JP2012517815A - Ang2の発現を阻害するための手段 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1は、ヒトANG2をコードするmRNA配列である。この配列は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものとするGenBank受託番号NM_001147.2において示されるcDNA配列から転換されたものである。
本発明は、発現したANG2のRNA転写物(本明細書では、場合によって、「標的核酸」と称する)を指向する短鎖干渉RNA(siRNA)を含む組成物に関する。本発明のsiRNAは、二本鎖領域または二重鎖領域を含む核酸分子である。本発明はさらに、ANG2の発現レベルを低減するsiRNA組成物を用いる方法にも関する。遺伝子発現に言及するときに本明細書で用いられる「サイレンシング」または「ノックダウン」という用語は、遺伝子発現の低減を意味する。本発明はさらに、siRNAを作製する方法にも関する。
一実施形態では、センス鎖の3’末端における突出が、1、2、3、4、および5ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端における突出が、1、2、3、4、および5ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。一実施形態では、センス鎖の5’末端における突出が、1、2、3、4、および5ヌクレオチドの長さからなる群から選択される。
siRNAは、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても、細胞と直接的に接触させるか(「裸の(naked)」siRNA)、または細胞を標的化するか、もしくは細胞内へと送達することを容易にする1種以上の作用物質と組み合わせることを含め、当業者に知られる各種の方法により、細胞へと送達することができる。このような作用物質および方法には、リポプレックス、リポソーム、イオントフォレーシス、ハイドロゲル、シクロデキストリン、ナノカプセル、マイクロスフェアおよびナノスフェア、ならびにタンパク質性ベクター(例えば、Bioconjugate Chem.(1999)、10:1068〜1074およびWO00/53722)が含まれる。核酸/媒体の組合せは、in vivoにおいて、直接的な注射によって局所到達することもでき、注入ポンプを用いることにより局所送達することもできる。本発明のsiRNAは、in vivoにおいて、静脈内、皮下、筋肉内、もしくは皮内の注射、または吸入を含め、各種の手段により送達することができる。本発明の分子は、薬剤として用いることができる。薬剤は、対象における疾患状態の発生を防止、調節するか、またはこれを治療する(症状をある程度まで緩和し、好ましくは、すべての症状を緩和する)ことが好ましい。
a)約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、β−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
b)約48〜49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)と、
c)約1〜2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール、好ましくは、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩と
からなる正に帯電したリポソームである。
(細胞株)
マウスB16V黒色腫細胞およびマウス内皮MS−1細胞を、ATCC/LGC Promochem社から得て、製造元の推奨に従い培養した。EBM2+ SingleQuots増殖用補充物質を含有するEGM−2 BulletKit培地中において、HUVEC(Lonza社製)を培養した。
既に説明した通り(Santelら、2006)、表示の細胞数およびsiRNA濃度で、マウスB16V黒色腫細胞およびマウス内皮MS−1細胞に、リポプレックス化させたsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を溶解させ、全RNAを調製した(Invitek社製、Invisorb Spin Cell RNA単離キット)。その後、全RNAを、定量的リアルタイムRT−PCR法(ABI社製、TaqMan)を用いるmRNA定量アッセイに用いた。表示されるmRNAの標準化レベルは、標的遺伝子および基準遺伝子の両方についての発現レベルを示す2−(ΔΔCt)法により決定した。
4日間連続で、200μl溶液を、尾静脈に静脈内ボーラス注射することにより、siRNAリポプレックスを、C57/Bl6マウスに全身投与した。既に説明した通り(Santelら、2006)、リポプレックス溶液は、21.7mg/kgの全脂質(AtuFECT01、DPhyPE、DSPE−PEG)と共に複合体化させた、2.8mg/kgの最終用量でsiRNAを含有した。
動物に対するすべての手順は、現地の規制当局による承認を受けた。既に説明した通り(Schmeckら、2004;Opitzら、2004)、C57/Bl6マウスに、5×106コロニー形成単位の肺炎球菌(NCTC 7978)を経鼻感染させた。ヒト血清アルブミン(HSA)を静脈内適用し、気管支肺胞洗浄(BAL)を行った後で、ELISA(酵素免疫測定アッセイ)(テキサス州、モンゴメリー、Bethyl社製)(Matute−Belloら、2001)により、BALおよび血清中におけるHSA濃度を測定し、HSAのBAL/血清比を計算した。
既に説明した通りに、BALB/cマウスの肺を調製した。略述すると、麻酔をかけたマウスを気管切開および換気した。胸骨切開し、左心房および肺動脈にカニューレ挿入し、37℃のクレブス−ヘンゼルライトの滅菌ヒドロキシエチルアミロペクチン緩衝液(ドイツ、Serag社製、1mL/分)により肺を灌流し、陰圧(−4.5〜−9.0cm H2O)により換気した。圧力トランスデューサーにより肺動脈圧(Ppa)および肺静脈圧を持続的にモニタリングし、デジタルデータ化した。Graph−Pad−4ソフトウェア(米国、カリフォルニア州、サンディエゴ)により、Ppa曲線下面積(AUC)を計算した。説明される通り(Patonら、1993)に組換えPLY(ニューモリシン)を調製し、肺動脈内へと注入するか、またはマイクロスプレー装置(ペンシルベニア州、フィラデルフィア、Penn−Century社製)を用いて気管内エアゾール投与した。肺胞毛細血管の透過性を測定するため、PLYを適用する前に、灌流物にHSAを混合した(0.04%)。PLY接種の30分後、BALを実施し、BAL上清中においてHSA濃度を測定した。in vivoにおけるデータを、平均+/−SEMとして表した。一元分散分析の後、ステューデント・ニューマン・クールズ検定により、差違を解析した。
アンジオポエチン2(Ang−2)をコードするmRNAを指向するsiRNA分子(AtuRNAi、表1および2を参照されたい)、ならびにルシフェラーゼを指向し、本明細書で説明される実験および実施例と関連して用いられた各種のsiRNA分子は、BioSpring社(ドイツ、フランクフルトアムマイン)により合成されたものであり、これらを、本発明の二本鎖核酸分子を形成する第1の鎖および第2の鎖両方の配列に関して、表1に示す。
本明細書ではまた、Ang2特異的なsiRNA分子を含有するリポプレックス製剤を、siRNAリポプレックスまたはsiRNAAng2リポプレックスとも称する。脂質膜を、300mMのRNaseを含まない滅菌スクロース溶液中に、4.34mg/mlの全脂質濃度まで再水和することにより、50/49/1のモル比で、特許で保護された陽イオン性脂質であるAtuFECT01(β−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、Silence Therapeutics AG社製)、中性リン脂質である1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)(アラバマ州、アラバスター、Avanti Polar Lipids社製)、およびPEG化脂質であるN−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩(DSPE−PEG)(ドイツ、ルートヴィッヒシャーフェン、Lipoid GmbH社製)を混合した。IPMLおよび肺炎球菌感染についての実験の場合、このような製剤は、21.7mg/kgの全脂質と共に複合体化させた、2.8mg/kgのsiRNAであり、これを、4日間連続で静脈内ボーラスにより注射した。in vitro試験の場合は、1μg/mlでAtuFECT01−DPhyPEを混合することにより、リポプレックスを作製した。
実施例3に従ってリポプレックスとして製剤化された実施例2のAng2特異的siRNA分子を、それらが、B16V細胞、MS−1細胞、およびHUVEC細胞のそれぞれにおいてAng2 mRMA発現を阻害する能力について調べた。このような目的で、48時間にわたり、20nMの最終濃度で、表1A、Bで列挙するsiRNAAng2リポプレックス、または対照を、培養細胞にトランスフェクトした。細胞を回収し、対応する全RNAを、TaqManリアルタイムPCR解析にかけた。さらなる詳細は、実施例1から理解することができる。対照としては、鎖LUC−BおよびLUC−Aからなる、ルシフェラーゼ特異的なsiRNA分子を含有するリポプレックスを用いた。ローディング対照としては、PTENを用いた。TaqMan解析の結果を、図3、6、7、10、12、13に示す。
肺の微小血管透過性の増大は、ALI(急性肺傷害)またはそのより重篤な形態であるARDS(急性呼吸窮迫症候群)の発症および進行における主要な事象である(Aird、2003;Ware 2006、ManiatisおよびOrfanos、2008)。マウスを、4日間連続で、19マーのsiRNAAng2リポプレックスにより静脈内処置(尾静脈への低圧ボーラス注射)した。対照として、siRNALucリポプレックスおよび関連のないsiRNA標的2リポプレックスを並行して適用した。その後、単離ニューモリシン(PLY)により刺激した肺(ex vivoにおける単離灌流マウス肺系、図4〜5)において、肺血管透過性を測定した。対照試料と異なり、PLYは、HSAの微小血管透過性を劇的に増大させた。しかし、siRNALucリポプレックスまたはsiRNA標的2リポプレックスにより処置した対照動物とは異なり、siRNAAng2で処置した動物に由来する肺における平均血管透過性が著明に低かったことは、PLYによる侵襲から血管系が防御されたことを示唆する(図5)。肺炎球菌(Pneumococcus)属の肺感染(=病原性肺炎球菌の吸入後における、肺炎)によりマウスを接種し、Ang2 siRNAリポプレックスにより処置した後においても、in vivoにおいて同様の結果が得られた(図5、6)。ここでも、対照群に由来する動物とは異なり、Ang2リポプレックス処置により、血管漏出に対する防御がなされた。肺炎球菌感染したときに、siRNAAng2リポプレックスによる静脈内処置が、関連のないsiRNALucリポプレックス/siRNA標的2リポプレックス対照と比較して、血管透過性に対する防御効果を及ぼすさらなる実験においても、この知見は裏付けられた(図6A)。RNAiを介してAng2発現の下方制御を誘発するのにリポプレックスが果たす機能性は、in vivoにおける実験を実施する前に、細胞培養物中において確認された(図6B)。加えて、siRNAAng2リポプレックスで処置したマウスに由来する肺においてバリア機能が改善されること、対応する試料中においてAng2 mRNAの発現が標的特異的にノックダウンされることも観察された(図6C)。7番のsiRNA分子(図2を参照されたい)の3’側伸長変異体、すなわち、9番のsiRNA分子(図11を参照されたい)も、上記で説明したex vivoにおける別のIPML実験において、同じ防御効果を示した(図8)。
19マーの初期リードsiRNA分子である7番および8番のsiRNA(また、図2を参照されたい)、ならびにそれらの対応する3’側伸長23マー変異体を、HUVECにおけるトランスフェクション実験による力価決定によりさらに特徴付けた。図15に示す通り、(上記で説明した通り)いずれの19マー分子(マウスmRNAおよびヒトmRNAの両方に対して完全にマッチする)も、非処置試料と比較して、明確に用量依存的なサイレンシング活性を示すのに対し、対応する23マー(図15に示す)は、培養ヒト細胞において、効力の明確な差違を示した。ヒトAng−2 mRNAに対して1つのミスマッチを保有する9番の23マーのsiRNAは、23マーのsiRNAより強力であった。
ヒトAng−2のmRNA配列を標的とする16個の23マーsiRNA分子の別のセット(11〜26番のAtuRNAi分子)をデザインおよび合成した(図16、配列番号73〜104)。26番のsiRNA分子は、9番のマウスsiRNA分子(配列番号68、69)のヒト変異体であり、マウスsiRNA変異体に対して1つのミスマッチを保有する。表示の条件(図17)でヒト内皮細胞(HUVEC)にトランスフェクトすることにより、これらのsiRNAを、RNAiの有効性について調べ、qRT−PCRによりAng2 mRNAレベルを評価した。新規のヒトリードsiRNAを同定し(13、19、21、23、24、25番、図18)、さらなるトランスフェクション実験においてさらに特徴付けし、既に同定したヒトおよびマウスのsiRNAリード分子(4番は配列番号8、9)、マウス特異的なsiRNA(5番は陰性対照)のほか、7番の19マー初期リードsiRNAの変異体、ならびにそのマウスおよびヒトの23マー変異体と比較した。結論として述べると、ヒトsiRNAをスクリーニングしたところ、トランスフェクション実験において、新規の23マーのsiRNA分子が、mRNAを抑制するのに同様の有効性を示すことが明らかとなった。
図19Aに示す通り、肺炎球菌による感染後のマウスにおいて肺炎が発達するときの、Tie2−Ang系構成要素の発現レベルの変化を観察した。この実験では、吸入により細菌を施し、48時間にわたり、肺炎の進行についてモニタリングした。表示される各時点の後、感染マウスおよび非感染マウスに由来する動物n=6匹のコホートを屠殺し、肺組織を分析した。対応する試料中におけるTie2、Ang1、Ang2、およびPTENのmRNAレベルを決定するため、TaqMan PCRにより、各試料に由来する全RNAを単離および解析した。各群の平均値を経時的にプロットしたところ、感染マウスにおいては、Ang1およびTie2のmRNAレベルが、非感染マウスと比較して経時的に低下することが示された。Ang2のmRNAレベルが、非感染対照と比較して経時的に上昇したことは、驚くべきことである。
Claims (21)
- アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むsiRNAであって、前記アンチセンス鎖の全部または一部がアンチセンス二重鎖領域を含み、前記センス鎖の全部または一部がセンス二重鎖領域を含み、前記アンチセンス二重鎖領域が前記センス二重鎖領域と少なくとも部分的に相補的であり、前記siRNAが前記アンチセンス二重鎖領域と前記センス二重鎖領域とからなる二重鎖領域を含み、
a)前記アンチセンス鎖が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、または104のヌクレオチド配列を含むか、または
b)前記アンチセンス鎖が、全部または一部が配列番号1または70の一部と相補的であるアンチセンス二重鎖領域を含むsiRNA。 - 前記センス鎖が、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、または103のヌクレオチド配列を含む請求項1に記載のsiRNA。
- 前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、各々、19〜25ヌクレオチドの長さである請求項1に記載のsiRNA。
- 前記二重鎖領域が、19〜25ヌクレオチドである請求項3に記載のsiRNA。
- 前記二重鎖領域が、19〜25の連続ヌクレオチド塩基対からなる請求項4に記載のsiRNA。
- a)両方の末端が平滑末端であるか、
b)一方の末端において突出を有し、他方の末端において平滑末端を有するか、または
c)両方の末端において突出を有する
請求項1、2、3、4、または5に記載のsiRNA。 - 前記センス鎖および/または前記アンチセンス鎖の1個以上の一つおきのヌクレオチドが修飾されている請求項1、2、3、4、または5に記載のsiRNA。
- 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方の前記一つおきのヌクレオチドが、2’位においてO−メチル基により修飾されている請求項7に記載のsiRNA。
- 奇数番号を付した前記ヌクレオチドのそれぞれが前記アンチセンス鎖にて修飾され、偶数番号を付した前記ヌクレオチドのそれぞれが前記センス鎖にて修飾されている請求項8に記載のsiRNA。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNAと、リポソームとを含む、リポプレックス。
- 前記リポソームが、
a)約50モル%のβ−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミドトリヒドロクロリド、好ましくは、β−(L−アルギニル)−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミドトリヒドロクロリドと、
b)約48〜49モル%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE)と、
c)約1〜2モル%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール、好ましくは、N−(カルボニル−メトキシポリエチレングリコール2000)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンナトリウム塩と
からなる請求項10に記載のリポプレックス。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の核酸を含むかまたはコードするベクター。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の核酸またはベクターを含む細胞であって、ヒト細胞である場合には、前記ヒト細胞が単離細胞であることを条件とする細胞。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNAと、生理学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNA分子を含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含む炎症性疾患を治療する方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNA分子を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、ヒトの疾患または病理学的状態を治療する方法。
- 医薬を製造するための請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNAの使用。
- ヒトの疾患または病理学的状態の治療のための医薬を製造するための請求項1から9のいずれかに記載のsiRNAの使用。
- 前記ヒトの疾患または病理学的状態が、皮膚の過剰増殖性状態、または他の過剰増殖性疾患である請求項16または18に記載の方法または使用。
- 前記ヒトの疾患または病理学的状態が、乾癬、接触皮膚炎、網膜症、子宮内膜症、子宮筋腫、機能不全性血管増殖、子宮内膜微小血管増殖、炎症、関節炎、関節リウマチ、急性肺傷害(ALI)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、アテローム性動脈硬化、遺伝性出血性毛細血管拡張症、海綿状血管腫、血管新生誘導性肥満、移植後動脈症、糖尿病性網膜症、炎症性腸疾患、および歯周病、腹水、月経過多、肺高血圧、肺炎、子癇前症、肺線維症、肺気腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、膵炎、敗血症、血栓症、虚血性心疾患、多発性硬化症、脳卒中、または黄斑変性、肝硬変、マラリア、全身性エリテマトーデスである、請求項16または18に記載の方法または使用。
- 請求項15、16、および20のいずれかに記載の方法において使用するための、請求項1〜9のいずれかに記載のsiRNA、または請求項10および11のいずれかに記載のリポプレックス、または請求項14に記載の組成物。
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