JP7154403B2 - アンフィレグリン遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物 - Google Patents

アンフィレグリン遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、アンフィレグリン発現を非常に特異的で高効率に阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド、好ましくは、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態の配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びナノ粒子、及びその線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用途に関する。
１９９５年にＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）でアンチセンスを用いた遺伝子発現を抑制する上で、アンチセンスＲＮＡと同様にセンスＲＮＡも有効であることを発見し、その原因を糾明するための研究を行い始め、１９９８年にＦｉｒｅ等が初めて、二重鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）を注入してそれに対応するｍＲＮＡが特異的に分解されて遺伝子の発現が抑制される現象を確認し、これをＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）と名付けた。ＲＮＡｉは遺伝子発現を抑制するために用いられる方法で、簡便でありながら少ない費用で遺伝子抑制効果を明確に得ることができるので、その技術の応用分野が多様化しつつある。
このような遺伝子の発現を抑制する技術は、特定遺伝子の発現を調節できるので、特定遺伝子の過剰発現が原因とされる癌、遺伝疾患などの標的遺伝子をｍＲＮＡレベルで除去でき、疾病治療のための治療剤開発及び標的検証の重要なツールとして活用可能である。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては、標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されているが、プロモーターを基準に逆方向（アンチセンス）に転移遺伝子を導入する方法と、プロモーター基準に順方向（ｓｅｎｓｅ）に移植遺伝子を導入する方法がある。
このようなＲＮＡを標的にするＲＮＡ治療法は、標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドを用いて当該遺伝子の機能を除去する方法で、既存の抗体と化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）のような従来の治療剤が主にタンパク質を標的にすることとは異なる方法であると言える。ＲＮＡを標的にする接近法には大きく２種類があるが、一つは、二重螺旋ＲＮＡが媒介されたＲＮＡｉであり、他の一つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。現在、様々な疾病においてＲＮＡを標的にして臨床が試みられている。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、以下、‘ＡＳＯ’という。）は、ワトソン－クリック塩基反応によって目的遺伝子に結合するようにデザインされた短い長さの合成ＤＮＡであり、遺伝子の特定塩基配列の発現を特異的に抑制できる点で、遺伝子の機能を研究して癌のような疾患を分子レベルで治療できる治療剤を開発するために用いられてきた。このようなＡＳＯは、遺伝子発現を抑制する目標を様々に設定し、容易に作製可能である長所から、発癌遺伝子の発現と癌細胞の成長を抑制することに活用しようとする研究が行われてきた。ＡＳＯが特定遺伝子の発現を抑制する過程は、相補的なｍＲＮＡ配列と結合してＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導してｍＲＮＡを除去したり、或いはタンパク質翻訳のためのリボソーム複合体の形成及び進行を妨害することによってなされる。また、ＡＳＯはゲノムＤＮＡと結合してトリプルヘリックス（Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）構造を形成することによって遺伝子の転写を抑制することも報告されている。ＡＳＯは上記のような潜在的可能性があるが、これを臨床に活用するためには、ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する安定性が向上するとともに、目的遺伝子の塩基配列に特異的に結合するように標的組織や細胞内に効率的に伝達される必要がある。また、遺伝子ｍＲＮＡの２次及び３次構造はＡＳＯの特異的結合に重要な要素であり、ｍＲＮＡの２次構造が少ない部分が、ＡＳＯが接近するのに非常に有利なので、ＡＳＯを合成する前に、ｍＲＮＡの２次構造が少なく生成される領域を体系的に分析し、生体外だけでなく生体内でも遺伝子特異的抑制を効果的に達成するために努力してきた。このようなＡＳＯは、ＲＮＡの種類であるｓｉＲＮＡに比べて非常に安定的であり、水と生理食塩水などによく溶解される長所があり、現在、３つのＡＳＯがＦＤＡ（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認されている（Ｊｅｓｓｉｃａ，Ｃ．，Ｊ Ｐｏｓｔｄｏｃ Ｒｅｓ，４：３５－５０，２０１６）。
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、‘ＲＮＡｉ’という。）は、その役目が発見されて以来、種々の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）において配列特異的ｍＲＮＡに作用するという事実が明らかにされた（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００５）８３：７６４－７７３）。長いＲＮＡ二重鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二重鎖は、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）というエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１～２３個の二重鎖（ｂａｓｅ ｐａｉｒ，ｂｐ）にプロセシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、以下、‘ｓｉＲＮＡ’という。）に変換され、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合し、ガイド（アンチセンス）鎖がターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程によって、ターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する。ＳｉＲＮＡを用いた遺伝子の発現抑制技術は、標的細胞で標的遺伝子の発現を抑制させ、これによる変化を観察することであり、標的細胞における標的遺伝子の機能を糾明する研究に有用に用いられる。特に、感染性ウイルス又は癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制することは、当該疾病の治療方法を開発するのに有用であろうが、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における研究及び実験動物を用いた生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究を行った結果、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されたことがある。
ベルトラン（Ｂｅｒｔｒａｎｄ）研究陣によれば、同じターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）に比べて、生体内／外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ）においてｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、当該効果が長く持続する効果を有することが明らかにされた。また、ｓｉＲＮＡの作用機序は、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体基盤医薬品や化学物質医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）に比べて適用可能な対象を画期的に拡大できるという長所がある（ＭＡ Ｂｅｈｌｋｅ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６ １３（４）：６６４－６７０）。
ｓｉＲＮＡの優れた効果及び様々な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、体内におけるｓｉＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の改善と細胞伝達効率の改善によってｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されるようにしなければならない（ＦＹ Ｘｉｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２００６ Ｊａｎ；１１（１－２）：６７－７３）。体内安定性の向上及びｓｉＲＮＡの非特異的な細胞免疫反応（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の問題を解決するために、ｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチド又は骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を、核酸分解酵素抵抗性を有するように修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）したり、或いはウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、リポソーム又はナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの伝達体を用いるなど、これに対する研究が活発に試みられている。
アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性ベクターを用いた伝達システムは、形質注入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。一方、ナノ粒子を含む非ウイルス性（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウイルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率は低いが、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能であり、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞又は組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）及び内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、細胞毒性及び免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）がほとんどないという長所から、今のところウイルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法として評価されている（Ａｋｈｔａｒ Ｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ３；１１７（１２）：３６２３－３６３２）。
非ウイルス性伝達システムのうち、ナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を用いる方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの様々な高分子を使用することによってナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する方法である。ナノ伝達体を用いる方法において主に活用される方法には、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などがあるが、なかでもリポプレックスを用いた方法は、陽イオン性脂質で構成され、細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の陰イオン性脂質と相互作用することで、エンドソームの脱安定化効果を誘発して細胞内に伝達する役割を担う。
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結し、増進した薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的特徴を有させ、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できるということが知られている（Ｊ Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ １１；４３２（７０１４）：１７３－８，２００４）。このとき、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））又はアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合した化学物質の性質によってｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡは、陽イオン性物質が存在する条件で、ｓｉＲＮＡの陰イオン性リン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を持つ伝達体となる（ＳＨ Ｋｉｍ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１６，２００８）。特に、高分子複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は、薬物伝達運搬体として用いられる他のシステムである、微小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）又はナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べて、そのサイズが極小さいながらも分布が非常に一定であり、且つ自発的に形成される構造であるので、製剤の品質管理及び再現性の確保がしやすいという長所がある。
ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ））を単純共有結合又はリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を用いて、ｓｉＲＮＡの安定性確保及び効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許第８８３４７１号）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは、生体内における低い安定性と標的臓器への円滑な伝達の課題が依然として残る。このような課題を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重鎖オリゴＲＮＡに親水性及び疎水性物質が結合した二重鎖オリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、該構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）と名付けられた自己組立ナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国登録特許第１２２４８２８号）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子が得られるという長所がある。
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例では、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）又はＨＥＧ（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）が用いられるが、ＰＥＧは、合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）でしばしば医薬品、特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加及び薬物動態学の調節のために用いられる。ＰＥＧは多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質であり、１つのバッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、異なる個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総和からなり、分子量がガウス曲線の形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ ｖａｌｕｅ，Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性の程度を表現する。すなわち、ＰＥＧが低い分子量（３～５ｋＤａ）であるとき、約１．０１の多分散指数を示し、高い分子量（２０ｋＤａ）のとき、約１．２という高い多分散指数を示し、高い分子量であるほど、物質の同質性が相対的に低い特徴を示す。したがって、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧ多分散的特徴が反映され、単一物質の検証がし難いという短所があり、ＰＥＧの合成及び精製過程の改善によって低い多分散指数を持つ物質を生産している趨勢であるが、特に、分子量の小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、容易に結合されたかどうか確認し難い不都合があるなど、物質の多分散性特徴に伴う問題点がある。（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．ＶＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＴＯＤＡＹ（２００５）１０（２１）：１４５１－１４５８）。
これによって、最近では、既存の自己組立ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の改良された形態であり、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質を、一定の分子量を持つ均一な１～１５個の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、及び必要によってリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む基本単位をブロック（ｂｌｏｃｋ）化し、これを必要に応じて適切な個数を使用することによって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さいサイズを有するとともに多分散性が画期的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発されている。また、体内にｓｉＲＮＡを注入した場合、血液中に存在する様々な酵素によってｓｉＲＮＡが急速に分解され、標的細胞又は組織などへの伝達効率がよくないことが既に知られているが、改良されたＳＡＭｉＲＮＡＴＭにおいても標的遺伝子によって安定性及び発現阻害率にバラツキがあった。したがって、本発明者らは、改良された自己組立ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭを用いて標的遺伝子をより安定的で効果的に発現阻害するために、ガイドであるセンス鎖はＡＳＯであるＤＮＡ配列を、パッセンジャーであるアンチセンス鎖はＲＮＡ配列を用いて、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態の二重鎖オリゴヌクレオチドを適用することによって、標的遺伝子に対する発現阻害効果と安定性を増進させようとした。
線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の一種である特発性肺線維化症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、以下、‘ＩＰＦ’という。）は、肺胞（肺の袋）の壁に慢性炎症細胞が侵入して肺を硬くする様々な変化が発生しながら肺組織の大きな構造的変化を引き起こし、肺機能が漸次低下して結局としては死亡に至る疾患であり、今のところ効果的な治療方法がなく、通常、症状を感じて診断をすると、平均生存期間が約３～５年しかならない、極めて予後の悪い疾病である。発生頻度は、海外の場合、人口１０万名につき約３～５名程度と報告されており、通常、５０代以後に発病率が高く、男子が女子に比べて２倍程度発病率が高いと知られている。
ＩＰＦの発病原因はまだ明確にされていないが、喫煙者において頻度が高く、抗うつ剤、胃食道逆流による慢性的肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、又は溶媒剤吸入などがＩＰＦの発生と関連している危険因子として報告されたことがあるが、大部分の患者において確実な因果関係を持つ因子が報告されたことはない。最も言及されている因子としては、いかなる原因であれ、Ｔｈ１／Ｔｈ２反応、凝固カスケード（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｃａｓｃａｄｅｓ）などが活性化すると、これらによって線維化性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が分泌され、活性化されたサイトカインは線維芽細胞を刺激してＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）を増加させ、これで肺線維化が起きることが知られている。勿論、この過程で肺の炎症を伴うことによって肺の線維化が起きることがあるが、最近では、肺の炎症に関係なく直接的に肺線維化を起こし得るという意見がより支配的である。最近の仮設は、上皮－間葉細胞相互関係（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の異常信号伝達体系によって傷治癒過程で病理的な肺線維化が起きるということである。上皮細胞が損傷を受けると、上皮細胞のアポトーシスが増加し、移動が制限され、分化調節がされず、増殖が抑制されて液性因子（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ）（ＴＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ、ＲＯＳなど）が分泌され、ＥＣＭと共に間葉細胞のアポトーシスが抑制されることで、筋線維芽細胞の分化増加、ＥＣＭ浸潤に関して肺線維化を誘発したり或いは上皮細胞を再び刺激することになる。すなわち、肺の炎症が肺線維化に直接つながるとはいえないが、ただし、まず肺の炎症が起き、続いて正常組織として治癒される過程で、ＩＰＦ患者と正常人の差によって肺線維化が起きるということを意味する。また、ＩＰＦはＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの不調和によって誘発されることがあるが、Ｔｈ１サイトカイン反応は細胞媒介性免疫に関係するもので、組織回復に関する損傷部位を正常に回復させるのに対し、Ｔｈ２サイトカインは、線維芽細胞の活性化と増殖によってＥＣＭの浸潤及び線維化を誘発する。ブレオマイシンを用いた肺線維化モデルにおいて、ＩＦＮ－γを投与すると、ＴＧＦ－βとプロコラーゲンのｍＲＮＡを減少させ、肺線維化を防ぐことができるという報告があるが、病因については正確に知られておらず、将来、線維化を起こす初期の原因因子を糾明し、ＩＰＦと関連した遺伝子及びＴＧＦ－β信号伝達体系を抑制できる物質の開発などが必要である。
ＩＰＦは、治療しないと悪化し続き、患者の約５０％以上が３～５年内に死亡すると知られており、しかも、一応症状が進行して完全に線維化すると、いかなる治療をしても好転しないため、治療する場合には、早期治療が有効である可能性が高いと予測している。現在用いられている治療剤には、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）とアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、又はシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）の併合療法を用いる方法が知られてはいるが、特に効果があるとはいえず、様々な線維化抑制剤が動物実験及び小規模の患者に対して試みられたが、明確な効果が立証されたことがない現状である。特に、末期ＩＰＦ患者にとっては肺移植の他には有効な治療方法がない実情である。このため、より効率的なＩＰＦの治療剤の開発が切実な状況である。
線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）とは、ある理由によって、組織や臓器が、結合組織の過剰線維化によって硬くなる病症を総称するが、線維化が起きる全ての過程は、部位を問わず、傷跡が治療される過程と同じ経路を経る。線維化症状は現在まで完治方法がないとされており、治療方法を開発及び研究中である。効果的な線維化治療剤は、代表的な線維症である肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）だけでなく、線維症を伴う様々な疾病に適用可能な点から、効率的な線維症の治療剤の開発が切実な状況である。
一方、アンフィレグリンは、上皮細胞成長因子受容体に結合して上皮細胞受容体経路（ＥＧＦＲ ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させ、細胞増殖に関与するという事実が知られており、アンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡによってアンフィレグリンの発現を阻害させることができ、これは特定タイプの乳癌に治療効果を示すことが開示されている。また、アンフィレグリンに対するｓｈＲＮＡを用いて炎症性乳癌における細胞侵入を抑制でき（Ａｎｄｒｅａ Ｂａｉｌｌｏ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１ ２２６（１０）：２６９１－２７０１）、アンフィレグリン特異的ｓｈＲＮＡを用いてアンフィレグリン発現を抑制すると、タバコ煙に露出されたマウスにおいて肺動脈再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が抑制されるという事実が開示されている。気道平滑筋（ａｉｒｗａｙ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ；ＡＳＭ）過増殖（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）と血管新生にアンフィレグリンが関連しており、特に、喘息患者の気道再形成（ａｉｒｗａｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を促進するということと、急性喘息による組織再形成において過剰分泌される上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及びアンフィレグリンが関与すること、が開示されている。
以上述べたように、アンフィレグリンの呼吸器疾患及び線維症、特にＣＯＰＤ及びＩＰＦ治療剤ターゲットとしての可能性が提示されている状況であるが、まだアンフィレグリンに対するＲＮＡｉ治療剤及びその伝達技術に関する技術開発はわずかな状況であり、特異的且つ高効率にアンフィレグリン発現を阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド治療剤及びその伝達技術に対する市場の需要は非常に高い状況である。
そこで、本発明者らは、ＩＰＦをはじめとする線維化症に関連した遺伝子としてアンフィレグリンを選定し、アンフィレグリンを標的にする二重鎖オリゴヌクレオチドを選別してアンフィレグリン発現を阻害できるＲＮＡｉ治療剤及びその伝達体を確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、アンフィレグリンの発現を非常に特異的で高効率に阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド、好ましくは、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態の配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチド、該二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び該二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含有する線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に用いるための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に用いるための前記薬学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療のための薬物の製造のための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１～１４からなる群、より好ましくは配列番号１０、１１及び１２からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を提供する。
本発明はまた、配列番号１～１４からなる群、より好ましくは配列番号１０、１１及び１２からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含む二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法を提供する。
本発明に係る配列番号１～１４からなる群、より好ましくは配列番号１０、１１及び１２からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を含む二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、これを含むナノ粒子は、アンフィレグリンの発現を非常に効率的に阻害できるので、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びナノ粒子のそれぞれを線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に有用に用いることができる。
前記目的を達成するために、提供される好ましい二重鎖オリゴヌクレオチドに含まれる配列番号１０、１１及び１２の配列は、次の通りである。
５’－ＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ－３’（配列番号１０）
５’－ＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧ－３’（配列番号１１）
５’－ＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴ－３’（配列番号１２）
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、一般のＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を持つ全ての物質を含む概念であり、前記アンフィレグリンタンパク質をエンコードするｍＲＮＡ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドにはアンフィレグリン特異的ｓｈＲＮＡなども含まれるということが、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。すなわち、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とし得る。
また、アンフィレグリンに対する特異性が維持される限り、前記配列番号１０、１１及び１２からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖又はこれに相補的なアンチセンス鎖において、一つ以上の塩基が置換、欠失、又は挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むアンフィレグリン特異的ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の権利範囲に含まれるということは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。
本発明において、前記センス又はアンチセンス鎖は独立してＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とし、また、センス鎖はＤＮＡ、アンチセンス鎖はＲＮＡであるか、センス鎖はＲＮＡ、アンチセンス鎖はＤＮＡである、ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）形態が用いられてもよい。
本発明において、前記配列番号１０、１１及び１２はＤＮＡ形態であると記載されているが、ＲＮＡ形態が用いられる場合、配列番号１０、１１及び１２の配列は、それに対応するＲＮＡ配列、すなわち、ＴがＵに変更された配列を用いることができる。
また、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレグリンに対する特異性が維持される限り、配列のセンス鎖がアンフィレグリン遺伝子の結合部位と１００％相補的な塩基配列である場合、すなわち、完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）する場合だけでなく、一部の塩基配列が一致しない場合、すなわち不完全一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）がある場合も含む。
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、一側又は両側の鎖の３’末端に１つ又はそれ以上の非結合した（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができる。
本発明において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、好ましくは、１９～３１個のヌクレオチドで構成されることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、配列番号１０、１１及び１２からなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む二重鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）に特異的であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、生体内安定性の向上のために、又は核酸分解酵素抵抗性の付与及び非特異的免疫反応の減少のために、様々な化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とし、化学的修飾は、ヌクレオチド内糖（ｓｕｇａｒ）構造の２’炭素位置で水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、Ｏ－２－メトキシエチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－２－メチルチオエチル基、Ｏ－３－アミノプロピル基、Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基及びＯ－ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選ばれるいずれか一つに置換される修飾；ヌクレオチド内糖構造の酸素が硫黄に置換される修飾；ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選ばれるいずれか一つの結合となる修飾；及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態への修飾；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とし得るが（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５，６１－６５ ２００４；ＵＳ５，６６０，９８５；ＵＳ５，９５８，６９１；ＵＳ６，５３１，５８４；ＵＳ５，８０８，０２３；ＵＳ６，３２６，３５８；ＵＳ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９－１１４３，２００３；ＲＮＡ，９：１０３４－１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９－５９５，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１－７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）：１８２３－１８３２，２０１１）、これに限定されるものではない。
本発明において、二重鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に１つ以上のリン酸基（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とし、好ましくは１～３個のリン酸基が結合していることを特徴とし得る。
本発明は、他の観点において、下記構造式（１）の構造を含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体に関し、下記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒは二重鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
一つの好ましい具体例として、本発明に係るアンフィレグリン特異的配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、構造式（１）のような構造を有することが好ましい。
Figure 0007154403000001
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒはアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドの形態としては、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが好ましいが、これに限定されず、ｍｉＲＮＡに対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の役割ができる単一鎖のｍｉＲＮＡ阻害剤も可能である。
以下、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡを中心に説明するが、本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドと同じ特性を有する他の二重鎖オリゴヌクレオチドにも適用可能であることは、当業界における通常の技術者にとって明らかであろう。
より好ましくは、本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（２）の構造を有する。
Figure 0007154403000002
前記構造式（２）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）における定義と同一であり、Ｓはアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖、ＡＳはアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を意味する。
より好ましくは、アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（３）又は（４）の構造を有する。
Figure 0007154403000003
前記構造式（３）及び構造式（４）において、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、Ｘ及びＹは、前記構造式（２）における定義と同一であり、５’及び３’は、アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されない。
上記の、構造式（１）～構造式（４）における前記アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が１～３個結合でき、ＲＮＡに代えてｓｈＲＮＡが用いられてもよいことは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。
前記構造式（１）～構造式（４）における親水性物質は、分子量が２００～１０，０００である高分子物質であることが好ましく、より好ましくは、１，０００～２，０００である高分子物質である。例えば、親水性高分子物質には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を用いることが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。
特に、構造式（１）～構造式（４）における親水性物質（Ａ）は、下記構造式（５）又は構造式（６）のような形態の親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）の形態で用いることができるが、このような親水性物質ブロックを必要によって適切な個数（構造式（５）又は構造式（６）におけるｎ）を使用することによって、一般合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題点を大きく改善することができる。
Figure 0007154403000004
前記構造式（５）又は構造式（６）において、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍ ｅｒ）、Ｊは、ｍ個の親水性物質単量体同士又はｍ個の親水性物質単量体と二重鎖オリゴヌクレオチドとを連結するリンカー、ｍは１～１５の整数、ｎは１～１０の整数を意味し、（Ａ’ｍ－Ｊ）又は（Ｊ－Ａ’ｍ）で表示される反復単位が親水性物質ブロックの基本単位に該当する。
前記構造式（５）又は構造式（６）のような親水性物質ブロックを有する場合、本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記構造式（７）又は構造式（８）のような構造を有することができる。
Figure 0007154403000005
前記構造式（７）及び構造式（８）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ及びＢは、構造式（１）における定義と同一であり、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）及び構造式（６）における定義と同一である。
前記構造式（５）及び構造式（６）において、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体のうち、本発明の目的に符合するものであればいずれも用いることができ、好ましくは、表１に記載された化合物（１）～化合物（３）から選択された単量体、より好ましくは、化合物（１）の単量体を用いることができ、化合物（１）においてＧは、好ましくはＯ、Ｓ及びＮＨから選択可能である。
特に、親水性物質単量体の中でも特に化合物（１）で表示される単量体は、様々な官能基を導入でき、生体内親和性が良く、免疫反応を少なく誘導するなど、生体適合性（ｂｉｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れるだけでなく、構造式（７）又は構造式（８）による構造体内に含まれた二重鎖オリゴヌクレオチドの生体内安定性を増加させ、伝達効率を増加させることができるという長所から、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
Figure 0007154403000006
前記構造式（５）～構造式（８）における親水性物質は、総分子量が１，０００～２，０００の範囲に含まれることが特に好ましい。したがって、例えば、構造式（７）及び構造式（８）において、化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち、ＧがＯであり、ｍが６である物質が用いられる場合、ヘキサエチレングリコールスぺーサ（ｓｐａｃｅｒ）の分子量が３４４であるので、反復回数（ｎ）は３～５であることが好ましい。特に、本発明は、必要によって、前記構造式（５）及び構造式（６）において（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ又は（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎで表示される親水性グループの反復単位、すなわち、親水性物質ブロック（ｂｌｏｃｋ）として、ｎで表示される適切な個数を使用できることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡ及びリンカーであるＪは、独立して、各親水性物質ブロック間において同一でもよく、互いに異なってもよい。すなわち、親水性物質ブロックが３個用いられる場合（ｎ＝３）、一番目のブロックには化合物（１）による親水性物質単量体が、二番目のブロックには化合物（２）による親水性物質単量体が、三番目のブロックには化合物（３）による親水性物質単量体、が用いられるなど、全ての親水性物質ブロック別に異なる親水性物質単量体が用いられもよく、全ての親水性物質ブロックに、化合物（１）～化合物（３）による親水性物質単量体から選択されたいずれか一つの親水性物質単量体が同一に用いられてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーも、各親水性物質ブロック別に全て同じリンカーが用いられてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが用いられてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも、各親水性物質ブロックにおいて同一でも異なってもよい。すなわち、一番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が３個連結（ｍ＝３）され、二番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が５個（ｍ＝５）、三番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が４個連結（ｍ＝４）されるなど、異なる個数の親水性物質単量体が用いられてもよく、全ての親水性物質ブロックにおいて同じ個数の親水性物質単量体が用いられてもよい。
また、本発明において、前記リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ３ －－、－ＳＯ３－及び－ＣＯ２－からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されず、用いられる親水性物質の単量体などに応じて、発明の目的に符合するものであれば如何なるリンカーも使用可能であることは、通常の技術者には明らかであろう。
前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用によって、構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を担う。前記疎水性物質は、分子量が２５０～１，０００が好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）及びトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）からなる群から選ばれるいずれか一つを用いることができるが、これに制限されず、本発明の目的に符合するものであればいかなる疎水性物質も用いることができるという点は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者には明らかであろう。
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コテスタニルホルメート及びコレステリルアミンからなる群から選択可能であり、前記グリセリド誘導体は、モノ－、ジ－及びトリ－グリセリドなどから選択可能であるが、このとき、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和脂肪酸が好ましい。
特に、前記疎水性物質の中でも飽和又は不飽和炭化水素又はコレステロールが、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の合成段階において容易に結合させることができるので好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にジスルフィド結合を含む形態が最も好ましい。
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側の末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合し、二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれの位置に結合しても構わない。
本発明に係る構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）における親水性物質又は疎水性物質とアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドは、単純共有結合又はリンカーが媒介された共有結合（Ｘ又はＹ）によって結合する。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質、又は疎水性物質とアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドの末端で共有結合し、必要によって特定環境で分解可能な結合を提供する限り、特に限定されるものではない。したがって、前記リンカーは、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造過程においてアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及び／又は親水性物質（又は疎水性物質）を活性化するために結合させるいかなる化合物も用いることができる。前記共有結合は、非分解性結合又は分解性結合のいずれであってもよい。このとき、非分解性結合にはアミド結合又はリン酸化結合があり、分解性結合には、二硫化結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド結合、生分解性結合又は酵素分解性結合などがあるが、これに限定されるものではない。
また、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）におけるＲ（又は、Ｓ及びＡＳ）で表示されるアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドは、アンフィレグリンのｍＲＮＡと特異的に結合できる特性を持つ二重鎖オリゴヌクレオチドであればいずれも制限なく使用可能であり、好ましくは、本発明では、配列番号１０、１１及び１２番から選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的配列を含むアンチセンス鎖で構成される。
本発明はまた、本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体において、前記構造体内の親水性物質のオリゴヌクレオチドと結合した反対側の末端部位に、アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基がさらに導入され得る。
これは、本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするためのものであり、既に量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）、デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体の細胞内導入とエンドソーム脱出を容易にするために、アミン基の導入とポリヒスチジン基を用いることができる点及びその効果が報告されたことがある。
具体的に、伝達体の末端或いは外側に修飾された一次アミン基は、生体内ｐＨで陽性子化されながら陰電荷を帯びる遺伝子と静電気的相互作用によって結合体を形成し、細胞内流入後にエンドソームの低いｐＨで緩衝効果を持つ内部３次アミンによってエンドソームの脱出が容易になることから、リソソームの分解から伝達体を保護できると知られており（高分子基盤ハイブリッド物質を用いた遺伝子伝達及び発現抑制。Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４－２５９）、
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（－Ｒ）にイミダゾール環（ｐＫａ３ ６．０４）を有するので、エンドソームとリソソームにおいて緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させる効果があり、リポソームをはじめとする非ウイルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ）においてエンドソーム脱出効率を高めるためにヒスチジン修飾を利用できるという点が知られている（Ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１８，ｐｐ２６２－２７０）。
前記アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基は、一つ以上のリンカーを通じて親水性物質又は親水性物質ブロックと連結され得る。
本発明の構造式（１）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式（９）のような構造を有することができる。
Figure 0007154403000007
前記構造式（９）において、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｘは、Ｙ構造式（１）における定義と同一であり、
Ｐは、アミン基又はポリヒスチジン基を意味し、Ｊ１とＪ２はリンカーであり、Ｊ１及びＪ２は独立して、単純共有結合、ＰＯ３－、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２－１２アルキル、アルケニル、アルキニルから選択可能であるが、これに限定されず、用いられる親水性物質に応じて、本発明の目的に符合するＪ１とＪ２はいかなるリンカーでも用いられ得ることは、通常の技術者には明らかであろう。
好ましくは、アミン基が導入された場合には、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３－、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されない。
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入された場合には、構造式（９）では、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３－、Ｊ１は化合物（４）が好ましいが、これに限定されない。
Figure 0007154403000008
また、構造式（９）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質が構造式（５）又は構造式（６）による親水性物質ブロックであり、これにアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）基が導入される場合には、構造式（１０）又は構造式（１１）のような構造を有することができる。
Figure 0007154403000009
前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）又は構造式（６）における定義と同一であり、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は構造式（９）における定義と同一である。
特に、前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、親水性物質は、アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の３’末端に結合した形態であることが好ましく、この場合、前記構造式（９）～構造式（１１）は、次の構造式（１２）～構造式（１４）の形態を有することができる。
Figure 0007154403000010
前記構造式（１２）～構造式（１４）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は、前記構造式（９）～構造式（１１）における定義と同一であり、５’及び３’は、アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
本発明で導入可能なアミン基には１次～３次アミン基を用いることができ、１次アミン基が用いられることが特に好ましい。前記導入されたアミン基はアミン塩として存在してもよいが、例えば、１次アミン基の塩は、ＮＨ３ ＋の形態で存在できる。
また、本発明で導入可能なポリヒスチジン基は、３～１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは、５～８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含むことができる。ヒスチジンの他に一つ以上のシステインがさらに含まれてもよい。
一方、本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び該構造体から形成されたナノ粒子にターゲッティングモイエティが備えられると、効率的にターゲット細胞への伝達を促進し、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達され、高いターゲット遺伝子発現調節機能を示すことができ、他の臓器及び細胞への非特異的なアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドの伝達を防止することができる。
これによって、本発明は、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による構造体にリガンド（Ｌ）、特に、受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を通じてターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンド（ｌｉｇａｎｄ）がさらに結合した二重鎖オリゴＲＮＡ、構造体を提供し、例えば、構造式（１）による二重鎖オリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合した形態は、下記構造式（１５）のような構造を有する。
Figure 0007154403000011
前記構造式（１５）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）における定義と同一であり、Ｌは、受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＲＭＥ）を通じてターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を持つリガンドを意味し、ｉは、１～５の整数、好ましくは１～３の整数である。
前記構造式（１５）におけるリガンドは、好ましくはターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を持つターゲット受容体特異的抗体、アプタマー又はペプチド；又は葉酸（Ｆｏｌａｔｅ、一般に、ｆｏｌａｔｅとｆｏｌｉｃ ａｃｉｄは同じ意味で使われており、本発明における葉酸は、自然状態又は人体で活性化状態であるｆｏｌａｔｅを意味する。）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）などのヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）をはじめとする糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）などの化学物質などから選択可能であるが、これに限定されるものではない。
また、前記構造式（１５）における親水性物質Ａは、構造式（５）及び構造式（６）による親水性物質ブロックの形態で用いることができる。
本発明のさらに他の態様として、本発明は、アンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。
本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する過程は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）に基づいて親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合した固形支持体に基づいてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体からオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖を分離精製する段階；
（６）製造されたオリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニールによって二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んでなり得る。
本発明における固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）が好ましいが、これに限定されず、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）シリカゲル、セルロースペーパーなどが用いられ得る。ＣＰＧの場合、直径は４０～１８０μｍが好ましく、５００～３０００Åの孔隙サイズを有することが好ましい。前記段階（５）の後、製造が完了すると、精製されたＲＮＡ－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機で分子量を測定し、目的とするオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖が製造されたかを確認することができる。前記製造方法において、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階（４）は、（１）段階の前、又は（１）段階～（５）段階のいずれか一過程中に行われても構わない。
また、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖と相補的配列を含むオリゴヌクレオチド単一鎖は、５’末端にリン酸基が結合した形態で用いられたことを特徴とする製造方法も可能である。
一方、本発明のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体にさらにリガンドが結合した二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法を提供する。
リガンドが結合したアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法は、例えば、
（１）官能基が結合している固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基－親水性物質が結合している固形支持体に基づいてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から官能基－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドを結合させてリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体単一鎖を製造する段階；
（７）製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニールを通じてリガンド－二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；
を含んでなり得る。
前記（６）段階後に、製造が完了すると、リガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を分離精製した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機で分子量を測定し、目的するリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的なオリゴヌクレオチドが製造されたかを確認することができる。製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニールを通じてリガンド－二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造することができる。前記製造方法において、（３）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階（４）は、独立した合成過程として（１）段階の前、又は（１）段階～（６）段階のいずれか一過程中に行われても構わない。
本発明は、さらに他の観点において、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子に関する。本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組立ナノ粒子を形成するが（大韓民国登録特許公報第１２２４８２８号）、このようなナノ粒子は、体内への伝達効率及び体内における安定性に極めて優れるだけでなく、粒子サイズの均一性にも優れているので、ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であり、薬物としての製造工程が簡単である。
本発明において、前記ナノ粒子は、互いに異なる配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合されてなることを特徴とし、例えば、前記ナノ粒子は、配列番号１０～１２から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む同種のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含むことができるが、さらに他の態様として、配列番号１０～１２から選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む異種のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを共に含んでもよく、本発明で開示していないアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを共に含んでもよいだろう。
本発明は、他の観点において、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド構造体又は二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を有効成分として含有する線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
本発明に係る線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物は、結合組織再形成（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、特に、肺動脈再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）及び気道再形成（ａｉｒｗａｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を抑制し、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に効果を奏する。
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎又は喉頭炎であることを特徴とし、線維症は、特発性肺線維化症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び放射線誘発線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。本発明において、前記放射線誘発線維症は、癌、腫瘍などの治療のためにしばしば用いられる放射線療法によって頻繁に誘発される副作用であり、放射線線維化症候群（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍ，ＲＦＳ）と同じ意味で使用可能である。
本発明の組成物には、投与のために、前記記載された有効成分に加えて、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならず、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のいずれか１つの成分又は２つ以上の成分を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加できる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化できる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した形態の剤形で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術の分野に通常知られている方法を用いることができ、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。当分野における適切な方法で又はレミングトンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾病に応じて又は成分に応じて好ましく製剤化できる。
本発明の組成物は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野における通常の専門家が決定できる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態で製剤化でき、単位投与量又は多回投与量の容器、例えば、密封したアンプル及び瓶などとして提供され得る。
本発明の組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明に係る組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、例えば、口腔、吸入用、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、臓管、舌下又は局所投与が可能である。特に、呼吸器疾患治療のために気管支内点滴注入を通じた肺への投与も可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率又は疾病の重症度などによってその範囲が様々であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定できる。また、臨床投与のために公知の技術を用いて本発明の組成物を適切な剤形に製剤化できる。
本発明は、他の観点において、本発明に係る医薬組成物を含む凍結乾燥した形態の剤形に関する。
本発明は、他の観点において、本発明に係る線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法に関する。
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎又は喉頭炎であることを特徴とし、線維症は、特発性肺線維化症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、又は放射線誘発線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
本発明は、さらに他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に用いるための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子に関する。
本発明は、さらに他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に用いるための前記薬学的組成物に関する。
本発明は、さらに他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療のための薬物の製造のための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途に関する。
ヒトアンフィレグリンをターゲットとする１，２５７個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果を示す。 選別されたアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのナノ粒子サイズ分布を示す。（ａ）ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１０、（ｂ）ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１１、（ｃ）ＳＡＭｉ－ＡＲＥＧ＃１２ 実施例４のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（２００又は６００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。 実施例５のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。 実施例５のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１１の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。 実施例５のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１２の配列をセンス鎖として有するＳＡＭ ｉＲＮＡを濃度を異ならせて（１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、（ａ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、（ｂ）ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。 実施例６のアンフィレグリン候補配列に対する内在免疫反応実験（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｅｓｔ）分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１０（ＡＲ－１）、１１（ＡＲ－２）、１２（ＡＲ－３）をセンス鎖として有するアンフィレグリンＳＡＭｉＲＮＡ ２．５μＭをそれぞれ、ヒト末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）に処理し、アンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡによる内在免疫関連サイトカインのｍＲＮＡの相対的な増加量を分析し、ヒト末梢血液単核細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を評価したグラフである。（ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ、（ｂ）ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ 実施例７のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、選別されたアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較した分析結果である。本発明の配列番号１０（ＡＲ－１）、１１（ＡＲ－２）、１２（ＡＲ－３）の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較して示すグラフである。 マウスアンフィレグリンをターゲットとする２３７個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果及びその中から選別された９個の候補配列の効果を示す。 実施例８のマウスアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１９、２０、２１の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（２００又は５００ｎＭ）マウス肺線維芽細胞の細胞株であるＭＬｇに処理し、アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。 実施例８のマウスアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示すものであり、本発明の配列番号１９、２０、２１の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度を異ならせて（２００、５００又は１０００ｎＭ）マウス肺上皮細胞の細胞株であるＬＡ－４に処理し、アンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。 実施例９のシリカ誘発マウスに微静脈投与法によってＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ＃２０を１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇで投与後、肺組織染色分析結果及びターゲット遺伝子と線維化マーカー遺伝子ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。 実施例１０のブレオマイシン誘発マウスに微静脈投与法によってＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ＃２０を５ｍｇ／ｋｇで投与後、肺組織染色分析結果及びターゲット遺伝子と線維化マーカー遺伝子ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。 実施例１１のＵＵＯ手術を用いたＵＵＯモデルマウスに、微静脈投与法によってＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ＃２０を１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇで投与後、腎臓組織においてターゲット遺伝子と線維化マーカー遺伝子及び炎症マーカー遺伝子ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
本発明では、アンフィレグリンの発現を阻害できる３個の特異的な配列を同定し、それらがアンフィレグリンを暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合してアンフィレグリンの発現を効果的に抑制することによって、線維症と呼吸器疾患関連疾患を効果的に治療できることを確認した。
実施例１．アンフィレグリンをターゲットとするＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングのためのアルゴリズムと候補配列選定
ＳＡＭｉＲＮＡ基礎治療剤高速大量スクリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、全ｍＲＮＡに対して１－塩基（１－ｂａｓｅ）又は２－塩基（２－ｂａｓｅ）スライディングウィンドウアルゴリズム（ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用して可能な全ての候補配列を生成し、相同性フィルタリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を行って不要な候補配列を除去し、最終的に選別された全ＳＡＭｉＲＮＡに対して当該遺伝子発現阻害の程度を確認する方法である。
まず、アンフィレグリンに対するＳＡＭｉＲＮＡ候補配列に対するデザイン過程は、ヒトアンフィレグリンｍＲＮＡであるＮＭ＿００１６５７．３（１２９０ｂｐ）に対して１－塩基又は２－塩基スライディングウィンドウアルゴリズムを適用して、１９個の塩基で構成された１，２５７個のＳＡＭｉＲＮＡ候補配列を最終選別し、アンフィレグリン阻害程度実験を行った。
実施例２．二重鎖オリゴＲＮＡ構造体の合成
本発明で製造された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記構造式のような構造を有する。
Figure 0007154403000012
モノＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）二重鎖オリゴ構造体のセンス鎖は、３，４，６－トリアセチル－１－ヘキサ（エチレングリコール）－Ｎ－アセチルガラクトサミン－ＣＰＧ（１－Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）－Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ＣＰＧ）を支持体とし、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホロアミダート（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）３個を、前記反応によって連続して結合した後、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を行った後、さらに５’末端部位に疎水性物質である二硫化結合が含まれているＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）を結合させることで、３’末端にＮＡＧ－ヘキサエチレングリコール－（－ＰＯ３－ヘキサエチレングリコール）３が結合しており、５’末端にＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）が結合しているモノＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）のセンス鎖を作った。
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理し、合成されたＲＮＡ単一鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体をＣＰＧから分離した後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応によって保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ単一鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４で処理し、２’ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）を除去した。これらの反応物から、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）でＲＮＡ単一鎖、オリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体及びリガンドが結合したオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体を分離し、これをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析機（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ－ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）で分子量を測定し、合成しようとする塩基配列及びオリゴ－高分子構造体と符合するか確認した。その後、それぞれの二重鎖オリゴ構造体を製造するためにセンス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ酢酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０～７．５）に入れ、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、さらに３７℃で反応させ、目的とするＳＡＭｉＲＮＡを製造した。製造された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動によってアニールを確認した。
実施例３．ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンをターゲットとしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）
３．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の製造
実施例２で合成されたアンフィレグリン配列をターゲットとする１，２５７種のＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ＷＥＬＧＥＮＥ，ＫＲ）に溶かして凍結乾燥器（ＬＧＪ－１００Ｆ，ＣＮ）で５日間凍結乾燥させた。凍結乾燥したナノ粒子パウダーを脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，ＫＲ））１．４２９ｍｌに溶かして均質化し、本発明のための実験に使用した。
３．２ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレグリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡの発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用い、Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏTMＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。上と同じ培地を用いてＡ５４９細胞株を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、前記実施例３．１で脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈し、細胞に５００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で総４回処理し、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。
３．３ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析を用いたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例３－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
アンフィレグリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量分析のために、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）の各ウェルにＡＲＥＧ順方向プライマー３００ｎＭ、ＡＲＥＧ逆方向プライマー３００ｎＭ、ＡＲＥＧプローブ３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ順方向プライマー３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ逆方向プライマー３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａプローブ３００ｎＭ、ＴＢＰ順方向プライマー４００ｎＭ、ＴＢＰ逆方向プライマー４００ｎＭ、ＴＢＰプローブ３００ｎＭが追加されて乾燥製造された（表２、高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）実験に用いられたプライマー及び加水分解プローブ配列）。製造されたキットの性能は、Ａ５４９細胞全ＲＮＡを用いて検量曲線を作成し、ＰＣＲ増幅効率（表３）で判定した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、９５℃５分、（９５℃５秒、５８℃１５秒）×４５サイクルで反応をし、各サイクルごとに蛍光値が検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）されるプロトコルを用いた。
ＳＡＭｉＲＮＡ処理された９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）は全ＲＮＡ抽出からＲＴ－ｑＰＣＲまで自動化装備であるＥｘｉＳｔａｔｉｏｎ ＨＴTM ＫｏｒｅａにＨＴ ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）とアンフィレグリン分析のためのプライマー及びプローブを含んで別途に製造されたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を、自動化プログラムにしたがって全ＲＮＡ抽出及びワンステップＲＴ－ｑＰＣＲが行われた。
ｑＰＣＲアレイ後、導出される２遺伝子のＣｔ値を２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））法［Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．２００１．Ａｎａｌｙｓ ｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ；２５（４）：４ ０２－８］を用いて、相対定量分析により、対照群に対して実験群であるアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な量（％）を計算した。
Figure 0007154403000013
Figure 0007154403000014
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度５００ｎＭ又は１０００ｎＭの濃度でアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量が、対照群と対比して発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡ １４種を選別した。
図１に示すように、アンフィレグリンを標的にする１，２５７種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレグリン遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ １４種を最終選別した。当該ＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は、下記表４の通りである。
Figure 0007154403000015
実施例４．ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンをターゲットとしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子スクリーニング
実施例３で選別された配列番号１～１４の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９を処理し、前記細胞株においてアンフィレグリンｍＲＮＡの発現様相を分析した。
４．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレグリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡ発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用いたが、Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏTMＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。同上の培地を用いてＡ５４９細胞株を１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）に８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、前記実施例３．１で脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈し、細胞に２００ｎＭ又は６００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で総４回処理し、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。
４．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析を用いたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
４－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌエッペンドルフチューブに含まれたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブ当たりに抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌとなるように、ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM９６Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーを混成化し、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回反復した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
４－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲグリーン方式の実時間ｑＰＣＲを用いて、ＳＡＭｉＲＮＡ対照試料（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅ）に対するアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６ウェルプレートの各ウェルに前記実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R) ２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作った。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液が入っている９６ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得たターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によって補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した。
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度２００ｎＭ又は６００ｎＭの濃度でアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量が対照群に比して発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡ ３種を選別した。
図３に示すように、アンフィレグリンを標的とする１４種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレグリン遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ ３種を最終選別した。当該ＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は、下記表６の通りである。
Figure 0007154403000016
Figure 0007154403000017
実施例５．肺癌細胞株（Ａ５４９）から選別されたＳＡＭｉＲＮＡを用いたヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンの発現抑制
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９を処理し、前記細胞株においてアンフィレグリンｍＲＮＡの発現様相を分析してＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。
５．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の製造及び粒度分析
実施例２で合成されたアンフィレグリン配列をターゲットとする３種のＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳ（ＷＥＬＧＥＮＥ，ＫＲ）に溶かして凍結乾燥器（ＬＧＪ－１００Ｆ，ＣＮ）で５日間凍結乾燥させた。凍結乾燥したナノ粒子パウダーを脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，ＫＲ））２ｍｌに溶かして均質化し、本発明のための実験に使用した。製造されたＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の粒度分析のために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いてＳＡＭｉＲＮＡのサイズ及び多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を測定した結果、選別されたＳＡＭｉＲＮＡに対するナノ粒子のサイズ及び多分散指数は下記表７の通りであり、グラフは、図２のように測定された。
Figure 0007154403000018
５．２ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレグリンの発現を抑制する選別されたＳＡＭｉＲＮＡ効果を確認するために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用いたが、Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏTMＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。同上の培地を用いてＡ５４９細胞株を１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）に８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、前記実施例５．１で脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈し、細胞に１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で総４回処理し、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。
５．３ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析を用いたＳＡＭｉＲＮＡ ＩＣ５０確認
実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
５－３－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例５－２でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌエッペンドルフチューブに含まれたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブ当たりに抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌとなるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM９６Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーを混成化し、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回反復した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
５－３－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例５－３－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲグリーン方式の実時間ｑＰＣＲを用いて、ＳＡＭｉＲＮＡ対照試料に対比するアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６ウェルプレートの各ウェルに前記実施例５－３－１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R) ２ＸＧｒｅｅｎＳｔａｒTM ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作った。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰ ＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液が入っている９６ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTMＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得たターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によって補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した。
その結果、配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡはいずれも１００ｎＭの低濃度においても５０％以上のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の減少を示し、非常に高効率でアンフィレグリン発現を阻害する効果を示すことを確認した。それぞれのＩＣ５０は、配列番号１０の配列をセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、図４に見られるように２８．７５ｎＭ、配列番号１１の配列をセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、図５に見られるように２６．０４ｎＭ、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、図６に見られるように１２．０７ｎＭと確認された。特に、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、図６に見られるように、２５ｎＭの低濃度においても５０％以上のアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量の減少を示し、選別された３種の配列のうち最も効果的にアンフィレグリン遺伝子発現を阻害する効果を示すことを確認した。
実施例６．ヒト末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価
ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧによる内在免疫関連サイトカインのｍＲＮＡ増加量を確認するために、１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｉｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＨｙｃｌｏｎｅTM）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＨｙｃｌｏｎｅTM）培地にｅＰＢＭＣ(R)Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ（ヒト末梢血液単核細胞、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＳＡ）を１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＵＳＡ）にウェル当たり５×１０５ｃｅｌｌとなるように分注した。細胞が安定化するように１時間３７℃、５％ ＣＯ２培養器に培養した後、分注されたＰＢＭＣにＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ＣＯＮ（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１０（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１１（ＲＮＡ／ＲＮＡ）、ＳＡＭｉ－ｈＡＲＥＧ＃１２（ＲＮＡ／ＲＮＡ）を２．５μＭとなるようにそれぞれ処理し、６時間３７℃５％ ＣＯ２培養器に培養した。陽性対照群として２０μｇ／ｍｌのコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ）Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を使用した。
その後、全ての細胞を回収し、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でメーカー提供プロトコルにしたがって全ＲＮＡを抽出した。
抽出されたＲＮＡ２００ｎｇと脱イオン殺菌ＤＷ（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｓｔｅｒｉｌｅ ＤＷ）（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）、そしてＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を混合し、これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて（３７℃３０秒、４８℃４分、５５℃３０秒）×１２サイクル、９５℃、５分のような条件で反応して総２０μｌ ｃＤＮＡを合成した。
合成されたｃＤＮＡは、ＲＰＬ１３Ａ、Ｉ Ｌ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、ＩＬ１２Ｂ遺伝子に対するｑＰＣＲプライマーと混合した後、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を用いて９５℃５分、（９５℃５秒、５８℃１５秒）×４５サイクル条件で増幅した。
ｑＰＣＲアレイ後、導出される２つの遺伝子のＣｔ値を、２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））法［Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．２００１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ；２５（４）：４０２－８］を用いて相対定量分析により、対照群対比実験群のｍＲＮＡの相対的な量（％）を計算した。
その結果、図７に見られるように、ヒト末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ）においてアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡ ＃１０、ＳＡＭｉＲＮＡ ＃１１及びＳＡＭｉＲＮＡ ＃１２による内在免疫関連サイトカインが発現しないことが確認された。
実施例７．選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をセンス鎖として含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡによるヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンの発現抑制比較分析
実施例４で選別された配列番号１０、１１及び１２の配列をそれぞれセンス鎖として有するアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９を処理し、前記細胞株においてアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較分析した。
７．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
アンフィレグリンの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡ発掘のために、ヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用いたが、Ａ５４９細胞株は１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏTMＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。同上の培地を用いてＡ５４９細胞株を１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）に８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日、前記実施例３．１で脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１Ｘ ＤＰＢＳで希釈し、細胞に２００ｎＭ、６００ｎＭ又は１２００ｎＭとなるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で総４回処理し、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。
７．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡ発現抑制効能分析を用いたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてアンフィレグリン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
７－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌエッペンドルフチューブに含まれたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ￠ ｃ ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に１チューブ当たりに抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌとなるように、ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーを混成化し、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する２つの過程を１２回反復した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
７－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）アンフィレグリンｍＲＮＡの相対定量分析
実施例７－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲグリーン方式の実時間ｑＰＣＲを用いて、ＳＡＭｉＲＮＡ対照試料に対比するアンフィレグリンｍＲＮＡの相対的発現率を、下記のような方法で分析した。９６ウェルプレートの各ウェルに前記実施例７－２－１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R) ２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号１７及び１８（表５）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作った。一方、アンフィレグリンｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。前記混合液が入っている９６ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTMＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４つの過程を４２回繰り返し行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得たターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子によって補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を定量した。
二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの中から高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、最終濃度２００ｎＭ、６００ｎＭ、１２００ｎＭの濃度でアンフィレグリンｍＲＮＡ発現量が対照群に比して発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１２の配列をセンス鎖として有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるＳＡＭｉＲＮＡ（９０％以上の遺伝子発現を抑制）を最終選別した。
図８に示すように、選別された３種のアンフィレグリン特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、アンフィレグリン遺伝子発現を最も効果的に抑制するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ １２種を最終選別した。
実施例８．マウス（Ｍｏｕｓｅ）アンフィレグリンをターゲットとしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）
ｓｉＲＮＡ治療剤の場合、異なる種（Ｓｔｒａｉｎ）に共通適用可能な最適配列発掘が容易でない。この場合、治療効果を分析する動物モデル（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ確認）特異的なｓｉＲＮＡ配列（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ；ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ）をデザインし、当該遺伝子の発現阻害による薬剤学的効能（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）及び当該遺伝子発現阻害による毒性部分を検証するように、米ＦＤＡガイドラインが存在する（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｄｏｒｓａｍ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｅｒ，ＦＤＡ／ＣＤＥＲ）。
既存アルゴリズム基盤ｓｉＲＮＡデザインプログラム（自社保有のＴｕｒｂｏ－ｓｉ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を用いて既存に発掘したスクリーニングを補完し、ＳＡＭｉＲＮＡ基盤配列発掘高速大量スクリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を行った。ターゲット遺伝子全体を対象に１９ｍｅｒ長さのｓｉＲＮＡを１塩基スライディングウィンドウスキャニング（１ ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ｓｃａｎｎｉｎｇ）して（前記ヒトアンフィレグリンターゲットスクリーニングと同じ方法）、可能なマウスアンフィレグリン遺伝子（ＮＭ＿００９７０４．４）完全転写（ｆｕｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）配列を対象に総１１９０個の候補ｓｉＲＮＡ配列を生成し、相同性フィルタリング（ｂｌａｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を行って、不要な他の遺伝子発現に影響を与える候補配列を除去し、最終的に選別された２３７種のＳＡＭｉＲＮＡを合成後、マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞株に１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件で１ｕＭ濃度で処理し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現阻害効果を表８（ｑＰＣＲ用プライマー配列情報）のプライマーを用いて１次スクリーニングした。（図９）
その後、追加スクリーニングによって前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞株から選別された２種の配列（配列番号１９、２０）及び先行マイルストーン研究によって発掘した配列番号２１のマウスＳＡＭｉＲＮＡ－アンフィレグリンに対して、マウス肺線維芽細胞の細胞株であるＭＬｇ細胞株において、１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件で２００ｎＭ及び５００ｎＭ処理濃度で処理して追加スクリーニングを行った結果、配列番号２０が最も優れた発現阻害効果を示すことを確認した。（図１０ａ）
さらに、マウス肺上皮細胞株（Ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＬＡ－４細胞株に、選別された２種配列（配列番号１９、２０）及び先行マイルストーン研究によって発掘した配列番号２１のマウスＳＡＭｉＲＮＡ－アンフィレグリンを、１０％ ＦＢＳが存在する細胞培養条件で２００ｎＭ、５００ｎＭ及び１０００ｎＭ処理濃度で処理して追加発現阻害効果を確認した結果、配列番号２０から最も優れた発現阻害効果を再確認した。（図１０のｂ）
図１０に示すように、マウスアンフィレグリンを標的とする２３７種のＳＡＭｉＲＮＡから、アンフィレグリン遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ ２種を最終選別した。当該ＳＡ ＭｉＲＮＡの配列情報は、下記表９の通りである。
Figure 0007154403000019
Figure 0007154403000020
実施例９．シリカ（Ｓｉｌｉｃａ）誘発肺線維症マウスモデルで微静脈投与法によるＳＡＭｉＲＮＡ－ｍＡＲＥＧの効能検証
シリカ（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ、韓国）で誘発した肺線維化症動物モデルにおけるＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧに効能分析のために実施した。実験をするために、７週齢のマウスを入手して１週間純化させた。モデルを誘発するためにシリカ（３ｍｇ）を溶かし、マウスに器官内注射方法を用いた。誘発３日後、異常症状を示さないマウスを選別して正常群、実験群に生理食塩液（ＰＢＳ）を投与した群、実験群にＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌを投与した群、実験群（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）に１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇを各２日間隔で３回投与した。そして、モデル誘発後１４日目にマウスを犠牲した。
９－１．シリカ（Ｓｉｌｉｃａ）で誘導された肺線維化症動物モデルにおけるＳＡＭｉＲＮＡに対する遺伝子発現分析
犠牲させたマウスの肺組織を得てホモゲナイザーを用いて組織を粉砕した。ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲグリーン方式の実時間ｑＰＣＲを用いて各群の全ｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６ウェルプレートの各ウェルに製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡ発現量分析のために、希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R) ２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレグリンｑＰＣＲプライマー（配列番号２４及び２５（表８）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作った。一方、アンフィレグリン、フィブロネクチン及びコラーゲン３α１ ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得たターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅ ｓｈｏｌｄ サイクル）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子によって補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、各群を比較してΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて、アンフィレグリン、フィブロネクチン及びコラーゲン３α１遺伝子の発現量を相対定量した。
その結果、アンフィレグリンの場合、シリカモデルに生理食塩液を処理した群とシリカモデル群にＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌ投与した群に比して、ＳＡＭ ｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ及びＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇを処理した群において減少効果を確認した。また、フィブロネクチンとコラーゲン３α１の場合、シリカモデルに生理食塩液を処理した群とシリカモデル群にＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌ投与した群に比して、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ及びＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇを投与した群から濃度依存的に減少効果を確認した。
９－２．シリカで誘発した肺線維化症動物モデルにおけるＳＡＭｉＲＮＡに対する組織病理学的分析
シリカモデルに対するＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧが細胞の基質成分の発現に影響を与えるかどうかを検証するために免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。動物モデルを各群別に犠牲させ、組織固定、水洗、脱水、透明、浸透、包埋及び薄切過程を通じてパラフィン切片を作製した。パラフィン切片を薄切機で薄く切って組織をスライドに接着させる。肺組織を病理学的に観察するために、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、コラーゲン１の発現程度を確認するために、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行った。そして、アンフィレグリン発現程度を分析するために免疫組織化学染色を行った。
ヘマトキシリン及びエオシン染色から、正常モデルの肺組織に比べて、シリカで誘発した肺組織に損傷が起きたことを分かった。しかし、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを投与したマウスの肺組織では、正常モデルの肺組織のように肺組織の損傷が相対的に少なく起きたことが分かった。そして、線維化が発生した程度を確認するために、マッソントリクローム染色を行った。シリカモデル群に生理食塩液を投与した群、ＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌを投与した群に比して、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを投与した群では、肺組織間の間質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ）で線維化の発現程度が減少したことを確認した。また、アンフィレグリンに対する免疫組織化学染色から、シリカで誘発した動物群では細胞間の間質において多く発現していることが分かった。しかし、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを投与した群では、肺組織間の間質にＡＲＥＧの発現が減少したことが確認できた。
結論的に、シリカ誘発肺線維症マウスモデルに、マウスＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを、微静脈投与によって３回（１０日、１２日、１４日）、１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ投与濃度で反復投与し、肺組織からターゲット遺伝子及び線維化マーカー遺伝子発現阻害効能及びＨ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色を行った。ターゲット遺伝子であるアンフィレグリン及び線維化マーカー遺伝子であるコラーゲン及びフィブロネクチンの発現を確認した結果、シリカ誘発において発現が増加し、ＳＡＭｉＲＮＡ処理によって発現抑制効能が濃度依存的に確認された。また、組織染色の結果、シリカ誘発マウスにＰＢＳ又は対照群であるＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌを処理した群では、肺組織への細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及びコラーゲンが増加したが、実験群であるＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ処理によって、濃度依存的に細胞浸潤（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及びコラーゲンが、対照群であるＤＰＢＳを処理した群と比較される程度に著しく減少することを確認した。（図１１）
そして、シリカ誘発肺線維化症モデルにおけるＡＲＥＧ免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。図１１で、シリカ誘発肺線維症マウスモデルにＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇを投与した組織においてＡＲＥＧ発現程度をＩＨＣ染色を用いて確認した。シリカ＋ＰＢＳ、シリカ＋ＳＡＭｉ－Ｃｏｎｔを投与したモデルにおいて、正常肺組織に比べてＡＲＥＧの発現が間質位置（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｉｔｅ）に多く増加したことを確認した。一方、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを１ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇ投与した組織におけるＡＲＥＧ発現を確認した結果、シリカ誘発した肺組織に比べてＡＲＥＧ発現が顕著に減少したことが確認できた（図１１）。
実施例１０．ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）誘発肺線維症マウスモデルで微静脈投与法によるＳＡＭｉＲＮＡ－ｍＡＲＥＧの効能検証
ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルに、マウスＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（Ｓ ＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）を、微静脈投与によって３回（８日、１日、１２日）、５ｍｇ／ｋｇ濃度で反復投与してＳｉｒｃｏｌ ａｓｓａｙ分析を行った結果、対照群であるＳＡＭ ｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔに比して、実験群であるＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ投与した群においてコラーゲンタンパク質の量が＞４０％減少することを確認した。また、同一実験群の肺組織からＲＮＡを抽出し、ターゲット遺伝子であるアンフィレグリン及び線維化マーカー遺伝子であるコラーゲンの発現阻害効能を確認した結果、対照群に比して発現阻害効能が確認された。試験物質の場合、既存配列に比べて新規発掘した配列番号２０に対する効能が同等以上と確認された。肺組織からＨ＆Ｅ染色及びコラーゲン特異的染色のためのマッソントリクローム染色を行った。組織染色の結果、ブレオマイシン誘発マウスにＰＢＳ又は対照群であるＳＡＭｉＲＮＡ－Ｃｏｎｔｒｏｌを処理した群では、肺組織への細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が増加し、コラーゲン蓄積による染色が増加することを確認した。実験群であるＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ処理によって細胞浸潤及びコラーゲン蓄積が顕著に減少することを確認した（図１２）。組織染色方法及びターゲット遺伝子発現確認方法は、実施例８と同一に行った。
実施例１１．ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを投与したマウスに発生したＵＵＯ（Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｕｒｅｔｅｒａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって誘導された腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）に対する効果確認
ＵＵＯ手術で誘発した腎臓線維症動物モデルにおけるＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ（ＳＡＭｉ－ｍＡＲＥＧ＃２０）に効能分析をするために行った。まず、腎臓線維症動物モデルを作製するために、アイフラン液（ハナ製薬、韓国）でマウスを呼吸麻酔させた。皮膚と腹膜を切開して４－０シルクで左側腎臓の尿管を２カ所で縛り、尿路感染を防ぐために２カ所の中間部位を切った。そして、右側部位は、同じ方法で手術したが、尿管は縛らなかった。同様に、正常群のモデル群も開腹して左側腎臓の尿管を確認したが、縛らなかった。そして、感染を防ぐために、腹膜と皮膚に縫合を施した。モデル誘発６時間後にＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇを、一番目の投与を行った。２４時間後に２番目の投与を行った。最終２回投与を行い、最後投与後２４時間後に動物を犠牲させた。動物モデルの群は、正常群、ＵＵＯモデル群に生理食塩液を投与した群、ＵＵＯモデル群にＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇを投与した群の合計４群である。
１１－１． ＵＵＯ（Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｕｒｅｔｅｒａｌ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって誘導された腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）におけるＳＡＭｉＲＮＡに対する遺伝子発現分析
犠牲させたマウスの肺組織を得てホモゲナイザーを用いて組織を粉砕した。ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例７－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R)ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔTMＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０，Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲグリーン方式の実時間ｑＰＣＲを用いて各群の全ｍＲＮＡの相対的発現率を、下記のような方法で分析した。９６ウェルプレートの各ウェルに製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、アンフィレグリンｍＲＮＡ及び線維化標識子の発現量分析のために、希釈されたｃＤＮＡ ３μｌとＡｃｃｕＰｏｗｅｒ(R) ２Ｘ ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を２５μｌ、蒸留水１９μｌ、アンフィレグリン及び線維化標識子のｑＰＣＲプライマー（配列番号２４及び２５（表８）；１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を３μｌ入れて混合液を作った。一方、形質転換生長因子１、アンフィレグリン、フィブロネクチン、コラーゲン１、平滑筋アクチン及びコラーゲン３α１ ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子とした。また、炎症性因子の効能を検証するためにＣＣＲ２遺伝子も共に確認した。
ＰＣＲが終了した後、それぞれ得たターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子を用いて補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、各群を比較してΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ）×１００を用いて形質転換生長因子１、アンフィレグリン、フィブロネクチン、コラーゲン１、コラーゲン３α１、及びＣＣＲ２遺伝子の発現量を定量した。
その結果、アンフィレグリンの場合、正常群に比してＵＵＯモデル群に生理食塩液を投与した群では、６０倍以上増加した。しかし、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ及びＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇを処理した群ではアンフィレグリンの遺伝子発現が４倍減少したことを確認した。また、フィブロネクチンと形質転換生長因子１の場合、ＵＵＯモデル群に比べてＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ及びＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇを投与した群において濃度依存的に減少したことを確認した。また、コラーゲン３α１、コラーゲン１、及び平滑筋アクチンの場合、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇを投与した群ではＵＵＯモデルに比して減少する傾向はあった。一方、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ ５ｍｇ／ｋｇを投与した群では、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧ １ｍｇ／ｋｇ投与した群に比べて優れた減少効果を確認した。また、ＣＣＲ２は、ＵＵＯモデルでは約６倍以上増加したが、ＳＡＭｉＲＮＡ－ＡＲＥＧを投与した群では減少効果を確認した。
以上、本発明内容における特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
本発明に係るアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれを有効成分として含む医薬組成物は、副作用無しで高効率でアンフィレグリンの発現を抑制でき、過度な線維化による疾病及び呼吸器疾患の予防及び治療に優れた効果を奏することができる。

Claims (16)

  1. 下記構造式（３）又は構造式（４）の構造を含むアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：
    Figure 0007154403000021
    前記構造式（３）及び（４）において、Ａはヘキサエチレングリコール－（－ＰＯ ３ － ヘキサエチレングリコール） ３ 、ＢはＣ ２４ （Ｃ ６ －Ｓ－Ｓ－Ｃ １８ ）、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して単純共有結合又はリンカーを介した共有結合を意味し、Ｓ及びＡＳはそれぞれ二重鎖オリゴヌクレオチドの配列番号１２のセンス鎖とこれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を意味する。
  2. 前記Ｘ及びＹで表示される共有結合は、非分解性結合又は分解性結合であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  3. 前記非分解性結合は、アミド結合又はリン酸結合であることを特徴とする、請求項２に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  4. 前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド結合、生分解性結合及び酵素分解性結合からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項２に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  5. 前記センス又はアンチセンス鎖は独立してＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  6. 前記二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  7. 前記化学的修飾は、ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２’炭素位置で水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、－Ｏ－２－メトキシエチル基、－Ｏ－プロピル基、－Ｏ－２－メチルチオエチル基、－Ｏ－３－アミノプロピル基、－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基及び－Ｏ－ジメチルアミドオキシエチルからなる群から選ばれるいずれか一つに置換される修飾；ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄に置換される修飾；ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合からなる群から選ばれるいずれか一つの結合になる修飾；及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への修飾；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項６に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  8. 前記二重鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合していることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリン特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子。
  10. 前記ナノ粒子は、互いに異なる配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合されて構成されることを特徴とする、請求項９に記載のナノ粒子。
  11. 請求項１～８のいずれか一項に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を有効成分として含む、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  12. 請求項９に記載のナノ粒子を有効成分として含む、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  13. 前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性及び慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１１に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  14. 前記線維症は、特発性肺線維化症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び放射線誘発線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１１に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  15. 前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性及び慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  16. 前記線維症は、特発性肺線維化症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び放射線誘発線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
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