲＮＡ、例えばストロムライシンおよび特に、表２に示したその標的ｍＲＮＡを 切断する酵素的ＲＮＡ　（またはりポザイム）を提供するものである。

表２ 配列番号 ヌクレオチド番号　匡烈　（ＩＤ、　ＮＯ，）２０　ＵＡＧＡＧＣＵＭＧＵＡＡ ＡＧＣＣＡ（、より、ＮＯ，０１１２Ｇ　ＡＣＡＣＣＡＧＣＡＵＧＭ　ＩＤ、Ｎ Ｏ，０２１４７ＡＧＡＡＡｔｌＡＵＣＵＡＧＡ　ＩＤ、ＮＯ，０３１７１ＡＣＣ ＩＪＣＡＡＡＡＡＡＧＡＵＧＵＧＭＡＣＡＧＵ　ｒＤ、ＮＯ，０４２４０人ＡＡ ＵＧＣＡＧＭＧＵＬ７Ｃより、ＮＯ，０５２８７ＧＡＣＡＣＵＣＵＧＧＡＧＧＵ ＧＡＵＧＣＧＣＭＧＣＣＣＡＧＧＵＧＵ　ＸＤ、ＮＯ，０６３２７ＣＵＧＡＵＧ ｔ７ＵＧＧＵＣＡＣＵｔＪＣＡＧＡＡＣより、ＮＯ，０７３５７ＧＣＡＵＣＣＣ ＧＡＡＧＵＧＧＡＧＧＡＡＭＣＣＣＡＣＣＵｔＪＡＣＡＵ　より、ＮＯ−０１３ ４０２ＡＵＵＡＵＡＣＡＣＣＡＧＡＵＵＵＧＣＣＡＡＡＡＧＡＵＧ　ＸＤ、ＮＯ ，０９４２９ＣＵＧＵｔＪＧＡＵＵＣＩＪＧＣＵＧＵｔＪＧＡＧＡ　より、ＮＯ ，１０４５５ＣＵＧＡＡＡＧＵＣＵＧＧＧＡＡＧＡＧＧＵＧＡ　より、ＮＯ，１ １５１３ＣＵＧＡＵＡＵＭＵＧＡ　ＩＤ、ＮＯ，１２５９２ＵＧＣＣＵＡＵＧＣ ＣＣＣより、ＮＯ・　１３６２４　人υＧＣＣＣＡＣＵＵＵＧＡＵＧＡＵＧＡＵ ＧＭＣＭＵＧＧＡＣＡ　より、Ｎｏ、　１４６７９　ＡＵＵＵＣＵＣＧＵＵＧＣ ＵＧＣＵＣＡＵＧ　ＩＤ、ＮＯ，１５７２５ＣＡＣＵＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＵＧ Ａ　ＸＤ、ＮＯ，１６８０１ＭＧＡＵＧＡＵＡＵＡＡＡＵＧＧＣＡＴＪＵＣＡＧ ＵＣＣより、ＮＯ，１７８２７ＣＵＣＵＡＵＧＧＡＣＣＵＣＣＣＣＣＵＧＡＣＵ ＣＣＣＣＵ　より、ＮＯ，１８８５９ＣＣＣＣＣＵＧＧＵＡＣＣＣＡ　ＩＤ、Ｎ Ｏ，１９９１６ＵＣＣｌＪＧＣＵＵＵＧＵＣＣＵＵＵＧＡＵＧＣＵＧＵＣＡＧＣ ＡＣＩＤ、ＮＯ，２０９５８ＡＡＵＣＣＵＧＡＵＣＴＪＵＵＡＡＡＧＡ　より、 ＮＯ，；！１９７５　ＣＡＧＧＣＡＣ１７ＵＵＵＧＧＣＧＣＡＭＵＣＣＣより、 ＮＯ，２２１０１８ＡＵＵＧＣＡＵＵＵＧＡＬＩＣＵＣＵＵＣＡＵＩＪＵＩＪＧ ＧＣＣＡＩＪＣＩＤ、ＮＯ，２３１０７０ＧＣＡＵＡＵＧＡＡａＡ　より、ＮＯ ，２４１２０３ＡＡＡＵＣにＡＵＧＣＡＧＣＣＡＵＩＪＵＣＵＧＡ　より、ＮＯ ，２５１２７４ＵＩＪＩＪＧＡＵＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＩＪＩＪＣＣＡｔＪＧ ＧＡＧＣより、ＮＯ，２６１３０２ＣＡＧＧＣＵＵＵＣＣＣＭＧＣＡＡＡＵＡＧ ＣＵＧＭＧＡＣＩＤ、ＮＯ，２７１４２０ＣＣＣＡＡＡＵＧＣＡＡＡＧ　より、 ＮＯ，２８１４８５ＡＵＧＵＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＵＡＵＧにＧＣＡＣＭＭＡ 　より、ＮＯ，２９１６２３ＵＣＵＵＧＣＣＧＧＵＣＡＷＡＵＧＵＵＡＵ　ＩＤ 、ＮＯ，３０１６６５ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＣＩＤ、ＮＯ，３１１７３３Ｃ ＡＡＣＡｃＡｃＡＡｃｔＪＧＡｃＬＪｃｔＪＡＵｃＵ　より、ＮＯ，３２１７６ ９ＣＵＵＡＵｔＪＵＭＵＡ　ＩＤ、ＮＯ，３３第３の観点において、本発明は再 狭窄の症状を発現または維持するのに関与するｍＲＮＡ、例えばｃ−ｍｙｂ（も しくは上記の他のｍＲＮＡ）　、および特に表３に示したｍＲＮＡ標的、を切断 する酵素的ＲＮＡ　（またはりポザイム）を提供する。

２９３５　ＵＵＣＵＩＪｔＪＵＵＵＧＧＧＡＧＡＵ　ＩＤ、ＮＯ，７１２９６７ ＣＵＡＵＧｔＪ′ＵＵＵＧＵＵ′Ｕ′ＵＧ　より、ＮＯ，７２２９８７ＡＧＣＣ ＵＧＡＣＵＧｔＴＵＩＪＵＡＵＡ　ＩＤ、ＮＯ，７３３０１６ＵＣＧＡＩＪＩＪ ＬＪＧＡＵＣＩＤ、ＮＯ，７４３０７２ＵＧＧＡＵＣＣＵＧＵＧｔＪＵ　ＩＤ、 ＮＯ，７５３１１１ＵＵＧＡＵＡＧＣＣＡＧＵＣＡＣＵにＣＣＵＬＪＭＧＡ　Ｉ Ｄ、ＮＯ，７６３１３６ＡＣＡｔＪｔｎＪＧＡＵＧＣＡＡＧＡＵＧＧＣＣＡＧＣ ＡＣＵ　ＩＤ　、　Ｎｏ　、　７７第４の観点において、本発明は心臓血管症の 発現および維持に関与するｍＲＮＡ、例えばＡＣＥまたはＥＣＥ、および特に、 表４に示したｍＲＮＡ標的、を切断する酵素的ＲＮＡ　（またはりボザイム）を 提供する。

表４ 配列番号 ヌクレオチド番号　ｙ烈　（ＩＤ、　ＮＯ，）３８　ＧＣＩＪＡＣＵＧＣＡＧＧ ＡＣＬｒｔＪＣＣＣＡＧＣより、ＮＯ，０１５９Ｃ１ＪＣＣ１ＪＣＵＵＣＣＵＧ ＣＵＧＣＵＣＧＣＵＡＧＧ　より、ＮＯ，０２１０５ＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＵ ＣＩＤ、ＮＯ，０３１２０ＡＡＣＡＧＧＵＧＡＣＡＧＵＣＡＣＣＣＡｔｌＧ　Ｉ Ｄ、ＮＯ，０４２１０ＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＵＧＧＩＪＧＡ　ＩＤ、 ＮＯ，０５２４７ＣＡＧＣＡＡＧＵｔＪＵＧＵＧＧＡＧＧＡＡＵＡＵＧＡ　より 、ＮＯ，０６２７１ＣＣＧＧＡＣＡｔｌＣＣＣ八　より、ＮＯ，０７２９２ＧＡ ＡＣＧＡＧＵＡＵＧＣＣＧＡＧＧＣＣＩＤ、ＮＯ，０８３１１ＭＣＵＧＧＡＡＣ ＵＡＣＭＣＡＣより、ＮＯ，０９３４１にＡＧＡＣ（：ＡＧＣＭＧＡｔＪｔＪＣ ＵＧＣＵＧ　より、ＮＯ，１０３６９八ＣＡＵＧＣＡＡＡＵＡＧ　より、ＮＯ， １１３８７ＡＣＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧ　より、Ｎｏ、１ ２４２４　ＧＵＧＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＭＣＡＣＣＡＣＵＡ　ＩＤ、ＮＯ， １３４７４八ＧＧＡＣＣＵＡＧＭ　より、ＮＯ，１４４９１ＧＣＧＣＵＧＣＣＵ ＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＬＪＧＧＡＧ　より、ＮＯ，１５５１５ＧＡＧＵＡＣＡＡ ＣＭＧＡｔＪＣＣｔＪＧＩＪＵＧＧＡ　ＩＤ、ＮＯ，１６５３５ＧＧＡＵＡＵＧ ＧＡＡＡＣＣＡＣＣＩＪＡＣＡＧＣより、ＮＯ，１７５６４Ｃ１ＪＧｔＪＧＩＪ ＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＵＧＧＣより、ＮＯ，１８５９８ＣＧＡＧＣＣＡＧＡＵＣ ＬＩＧＡＣＧＭＩＪＧＬＩＧＡＵＧ　ＩＤ、Ｎｏ、１９６２７　ＣＡＵＣＣＣＧ ＧＡＡＡＵＡＵＧＭＧＡＣＣＵＧ　より、Ｎｏ、２０６４６　ＣＣＵＧＵｔＪＡ ＵＧＧＧＣＡＵＧＧＧ　ＸＤ、Ｎｏ、２１６６７　ＣＵＧＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧ ＧＣＧＧＧ　より、ＮＯ，２２７０６ＣＣＣＧＡＡＡυ八ＣＧ　へ　より、ＮＯ ，２３７２５ＡＵＣＡＡＣＣＡＧＧ　より、ＮＯ，２４７５５ＧＵＡＧＡＵＧＣ ＡＧＧＧＧＡＣｌＪＣより、ＮＯ，２５７７５ＡＧＧＵＣＵＡＵＧＵＡＣＧＡＧ ＡＣＡＣＣＡＵＣＣより、ＮＯ，２６８３１ＡＧＣＵＧＣＡＧＣＣＡＣＵＣＵＡ ＣＣＵＣＭＣより、ＮＯ，２７８４４ＣＩＪＧＣＡＵＧＣＣＵＡＣＧＵＧＣＧＣ ＣＧ　ＩＤ、ＮＯ，２８８９９ＣＡＧＣＡＵＣＡＡＣより、ＮＯ，２９９２１Ｃ ＣＡＵＵＣＣＵＧＣＵＣＡＣより、ＮＯ，３０９５６ＣＡＧＡＣＣＵＧＧＵＣＣ ＡＡＣＸＤ、ＮＯ，３１９７１ＡＵＣＵＡＵＧＡＣＵＵＧＧυＧＧ　より、ＮＯ ，３２９９６ＣＵＵＣＡＧＣＣＣＣＣＵＣＧＡＵＧＧＡＣより、ＮＯ，３３１０ １５ＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＵＡＵＧＣＵＡＡ　ＩＤ、ＮＯ，３４１０４０Ｇ ＧＣＵＧＧＡＣＧＣより、ＮＯ，３５１０５４ＧＡＧＧＡＵＧＵＵＩＪＭＧＧＡ ＧＧＣＵＧＡＵＧＡ　より、ＮＯ，３６１０７１ＣＵＧＡＵＧＡＵＵＵＣＵＵＣ ＡＣＣＵＣＣＸＤ、ＮＯ，３７１１０７υＧＣＣｔＪＣＣＵＧＡＧＵＵＣＵＧＧ ＭＣＡ　ＩＤ、ＮＯ，３８１１２７ＡＡＧＵＣＧＡＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧ　Ｉ Ｄ、ＮＯ，３９１１７３ＡＣＧＣＣＵＣＧＧＣＣＵＧＧＧＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡ 　より、ＮＯ，４０１２０３ＡＧＧＡＣＩＪＵＣＣＧＧＡＵＣＭＧＣＡＧＵＧＣ Ａ　より、ＮＯ，４１１２２７ＣＣＡＣＣＧＵＧＭＣＵＵＧＧＡＧＧＡＣＣＵＧ Ｇ　より、ＮＯ，４２１２７５ＡＣＡＵＣＣＡＧＵＡＵＵＵＣより、ＮＯ，４３ １２９１ＧＣＡＧＵＡＣＡＡＡＧＡＣＩＪＵＡＣＣＵＧＵＧＧ　より、ＮＯ，４ ４１３１５ＣＵＵＧＡＧＧＧＡＧＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＩＤ、ＮＯ，４５１３３ ５ＣＣＧＧＣＵＵＣＣＡＵＧＡＧＧＣＣＡＵＵＧＧ　より、ＮＯ−４６Ｄ５８　 ＧへＣＧＵＧＣＵＡＧ　ＩＤ、ＮＯ，４７１３７６ＧＵＧＵＣＵＡＣＧＣＣＣＭ ＧＣＡＣＣＵＧＣＡＣＡ　より、ＮＯ，４８１４０１ＧＵＣｔＪＣＡＡＣＣＵＧ ＣＵＧＡＧＣＡＧ　より、ＮＯ，４９１４２９ＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＵＧＡ ＣＡＵＣＡＡＣＩＤ、ＮＯ，５０１４５０ＣＩＪＵＵＣＵＧＡＵＧＭＧＡｔｌＧ ＧＣＣＣＵＩＪＧ　より、ＮＯ，５１１４６９ＣＵＵＧＡＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣ ＩＤ、ＮＯ，５２１５００ＡＣＣＩＪＣＧＵＣＧＡＩＪＣＡＧＵＧＧＣＧ　より 、ＮＯ，５３１５３６ＧＡＡＧＣＡｔｌＣＡＣＣＩＤ、ＮＯ，５４１５５３ＭＣ ＵＡＵＭＣＣＡＧＧＡＧＵＧＧ　より、ＮＯ，５５１５６５ＧＣＣＩＪＣＡＧＧ ＣＵＧＭＧＵＡ　ＩＤ、ＮＯ，５６１５９１ＣＣＡＧＧＧＣＣＵＣＵＧＣＣＣＣ ＣＣＡＧ　より、ＮＯ，５７１６１６ＡＧＧＡＣＵＣＡＡＧＧＵＧＡＣより、Ｎ Ｏ，５８１６３０ＣＵＵＩＪＧＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＩＤ、ＮＯ，５９１６６ ２ＣＵＡＧＣＧＵＧＣＣＩＪＵＡＣｒＤ、Ｎｏ、６０１６９９　ＣＡＵＣＣＡＧ ｔＪｔＪＣＣＡＧＵＵＣＣＡＣＧ　より、ＮＯ，６１１７０１ＧＩＪＵＣＣＡＣ ＧＡＧＧＣＡＣＵＧ　より、ＮＯ，６２１７４９ＧＣＣＣＣＣＵＧＣＡＣＭＧＵ ＧＵＧＡＣＡＵＣより、ＮＯ，６３１７７１ＣＵＡＣＣＡＧＵＣＣＭＧＧＡＧ　 より、ＮＯ，６４１８９４ＧＡＧＣＵＡＣＩＪＵＣＭＧＣＵＧＣＵＧＧ　より、 ＮＯ，６５１９１５ＧＧＡＣＵＧＧＣＵＣＣＧＣＡＣＧＧ　より、ＮＯ，６６１ ９６８ＡＧＵＡＣＡＡＣＵＧＧＡＣＧＣＣより、ＮＯ・　６７１９８４　ＧＭＣ ＵＣＣＧＣＵＣＧＣＵＣＡＧＡＡＧＧ、　ＩＤ、ＮＯ，６８２００５ＧＣＣＣＣ ＵＣＣＣＡＧＡＣＡＧ　より、ＮＯ，６９２０４６ＡＣＣＵＧＧＡＵＧＣＧＣＡ ＧＣＡ　より、ＮＯ，７０２０７６ＡＧＵＧＧＣＵＧＣＵＧＣＩＤ、ＮＯ，７１ ２１０１ＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＡＧＣＣＡＣＣＣより、ＮＯ，７２２１４７ ＡＵＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＣＣＵＣＣＩＤ、Ｎ０１７３２２１２　ＡＣＡＣ ＵＣＣＵＧＡＧＧＵＧＡＣＣＣＧＧ　ＩＤ、ＮＯ，７４２：１１６　ＧＣＣＣＡ ＣＣＣＵＧＣＩＤ、ＮＯ，７５２３３７ＣＵＧＵＣＣＣＵＧＵＣＣＣＣＣＵＣＣ ＣＣＩＤ、ＮＯ，７６２３６５ＣＵＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＩＤ、Ｎｏ、７７２３ ８６　ＡＧＣＣＣＣｔＪｔＪＣＵＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣより、ＮＯ，７８２４０ ８ＣＵＧＣＣＵＧＡＣＡＣＵＧＡＧＣＣＣＩＤ、ＮＯ，７９２４２６ＣＡＣＣＵ ＣＵＣＣＡＡＧＵＣＵＣＵＣＵＧ　より、ＮＯ，８０２４４６ＵＧＡＡＵＡＣＡ ＡｔＪＩＪＡＡＡＧＧＵＣＣＩＪＧ　より、ＮＯ，８１「酵素的ＲＮＡ分子」と いう語は、基質結合部位において特定されたｍＲＮＡと相補性を有し、そしてこ のｍＲＮＡを特異的に切断する活性である酵素活性を有するＲＮＡ分子を意味す る。即ち、酵素的ＲＮＡ分子はｍＲＮＡを分子内で切断し、そして標的ｍＲＮＡ を不活性化し得る。この相補性機能により、切断を生じさせるのに充分なように 酵素的ＲＮＡを欅的ＲＮＡヘハイブリダイゼーションさせる。１００％相補性で あるものが好ましいが、５０〜７５％の低い相補性でも本発明には有用である。

インビボの処置のためには、３５から４５塩基が相補性であることが好ましい。

好ましい態様において、酵素的ＲＮＡ分子はハンマーヘッドモチーフに形成され るが、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウィルスモチーフ、グループＩイントロン もしくはＲＮＮアーゼ類似のＲＮＡ　（ＲＮＡガイド配列に関与している）に形 成してもよい。かかるハンマーヘッドモチーフの例はロッジらのエイズ・リサー チ・アンド・ヒユーマン・レトロウィルス第８巻、１８３頁、１９９２年に記載 され、ヘアピン形の例はハンペルとトリッブのバイオケミストリー、２８巻、４ ９２９頁、１９８９年：およびヘンペルらのヌクレイツク・アシッズ・リサーチ １８巻、２９９頁、１９９０年に記載されている、および肝炎デルタウィルスモ チーフの例はベルロッタとビーンのバイオケミストリー３１巻、１６頁、１９９ ２年に、ＲＮアーゼＰの形状の例はゲリラーータカダらのセル３５巻、８４９頁 、１９８３年に、そしてグループＩイントロンの例はセーフらの米国特許第４， ９８７．０７１号に記載されている。これらの特定のモチーフは本発明において 制限的ではなく、そして当業者であれば本発明の酵素的ＲＮＡ分子において重要 なもの全ては、１または複数の標的の遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特異的基 質結合部位を有し、および該基質結合部位の内部もしくは周囲にＲＮＡ切断活性 を付与するヌクレオチド配列を有することが理解されるであろう。

関連する観点において、本発明は上述の酵素的ＲＮＡ分子を含有する哺乳類の細 胞をも提供する。好ましくは、この哺乳類細胞はヒト細胞である。

他の関連観点において、本発明は上述の酵素的ＲＮＡ分子をコード化する核酸を 、例えば酵素的ＲＮＡ分子を哺乳類細胞内に発現させ得るように含有する発現ベ クターを提供する。

さらに他の観点においては、本発明は、上述のごとき酵素的ＲＮＡ分子を患者に 投与することによる、上述の疾患の処置方法に関する。

本発明は転層または関節炎または心血管症の原因となるｍＲＮＡに対して高度の 特異性を示す化学的切断剤を提供する。かかる症状には心臓病に対する感受性の 測定可能な同定を含み、従ってかかる症状もしくは心血管病の筋痛段階をも含む 。この酵素的ＲＮＡ分子は感染細胞に外因的および内因的に導入し得る。好まし いハンマーヘッドモチーフにおいて、小さなサイズ（４０ヌクレオチド未満、好 ましくは３２から３６ヌクレオチドの長さ）の分子は治療のコストを抑制する。

現在報告されている全ての種類の処置に対して用いられたうちで最も小さなリポ ザイムは１４２ヌクレオチドのインビトロ転写体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔ）である。１００ヌクレオチド長以上のりボザイムの合成は自動化 された方法を用いては非常に困難であり、かかる分子を用いた治療のコストも非 常に高くなる。リボザイムの発現ベクターによる移送は基本的にはエキソビボ処 置によってのみ可能である。このことは本アプローチの利用性を制限する。本発 明の代替手段においてはより小さなリボザイムモチーフを使用しく例えば、図１ に示したハンマーヘッドモチーフ）、外因的に移送する。これらの分子の単純な 形状はまたリボザイムをｍＲＮＡ構造における標的領域へ容易に到達させること となる。即ち、ハンマーへソドモチーフがより長い転写物に含有されている場合 と異なり、リボザイムのｍＲＮＡ標的に対する相補的結合に対してと同様、リボ ザイム構造の正確な折り畳みに対して干渉する非すポザイム隣接配列が無いので ある。

本発明の酵素的ＲＮＡ分子は乾瘤もしくは前乾田、喘息もしくは前喘息、関節炎 もしくは前関節炎、狭窄もしくは前狭窄症状を処置するのに使用し得る。かかる 処置は他の非ヒト霊長類における他の関連遺伝子でもなし得ると推測し得る。

罹患動物に対し、疾病の危険時もしくは検出時に処置してもよいし、または予防 として処置してもよい。このタイミングの処置ではさらなる疾患のダメージを減 少させるであろう。

本発明のりボザイムは罹患細胞内における遺伝子の変動および変異を試験する診 断用の道具として用い得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡ構造の密接な関係によ り、標的ＲＮＡのいずれの領域においても塩基対生成および三次元構造の変化を 生じさせる変異を検出し得る。本発明で説明した様々なりボザイムを使用するこ とによって、ＲＮＡの構造および機能に重要であるヌクレオチドの配置図を、細 胞内および組織内と同様インビトロにおいても得ることができる。リボザイムに よる標的ＲＮＡの切断は遺伝子の発現の抑制に用いることができ、そして疾患の 進行における特定の遺伝子の産生の制限の役割を（本質的に）果す。この方法に おいて、他の遺伝子標的が、疾患の重要な媒介物質と規定されるかもしれない。

実験により、組み合わせる治療法を探すことによって（例えば異なる遺伝子を標 的とする多様なりポザイム、既知の小分子インヒビターと結合させたりボザイム またはりボザイムおよび／または他の化学的または生物的分子との組み合わせに よる間欠療法）より良い疾患進行の処置を見いだすことができるであろう。

本発明の他の特徴および有用性は以下の好ましい態様および請求の範囲から明ら かとなろう。

好ましい実施態様の説明 最初に図面について概略説明する。

図面 図１は、標的領域と相互に作用するステムエ、■および■（それぞれ（Ｉ）、（ ＩＩ）および（Ｉ［［）と記号を付けである）を示すハンマーヘッドモチーフリ ボザイムの線図である。リボザイムおよび標的の両者の５゛末端と３゛末端を示 す。ダッンユ印は塩基対合ヌクレオチドを示す。

標的部位 選択された疾患に関連するｍＲＮＡの選択された領域を標的とするりボザイムと しては、好ましくは標的ＲＮＡの翻訳を阻害する方式で標的ＲＮＡを切断するり ボザイムが選択される。遺伝子は、翻訳を阻害して例えば必要なタンパク質の産 生を阻害することによって好ましくは細胞の複製を阻害するように選択される。

ｍＲＮＡのこれらの重要な領域内の有効な標的を選択するには、標的ＲＮＡの各 種オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成に対するアクセシビリティ −（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を試験する必要がある。これらの試験は、Ｒ ＮＡプローブを用い、ハイブリッド分子をＲＮアーゼＨで切断することによつて アクセシビリティ−を検定して行う（下記参照）。あるいは、このような試験は 、ｍＲＮＡの二次構造を予測して設計されたりポザイムブローブを使用して行う ことができ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって切断生成 物を検定して切断分子と未切断分子の存在が検出される。

以下に示すのは、適切な標的部位を同定することができる方法の一実施例にすぎ ないが本発明を限定するものではない。一般に本発明の方法は、ハンマーヘツド リボザイムに対して切断部位となる可能性のある部位を同定し、次いでこれらの 各部位を試験し、二次構造の形成が最少であることを保証することによって標的 としてのそれら部位の適性を決定することからなる方法である。

ｍＲＮＡの配列は適切な標的領域で比較される。推定リボザイム切断部位が見出 されている。これらの部位は、ハンマーへッドリボザイムが切断する標的ｍＲＮ Ａ内の好ましい部位となある。

ｍＲＮＡ部位の各々に対応する短いＲＮＡの基質が設計される。各基質は、対応 するりボザイム認識部位と塩基対を形成しない２〜３個のヌクレオチドで５゛と ３°の末端が構成されている。その塩基対を形成しない領域は、リボザイム内の 相補的アームが設計されている１２〜１４個のヌクレオチドの中央部分の両端に 連結している。

各基質の配列の構造は標準のＰＣフォールドコンピュータプログラム（ＰＣｆｏ ｌｄ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて予想する。結合の正の自由 エネルギーを与える配列が容認される。負の自由エネルギーを与える配列は、各 末端から１個もしくは２個の塩基をトリミングすることによって修飾する。その 修飾された配列が依然として強い二次構造をもっていると予測されたならば排除 する。

基質を選択してから、各ＲＮＡ基質に対するリボザイムを設計する。またリポザ イムの折りたたみはＰＣフォールドを用いて分析する。

ハンマーへラドモチーフステム■（図１参照）領域を形成し、かつ分子内の塩基 対を欠いている両端のアーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ａｒｌｌ）を有するリボザイ ム分子を探す。

このようなりボザイムは、リボザイムの両端から塩基をトリミングするか、また は所望の折りたたみを達成するためステム■に追加の塩基対を導入することによ って修飾することが多い。不適切な折りたたみを有するリボザイムは排除する。

構造／リポザイムの対が適正な分子内構造を含有していることが見出されたなら ば、これらの分子はともに折りたたまれて分子が相互に作用すると予想される。

その同系標的配列に対してその同調塩基対合性を有するリポザイムの概略図を図 １に示す。

リボザイムの標的として有用であると考えられるこれらの標的は、リボヌクレア ーゼＨ検定法で試験して核酸プローブに対するアクセンビリティ−を測定するこ とができる（下記の説明参照）。本発明の検定法は、リボザイムの合成を必要と せずに標的部位の使用について迅速に試験することができる。本発明の検定法は 、リボザイムが攻撃するのに最適の部位を選別するのに利用することができる。

リボザイムの合成 本発明に有用なりポザイムは、セーフ（Ｃｅｃｈ）の前記文献に記載されている のと同じ遺伝子転写または化学合成によって製造することができる。ＲＮＡの化 学合成はＤＮＡの合成法に類似している。しかしＲＮＡの追加の２’−ＯＨ基は 、選択的３゛〜５゛ヌクレオチド間結合の生成および塩基存在下での分解に対す るＲＮＡの感受性に対処するため異なる保護基を用いる必要がある。２゛ヒドロ キシルを保護するのにｔ−ブチルジメチルシリル基を利用する最近開発されたＲ ＮＡ合成法は最も信頼性が高いリボザイム合成法である。この方法によれば、正 しい３°−５゛ヌクレオチドの結合を有し、平均力ｙブリング収率が９９％以上 のＲＮＡがよい再現性で得られ、またこの方法は高分子物の脱保護のステップは ２ステツプしか必要でない。

ホスホロアミダイトのトホスホネート化学（■叩ｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｃｈｅ ＋ｃｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｐｈ。

ｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅｓ）に基づいた方法は、ホスホロアミダイト化学に 基づいた方法と比べてカップリング効率が低い。このことは同様にＤＮＡの合成 に対しても問題である。オリゴヌクレオチドの自動合成を拡大する有望な方法が 、Ｈ−ホスホネートについて最近報告されている。適正なカップリング時間およ び［不十分Ｊ　（ｆａｉｌｕｒｅ）な配列のさらなるキャッピングを組合わせる ことによって、カップリングのステップにおいて２当量はどの少量のモノマーを 用いて１４μｍｏｌの範囲の規模でオリゴデオキシヌクレオチドが高収率で合成 された。もう一つの方法は、通常の固体の支持体の代わりに、可溶性高分子物の 支持体（例えばポリエチレングリコール類）を使用する方法である。この方法で は、カップリングステップで約３当量のモノマーを用いて１バツチ当たり１００ １０ｇの量で短いオリゴヌクレオチドを得ることができる。

リポザイムの構造に種々の修飾を行ってリポザイムの効用を増大することができ る。このような修飾を行うことによって、リポザイムの有効期間、生体外での半 減期、安定性および標的部位へのりボザイムの導入の容易さが増大され、例えば 細胞膜への浸透性が増大されかつ標的細胞を認識し、標的細胞に結合する性能が 与えられる。

リポザイムの外因的移送性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ）は、その 骨格を化学的に修飾することによって例えばリポザイム分子のすべての負の電荷 を減少させて、細胞膜を横ぎる拡散を容易に行えるようにすることによって改善 される。オリゴヌクレオチドの電荷を減少させる方法としては現在次のような方 法がある。すなわち、リン酸メチル類によるヌクレオチド間の結合部の修飾、ホ スホルアミダイト類の使用、オリゴヌクレオチドに対する正電荷分子の結合、な らびにオリゴヌクレオチド、脂質および標的細胞に対して特異的な受容体もしく はエフェクターで構成された複合パッケージ（ｃｏｍｐｌｅｘ　ｐａｃｋａｇｅ ）の創製である。このような修飾の例としては、ＲＮＡのヌクレオチド間の結合 部としてチオリン酸基およびジチオリン酸基を含有する硫黄含有リボザイムがあ る。このような硫黄で修飾されたりボザイムの合成は、硫黄移送剤（ｓｕｌｆｕ ｒ−ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｒｅａｇｅｎｔ）の’Ｒ−１，２−ベンゼンジチオール −３−オン１，１−ジオキシドを使用することによって達成される。またリボザ イムはリボースを修飾されたりポヌクレオチドを含有していてもよい。ピリミジ ン類似体は、出発試薬としてジエチルアミノ三フッ化硫黄（ＤＡＳＴ）を用いる 方法を利用してウリジンから製造される。またリボザイムは、電荷を減らすため に高分子カチオンに対して静電気的にまたは共有結合で結合させてもよい。この 高分子物は、リボザイムの３°末端をリボヌクレオノドジアルデヒドに変換する だけでリボザイムに結合することができ、そのジアルデヒドはりポザイムの末端 ２’　、　３−ｃｉｓノオール系をベルヨーディトで切断することによって得ら れる。移送系に対する特定の必要条件によって、その外の可能性がある修飾とし ては、カルボキシル、アミンまたはチオールの官能性を有する各種のリンカ−ア ームがある。

さらに別の例としては、リン酸メチル基および２′−〇−メチルリボースの使用 ならびにｍ、ＧｐｐｐＧまたはｍ３”　、”　、’ＧｐｐｐＧによる５゛もしく は３°のキャッピングもしくはブロッキングがある。

例えばキナーゼ化すボザイム（ｋｉｎａｓｅｄ　ｒｉｂｏｚｙｍｅ）をグアノシ ン三リン酸およびグアニルトランスフェラーゼに接触させ、そのリポザイムに１ Ｉ３Ｇキヤツプを添加する。このような合成を行った後、そのリポザイムは標準 の方法を用いてゲル精製を行うことができる。得られたりボザイムが所望の活性 をもっていることを確認するため、標準の方法を用い、５°キヤツプをもってい るものともっていないものについて試験してその酵素活性と安定性の両方を検定 することができる。

合成リボザイム類は、種々の修飾部分を有するものを含めて、高圧液体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）で精製することができる。またシリカおよび高分子支持 体の逆相カラムおよびアニオン交換体を利用する他の液体クロマトグラフィー法 も使用できる。

次に一つのりボザイムの合成例について述べる。固相ホスホルアミダイト化学を 利用する。使用されるモノマーは、ウリジンの２’−ｔｅｒｔ−ブチルージメチ ルシリルノアノエチルホスホルアミダイト類、Ｎ−ベンゾイル−シトシン、トフ エノキシアセチルアデノシンおよびグアノシン（米国、バージニア州、スターリ ング所在のグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）社）である。固相 合成は、ＡＢＩ３９４型または３８０Ｂ型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成器を利用し、各 機械とともに提供された標準のプロトコルを用いて実施される。唯一の例外はカ ップリングのステップが１０分間から１２分間まで延長されていることである。

ホスホルアミダイトの濃度は０．ＩＭである。合成は１μｍｏｌ　ＲＮ　Ａの反 応カラムを用い１μ順１の規模で行う（グレン・リサーチ社）。平均カップリン グ効率は、放出されたトリチルカチオンを熱量測定法で測定したところ、３９４ 型の場合は９７〜９８％であり、３８０Ｂ型の場合９７〜９９％であった。

ブロックされたりボザイムは固体支持体（例えばＣＰＧ）から切り離され、次い でその塩基とジホスホエステル部分（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒ　ｍｏｉｅ ｔｙ）が、滅菌バイアルびん中、乾燥エタノール性アンモニア（２ｍｌ）によっ て５５℃にて１６時間脱保護される。その反応混合物をドライアイス上で冷却す る。次いでこの冷液体をねじぶた付き滅菌バイアルびん中に移し、凍結乾燥する 。

リポザイムから２’−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルノリル基を除くために、残留 物を乾燥ＴＨＦにテトラーローブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）を溶 解して得た１Ｍ溶液中に、各ノリル基に対して２０倍過剰の試薬を用い、常温（ 約１５〜２５℃）で１６時間懸濁させる。その反応は、等容積の滅菌１１１トリ エチルアミンアセテートｐＨ６５を添加してクエンチする。試料を冷却し、次い でスピード・バック（Ｓｐｅｅｄ　ｖａｃ）で濃縮して容積を最初の容積の１７ ２にする。

得られたりボザイムは、Ｃ４３００＾５闘デルタパツク（ＤｅｌｔａＰａｋ）カ ラムのＨＰＬＣ（アセトニトリル勾配液使用）によって２ステツプで精製する。

第一ステップすなわち「トリチルオン（ｔｒｉｔｙｌｏｎ）　Ｊステップは、５ °−ＤＭＴ−保護りポザイムを、５’−ＤＭＴ基を欠いているフエイラー配列か ら分離するステップである。このステップに用いる溶媒は、Ａ（０，１Ｍトリエ チルアンモニウムアセテート、ｐｌ＋６．８）およびＢ（アセトニトリル）であ る。溶離法は次のとおりである。２０％Ｂで１０分間、次に２０％Ｂから５０％ Ｂまでの線状勾配液で５０分間、５０％Ｂで１０分間、５０％Ｂから１００％Ｂ までの線状勾配液で１０分間、および１００ＢからＯ％Ｂまでの線状勾配液で１ ０分間溶離する。

第ニステップは、２％のトリフルオロ酢酸で処理して完全に脱ブロックされた（ ｄｅｂｌｏｃｋｅｄ）リポサイムを、Ｃ４３００Ａ　５ｍｍデルタパックカラム （アセトニトリル勾配液使用）で精製するステップである。この第二ステップで 使用させる溶媒は、Ａ（０，１Ｍ）リエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ６， ８）　、次いでＢ（８０％アセトニトリル、０．　Ｉｌｌ　）リエチルアンモニ ウムアセテート、ｐｔ＋６．８）である。溶離法は次のとおりである。すなわち 、５％Ｂで５分間、５％Ｂから１５％Ｂまでの線状勾配液で６０分間、１５％Ｂ で１０分間、次いで１５％Ｂから０％Ｂまでの勾配液で１０分間溶離する。

リボザイムを含有する両分を冷却し、次いでスピード・バンクで凍結乾燥した。

固体残留物をアセトン中のエタノールおよび過塩素酸ナトリウムの最少量に溶解 する。次にリホザイムを遠心分離によって集めアセトンで３回洗浄し、次いで凍 結乾燥する。

発現ベクタ一 本発明では合成のりボザイムの方が好ましいが、発現ベクターによって産生され るものも用いることができる。適切なりポザイム発現ベクターを設計する場合、 下記の因子を検討することが重要である。最終のりボザイムは、リボザイム内の 望ましくない二次構造を最小にするためできるだけ小さくしなければならない。

プロモーターとしては、比較的強力でしかも生体外と生体内の両方で発現可能な もの（例えばヒトのサイトメガロウィルス）の即時型プロモーターまたはヒトβ アクチンプロモーター）を選択しなければならない。かようなプロモーターは、 標的ＲＮＡを破壊するのに充分なりボザイムを産生ずるのに適したレベルでリボ ザイムを発現しなければならないが、そのレベルが高すぎて他の細胞の活性が出 現しないほどであってはならない（細胞死自体が望ましくない場合）。

リボザイムの５゛末端におけるヘアピンは、必要な転写開始配列（ＧＧもしくは ＧＧＧもしくはＧＧＧＡＧ）がそのリポザイムの他の部分に結合してその転写プ ロセスの調節に影響することがないことを保証するのに有用である。この５゛ヘ アピンはりボザイムを５゛−３°エキソヌクレアーゼ類に対して保護するのにも 有用である。リボザイム遺伝子の３′末端における選択されたヘアピンは、転写 終止シグナルとして作動し、かつリポソームを３−５゛エキソヌクレアーゼ活性 から保護するので有用である。公知の終止シグナルの一例は、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼ系に存在する終止シグナルである。このシグナルは長さが約３０個のヌク レオチドである。別の長さが短い３゛ヘアピンを良好な終止性とＲＮＡの安定性 を提供するため使用することができる。このようなヘアピンは、ベクター配列中 に挿入して、標準のりボザイムを適切に配向させ、かつ連結されたこのような配 列とともに発現させることができる。

ポリ（Ａ）テイル［ｐｏｌｙ（＾）ｔａｉｌ］もリボザイムの３゛末端を保護す るのに有用である。ポリ（Ａ）テイルは、発現ベクター中にポリ（Ａ）シグナル 部位を入れるか（生体内でポリ（Ａ）テイルを付加するよう細胞にシグナルする ため）または発現ベクター中にポリ（Ａ）配列を直接導入することによって提供 することができる。最初の方法では、そのシグナルは、リボザイムの他の部分と ともに望ましくない二次構造を形成することがないように配置しなければならな い。第二の方法では、ポリ（Ａ）領域は、生体内で発現される場合、時間が経過 するにつれて大きさが減少することがある。したがってそのベクターは時間の経 過とともに点検する必要がある。リボザイムを作動しないようにするタンパク質 を捕捉するポリ（Ａ）を捕捉するポリ（Ａ）テイルを付加する場合には注意しな ければならない。

リポザイムの試験 所望のりボザイムを選択し、合成し、精製したならば、動力学的試験などで試験 してその効力を測定する。その方法の一例を以下に示す。

リボザイムの製造 粗合成リボザイム（一般的に一回当たり３５ｏｎｇ）は、１５％の変性ポリアク リルアミドゲル（厚みが０．７５ｏｎで長さが４０ｃｍ）で分離して精製し、次 いでＵＶシャドウィング法（ＵＶ　ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）によって目視可能にす る。切り取った後、全長のりボザイムを含有するゲルスライスを、５＋ｏｌのゲ ル溶離緩衝液（０，５Ｍ　ＮＨ，０＾ｃ、　１ｍＭＥＤＴ＾）中に、４℃にて振 盪しながら一夜浸漬する。溶出液をＣ−１８マトリツクス（米国、マサチューセ ッツ州、ミルフォード所在のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社のセブパック（ ＳｅｐＰａｋ）カートリッジ）上で脱塩し、次いで減圧乾燥する。その乾燥され たＲＮＡを５０−１００μｌのＴＥ　（）リス１ｈＭ、　ＥＤＴＡ１ｍＭ、　ｐ Ｈ７，２）中に再懸濁させる。この溶液の一部を１ｍＭのＴＥで１００倍に希釈 し、その１／２を、そのリボザイム溶液を分光分析によって定量するのに使用す る。この希釈物の濃度は一般に１５０〜８００ｎＭである。そのリボザイムの純 度は、変性ポリアクリルアミドゲルの単一バンドの存在によって確認する。

リポザイムは２個以上の部分で合成するのが有利である。リボザイムの各部分は 一般にごく制限された酵素活性をもっているか、または酵素活性が全くない。

そして、すべての部分が連結されると（または別の方法でならべる）、その活性 が著しく増大する（少なくとも５〜ＩＯ倍になる）。ハンマーへッドリポザイム の合成の具体例を以下に示す。

この方法には、２個（もしくは２個を超える）短い「ハーフ」リボザイムの合成 およびＴ４ＲＮＡリガーゼを用いるハーフリボザイムの連結が含まれる。例えば 、３４量体のりボザイムを製造するには、２個の１７Ｊ１体を合成し、一方をリ ン酸化し、次いで両者をゲルで精製する。次に、これらの精製された１７量体を アニールして２個の１７量体に対して相補的なりＮＡスプリントストランド（ｓ ｐｌｉｎｔ　５ｔｒａｎｄ）にする（このようなスプリントは必ずしも必要でな い）。このＤＮＡスプリントは、２個の１７量体の部分を各々一端が互いに隣接 して位置するよう設計された配列をもっている。並べられたＲＮＡ分子を、ＡＴ Ｐの存在下でＴ４ＲＮＡリガーゼで処理する。このようにして形成された３４量 体のＲＮＡを次にＨＰＬＣで精製する。

基質の製造 約１０〜３０ｐｍｏｌｅの未精製基質を、２５ｐｍｏｌｅの［ｙ−”Ｐ］ＡＴＰ を用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端に放射能の標識を付ける。全 標識混合物を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでオートラジ オグラフィーで目視可能にする。全長のバンドを切り取り、１００μｌのＴＥ（ １０ＩｏｉＩトリス−１１ＣＩ、ｐ）１５．５、Ｑ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に ４℃にて一夜浸漬する。

動力学的反応 短い基質（８〜１６個の塩基）と用いて反応を行うために、基質の濃度が１ＭＭ より低くなるように、基質溶液と検定緩衝液（７５ｍＭ　）リス−１１ＣＩ、ｐ Ｈ７，６：　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｈＭ　ＭｇＣ１，）で製造する（ＩＸ） 、リボザイムの溶液（一般に２０ｎＭ）を検定緩衝液で作製しくＩＸＬ４種の希 釈液を検定緩衝液をＩＸ使用して作製する。

各リポザイム希釈液（すなわち２０．１６．１２．８および４ＭＭ）１５μｍづ つを別々の試験管に入れる。これらの試験管と基質の試験管とを３７℃で少なく とも５分間ブレインキュベートする。

各リボザイムの試験管に、迅速ピペッティングによって１５μｍの基質を混合す ることによって反応を開始させる（リボザイムの最終濃度は１０．８．６．４． ２ＭＭであることに留意のこと）。１５秒もしくは３０秒間隔で５μｌづつを取 り出し、５μｌづつの停止溶液（９５％ホルムアミド、２ｈＭ　ＥＤＴＡキシレ ンシアツールおよびブロムフェノールブルー染料）でクエンチする。リボザイム の最終時点になった後、残りの基質の部分を、リポザイムのゼロ対照として取り 出す。

これらの試料を、１５％もしくは２０％のポリアクリルアミドゲル上で分離する 。

各ゲルを目視可能にし、次いでアンビス（八ａ＋ｂｉｓ）β−スキャナー（米国 １カリフオルニア州、サンディエゴ所在のアンビス・システム社）で定量する。

最大活性のりボザイムを得るため、過剰基質中で動力学的分析を行ってに、とに 、、、の値を測定する。

長いＲＮＡ基實（長さが１５個の塩基より長い基質）との動力学的反応を行うた め、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７ブロモータと標的ＲＮＡの適正なヌク レオチドをコードするＤＮＡとを含有する所定の鋳型とを用いて転写することに よって基質を製造する。その基質の溶液を検定緩衝液（７５１１Ｍトリス−１１ ｃＩ、ｐＨ７，６：　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ；　１ｈＭ　１１ｇＣ１□）で製造 しくＩＸ）、この溶液りは５８ナノモル濃度の長いＲＮＡ分子を含有している。

反応はゲルで精製したりポザイムを１ＭＭの濃度まで添加することによって開始 させる。２０．４０．６０．８０および１００分間経過時に一部分を取り出し、 ５μｍの停止溶液を加えてクエンチする。切断生成物を変性ＰＡＧＥを利用して 分離する。生成したバンドを目視可能にしてアンビスβ−スキャナーで定量する 。

動力学的分析 リポザイムによる切断反応の単純な反応機構は次のとおりである。

ここでＲはリポザイムであり、Ｓは基質であり、Ｐは生成物である。箱枠内のス テップは基質の１度が過剰な場合にのみ重要である。リボザイムの濃度が基質の 濃度を超えて過剰であるから、リホザイムー基質複合体（［Ｒ：　Ｓコ）の濃度 は、この複合体が最初に形成されるごくわずかの時間を除いて時間が経過しても 一定である。すなわち ここでｔは時間である。したがって （Ｒ）（Ｓ）ｋｌ＝　（Ｒ５）（ｋ！＋ｋｌ）である。

反応速度は時間とともに基質が消失する速度である。すなわちこれらの式を代入 すると、 この式を時間に対して積分すると下記式が得られる。

ここでＳｏは初期の基質である。それ故に、切断されていない画分の基質の負の 対数を時間（単位・分）に対してプロットすると下記勾配。

の直線で得られる。ここでｋ。１．は観察された速度定数である。リポザイムの １度に対して勾配（ｋ、、、）をプロットすると下記勾配を有する直線が得られ る。

これらの式を利用すれば、動力学的実験で得たデータによって、試験されたどの リボザイムが最も有用であるか、すなわち最も活性であるかを決定するの（＝必 要な情報が提供される。このようなりポザイムを選択し、生体内もしくは、生体 外の系で試験することができる。

リポソームの製造 脂質分子を揮発性有機溶媒（ＣＨＣＬ３、メタノール、ジエチルエーテル、エタ ノールなど）に溶解する。その有機溶媒を蒸発させて除く。その脂質を０．１× リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で水和して懸濁させ、次いで液体窒素を用いて３回 凍結−融解を行い次いで室温でインキュベートする。その懸濁液を、順に０４μ ｍ１０２μｍおよび０．１Ｍｍのポリカーボネートフィルターを通じて、最大圧 ８００ｐｓｉで押出す。リボザイムを、上記の押出されたリポソームの懸濁液と 混合し、次いで凍結乾燥する。得られた脂質／リポザイムの粉末を、水を用いて 再び水和して元の容積の１７１０の容積にする。その￥濁液を押出すのに必要な 最小容積まで（１，５ｍｌのバレルに対して０４ｍ１および１０−１のバレルに 対して１．５＋ｏｌ）１ｘＰＢＳで希釈し、次いで０４μ■、０．２μ■、０． １μｍのポリカーボネートフィルターを通じて再び押出す。リポソームで捕捉さ れたりボザイムを、ゲルろ過クロマトグラフィー（セファロースＣＬ−４Ｂ、バ イオシェル（ＢＩＯＧＥＬ）　＾５Ｍ）を用いて、捕捉されなかったりボザイム から分離する。リポソーム抽出物を集め、０．２μｌフイルターでろ過して滅菌 する。遊離のりボザイムを集め、エタノール沈澱法で回収する。リポソームの濃 度は放射性脂質の取り込み量で測定する。リポザイムの濃度は３２ｐで標識を付 けることによって測定する。先に引用したロソンらの１９９２年の文献（および その文献に引用されている文献）にはリポソームを製造するのに適切な他の方法 が記載されている。

放射性脂質マーカーおよびベロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌ）によって捕捉される 発蛍光団の両者を類似した種変に吸収する他の有用なリポソーム製剤の例は、異 なる蛍光ステイニングパターンを示した。具体的に述べると、ＤＰＰＧ／ＤＰＰ Ｃ／コレステロール（５０／１７／３３の比率）で構成されたリポソームは斑点 状パターンの蛍光を示したが、ＤＯＰＥ／卵ＰＣ／コレステロール（３０／３７ ／３３の比率）で構成されたリポソームは細胞質中で拡散した均一なパターンの 蛍光を示した。細胞分画を行ったところ、ＤＰＰＧ／ＤＰＰＣ／コレステロール 配合物由来の捕捉されたものの８０％が細胞膜の両分中に局在していたが、ＤＯ ＰＥ／卵ＰＣ／コレステロール配合物は細胞質中に局在していた。

後者の配合物の特性決定をさらに行ったところ、３時間後には蛍光の７０％は細 胞質で発生し、３０％は細胞膜で発生した。２４時間後には、吸収は５倍に増大 し、リポソームの含有量は細胞質と細胞膜の画分に５０１５０の比率で分布した 。

Ｈ３Ｖ　ＩＣＰ４のｍＲＮＡを標的にする１５種のりボザイム（３２Ｐで標識付 け）を含有するリポソームを調製し、細胞とともにインキュベートした。２４時 間後、リポソーム投与量の２５％が、約６０．０００のリポソーム／細胞の比率 で吸収された。

放出されたりポザイムの３０％は２４時間後に無傷であった。細胞分画法で試験 した結果、無傷のりボザイムの４０％が膜の画分中に存在し、無傷のりボザイム の５２％選択されたりポザイムの作用の効力は、標的ｍＲＮＡを発現する形質転 換細胞または動物の生体内で、標準の方法を用いて試験することができる。

リボヌクレアーゼ保護の検定 細胞内における標的ｍＲＮＡの蓄積またはそのＲＮＡのリボザイムもしくはＲＮ Ｎアーゼによる切断（生体外もしくは生体内）はＲＮアーゼ保護検定法を用いて 定量することができる。

この方法では、ＩＸ転写緩衝液（メーカーが供給している）　、０．２μｌＭの ＡＴＰとＧＴＰとＵＴＰ、ＩＵ／μｍの膵ＲＮアーゼ阻害剤（ベーリンガー・マ ンハイム・バイオケミカルズ社）および２００μＣｉの３２ＰｙＡ識化ＣＴＰ　 （８００Ｃｉ／−モル、二ニー・イングランド・ヌクレアー社）を含有する２０ μｍの反応液中でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ニーニス　バイオケミカル社）を３ ７℃にて１時間用いて、アンチセンスリポプローブを鋳型のＤＮＡから転写する 。鋳型のＤＮＡは、ＩＵのＲＮアーゼを含有していないＤＮＮアーゼ（米国、オ ハイオ州、クリーブランド所在のニーニス　バイオケミカル社）を用い、３７℃ で１５分間消化し、取り込まれなかったヌクレオチドはＧ−５０セフ７デツクス スピンクロマトグラフイーで除去する。

アンチセンスプローブの転写に類似した方式で、標的ＲＮＡは適切なりＮＡ鋳型 を用いて生体外で転写することができる。その転写物を標準の方法で精製し、先 に述べた方法にしたがって３７℃でリポザイムによって消化する。

あるいは、感染した（ｍＲＮＡを発現する）細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に収穫し、 １．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、低速で３０秒間、微小遠心分離器にかけ てペレット化し、次いで７０μｌのハイブリッド形成緩衝液（４Ｍグアニジンイ ソチオンアネート、０．１％サルコンル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）　、２５１１Ｍク エン酸ナトリウム、ｐＨ７、５）中で溶解する。細胞溶解物（４５μｍ）または 所定量の生体外転写物（ハイブリッド緩衝液中）を、０５μｌエツベンドルフ管 中５　Ｘ　１０５ｃｐｌＩ＋の各アンチセンスリボプローブを含有するハイブリ ッド形成緩衝液５μ１．！：ａ合し、２５μｌの鉱油で上面を覆い、５５℃で一 夜加熱することによってハイブリッド形成を行う。生成したノーイブリッド形成 反応液を０．５ｍｌのＲＮアーゼ溶液（２００／ｍｌのＲＮＮアーゼ、２Ｕ／ｍ ｌのＲアーゼ１１．１００／ｍｌの０．４Ｍ　ＮａＣ１中ＲＮアーゼなしのＤＮ Ｎアーゼ）で希釈し、３７℃で３０分間加熱し、次に１０μｍの２０％ＳＤＳお よび１０μｍのプロテイナーゼＫ　（１０ｍｇ／■ｌ）を添加し、次いでさらに ３０分間３７℃でインキュベートする。ノーイブリッドを、フェノール／クロロ ホルムの１１混合物０．５ｍｌで抽出することによって部分的に精製し、水性相 をイソプロパツール０．５ｉ１と混合し、ＲＮアーゼ耐性のノーイブリッドを、 微小遠心分離器を用いて室温（約２０℃）で１０分間ペレ・ノド化する。

ベレットを１０μｌのローディング緩衝液［９５％ホルムアミド、ＩＸＴＢＥ、 ０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キンレンシンノールに溶解し、９５ ℃で５分間加部し、氷上で冷却し、次いで変性条件下４％ポリアクリルアミド／ ７Ｍ尿素ゲル選択されたりボザイムは、試験を行ってその安定性とその効用の可 能性を測定することができる。またこのような試験は、種々の化学的修飾（例え ばポリ（Ａ）テイルの付加）のりポザイムの安定性に対する効果を測定するのに 使用することができるのでより安定なりポザイムを選択する際の助けになる。例 えば、一つの反応混合物は、１〜５ｐｍｏｌｅの５゛（キナーゼ化）および／ま たは３°標識化リすザイム１５μｇ（７）細胞質ゾル抽出物（ｃｙｔｏｓｏｌｉ ｃ　ｅｘｔｒａｃｔ）および’ｌ、　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を１００μｌの全容積 中に含有している。その反応混合物を３７℃でインキュベートする。

８μｌづつを時間間隔をおいて採取し、８μｌの停止混合物（２０ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、９５％ホルムアミド）と混合する。試料を１５％アクリルアミドの配列決定 ゲル上で分離し、フィルムに！露し、次いで八ｍｂｌｓで走査する。

３゛に標識を付けたりホザイムは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて３°ＯＨに ３２Ｐｆｉｍ化コルノセピンを組込むことによって製造することができる。例え ばそのポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物は、４０ＩＩＩＩトリスｐＨ８：　１ ｈＭ　ＭｇＣ１ｔ　：　２５０１１ＩＭ　ＮａＣ１：　２．５μｌＭ　ＮａＣｌ ２　；　３　／１１”　Ｐ　：］ル／セビン、５００Ｃｉ／ｍＷ　；および６単 位のポリ（Ａ）ポリメラーゼを合計容積５０μｌ中に含有している。この反応混 合物を３７℃で３０分間インキュベートする。

リポザイムの活性に対する塩基置換の効果どの一次構造の特性がリポザイムの基 質切断性を変えることができるかを決定するために、特定のりボザイムが認識す る基質の切断部位に小さな塩基の変更を行うことができる。例えば基質の配列は 、ＧＵＣからＧＵＡのモチーフに切断部位を変更して中央の「Ｃ」ヌクレオチド で変えることができる。次に各基質を使用する切断反応に対するに、、、／に、 の値を分析して、このような変更によってリボザイムの切断速度が増大するか否 かを決定する。類似の試験を行って、リボザイムの結合アームに相補的な塩基を 変更することによる効果を検討することができる。上記の相補的基質に対する強 い結合を維持すると予測される変更が好ましい。ヌクレオチドの内容の小さな変 更によって、結合強度だけでは予測できない方式でリポソーム／細胞の相互作用 を変えることができる。リボザイムの触媒コア領域における構造は、基質の構造 またはりボザイム／基質複合体の三次元構造のわずかな変化を認識する。

リポザイムの設計の最適化を始めるために、長さを変えたアームをもっているが 、同じ長さの短いＲＮＡ基質を標的とするりボザイムの切断速度を試験すること ができる。最小のアームの長さが必要であり、有効な切断はりポザイム／基質の 組合わせで変わる。

選択されたりポザイムの切断活性は標的のｍＲＮＡ基質を用いて評価することが できる。その検定は過剰なりボブイム中で行われ、適正なに、、、／に、、、値 が得られる。短い基質と長い基質で得た数値を比較するとそのりボザイムの生体 内での効用が分かる。

リポソームが放出するりボサイムの細胞内での安定性選択されたりポザイムの生 体内での安定性を試験するには、下記の試験が有用である。リボザイムを３２ｐ で末端に標識を付け、リポソームに捕捉させ、次いで標的ｍＲＮＡを含有する細 胞に対して３時間放出する。これらの細胞を分画し、リポザイムをフェノール／ クロロホルムで抽出して精製する。あるいは、細胞（ＩＸ１０７、Ｔ−１７５フ ラスコ）をフラスコの表面からかきとり、冷ＰＢＳで２回洗浄する。これらの細 胞を、４■１のＴ　Ｓ　Ｅ　（１０ｓＭ　トリス、ｐＨ７，４，０，２５Ｍスク ロース、１Ｍ　ＥＤＴＡ）中で３５回ダンソング処理（ｄｏｕｎｃｉｎｇ）を行 うことによってホモジナイズする。咳を１１０Ｏｘで１０分間遠心分離すること によってペレット化する。細胞レベル下オルガネーラ（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ 　ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）　（膜画分）を、Ｓ　Ｗ２Ｏｏ−夕を用い２００．００ ０ｘｇで２時間遠心分離することによってペレット化する。そのベレットを、１ ■ｌのＨ緩衝液（０，２５Ｍスクロース、５０１Ｍへベス（ＨＥＰＥＳ）　、　 ｐｌ＋７．４）中に再懸濁させる。その上澄み液は細胞質画分を含有している（ 約３．７■１）。核のベレットを、Ｔ　Ｍ　（５０ａＭ　）リス、ｐＨ７，４， ２，５ｍＭ　ＭｇＣ１２）にスクロースを溶解して得た６５％スクロース溶液１ ｍｌ中に再懸濁させ、次いでＳ　Ｗ６０ロータを用いて３７．０００ｘｇで１時 間かけてスクロースステップ勾配法でバンドを形成させた（６５％スクロースＴ Ｍ中１＋ｉ１の核、ｌａｌの６０％スクロースＴＭ、ｌ＋１の５５％スクローｙ 、ＴＭ、５０％スクロースＴＭ、３００μｍの２５％スクロースＴＭ）。この核 のバンドを収穫し、７Ｍ緩衝液で希釈して１０％スクロースにする。各種を、Ｓ 　Ｗ６０ロータを用い３７．０００Ｘｇで１５分間かけてペレット化し、そのベ レットを７Ｍ緩衝液１ｍｌに再懸濁させる。各部分を、変性ポリアクリルアミド ゲル上でサイズ分画を行い、細胞内の局在性を測定する。新しく合成したりボザ イムの泳動速度を比較することによって、無傷のりポザイムを含有する種々の両 分を測定することができる。

リポザイム分子の細胞内での半減期を長くする修飾法を研究するため、細胞を上 記のように分画し、次いでその画分中に存在していることが分かっている酵素の 活性を検定することによって各画分の純度を評価する。

各種の細胞画分を一７０℃で凍結し、修飾リボザイム分子の相対ヌクレアーゼ耐 性（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を測定する のに用いる０リボザイム分子は、５ホスホロチオエート（ｐＳ）で、またはその 分子の各末端の２°−０メチル（２’　−ＯＭｅ）による修飾で合成することが できる。これらの分子およびリポザイムのホスホジエステル変異体に対し、Ｔ４ ポリメクレオチドキナーゼを用いて３２ｐとＡＴＰで末端に標識をつける。上記 細胞質抽出物に同濃度で添加して、１０分間隔で各々試料を採取する。これら試 料を、変性ＰＡＧＥによってサイズ分画を行い、ヌクレアーゼ耐性の相対比を、 アンビスβ−スキャナーでゲルを走査することによって分析する。その試験結果 は、リボザイムが細胞質抽出物によって消化されるか否か、およびどの変異体が 比較的ヌクレアーゼ耐性が高いかを示す。修飾リボザイムは一般に、短いＲＮＡ 基買を用いた場合、未変性のりポザイムの触媒活性の８０〜９０％を維持する。

リボザイムは、標識を付けていないもの、５°末端に標識を付けたもの、または ３′末端に標識を付けたものを検定に使用できる。またこれらの試験はヒト細胞 抽出物によって実施して観察結果を確認することができる。

一つの実施例では、ベロ細胞またはヒーラ（ＨｅＬａ　）細胞を１７５ｃ■２の 組織培養フラスコ中に９０〜９５％の集密度まで増殖させ、ｌｈｌの冷リン酸緩 衝食塩水（ＰＢＳ）中にかきおとし、次にｌｈｌの冷ＰＢＳで一回および１０ｍ １の冷Ｔ　Ｓ　Ｅ　（１ｈＭ　トリス、ｐＨ７，４；　０．２５Ｍスクロース： 　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で−回洗浄した。細胞のベレットを４■ｌのＴＳＥ中に再 懸濁させ、氷上でダンス処理（３５Ｘ）を行い放出された核を、１０００ｇで１ ０分間遠心分離することによってベレットにした。その核のベレットを１■ｌの ６５％スクロースＴＭ　（５ｈＭ’ｐリス、ｐＨ１７，４；　２．５ｗＭ　Ｍｇ Ｃｌ、）中に再懸濁させ、次いでベックマンのウルトラクリアー試験管（ｕｌｔ ｒａ−ｃｌｅａｒ　ｔｕｂｅ）に移した。次のスフローフッＭ溶液を試料の上に 重層した。すなわち１＋１の６０％溶液、ｌ＋１の５５％溶液および２５％溶液 を試験管の上部に重層した。勾配液をＳ　Ｗ６０ロータを用い、３７、０００ｇ で１時間遠心分離を行った。ヒーラ細胞の核は５５〜６０％のスクロースバウン ダリー（ｓｕｃｒｏｓｅ　ｂｏｕｎｄａｒｙ）でバンドを生成し、モしてベロ細 胞の核は５０〜５５％スクロースバウンダリーでバンドを生成した。これらの核 のバンドを収穫し、７Ｍ緩衝液を用いて１０％スクロースの濃度まで希釈し、次 に３　Ｗ６０ロータを用い、３７、０００ｇで１５分間遠心分離を行うことによ ってペレット化した。得られた核のベレットを１■ｌの７Ｍ緩衝液中に再懸濁さ せた。ポスト核上澄み液（ｐｏｓｔ　ｎｕｃｌｅａｒｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ） 中の細胞レベル下オルガネラと膜成分とを、Ｓ　Ｗ６０ロータを用い２００、０ ００ｇで２時間遠心分離することによって細胞質の画分から分離した。そのベレ ットは膜画分を含有しており、その画分を１■ｌのＨ緩衝液（０，２５にスクロ ース：　５ｈＭ　ＩＩＥＰＥｓ、　ｐＨ７，４）中に再懸濁させた。そしてその 上澄み液は細胞質の画分を含有していた。

これら各種画分の純度を、細胞質および膜の画分に対して特異的な酵素マーカー を用いて評価した。膜画分に対して３種の酵素マーカーを用いた。すなわち、ヘ キソサミダーゼとβ−グルコセレブロノダーゼをリゾソーム中に局在させ、一方 エンドソームに対して特異的なアルカリ性ホスホジェステラーゼを用いた。その 検定は具体的に述べると以下のとおりである。

Ｎ−アセチル−β−へキソサミニダーゼについては、０．３ｍｇ／＊１の４−メ チルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−グルコサミニド；　２０１１ＩＭのクエ ン酸ナトリウム、ｐＨ４，５；　０．０１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ− １００；および１００μｌの試料を含有し、最終容積が５００μｍの反応混合物 を用いた（バーディングら、セル、６４巻、３９３頁、１９９１年）。反応混合 物を３７℃で１時間インキュベートし、１．５■ｌの停止緩衝液（０，１３Ｍグ リ／ン、０．０７Ｍ　ＮａＣ１，０，０８Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１ｏ、　６） を添加して反応を停止させた。反応生成物は、日立Ｆ−４０１０蛍光分光光度計 を用い、３６０ｎ１１の波長光で発蛍光団を励起し、４４８ｎｍの波長光の発光 を分析することによって定量した。

アルカリ性ホスホジェステラーゼについては、２５ｍＭ　ＣＡＰＳ　［３−（／ クロへキシルアミノ）−プロパンスルホン酸］　、ｐＨ１０，６：　０．０５％ トリトンＸ−１００；　１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　：　１．２５ｍｇ／ｍｌチミジ ンー５−モノホスフェート−ｐ−ニトロフェニルエステル：および１００μｌの 試料を含有し、全反応容積が２００μｍの検定媒体を用いた。その反応混合物を ３７℃で２時間インキュベートし、次いで水で１■ｌまで希釈し、吸光度を４０ ０ｎｍ波長光で測定した（ラゼールとコーヤナ、ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー、２３４巻、７３９頁、１９５９年）。

β−グルコセレブロノダーゼについては、８５止クエン酸ナトリウムｐＨ５，９ ＋　０．１２％Ｔｒｉ　ｔｏｎλ−１００：　Ｏ，１％タウロコール酸ナトリウ ム＋５ｍＭ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド：および１ ２５μｍの試料を含有し、全容積が２５０μｌの反応混合物を使用した（ケネデ ィーとクーパー、バイオケミカルジャーナル、２５２巻、７３９頁、１９８８年 ）。その反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、０．７５ｍ１の停止緩 衝液を添加することによって反応を停止させた。蛍光分光光度計により、３６０ 止の波長の励起光を用い４４８止の波長光の発光を分析することによって産物の 生成を測定した。

細胞質酵素マーカーである乳酸デヒドロゲナーゼは、０．２Ｍ　）リス、ｐＨ？ 、　４　：　０．２２ａ＋Ｍ　ＮＡＤＨ；　’１　ｍＭピルビン酸ナトリウムお よび５０μｍの試料を含有し、最終容積が１゜０５ｍ１の検定混合物で検定した 。酵素のレベルは、室温でのＮＡＤＨの酸化でもたらされる３５０１波長光の吸 光度の低下によって測定した（シルバースタインとホイール、ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー、２３９巻、３９０１頁、１９６４年）。

乳酸デヒドロゲナーゼは、ベロ細胞とヒーラ細胞の両者の細胞質画分中に優先的 に見られたが、β−グルコセレブロンダーゼとアルカリ性ホスホジェステラーゼ は、はとんど膜画分中にのみ見出された。ベロ細胞画分中のへキソサミニダーゼ の活性は膜画分中に集中しく７０％）、細胞質画分中には約２０％であった。酵 素マーカーを適正な細胞コンパートメント（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏ叩ａｒｔＩ ｌｅｎｔ）で分離した結果、細胞質、膜および核の画分は、上記の分画法を用い て、最小コンパートメント間コンタミ不−ノヨン法（ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｔｅ ｒｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）で単離できるこ とが実証された。

リボザイムとｍＲＮＡのヌクレアーゼ安定性細胞画分内のヌクレアーゼ活性を監 視する最も簡単で最も鋭敏な方法は、末端に標識を付けたオリゴヌクレオチドを 用いる方法である。しかし、いくつかの生物学的抽出物においてホスファターゼ の活性のレベルが高いと、３２ｐで５°末端が標識付けされたオリゴヌクレオチ ドを基質として用いた場合、ヌクレアーゼの試験で不明確な結果がでる。抽出物 中のホスファターゼの活性を測定するには、細胞画分は、消化を最適化するため 、ｌ　ｍＭ　Ｍｇ”　（またはヒーラ細胞質抽出物の場合は２ｎ４２）の存在下 、冷すポザイムと痕跡量の５′末端標識化リポザイムとともにインキュベートし た。試料をポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付した後、オリゴヌクレオチド の消化を、染色とオートラジオグラフィの両方で評価した。

具体的に述べると、基本的なオリゴヌクレオチド消化反応混合物としては、基質 の核酸（３６個のヌクレオチドからなるＲＮＡオリゴヌクレオチド）および細胞 画分の抽出物を含有し、全容積が１００μｌのものを用いた。３７°Ｃでインキ ュベートし、各種の期間後に７μｍづつを採取し、７μｍのゲルローディング１ ｌｌｉ液（９５％ホルムアミド、０１％のブロモフェノールブルー、０．１％キ シレンシンノールおよび２０■Ｍ　ＥＤＴＡ）に添加した。これらの試料を７Ｍ の尿素を含有する２０％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離した。無 傷のりポザイムを、ステインスオール（Ｓｔａｉｎｓａｌｌ）　（米国、オハイ オ州、クリーブランド所在のユナイテッド・ステイソ・バイオケミカル社）で染 色するかまたは３２Ｐで標識を付けたりポザイムをオートラジオグラフィーにか けることによって可視化した。染色したゲルとＸ線フィルムを、Ｂｉｏ　５００ ０デンンテイースキヤナー（ニーニス・バイオケミカル社）で走査した。リボザ イムは、１０μＣｉの３２ｐγ−Ａ　Ｔ　Ｐ　（３，０００Ｃｉ／ｍモル：米国 、マサチューセッツ州、ボストン所在のニュー・イングランド・ヌクレアー社） および２０〜２５ｐモルのりボザイムを用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ （ニーニス・バイオケミカル社）で５°末端に標識を付けた。取り込まれなかっ たヌクレオチドを、Ｇ−５０スピンクロマトグラフイーによって生成物から分離 した。ヌクレアーゼ検定液として、３２ｐで標識を付けたりボザイムを１〜２ｐ ａｒｏｌｅ含有しているものを用いた。オリゴヌクレオチドはすべてアプライド ・バイオシステムズ３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器（米国、カリフォルニア州、 フォスター・シティ所在のアプライド・パイオンステムズ・インコーホレイテッ ド社）を用い、メーカーのプロトコルに従って合成した。核の画分は２．５ｍＭ 　ＭｇＣ１□を含有する緩衝液中に再懸濁させた。核の画分に関する試験は、ｌ 　ｍＭ　Ｍｇ”の存在下または１ｍＭのＭｎ”、Ｃａ゛２もしくはＺｎ“２と混 合して実施した。

ｍＲＮＡの安定性を測定するために、ベロ細胞を、５のＭ、　Ｏ，Ｉで単純ヘル ペスウィルス（ＩＩｓＩ’）に感染させ、全ＲＮＡを抽出した（コムクジンスキ ーとサッチ、アナリティカル・バイオケミストリー、１６２巻、１５６頁、１９ ８７年）。ＲＮアーゼ保護検定法を用いて、細胞質抽出物中の全感染細胞ＲＮＡ をインキュベートした後ｍＲＮＡを検出した。ＲＮＡプローブは、’　２Ｐ　ａ 　−ＣＴ　Ｐ　（３，０００Ｃｉ／＋＋ｍｏｌ、米国、マサチューセノツ州、ボ ストン所在のニュー・イングランド・ヌクレアー社）の存在下、Ｔ７ＲＮＡポリ メラーゼ（ニーニス・バイオケミカル社）を用いてＰＣＲで増幅した鋳型ＤＮＡ から製造した。鋳型ＤＮＡは、１単位のＲＮアーゼなしのＤＮアーゼエを用い３ ７℃で１５分間かけて不活性化した。取り込まれていないヌクレオチドを６−５ ０スピンクロマトグラフイーで除去した。３７℃で種々の期間インキュベートし た後、試料（６μｍづつ）をヌクレアーゼ検定液から採取し、４０μｌの４ＭＧ ［ｌ５ＣＮ緩衝液（４Ｍチオシアン酸グアニノウム；　２５ｍＭクエン酸ナトリ ウム、ｐＨ７；０．５％サルコンル、および０．１Ｍ２−メルカプトエタノール ）および３！Ｐで標識したＲＮＡプローブ（５ｘ　１０’ｃｐｍ／　５　ｔｔ　 ｌ、比活性：　１．８　Ｘ　１０’ｃｐｓ／　ｔｔ　ｇ）含有４Ｍ　ＧＵＳＣＮ 緩衝液５μｌ中に添加した。ハイブリッド形成反応混合物を鉱油で覆い、５５℃ で１２〜１６時間インキュベートし、その後、そのハイブリッド形成反応混合物 を５００μｍのＲＮアーゼ緩衝液（０，４Ｍ　ＮａＣ１，２０Ｐｇ／ｍｌ　ＲＮ Ｎアーゼ、２単位／ｍ１ＴＩＲＮアーゼ）と混合し、次いで３７℃で３０分間イ ンキュベートした。ＲＮアーゼの活性は１０μｌの２０％ＳＤＳおよび１０μｌ のプロテイナーゼＫ　（２ｈｇ／ｍｌ）とともにインキュベートすることによっ てクエンチし、次いでＲＮＡをフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し た。保護されたＲＮＡフラグメントを、キャリヤーの酵母ｔＲＮＡ２０μｇの存 在下、等容積のイソプロパツールで沈澱させることによって精製した。得られた ＲＮＡベレットをゲルローディング緩衝液中に再懸濁させ、９５℃で５分間加熱 し、５％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素ゲル上電気泳動によって分離した。保護 されたフラグメントをオートラジオグラフィーで可視化し、次いでそのフィルム をバイ第５０００デンシティ−スキャナーで走査した。

これらの方法を用いる試験では、ベロ細胞抽出物中のりポザイムの消化速度は類 似しており、ベロ細胞の画分には有意なホスファターゼ活性が欠けていることを 示した。類似の試験結果がＨｅＬａ細胞の画分についても観察された。大部分の 抽出物中に、消化されたフラグメントのラダー（ｌａｄｄｅｒ）が観察された。

このようなラダーは、消化がホスファターゼの作用のアーチファクト（ａｒｔｉ ｆａｃｔ）であったならば考えられないであろう。したがって５゛末端に標識を つけたりボザイムを用いる消化法は、細胞抽出物中のヌクレアーゼ作用の正確な 評価法である。

他の試験では、標識を付けたりボザイムを、ベロ細胞およびＨｅＬａ細胞の各種 細胞画分中でインキュベートした。リボザイムを、膜の両分または核の画分中で インキュベートしたところ、時間の経過とともに無傷の分子が直線的に減少した 。

これに対して、ベロ細胞の細胞質抽出物内では２４時間のインキュベーンタン中 リボザイムの消化は全く起こらなかった。モしてヒーラ細胞の細胞質抽出物は２ ０〜３０分間遅れてＲＮＡの消化開始を示した。この無反応の期間を過ぎると、 消化速度は直線的であったが、核または膜の両分のどれに観察された速度はどに 速くはなかった。

細胞画分のヌクレアーゼ活性に対する４種の二価カチオン（Ｍｇ゛２、翻゛２、 Ｃａ”およびＺｎ”りの作用を評価した。ベロ細胞の細胞質抽出物は１ｍＭのＭ ｇ゛２またはＭｎ弓を添加することによって刺激されたが、ら２またはＺｎ４２ は全く作用がなかった。

ヒーラ細胞の細胞質の抽出物のヌクレアーゼ活性は１ｍＭＺｎ”の添加によって のみ増大した。ベロ細胞とヒーラ細胞の膜画分は両者ともにＭｇ゛２またはＭｎ ”のイオンを添加すると最大のヌクレアーゼ活性を示したが、Ｃａ”を添加する とヒーラ細胞の膜画分の活性は有意に低下し、力りベロ細胞の膜画分のヌクレア ーゼ活性は消失した。両細胞の膜画分にＺｎ”を添加すると、全ＲＮアーゼ活性 が失われた。

ベロ細胞の核抽出物は、Ｍｇ−２のみまたはＭｇ−２とＭｎ”イオンの組合わせ の存在下ではほぼ同じヌクレアーゼ活性を示し、Ｍｇ’２とＣａ”２の存在下で は低いヌクレアーゼ活性を示し、かつＭｇ゛２とＺｎ”の存在下では全くヌクレ アーゼ活性を示さなかった。

ヒーラ細胞の核抽出物に対するカチオン添加の効果はさほど劇的なものではなか った。これら画分のヌクレアーゼ活性は、Ｍｇ゛のみまたはＭｇ−２とＣａ”の 存在下で最大であり、抽出物にＭｇ゛が存在しているところへＭｎ−２またはＺ ｎ４２を添加すると僅かに低下した。

ヌクレアーゼ活性が添加された二価のカチオンに依存しているということを実証 するため、２１１１ＭのＥＤＴＡの存在下または存在していない場合に１ｍＭ　 Ｍｇ”を用いてヌクレアーゼの検定を行った。ヒーラ細胞の細胞質画分について は、Ｍｇ−２の代わりにｌ　Ｉｎ１ｌ　Ｚｎ”を用いた。２０ｍＭ　ＥＩ）ＴＡ が存在すると、ベロ細胞とヒーラ細胞の細胞質画分およびベロ細胞の膜画分のヌ クレアーゼ活性は完全に消失した。

ヒーラ細胞の膜画分と膜画分のヌクレアーゼ活性は、ＥＤＴＡを添加すると部分 的に阻害されたが、ＥＤＴＡはベロ細胞の膜画分のヌクレアーゼ活性に対しては 全く影響しなかった。比較するために、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる反応 を、ベロ細胞の各種の両分を用いて行った。ベロ細胞の細胞質、膜および核の画 分のＤＮアーゼ活性はすべて２ｈＭ　ＥＤＴＡによって阻害された。

ＲＮＡオリゴヌクレオチドとＨ３Ｖ−１ｍ　ＲＮ　Ａの安定性を、活性を増大す る二価のカチオン（１ｍＭＭｇ″２、ベロ細胞；　ｌ　ｍＭ　Ｚｎ”、ヒーラ細 胞）の存在下または存在しない場合について比較した。ｌｌ５Ｖ−１を感染させ たベロ細胞由来の全細胞ＲＮＡ（８ｍｇ）および痕跡量の３２ｐで５′末端に標 識を付けたＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｌｐモル）をベロ細胞またはヒーラ細胞 の細胞質抽出物とともにインキュベートシた。二価カチオンが存在しない場合、 無傷のりボザイムの実質的な減少は検定中に検出できなかったが、ｍＲＮＡはベ ロ細胞およびヒーラ細胞の細胞質の抽出物中で消化された。二価のカチオンを添 加した後に、リポザイムの消化が、ベロ細胞とヒーラ細胞の細胞質の両分の両者 の中で起こった。ヒーラ細胞抽出物におけるリボザイムの消化速度は、ｍＲＮＡ について観察されたのと類似のレベルまで増大したが、ｍＲＮＡの消化速度は、 ベロ細胞の細胞質画分中でのりボザイムの消化速度より大きいままであった。

このようにして、ハンマーへッドリポザイムの安定性を、ベロ細胞とヒーラ細胞 の両者の細胞質、膜および核の画分内で比較した。ベロ細胞の細胞質と核の画分 は、最適のヌクレアーゼ活性を得るためにＭｇ”　２を必要とすることが見出さ れたが、膜の両分の場合は二価カチオンを加えても変化がなかった。ヒーラ細胞 の膜と核の画分も靭゛２によって活性化されたが、その細胞質画分はヌクレアー ゼを活性化するのにＺｎ”２が必要であった。リポザイムとｍＲＮＡの相対的安 定性を、ベロ細胞とヒーラ細胞の細胞質画分中で比較した。適正な二価カチオン が存在しない場合、リボザイムの消化は、いずれの細胞質試料にもほとんど観察 されなかったが、ｍＲＮＡは迅速に消化された。ベロ細胞の細胞質抽出物にＭｇ ′″２を添加した場合およびヒーラ細胞の細胞質抽出物にＺｎ”を添加した場合 、リポザイムの分解が刺激され、かつｍＲＮＡの消化が促進された。これらのデ ータは、リボザイムのヌクレアーゼ感受性が細胞のタイプに対して特異的であり 、試験される細胞内コンパートメントによって変化し、ｍＲＮＡについての試験 から予測することができないことを示している。しかし、リボザイムは、上記の 細胞画分中で潜在的に充分な期間にわたって安定なことを示し、治療上有用な活 性を有していることは注目すべきである。

リボザイムの投与 選択されたりボザイムは、予防のためまたは疾病にかかつている患者に対し、例 えば下記のようにして投与することができる。すなわちリポソーム、放出制御賦 形剤のような適正な放出賦形剤によって、ならびにイオン電気導入法（ｉｏｎｔ ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　、工Ｌｉクトロボレーノシン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ ｔｉｏｎ）またはイオン対合分子もしくは共有結合アダクト、および他の薬理学 的に承認された放出方法を用いて、所望の組織にリボザイムを外因的に放出する ことによって投与される。投与経路としては、筋肉内、エアゾル、経口（錠剤も しくは火剤の剤形）、局所、全身、眼内、腹腔内および／またはくも膜下の経路 が挙げられる。リボザイムによる免疫化および／またはりボザイムの放出に用い る発現ベクターも適切なものである。

選択されたりボザイムの特定の放出経路はりボザイムの使用法に依存している。

一般に各リポザイムについての特定の放出プログラムは、細胞内に局在させた場 合の未修飾リボザイムの摂取量の測定に集中して行われ、次いで効力が実証され る。あるいは、動物の器官もしくは組織のこれらの同じ細胞に対する放出量を追 跡することができる。摂取量の試験法としては、放出賦形剤または放出方法にか かわらず、細胞のりポザイム摂取量を評価する摂取量検定法がある。またこれら の検定法によって、リボザイムが摂取に続いて細胞内に局在化することが測定さ れ、最終的に、標的配列を含有する細胞コンパートメント（核および／または細 胞質）内に定常状態の濃度を維持するのに必要な条件を確認することができる。

次に効力と細胞毒性を試験することができる。毒性には細胞生存力のみならず細 胞機能も含まれる。

利用することができるいくつかの放出方法としては、下記の方法がある。

ａ、リポソームによる被包形成、 ｂ　レトロウィルスのベクターによる導入、Ｃ，コレステロールとの抱合 ｄ、大部分の核タンパク賃上に見られる核標的部位を利用する核コンパートメン トへの局在化、 ｅ、ヌクレオチド誘導体を利用することによるリボザイムの電荷の中和。および 、 ｆ、血液幹細胞を使用して身体全体にリポザイムを分布させる方法がある。

本発明では少なくとも３種の放出方法：リボザイムの修飾体、粒子担体の医薬放 出賦形剤およびレトロウィルスのベクターがある。未修飾のりボザイムは、大部 分の小分子と同様に、ゆっ（りではあるが細胞によって吸収される。細胞の摂取 を促進するために、リポザイムは、その電荷を低下させるが特異的な官能基を維 持する方法でほぼランダムに修飾することができる。この修飾によって、細胞膜 を横切って拡散できる分子が得られ、透過バリヤーが除かれる。

リボザイムの電荷を減少させる修飾法は、このような大きな分子の細胞摂取量を 増大する一方法である。しかしランダム法は、リポザイムが、構造と機能の面で 、小さい医薬の分子より一層複雑になるので得策ではない。リボザイムの触媒活 性を維持するために必要な構造上の必要条件は当該技術分野の当業者には充分理 解されている。これらの必要条件は、細胞放出を促進するため修飾を設計すると きに考慮される。またこれらの修飾は、ヌクレアーゼの分解に対する感受性を低 下させるために設計される。これら両方の特性によってリボザイムの効力は大き く改善されるはずである。細胞の摂取量は、リポザイムの切断活性に対して必要 なホスホジェルチル結合を変える必要なしに数桁の倍率で増大させることができ る。

リン酸基の骨格を化学的に修飾すると、負の電荷が低下して細胞膜を横切って自 由に拡散することができるようになる。この原理は、アンチセンスＤＮＡ法とし て実証され、成功している。ＤＮＡとＲＮＡの化学組成が類似していると、この 方法が適切な方法になる。身体内で外部濃度（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎ ｔｒａｔｉｏｎ）を維持することは、修飾されたりポザイムを組織の細胞中に拡 散させるのに必要である。疾患がみられる組織を一過性高濃度の医薬に暴露させ る投与経路としては、全身吸着によって徐々に散逸する経路が好ましい。リポザ イムの循環半減期を増大するよう設計された医薬担体を静脈投与する方法を利用 することができる。その医薬担体の大きさと組成によって、血液流からの迅速な りリアランスが制限される。担体は、感染部位に蓄積するように製造され、リポ ザイムを分解プロセスから保護することができる。

医薬放出賦形剤は、全身投与および局所投与の両方に対して有効である。これら 賦形剤は、徐々に放出する容器としての働きをするか、またはその内容物を標的 細胞に直接放出するよう設計することができる。医薬を直接放出する賦形剤を使 用する場合の利点は、多数の分子が一回摂取ごとに放出されることである。この ような賦形剤は、他の方法によれば血液流から迅速に排除される医薬の循環半減 期を増大することが報告されている。この範鴫に属するこのような特別の医薬放 出賦形剤のいくつかの例は、リポソーム類、ヒドロゲル類、シクロデキストリン 類、生物分解性ナノカプセル類、および生物接着性の微小球体である。

放出系のこの範鴫のなかでリポソーム類が好ましい。リポソーム類は、細胞内安 定性を増大し、摂取効率を増大し、かつ生物活性を改善する。

リポソーム類は、細胞膜を構成する脂質と類似した方式で配列された脂質で構成 された中空の球状小胞体である。そしてリポソーム類は、水溶性化合物を捕捉す る内部水性空間を有し、直径が００５０５ミフロン〜クロンの範囲内にある大き さである。リポソーム類がＲＮＡを細胞に放出することができ、かつそのＲＮＡ が生物学的に活性なままであることをいくつもの試験が示している。

例えば、研究の手段として最初に設計されたリポソーム放出賦形剤であるリポフ エクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）は、無傷のｍＲＮＡ分子を細胞に放出し、対 応するり〉バク賞を産生ずることが報告されている。

リポソーム類はいくつもの利益を提供する。すなわち、組成が非毒性で、かつ生 物分解性であり、長い循環半減期を示し、かつ組織を標的とする認識分子はリポ ソームの表面に容易に付着することができる。Ｉ！に１％的に、液体懸濁物また は凍結乾燥製品でリポソームベースの医薬は高い費用効率で製造されるので、こ の方法が容Ｗ可能な医薬放出系として存続できることが実証された。

池の放出制御医薬放出系、例えばナノ粒子類とヒドロゲル類はりボザイム用に可 能性がある放出賦形剤である。これらの担体は化学療法剤およびタンパク質ベー スの医薬用に開発されてきたものであるので、リポザイムの放出用に適用できる 。

リポザイムを局所投与することは、全身吸着を最少にすることによって投与部位 に濃度を局所化させるので有利である。この方法によって、リボザイムの疾病部 位に対して放出する方法が簡単になり、毒物学的特性の程度が減少する。さらに 、用いられる物質の量は他の投与経路に必要な量よりはるかに少ない。有効な放 出を行うには、リボザイムは感染細胞中に拡散する必要がある。リポザイムを化 学的に修飾して負の電荷を中和することは、透過するのに必要なすべてである。

しかし、電荷の中和が不充分な場合、修飾されたりボザイムは、アゾン（＾ｚｏ ｎｅ）またはオレイン酸のような透過促進剤とともに、リポソーム中に共配合す ることができる。これらリポソーム類は、修飾リボザイムと透過促進剤がリポソ ームから感染細胞に移行する際の徐放性賦形剤として働くことができるか、また はリポソームリン脂質類は修飾リボザイムおよび透過促進剤とともに、細胞放出 を容易にすることに直接参画できる。場合によっては、リポザイムと透過促進剤 を配合して徐放用坐剤にすることができる。

またリポザイムは全身に投与することもできる。全身吸収とは、医薬が血流中に 蓄積され、続いて全身に分布されることを意味する。全身吸収を行う投与経路と しては、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内、くも下膜内および眼内の投与経路があ る。これらの各投与経路は、リポザイムを接近可能な疾患組織に暴露する。皮下 投与を行うと、リンパ系ネットワークを通じてその循環系中に展開する局在リン パ節中に流入する。この循環系に入る速度は、分子量と分子の大きさの関数であ ることが分かっている。リポソームなどの医薬担体を使用するとりボザイムはリ ンパ節に局在化される。リボザイムが細胞内に拡散するよう修飾することができ るか、またはリポソームが未修飾もしくは修飾されたりボザイムの細胞に対する 放出に直接参画することができる。

オリゴヌクレオチドをリンパ球およびマクロファージに対して放出できるホスフ ァチジルエタノールアミドメチルチオスフノンイミドを含有するリポソーム配合 物は、ある種の症状に対して有用である。さらにこの組成を有するリポソームは 、１１００ｎ直径のもののみならず直径２００ｎ閣のものがインターナライズさ れた。この２０００−のリポソームは、充填容量が１１００ｎのリポソームの１ ０倍であり、がっリボザイム発現ベクターのような一層大きな分子を収納するこ とができる。このリポザイム放出系は、感染した一次免疫細胞内でｍＲＮＡが発 現するのを妨害する。

全血試験の結果は、上記配合物が、３７℃にて８時間後に９０％のリンパ球に吸 収されることを示している。生物分布および薬物動力学の予備試験では、静脈投 与してから１時間後、肺臓組織の１ｇ当たり注射投与量の７０％が得られた。

静脈注射されたリポソームは、肝臓、肺臓および肺臓に蓄積される。この蓄積量 が注射投与量の３０％〜４０％になるようにその組成と大きさを調節することが できる。残りの投与量は２４時間まで血流中を循環する。

選択された放出方法は細胞質への蓄積がなされなければならず、かつ分子は最適 の投与量に対しである種のヌクレアーゼ耐性をもっていなければならない。核の 放出は利用できるが余り好ましくない。最も好ましい放出方法としては、リポソ ーム類（１０〜４００ｎｍ）　、ヒドロゲル類、徐放性高分子物類、マイクロイ ンジェクションもしくはエレクトロポレーノヨン（生体外治療用）および他の医 薬として容認可能な賦形剤がある。投与量は疾患の徴候および投与経路に依存し ているが、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日でなければならない。治療期間は 、疾病の徴候の経過にしたがって続けて延長することができる。投与回数は、疾 患、放出賦形剤および臨床試験から得た効力のデータによって決まる。

リボザイムの細胞内の治療レベルの決定は摂取と分解の速度に依存している。

分解度を低下させると、リボザイムの細胞内半減期が延長される。したがって、 例えばリン酸基の骨格の修飾またはりボザイムの５゛と３°の末端のヌクレオチ ド類似体によるキャッピングによって、化学的に修飾されたりボザイムは異なる 投与法が必要である。有用な系の説明は先に引用した技術中に提供されているが 、これらはすべて本願に援用するものである。

他の実施態様は以下の特許請求の範囲に含まれている。

切断部位 −Ｇ Ｇ−Ｃニ −Ｃ Ａ ＦＩＧ、　１ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　、庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９１００ 　９３５９−４Ｂ （３１）優先権主張番号　９８９，８４９（３２）優先日　１９９２年１２月７ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　９８９，８４８（３２）優先日　１９９２年１２月７ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ’）Ｉ （３１）優先権主張番号　００８，８９５（３２）優先日　１９９３年１月１９ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．炎症、関節炎、狭窄または心血管病の疾患または症状の発生または維持に関 連するｍＲＮＡを切断する酵素的ＲＮＡ分子。
2. ２．ａ）腫瘍壊死因子−α；インターロイキン−５，−１，−３，−４，−６， −８、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＥＬＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭ−Ｉ：ＴＣＦ−α、ＴＮＦαＲ、 ＩＬ−１Ｒ、α−、β−もしくはγ−インターフェロン、ＥｏＣＳＦ、ＧＭ−Ｃ ＳＦ、グリセロールトランスフェラーゼ、セレクチン類、Ｅ−セレクチン、ＭＥ Ｌ−１４、ＧＭＰ−１４０、ＭＡＭおよびプロテインキナーゼＣをコードする遺 伝子；ｂ）マトリックスメタロプロティナーゼ；ｃ）ｃ−ｍｙｂ、ＴＧＦ−β、 ＮＦ−ＫＢ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＧＲＰ、アンギオテンシンＩＩおよび内皮 細胞由来弛緩因子をコードする遺伝子から選択される遺伝子；ならびにｄ）ＡＣ ＥまたはＥＣＥをコードする遺伝子から産生されるｍＲＮＡを切断する請求の範 囲１記載の酵素的ＲＮＡ分子。
3. ３．表１に示す配列番号１〜５４；表２に示す配列番号１〜３３；表３に示す配 列番号および表４に示す配列番号から選択される配列を有する標的ｍＲＮＡを切 断する請求の範囲１記載の酵素的ＲＮＡ分子。
4. ４．該ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフの分子である請求の範囲１、２また は３に記載の酵素的ＲＮＡ分子。
5. ５．該ＲＮＡ分子が、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウィルスモチーフ、グルー プ１のイントロンモチーフまたはＲＮアーゼＰＲＮＡモチーフの分子である請求 の範囲４記載の酵素的ＲＮＡ分子。
6. ６．該リボザイムが、該ｍＲＮＡに対して相補的な５〜２３個の塩基を有する請 求の範囲４記載の酵素的ＲＮＡ分子。
7. ７．該リボザイムが、該ｍＲＮＡに対して相補的な１０〜１８個の塩基を有する 請求の範囲６記載の酵素的ＲＮＡ分子。
8. ８．請求の範囲１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を含有する哺乳動物の 細胞。
9. ９．該細胞がヒトの細胞である請求の範囲８記載の細胞。
10. １０．請求の範囲１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を哺乳動物の細胞内 で発現させる方式で、該酵素的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含有している発現 ベクター。
11. １１．請求の範囲１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を患者に投与するこ とによって、炎症疾患、関節炎の症状、狭窄の症状または心血管病の症状を治療 する方法。
12. １２．該患者がヒトである請求の範囲１１記載の方法。