CN116157521A - 双链寡核苷酸和用于治疗covid-19的含有其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：可以高特异性地和有效地抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑Cov‑2)增殖的双链寡核苷酸、优选包含RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合体形式的序列的双链寡核苷酸；双链寡核苷酸结构和包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒；以及其用于治疗COVID‑19的用途。

Description

双链寡核苷酸和用于治疗COVID-19的含有其的组合物
【技术领域】
本发明涉及能够以高效率非常特异性地抑制SARS-Cov-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)增殖的双链寡核苷酸、优选包括RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合体形式的序列的双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体、包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒及其用于治疗COVID-19的用途。
【背景技术】
1995年，Guo和Kemphues发现，在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中使用反义抑制基因表达方面，有义RNA与反义RNA一样有效，因此进行了研究以确定其原因。1998年，Fire等人首次发现了一种现象，即注射双链RNA(dsRNA)，且其对应的mRNA被特异性降解，因此抑制基因表达，这种现象被称为RNA干扰(RNAi)。RNAi是一种用于抑制基因表达的方法，其能够以简单的方式以低成本清楚地显示抑制基因表达的效果，并且因此其应用范围日益增加。
因为用于抑制基因表达的技术能够调节特定基因的表达，因此可以在mRNA水平上消除由特定基因的过表达导致的癌症、遗传疾病等中的靶基因，基于此，这种技术可以用作用于疾病治疗的治疗剂的开发和靶标验证的重要工具。常规上，为了抑制靶基因的表达，披露了用于将转基因引入靶基因的技术，并且其例子包括在启动子的反向(反义)引入转基因的方法和在启动子的正向(有义)引入转基因的方法。
靶向RNA的RNA疗法是针对靶RNA使用寡核苷酸去除对应基因的功能的方法，并且据说其不同于常规治疗剂，这些常规疗法诸如使用主要靶向蛋白质的抗体和小分子的那些方法。有两种靶向RNA的主要方法：双链RNA介导的RNAi和使用反义寡核苷酸(ASO)。目前，正在针对各种疾病尝试靶向RNA的临床试验。
反义寡核苷酸(在下文中称为“ASO”)是短合成DNA，其设计成基于沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与靶基因结合，并且由于其能够特异性抑制基因的某一核苷酸序列的表达，因此已经用于研究基因功能和开发能够在分子水平上治疗疾病如癌症的治疗剂。ASO的优点在于，它可以通过多样地设定对基因表达的抑制而容易地产生，并且已经研究了其用于抑制致癌基因的表达和癌细胞的生长的用途。ASO抑制特定基因的表达的过程是通过以下方式来实现的：由于通过与互补mRNA序列结合诱导的RNA酶H活性而消除mRNA，或者干扰用于蛋白质翻译的核糖体复合物的形成和进程。还报道了ASO与基因组DNA结合以形成三螺旋结构，从而抑制基因转录。虽然ASO具有上述潜力，但是为了在临床实践中使用ASO，必须改进对核酸酶的抗性，并且将ASO有效地递送至靶组织或细胞中，以特异性地结合目的基因的核苷酸序列。此外，基因mRNA的二级和三级结构对于ASO的特异性结合是重要的，并且由于形成较少mRNA二级结构的区域对于ASO的进入非常有利，因此在ASO合成之前，已经作出努力通过系统地分析形成较少mRNA二级结构的区域来在体外以及在体内有效地实现基因特异性抑制。这种ASO比siRNA(一种RNA)更稳定，并且具有易溶于水和盐水的优点。目前，联邦药品管理局(FDA)已经批准了三种ASO(Jessica,C.,J.Postdoc.Res.,4:35-50,2016)。
由于发现了RNA干扰(在下文中称为“RNAi”)的作用，因此已经发现RNAi在各种类型的哺乳动物细胞中作用于序列特异性mRNA(Barik,S.,J.Mol.Med.(2005)83:764-773)。当长链双链RNA被递送至细胞时，递送的双链RNA被称为dicer的内切核酸酶加工成长度为21至23个碱基对(bp)的小干扰RNA(在下文中称为“siRNA”)，并且siRNA与RISC(RNA诱导的沉默复合物)结合，因此通过指导(反义)链识别和降解靶mRNA的过程以序列特异性方式抑制靶基因的表达。使用siRNA的基因表达抑制技术可用于通过抑制靶细胞中的靶基因的表达并观察由此引起的变化来鉴定靶细胞中的靶基因的功能的研究。特别地，抑制传染性病毒或癌细胞中靶基因的功能将可用于开发所述疾病的治疗方法，并且基于使用实验动物的体外研究和体内研究的结果，已经报道了siRNA能够抑制靶基因的表达。
根据Bertrand的研究小组，已经发现与反义寡核苷酸(ASO)相比，针对相同靶基因的siRNA在体外和体内对mRNA的表达具有强抑制作用，并且这种作用持续很长时间。此外，由于siRNA的作用机制是通过与靶mRNA互补结合以序列特异性方式调节靶基因的表达，因此有利的是与常规的基于抗体的药物或小分子药物相比，siRNA适用的靶标范围显著扩大(M.A.Behlke,MOLECULAR THERAPY.2006 13(4):664-670)。
尽管siRNA具有优异的作用和广泛的用途范围，但是对于作为治疗剂开发的siRNA，必须通过改进siRNA的体内稳定性和增加细胞递送效率而将siRNA有效地递送至靶细胞(F.Y.Xie,Drug Discov.Today,2006年1月；11(1-2):67-73)。为了改进体内稳定性并解决与siRNA的非特异性先天免疫刺激相关的问题，正在深入研究修饰siRNA的一些核苷酸或主链以赋予核酸酶抗性，使用载体如病毒载体、脂质体或纳米颗粒等。
使用病毒载体如腺病毒或逆转录病毒的递送系统具有高转染效率，但免疫原性和致癌性高。另一方面，包括纳米颗粒在内的非病毒递送系统的细胞递送效率低于病毒递送系统，但是非病毒递送系统是有利的，因为体内稳定性高，靶标特异性递送是可能的，RNAi寡核苷酸被细胞或组织摄取并内化到细胞或组织中，并且几乎没有细胞毒性或免疫刺激，因此非病毒递送系统目前被认为是与病毒递送系统相比更强有力的递送方法(Akhtar S.,J.Clin.Invest.2007年12月3日；117(12):3623-3632)。
在非病毒递送系统中使用纳米载体的方法包括使用各种聚合物如脂质体、阳离子聚合物复合物等形成纳米颗粒，并将siRNA装载在此类纳米颗粒(即纳米载体)上，由此将所述siRNA递送至细胞。在此，纳米载体的具体例子可以包括聚合纳米颗粒、聚合物胶束、脂复合物(lipoplex)等。特别地，由阳离子脂质构成的脂复合物与细胞内体的阴离子脂质相互作用以诱导内体的失稳作用，从而实现细胞内递送。
此外，已知可以通过将化学物质连接至siRNA随从(有义)链的末端部分以赋予增强的药代动力学而在体内诱导高效率(J.Soutschek,Nature 11；432(7014):173-8,2004)。在此，siRNA的稳定性根据结合至siRNA有义(随从)链或反义(指导)链末端的化学物质的特性而变化。例如，呈其中缀合了聚合物化合物如聚乙二醇(PEG)的形式的siRNA在阳离子材料的存在下与siRNA的阴离子磷酸根基团相互作用以形成复合物，从而获得具有改进的siRNA稳定性的递送载体(S.H.Kim,J.Control Release 129(2):107-16,2008)。特别地，与作为药物递送载体使用的其他系统如微球或纳米颗粒相比，由聚合物复合物构成的胶束具有极小的尺寸，但其分布非常均匀且自发地形成，因此容易控制配制品质量且具有再现性。
为了改进siRNA的细胞内递送效率，已经开发了使用siRNA缀合物实现siRNA的有效的细胞膜渗透性和稳定性的技术，在所述siRNA缀合物中，生物相容性聚合物亲水性材料(例如，聚乙二醇(PEG))通过简单的共价键或接头介导的共价键与siRNA缀合(韩国专利号883,471)。然而，即使当siRNA被化学修饰或者与聚乙二醇(PEG)缀合(聚乙二醇化)时，其仍具有缺点，如低体内稳定性和向靶器官的较差递送。为了克服这些缺点，已经开发了双链寡RNA构建体，在所述双链寡RNA构建体中亲水性材料和疏水性材料与寡核苷酸、特别是双链寡RNA如siRNA结合，并且所述构建体通过疏水性材料的疏水性相互作用形成自组装纳米颗粒，称为SAMiRNATM(自组装胶束抑制性RNA)(韩国专利号1,224,828)。在此，相对于常规递送方法，SAMiRNATM技术能够实现具有非常小的尺寸的同质性纳米颗粒。
在SAMiRNATM的一个具体实施方案中，使用亲水性材料如PEG(聚乙二醇)或HEG(六乙二醇)。PEG是一种合成聚合物，并且通常用于增加药物(特别是蛋白质)的溶解性并控制药代动力学。PEG是多分散材料，并且一批中的聚合物由一组不同数量的单体构成，因此其分子量显示出高斯曲线，并且多分散度值(Mw/Mn)表示材料的同质性程度。具体地，具有低分子量(3kDa至5kDa)的PEG具有约1.01的多分散度值，而具有高分子量(20kDa)的PEG具有约1.2的高多分散度值。分子量越高，材料的同质性越低。因此，当PEG与药物缀合时，PEG的多分散性反映在缀合物中，使得难以验证单一材料，这是不合需要的。因此，旨在通过改进PEG合成和纯化工艺来产生具有低多分散度值的材料。然而，特别地，当PEG与具有低分子量的材料结合时，存在与所述材料的多分散性相关的问题，如不容易确定是否易于进行结合的不便(Francesco M.V.DRUG DISCOVERY TODAY(2005)10(21):1451-1458)。
因此，近年来，作为常规自组装纳米颗粒SAMiRNATM的改进形式，根据需要而使用适当数量的嵌段，在所述嵌段中将构成SAMiRNATM的双链寡核苷酸构建体的亲水性材料构建成包含1至15个具有预定分子量的均匀单体和接头(必要时)的基本单元，由此开发出一种新型递送载体技术，与常规SAMiRNATM相比，所述技术具有小尺寸和显著改进的多分散性。已知siRNA在体内注射时会被血液中存在的各种酶迅速降解，因此导致向靶细胞或组织的递送效率差，并且改进的SAMiRNATM也显示观察到根据靶基因的稳定性和表达抑制效率的变化。因此，本发明人已经确定，可以通过应用DNA/RNA杂合体形式的双链寡核苷酸，使用ASO有义链DNA序列作为指导链并且反义链RNA序列作为随从链显著增强靶基因的稳定性和表达抑制作用，以使用改进的自组装纳米颗粒SAMiRNATM更稳定且有效地抑制靶基因的表达。
与此同时，COVID-19是由SARS-Cov-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)感染引起的呼吸综合征。在约2至14天的潜伏期后，COVID-19的主要症状是发热、呼吸道症状(如咳嗽或呼吸短促)以及肺炎，并且已知COVID-19是由于通过咳嗽或打喷嚏产生的飞沫(唾液飞沫)或者当人们触摸被SARS-Cov-2污染的物体然后触摸他们的眼睛、鼻子和嘴时传播的。
截至2020年4月，已有280万确诊COVID-19病例和超过200,000多人死亡。世界卫生组织(WHO)2020年1月30日宣布COVID-19为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)，然后在3月11日宣布COVID-19大流行。传染病风险最高水平的大流行意味着“大多数人对其没有免疫力的病毒的全球传播”，并且确诊病例、死亡和受影响的国家的数量持续增加。
冠状病毒在电子显微镜下具有从其外表面突出的冠状刺突(S)蛋白，并且是呈圆形或椭圆形的阳性单链(+ssRNA)病毒。冠状病毒分为四个属：αCoV、βCoV、δCoV和γCoV。引起常见呼吸道感染的αCoV的例子可以包括HCoV-229E和HCoV-NL63，并且βCoV的例子可以包括HCoV-OC43和HCoV-HKU1，其也可以导致上呼吸道感染如感冒和消化障碍。属于βCoV的SARS-CoV(B谱系)和MERS-CoV(C谱系)引起以急性呼吸道症状为特征的严重呼吸道传染病。分析从COVID-19早期的肺炎患者分离出的基因组序列与蝙蝠SARS样CoVZXC21具有89％核苷酸同源性，以及与SARS-CoV具有82％同源性，并且该病毒被发现属于βCoV属，并且被命名为SARS-CoV-2。
在韩国，在COVID-19爆发的早期，使用泛冠状病毒测试(常规PCR)和测序匹配进行验证测试。然而，目前正在进行实时RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)测试来诊断COVID-19。全球多家制药公司已经完成疫苗开发，并且疫苗接种正在进行中，但尚未发布有效的COVID-19治疗剂。
如上所述，用于COVID-19的RNAi治疗剂及其递送系统的技术开发仍然微不足道，并且对于能够以高效率特异性地抑制SARS-Cov-2增殖的双链寡核苷酸治疗剂及其递送技术的市场需求非常高。
因此，本发明人选择靶向SARS-Cov-2的双链寡核苷酸，并且特别鉴定能够通过抑制SARS-Cov-2增殖有效地治疗COVID-19的RNAi治疗剂及其递送载体，从而达到本发明的目的。
[引用列表]
[专利文献]
美国专利号5,034,323
美国专利号5,231,020
美国专利号5,283,184
韩国专利号883471
韩国专利号1224828
[非专利文献]
Jessica,C.,J.Postdoc.Res.,4:35-50,2016
Barik,S.J.Mol.Med.(2005)83:764-773
M.A.Behlke,MOLECULAR THERAPY.2006 13(4):664-670
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S.H.Kim,J.Control Release 129(2):107-16,2008
Francesco M.V.DRUG DISCOVERY TODAY(2005)10(21):1451-1458
Moon Seong-sil,BRIC View 2020-TX2(2020)
【公开内容】
【技术问题】
本发明的目的是提供能够以高效率非常特异性地抑制SARS-Cov-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)增殖的双链寡核苷酸、优选包括RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合体形式的序列的双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供用于治疗COVID-19的药物组合物，其含有所述双链寡核苷酸作为活性成分、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒。
本发明的又另一个目的是提供治疗COVID-19的方法，其包括向需要治疗COVID-19的受试者施用所述药物组合物。
本发明的另一个目的是提供所述双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒用于治疗COVID-19的用途。
本发明的又另一个目的是提供所述药物组合物用于治疗COVID-19的用途。
本发明的另外的目的是提供所述双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒用于制造治疗COVID-19的药物的用途。
【技术解决方案】
为了实现上述目的，本发明提供了双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含含有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的任一个序列的有义链以及含有与其互补的序列的反义链。
此外，本发明提供了包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和/或包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒。
此外，本发明提供了用于治疗COVID-19的药物组合物，所述药物组合物包含双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸含有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的任一个序列的有义链以及含有与其互补的序列的反义链；含有所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体；或含有所述双链寡核苷酸的纳米颗粒。
此外，本发明提供了治疗COVID-19的方法，其包括向需要治疗COVID-19的受试者施用所述药物组合物。
根据本发明的一个方面的双链寡核苷酸应理解为包括具有一般RNAi(RNA干扰)作用的任何材料，并且对SARS-Cov-2具有特异性的双链寡核苷酸还包括SARS-Cov-2特异性shRNA等，这对于本发明所属领域的技术人员将是清楚的。简单地说，所述寡核苷酸可以是siRNA、shRNA或miRNA。
在本发明中，有义链和反义链各自可以独立地是DNA或RNA，并且可以使用其中有义链是DNA且反义链是RNA或者其中有义链是RNA且反义链是DNA的杂合体形式。
在本发明中，SEQ ID NO:1至10以DNA的形式描述，但当使用RNA时，SEQ ID NO:1至10的序列可以以其中T变为U的对应RNA序列形式提供。
另外，根据本发明的双链寡核苷酸不仅包含其中序列的有义链是与SARS-Cov-2基因的结合位点100％互补的核苷酸序列的完全匹配，而且包含其中一些核苷酸序列不匹配的错配，只要维持对SARS-Cov-2的特异性即可。
根据本发明的双链寡核苷酸可以包含单链突出端结构，其中在一条或两条链的3'端提供一个或多个未配对的核苷酸。
在本发明中，有义链或反义链优选地由19至31个核苷酸构成，但本发明不限于此。
在本发明中，双链寡核苷酸的有义链或反义链可以包含任何化学修饰，以便改进体内稳定性或赋予核酸酶抗性并且减少非特异性免疫应答。所述化学修饰可以包括但不限于选自以下中的至少一种：其中核苷酸中的糖结构的2'碳位置处的羟基(-OH)被选自甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、胺(-NH2)、氟(-F)、O-2-甲氧基乙基、O-丙基、O-2-甲基硫代乙基、O-3-氨基丙基、O-3-二甲基氨基丙基、O-N-甲基乙酰胺基和O-二甲基酰胺基氧乙基中的任一种取代的修饰；其中核苷酸中的糖结构的氧被硫取代的修饰；其中核苷酸键是选自硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键和甲基膦酸酯键的任一种键的修饰；修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)；以及DNA-RNA杂合体形式的修饰(Ann.Rev.Med.55,61-65 2004；US5,660,985；US 5,958,691；US 6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US 6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；Nucleic AcidRes.31:589-595,2003；Nucleic Acids Research,38(17)5761-773,2010；Nucleic AcidsResearch,39(5):1823-1832,2011)。
在本发明中，可以将至少一个磷酸酯基团、优选1至3个磷酸酯基团结合至双链寡核苷酸的反义链的5'端。
本发明的另一方面涉及一种具有以下结构式(1)的结构的双链寡核苷酸构建体，其中A是亲水性材料，B是疏水性材料，X和Y各自独立地是简单的共价键或接头介导的共价键，并且R是双链寡核苷酸。
在优选的实施方案中，根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性序列的双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(1)的结构。
结构式(1)
A-X-R-Y-B
在结构式(1)中，A是亲水性材料，B是疏水性材料，X和Y各自独立地是简单的共价键或接头介导的共价键，并且R是SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸。
根据本发明的双链寡核苷酸优选地呈DNA-RNA杂合体、siRNA(短干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)或miRNA(微RNA)的形式，但不限于此，并且还包括充当miRNA拮抗剂的单链miRNA抑制剂。
在下文中，将基于RNA来描述根据本发明的双链寡核苷酸，但对于本领域技术人员将清楚的是，这还可以应用于具有与本发明的双链寡核苷酸相同的特性的其他双链寡核苷酸。
更优选地，根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(2)的结构。
结构式(2)
A-X-S-Y-B
AS
在结构式(2)中，A、B、X和Y如结构式(1)中所定义，S表示SARS-Cov-2特异性核苷酸序列的有义链，并且AS表示SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的反义链。
更优选地，包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(3)或(4)的结构。
结构式(3)
A-X-5′S3′-Y-B
AS
结构式(4)
A-X-3′S5′-Y-B
AS
在结构式(3)和结构式(4)中，A、B、S、AS、X和Y如结构式(2)中所定义，并且5′和3′分别表示SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的有义链的5′端和3′端。
亲水性材料可以选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉，但不限于此。
对于本领域的技术人员将清楚的是，在根据结构式(1)至结构式(4)的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体中，在反义链的5′端可以结合一至三个磷酸酯基团，并且可以代替RNA使用shRNA。
结构式(1)至结构式(4)中的亲水性材料优选地是具有200至10,000的分子量的聚合物材料，更优选地是具有1,000至2,000的分子量的聚合物材料。例如，亲水性聚合物材料可以是非离子亲水性聚合物化合物，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉等，但不必限于此。
特别地，结构式(1)至结构式(4)中的亲水性材料(A)可以以由以下结构式(5)或结构式(6)表示的亲水性材料嵌段的形式使用。当根据需要以适当数量(结构式(5)或结构式(6)中的n)使用这些亲水性材料嵌段时，可以极大地缓和在使用一般合成聚合物材料的情形中可能发生的由多分散性所致的问题。
结构式(5)
(A′m-J)n
结构式(6)
(J-A′m)n
在结构式(5)或结构式(6)中，A′为亲水性材料单体，J为将m个亲水性材料单体彼此连接或将m个亲水性材料单体和寡核苷酸彼此连接的接头，m为1至15的整数，n为1至10的整数，并且由(A′m-J)或(J-A′m)表示的重复单元是亲水性材料嵌段的基本单元。
当提供由结构式(5)或结构式(6)表示的亲水性材料嵌段时，根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体可以具有以下结构式(7)或结构式(8)的结构。
结构式(7)
(A′m-J)n-X-R-Y-B
结构式(8)
(J-A′m)n-X-R-Y-B
在结构式(7)和结构式(8)中，X、R、Y和B如结构式(1)中所定义，并且A′、J、m和n如结构式(5)和结构式(6)中所定义。
在结构式(5)至结构式(8)中，在非离子亲水性聚合物的单体中，可以无限制地使用任何亲水性材料单体(A')，只要其满足本发明的目的即可。优选地，使用选自下表1中所示的化合物(1)至化合物(3)的单体，更优选化合物(1)的单体，并且化合物(1)中的G优选选自O、S和NH。
特别地，在亲水性材料单体中，由化合物(1)表示的单体可以被引入各种官能团，可以展现出优异的生物相容性，如具有良好的体内亲和性并诱导较少的免疫应答，并且可以具有增加在根据结构式(7)或结构式(8)的构建体中所含的双链寡核苷酸的体内稳定性和增加递送效率的优点，因此其非常适合产生根据本发明的构建体。
[表1]本发明中亲水性材料单体的结构
Figure GDA0004195520670000071
结构式(5)至结构式(8)中的亲水性材料优选具有在1,000至2,000范围内的总分子量。
例如，在结构式(5)至结构式(8)中，当使用根据化合物(1)的六乙二醇(即，G为O且m为6的材料)时，六乙二醇间隔子的分子量为344，并且因此重复数量(n)优选是3至5。特别地，根据需要，可以以由n表示的适当数量使用结构式(5)至结构式(8)中由(A'm-J)n或(J-A'm)n表示的亲水性基团的重复单元(即亲水性材料嵌段)。每个亲水性材料嵌段中包含的亲水性材料单体A和接头J在亲水性材料嵌段之间可以独立地相同或不同。具体地，当使用三个亲水性材料嵌段(n＝3)时，不同的亲水性材料单体可以用于相应的亲水性材料嵌段，诸如，对于第一嵌段使用根据化合物(1)的亲水性材料单体，对于第二嵌段使用根据化合物(2)的亲水性材料单体，并且对于第三嵌段使用根据化合物(3)的亲水性材料单体，或者可替代地，选自根据化合物(1)至(3)的亲水性材料单体的任一种亲水性材料单体可以同样地用于所有的亲水性材料嵌段。同样地，作为介导亲水性材料单体的结合的接头，对于亲水性材料嵌段可以使用相同或不同的接头。另外，作为亲水性材料单体的数量的m在亲水性材料嵌段之间可以是相同或不同的。具体地，可以以这样的方式使用不同数量的亲水性材料单体，其中在第一亲水性材料嵌段中连接三个亲水性材料单体(m＝3)，在第二亲水性材料嵌段中连接五个亲水性材料单体(m＝5)，并且在第三亲水性材料嵌段中连接四个亲水性材料单体(m＝4)，或者可替代地，对于所有的亲水性材料嵌段，可以使用相同数量的亲水性材料单体。
另外，在本发明中，接头(J)优选地选自-PO3 --、-SO3-和-CO2-，但不限于此。对于本领域的技术人员将清楚的是，根据所使用的亲水性材料的单体，可以使用任何接头，只要其满足本发明的目的即可。
结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)中的疏水性材料(B)用于通过疏水性相互作用形成由根据结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)的双链寡核苷酸构建体构成的纳米颗粒。所述疏水性材料优选具有250至1,000的分子量，并且其例子可以包括但不限于类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺等。对于本领域的技术人员将清楚的是，可以使用任何疏水性材料，只要其满足本发明的目的即可。
类固醇衍生物可选自：胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾醇胺，并且甘油酯衍生物可选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在此，甘油酯的脂肪酸优选地是C12至C50不饱和或饱和脂肪酸。
特别地，在疏水性材料的例子中，饱和或不饱和烃或胆固醇的优选之处在于，其在根据本发明的双链寡核苷酸构建体的合成步骤中促进结合，并且C24烃、特别是包含二硫键的形式是最优选的。
疏水性材料结合至亲水性材料的远端，并且可以结合至siRNA的有义链或反义链上的任何位置。
根据本发明的结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)中的SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸和亲水性或疏水性材料通过简单的共价键或接头介导的共价键(X或Y)结合。介导共价键的接头在SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的末端共价结合至亲水性材料或疏水性材料，并且没有特别限制，只要其提供视需要在某种环境中可降解的键即可。因此，接头可以是在产生根据本发明的双链寡核苷酸构建体期间结合以激活SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸和/或亲水性材料(或疏水性材料)的任何化合物。共价键可以是不可降解键或可降解键。在此，不可降解键包括酰胺键或磷酸酯键，并且可降解键包括二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键，但本发明不限于此。
此外，结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)中由R(或S和AS)表示的SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸可以无限制地使用，只要其是能够与SARS-Cov-2的mRNA特异性结合的双链寡核苷酸即可。
优选地，在本发明中，所述SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸由有义链和反义链构成，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一个序列，所述反义链包含与所述序列互补的序列。
在根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体中，可以在亲水性材料的与结合寡核苷酸的末端相反的末端，另外引入胺基团或多组氨酸基团。
这促进载体的细胞内引入和根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的内体逃逸，并且为了促进载体如量子点、树状聚合物和脂质体的细胞内引入以及内体逃逸，已经报道了胺基团的引入和多组氨酸基团的使用及其效果。
具体地，已知在载体末端或外部修饰的伯胺基团通过静电相互作用与带负电荷的基因形成缀合物，同时在体内pH下质子化，并且还已知可以保护载体不受溶酶体降解，因为细胞内引入后，由于内部叔胺在内体的低pH下具有缓冲作用而促进内体逃逸(Genetransfer and expression inhibition using polymer-based hybridmaterial.Polymer Sci.Technol.,第23卷,第3期,第254-259页)。
已知作为非必需氨基酸的组氨酸在残基(-R)处具有咪唑环(pKR 6.04)，并因此增加在内体和溶酶体中的缓冲能力，因此组氨酸修饰可以用于增加在非病毒基因载体(包括脂质体)中的内体逃逸效率(Novel histidine-conjugated galactosylated cationicliposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatomaHepG2 cells.J.Controlled Release 118,第262-270页)。
胺基团或多组氨酸基团可以经由至少一个接头与亲水性材料或亲水性材料嵌段连接。
当将胺基团或多组氨酸基团引入根据本发明的结构式(1)的双链寡核苷酸构建体的亲水性材料中时，可以提供由以下结构式(9)表示的结构。
结构式(9)
P-J1-J2-A-X-R-Y-B
在结构式(9)中，A、B、R、X和Y如结构式(1)中所定义。
另外，P是胺基团或多组氨酸基团，并且J1和J2是接头。在此，J1和J2可以独立地选自简单的共价键、PO3 -、SO3、CO2、C2-12烷基、烯基和炔基，但不限于此，并且对于本领域技术人员将清楚的是，根据使用的亲水性材料，可以使用任何接头作为满足本发明的目的的J1和J2。
当引入胺基团时，优选的是J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是C6烷基，但本发明不限于此。
另外，当引入多组氨酸基团时，在结构式(9)中，优选的是J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是化合物(4)，但本发明不限于此。
化合物(4)
Figure GDA0004195520670000091
此外，当根据结构式(9)的双链寡核苷酸构建体的亲水性材料是根据结构式(5)或结构式(6)的亲水性材料嵌段并且向其中引入胺基团或多组氨酸基团时，可以提供由以下结构式(10)或结构式(11)表示的结构。
结构式(10)
P-J1-J2-(A′m-J)n-X-R-Y-B
结构式(11)
P-J1-J2-(J-A′m)n-X-R-Y-B
在结构式(10)和结构式(11)中，X、R、Y、B、A′、J、m和n如结构式(7)或结构式(8)中所定义，并且P、J1和J2如结构式(9)中所定义。
特别地，在结构式(10)和结构式(11)中，亲水性材料优选地呈与SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的有义链的3′端结合的形式。在此，结构式(9)至结构式(11)可以以由以下结构式(12)至结构式(14)表示的形式提供。
结构式(12)
P-J1-J2-A-X-3′S5′-Y-B
AS
结构式(13)
P-J1-J2-(A′m-J)n-X-3′S5′-Y-B
AS
结构式(14)
P-J1-J2-(J-A′m)n-X-3′S5′-Y-B
AS
在结构式(12)至结构式(14)中，X、R、Y、B、A、A′、J、m、n、P、J1和J2如结构式(9)至结构式(11)中所定义，并且5′和3′分别表示SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的有义链的5′端和3′端。
可以在本发明中引入的胺基团可以包括伯胺基团至叔胺基团，特别优选的是伯胺基团。引入的胺基团可以以胺盐的形式提供，并且伯胺基团的盐可以以例如NH3 +的形式提供。
此外，在本发明中可以引入的多组氨酸基团可以包含3至10个组氨酸，优选5至8个组氨酸，最优选6个组氨酸。此外，除组氨酸之外，还可以包含至少一个半胱氨酸。
同时，当向根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和由其形成的纳米颗粒提供靶向部分时，可以促进向靶细胞的有效递送，并且因此，即使在相对低的剂量下，也可以将其递送至靶细胞，从而展现出调节靶基因表达和防止非特异性SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸被递送至其他器官和细胞的强效果。
因此，本发明提供了一种双链寡RNA构建体，其中配体(L)(特别是与通过受体介导的胞吞作用(RME)促进靶细胞内化的受体特异性结合的配体)另外与根据结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)的构建体结合。例如，其中配体与根据结构式(1)的双链寡RNA构建体结合的形式具有以下结构式(15)的结构。
结构式(15)
(Li-Z)-A-X-R-Y-B
在结构式(15)中，A、B、X和Y如结构式(1)中所定义，L是与通过受体介导的胞吞作用(RME)促进靶细胞内化的受体特异性结合的配体，并且i为1至5的整数，优选1至3的整数。
结构式(15)中的配体优选选自具有促进靶细胞特异性细胞内化的RME特性的靶受体特异性抗体、适体和肽；以及化学物质，包括叶酸(通常，叶酸(folate)和叶酸(folicacid)可互换使用，并且本发明中的叶酸是指在人体内处于自然状态或激活状态的叶酸)、己糖胺(如N-乙酰基半乳糖胺(NAG))和糖或碳水化合物(如葡萄糖和甘露糖)，但不限于此。
另外，结构式(15)中的亲水性材料A可以以根据结构式(5)和结构式(6)的亲水性材料嵌段的形式使用。
本发明的仍另一个方面涉及一种产生包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的方法。
产生根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的方法可以包括，例如：
(1)将亲水性材料结合至固体支持物；
(2)在结合有所述亲水性材料的固体支持物上合成单链寡核苷酸；
(3)将疏水性材料共价结合至所述单链寡核苷酸的5'端；
(4)合成具有与所述单链寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸；
(5)在合成完成后，从所述固体支持物分离并纯化寡核苷酸/聚合物构建体和所述单链寡核苷酸；以及
(6)通过使所述寡核苷酸/聚合物构建体和具有互补序列的所述单链寡核苷酸退火来产生双链寡核苷酸构建体。
本发明中的固体支持物优选是控孔玻璃(CPG)，但不限于此，并且可以使用聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅胶、纤维素纸等。CPG优选具有40μm至180μm的直径和
Figure GDA0004195520670000101
至/>
Figure GDA0004195520670000102
的孔径。在步骤(5)之后，使用MALDI-TOF质谱仪测量纯化的RNA/聚合物构建体和单链寡核苷酸的分子量，以确定是否产生所需寡核苷酸/聚合物构建体和单链寡核苷酸。在上述产生方法中，合成具有与步骤(2)中合成的单链寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸的步骤(4)可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(5)中的任一个步骤期间进行。
另外，具有与步骤(2)中合成的单链寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸可以以磷酸酯基团结合至5'端的形式使用。
另外，提供了一种产生双链寡核苷酸构建体的方法，其中配体另外与根据本发明的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体结合。
产生配体结合的包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体的方法可以包括，例如：
(1)将亲水性材料结合至结合有官能团的固体支持物；
(2)在结合有官能团和亲水性材料的固体支持物上合成单链寡核苷酸；
(3)将疏水性材料共价结合至所述单链寡核苷酸的5'端；
(4)合成具有与所述单链寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸；
(5)在合成完成后，从所述固体支持物分离官能团/寡核苷酸/聚合物构建体和具有互补序列的单链寡核苷酸；
(6)通过使用官能团将配体结合至亲水性材料的末端，产生呈单链形式的配体/寡核苷酸/聚合物构建体；以及
(7)通过使所述配体/寡核苷酸/聚合物构建体和具有互补序列的所述单链寡核苷酸退火来产生配体/双链寡核苷酸构建体。
在步骤(6)之后，分离并纯化产生的配体/寡核苷酸/聚合物构建体和具有互补序列的单链寡核苷酸，然后使用MALDI-TOF质谱仪测量其分子量，以确定是否产生所需的配体/寡核苷酸/聚合物构建体和互补寡核苷酸。所述配体/双链寡核苷酸构建体可以通过使配体/寡核苷酸/聚合物构建体和具有互补序列的单链寡核苷酸退火来产生。在上述产生方法中，合成具有与步骤(3)中合成的单链寡核苷酸的序列互补的序列的单链寡核苷酸的步骤(4)可以是独立的合成过程，并且可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(6)中的任一个步骤期间进行。
本发明又另一个方面涉及一种包含根据本发明的双链寡核苷酸构建体的纳米颗粒。根据本发明的双链寡核苷酸构建体通过疏水性材料的疏水性相互作用形成自组装的纳米颗粒(韩国专利号1224828)。这些纳米颗粒不仅具有极其优异的体内递送效率和体内稳定性，而且具有优异的粒度均匀性，这促进质量控制(QC)，从而简化制造成药物的工艺。
在本发明中，所述纳米颗粒可以被配置为使得混合一种或多种双链寡核苷酸构建体、优选两种或更多种包含不同的双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体。在一个实施方案中，所述纳米颗粒可以包含一种类型的SARS特异性双链寡核苷酸，所述SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一个序列，所述反义链包含与所述序列互补的序列，并且在另一个实施方案中，纳米颗粒可以包含不同类型的SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸，所述SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一个序列，所述反义链包含与所述序列互补的序列，并且还可以包含未在本发明中公开的SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸。
本发明的仍又一个方面涉及用于治疗COVID-19的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的根据本发明的双链寡核苷酸、双链寡核苷酸构建体或纳米颗粒。
除了上文对于施用描述的活性成分之外，本发明的组合物还可以通过包含至少一种药学上可接受的载体来制备。所述药学上可接受的载体必须与本发明的活性成分相容，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇，其可以单独使用或以其两种或更多种的组合的形式使用。可以按需要添加其他典型的添加剂，如抗氧化剂、缓冲液和抑菌剂。另外，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以形成可注射配制品，如水溶液、混悬液、乳液等。特别地，优选提供冻干配制品。为了制备冻干配制品，可以使用本发明所属领域中通常已知的方法，并且可以添加用于冻干的稳定剂。优选地，可以根据每种疾病或组分使用本领域中的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company，宾夕法尼亚州伊斯顿)中披露的方法来制备配制品。
本发明的组合物的类型可以由本领域技术人员基于典型患者的症状和疾病的严重程度来确定。此外，可以将所述组合物配制成各种形式，如粉末、片剂、胶囊、溶液、注射剂、软膏、糖浆等，并且可以将其提供在单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿和瓶)中。
本发明的组合物可以口服或肠胃外施用。根据本发明的组合物的施用途径不限于此，并且例如可以口服、吸入、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、肠内、舌下或局部施用。
特别地，由于COVID-19是呼吸系统疾病，鼻内施用、优选使用喷雾方法的鼻内施用或通过气管内滴注施用至肺是可能的，但本发明不限于此。
根据本发明的组合物的剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄速率、疾病严重程度等变化，并且可以由本领域的技术人员容易地确定。此外，可以将本发明的组合物配制成合适的剂型用于使用已知技术进行临床施用。
在本发明的一个实施方案中，使用雪貂，并且具体地，将根据本发明靶向SARS-CoV-2序列的SAMiRNATM施用至感染SARS-CoV-2的雪貂，并且在雪貂的鼻洗液中通过qRT-PCR测量SARS-CoV-2拷贝数，证实与感染对照组相比，在皮下注射+气管内施用组中SARS-CoV-2病毒数量显著降低，并且还使用TCID50测量病毒滴度，证实与感染对照组相比，在皮下注射组和皮下注射+气管内施用组中病毒滴度在统计学上显著减小(图5)。
本发明的甚至仍又另一个方面涉及一种包含根据本发明的药物组合物的冻干配制品。
本发明的另外的方面涉及治疗COVID-19的方法，所述方法包括向需要治疗COVID-19的受试者施用根据本发明的药物组合物。
本发明的仍另一方面涉及双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和包含其的纳米颗粒用于治疗COVID-19的用途。
本发明的又另外的方面涉及所述药物组合物用于治疗COVID-19的用途。
本发明的仍又另外的方面涉及所述双链寡核苷酸、包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和包含所述双链寡核苷酸的纳米颗粒用于制造治疗COVID-19的药物的用途。
【有利效果】
根据本发明，包含SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸构建体和含有所述SARS-Cov-2特异性双链寡核苷酸作为活性成分的药物组合物可以以高效率抑制SARS-Cov-2的表达而无副作用，并且对治疗COVID-19非常有效。
【附图说明】
图1示出了通过将1碱基滑动窗口算法应用于基因组以设计SARS-CoV-2特异性寡核苷酸候选序列来选择每个由19个核苷酸组成的候选序列的过程；
图2A和图2B显示了用COVID-19感染SAMiRNA处理的Huh7细胞系后E和Rdrp基因Ct值的测量结果；
图3显示了用于评价SAMiRNA-COVID19的体内抗病毒功效的过程；
图4显示了在评价SAMiRNA-COVID19的体内抗病毒功效时雪貂的体重和体温的变化；并且
图5显示了在评价SAMiRNA-COVID19的体内抗病毒功效时雪貂的鼻洗液样品中SARS-CoV-2病毒RNA拷贝数和病毒滴度的测量结果。
【具体实施方式】
通过以下实施例可以获得对本发明的更好理解。对本领域技术人员将清楚的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物定义。
实施例1.用于筛选靶向SARS-CoV-2的寡核苷酸和选择候选序列的算法
基于siRNA的药物高通量筛选是用于通过以下方法生成所有可能的候选序列的方法：将滑动窗口算法应用于整个RNA病毒基因组序列，通过同源性过滤去除不需要的候选序列，以及确定所有最终选择的寡核苷酸对病毒复制的抑制程度。
以这样的方式进行针对SARS-CoV-2的寡核苷酸候选序列的设计过程，其中将1碱基滑动窗口算法应用于SARS-CoV-2参考基因组(NC_045512.2，29,903bp)，从而生成每个由19个核苷酸组成的29,885个候选序列(图1)。
所生成的寡核苷酸候选序列列表以对于人总参考seq RNA的100或更小的BLAST e值进行，并且因此选择与人基因和RNA序列具有15个核苷酸或更小同一性的6,885个候选序列。其中选择具有与SARS-CoV(NC_004718.3，29,751bp)相同的所有19个核苷酸的560个候选序列。考虑到siRNA效率，最终选择GC含量为30至60的480个候选序列。
实施例2.双链寡RNA构建体的合成
本发明中产生的双链寡RNA构建体(SAMiRNA)具有根据以下结构式的结构。
C24-5’S 3'-(六乙二醇-PO3 -)3-六乙二醇
AS 5’-PO4
如下合成单SAMiRNA(n＝4)双链寡核苷酸构建体的有义链。具体地，使用3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为支持物通过上述反应连续地结合作为亲水性材料单体的三个二甲氧基三苯甲基(DMT)六乙二醇氨基磷酸酯，进行RNA或DNA合成，然后因此将作为疏水性材料的含有二硫键的C24(C6-S-S-C18)结合至5'端，从而合成单SAMiRNA(n＝4)的有义链，其中NAG-六乙二醇-(-PO3 -六乙二醇)3结合至3'端，并且C24(C6-S-S-C18)结合至5'端。
在合成完成后，在60℃的水浴中使用28％(v/v)氨，将合成的单链RNA和寡(DNA或RNA)/聚合物构建体与CPG分离，随后进行脱保护反应以去除保护性残基。在去除保护性残基后，在70℃的烘箱中，用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三乙胺和三乙胺三氢氟化物处理单链RNA和寡(DNA或RNA)/聚合物构建体，以去除2'TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。通过高效液相色谱(HPLC)从反应产物中分离单链RNA、寡(DNA或RNA)/聚合物构建体和配体结合的寡(DNA或RNA)/聚合物构建体，并且使用MALDI-TOF质谱仪(MALDI TOF-MS，SHIMADZU，日本)测量其分子量，以确定它们是否与要合成的核苷酸序列和寡/聚合物构建体匹配。此后，为了产生每个双链寡构建体，将有义链和反义链以等量混合，添加到1X退火缓冲液(含有30mM HEPES、100mM乙酸钾和2mM乙酸镁，pH 7.0-7.5)中，允许其在90℃的恒温水浴中反应3分钟，并且允许其进一步在37℃下反应，从而产生所需的SAMiRNA。通过电泳证实由此产生的双链寡RNA构建体的退火。
实施例3.靶向SARS-CoV-2的RNAi诱导SAMiRNA纳米颗粒的高通量筛选
3.1SAMiRNA纳米颗粒的制备
将实施例2中合成的960个靶向SARS-CoV-2序列的SAMiRNA溶解在1X杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，韩国)中，用0.22μm、透明、无菌96孔过滤板MultiScreenHTS GV过滤板(MERCK，德国)过滤，然后用于本发明的实验中。
3.2SAMiRNA纳米颗粒的细胞内处理
为了发现抑制SARS-CoV-2表达的SAMiRNA，使用了人源肝癌细胞系Huh7，并在用SAMiRNA治疗前24小时将Huh-7细胞(JCRB，日本)接种在96孔板中。将RPMI 1640培养基(sh30027.01)(Hyclone，美国)用作细胞培养基，并将其100μl添加至每个孔，然后在37℃和5％ CO2下进行细胞培养。RPMI 1640培养基补充有2.05mM L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素(Hyclone，美国)和10％胎牛血清(Hyclone，美国)。用浓度为10μM的SAMiRNA候选物更换处理细胞一次并两次更换培养基，然后在37℃和5％ CO2下培养24小时。
3.3细胞内SARS-CoV-2感染
从实施例3.2中培养的96孔细胞培养板去除培养基后，用制备的病毒以0.01的MOI处理每个孔，并感染1小时30分钟。此后，将培养基更换为含有2％胎牛血清的RPMI 1640培养基(病毒生长培养基)，随后在37℃和5％ CO2下进行细胞培养2天。最后，从细胞培养板收获细胞培养液，然后将其与1号筒(裂解缓冲液)和ExiprepTM 96病毒DNA/RNA试剂盒(BIONEER，韩国)的蛋白酶K混合，然后在65℃下培养2小时。
3.4通过分析SARS-CoV-2gRNA表达抑制功效进行SAMiRNA筛选
为了从实施例3.3中获得的细胞培养液提取gRNA，使用了作为自动化核酸提取仪器的ExiPrepTM 96Lite(BIONEER，韩国)和ExiPrepTM 96病毒DNA/RNA试剂盒(BIONEER，韩国)。根据
Figure GDA0004195520670000141
SARS-CoV-2实时RT-PCR试剂盒(BIONEER，韩国)的制造商方案，使用ExicyclerTM 96实时定量热模块(BIONEER，韩国)分析提取的核酸的E和Rdrp基因。此处，RT-qPCR进行45个如下循环：50℃下30分钟，94℃下10分钟，95℃下15秒，以及60℃下1分钟。
确定了从获得自用SAMiRNA处理的病毒感染的细胞培养样品的E和Rdrp基因的生物学/技术重复序列得出的所有Ct值。基于上述结果，选择SARS-CoV-2的每个基因区域的最佳SAMiRNA候选物。将选择的SAMiRNA候选物与COVID-19数据库中登记的7259个序列进行比较，并测试基因序列变异。
因此，如下表2所示，最终选择了10种具有SARS-CoV-2抑制功效的SAMiRNA。选择的SAMiRNA候选物是分别具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列(按所描述的顺序)的SAMiRNA。选择的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分别对应于图2的#161、#214、#233、#246、#249、#544、#625、#707、#715和#758。
[表2]
通过1碱基滑动窗口筛选选择的SARS-CoV-2特异性寡核苷酸候选物
Figure GDA0004195520670000142
实施例4.SAMiRNATM在SARS-CoV-2感染的雪貂模型中的症状缓解功效的评价
4.1SAMiRNATM纳米颗粒的制备
将实施例2中所示的10个类型的靶向SARS-CoV-2序列的SAMiRNATM的混合物溶解在1X杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，韩国)中，用0.22μm、透明、无菌96孔过滤板MultiScreenHTS GV过滤板(MERCK，德国)过滤，然后用于本发明的实验中。
4.2SARS-CoV-2感染的雪貂动物测试方法
将11只平均年龄为15个月的雌性雪貂(IDBio，韩国)分为感染后未治疗的对照组(包括3只雪貂)、皮下注射(皮下)组(包括4只雪貂)和皮下注射+气管内施用组(包括4只雪貂)。
将0.5mL SARS-CoV-2(CBNU-nCoV-01)以1×105.5TCID50/mL各自接种至雪貂的鼻腔和支气管中。在病毒感染后24小时，通过皮下注射(50mpk)和通过皮下注射(50mpk)+气管内施用(500μl)将SAMiRNATM纳米颗粒施用至每只实验动物。
在病毒感染前第0天和感染后第2、4、6、8和10天测量对照组和测试组中单独受试者的体重和体温变化，并收集鼻腔洗液样品(图3)。使用TCID50方法对收集的样品进行病毒滴度测量，或从中提取RNA，然后根据
Figure GDA0004195520670000143
SARS-CoV-2实时RT-PCR试剂盒(BIONEER，韩国)的制造商方案通过qRT-PCR对病毒RNA拷贝数进行绝对定量分析。
因此病毒感染后雪貂的体重与感染前相比降低了7％-8％，并且在4dpi时平均升高0.5℃或更高后体温恢复正常，并且通过SAMiRNA处理没有显著差异(图4)。
基于在雪貂的鼻洗液中通过qRT-PCR得到的SARS-CoV-2拷贝数的测量结果，与感染对照组相比，皮下注射+气管内施用组在8dpi时SARS-CoV-2病毒的数量显著降低(图5A)。
基于使用TCID50的病毒滴度的测量结果，与感染对照组相比，皮下注射组和皮下注射+气管内施用组二者在4dpi时病毒滴度在统计学上显著降低。与感染对照组相比，证实了皮下注射+气管内施用组甚至在6dpi时也具有统计学显著性(图5B)。
尽管已在上文详细地公开了本发明的具体实施方案，但是对于本领域的普通技术人员将明显的是描述仅仅是优选的示例性实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物定义。本领域的普通技术人员可以容易地使用本发明的简单的修改或改变，并且所有这样的修改或改变可以被认为包括在本发明的范围内。
<110> 柏业公司
　　　　　思耐基因
<120> 双链寡核苷酸和用于治疗COVID-19的含有其的组合物
<130> PP-B2612
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SARS-CoV-2 specific oligonucleotide
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cucacucccu uucggaugg 19

Claims (27)

1.一种对SARS-Cov-2具有特异性的双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含含有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的任一个序列的有义链和含有与其互补的序列的反义链。
2.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中所述有义链或所述反义链包含19至31个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是siRNA、shRNA或miRNA。
4.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链各自独立地是DNA或RNA。
5.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中所述双链寡核苷酸的所述有义链或所述反义链包含化学修饰。
6.根据权利要求5所述的双链寡核苷酸，其中所述化学修饰是选自以下的至少一种：
如下修饰，其中核苷酸中糖结构的2'碳位置处的羟基基团(OH)被选自甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、胺(-NH2)、氟(-F)、O-2-甲氧基乙基、O-丙基、O-2-甲基硫代乙基、O-3-氨基丙基、O-3-二甲基氨基丙基、O-N-甲基乙酰胺基和邻二甲基酰胺基氧基乙基的任一种取代；
如下修饰，其中所述核苷酸中糖结构的氧被硫取代；
如下修饰，其中核苷酸键是选自硫代磷酸酯键、硼烷膦酸酯键和甲基膦酸酯键的任一个键；以及
修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)。
7.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中至少一个磷酸酯基团结合至所述双链寡核苷酸的反义链的5'端。
8.一种对SARS-Cov-2具有特异性的双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(1)的结构：
结构式(1)
A-X-R-Y-B
在结构式(1)中，A是亲水性材料，B是疏水性材料，X和Y各自独立地是简单的共价键或接头介导的共价键，并且R是根据权利要求1至7中任一项所述的双链寡核苷酸。
9.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(2)的结构：
结构式(2)
A-X-S-Y-B
AS
在结构式(2)中，S和AS分别表示根据权利要求8所述的双链寡核苷酸的有义链和反义链，并且A、B、X和Y是根据权利要求8所述的。
10.根据权利要求9所述的双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(3)或结构式(4)的结构：
结构式(3)
A-X-5′S 3′-Y-B
AS
结构式(4)
A-X-3′S S′-Y-B
AS
在结构式(3)和(4)中，A、B、X、Y、S和AS是根据权利要求9所述的，并且5'和3’分别表示所述双链寡苷酸的有义链的5'端和3'端。
11.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述亲水性材料选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
12.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述亲水性材料具有以下结构式(5)或结构式(6)的结构：
结构式(5)
(A′m-J)n
结构式(6)
(J-A'm)n
在结构式(5)或结构式(6)中，A'为亲水性材料单体，J为将m个亲水性材料单体彼此连接或将m个亲水性材料单体和双链寡核苷酸彼此连接的接头，m为1至15的整数，n为1至10的整数，所述亲水性材料单体A'是选自以下化合物(1)至(3)的任一种化合物，并且所述接头(J)选自-PO3--、-SO3-和-CO2-：
化合物(1)
Figure FDA0004026495390000021
在化合物(1)中，G选自O、S和NH；
化合物(2)
Figure FDA0004026495390000022
并且
化合物(3)
Figure FDA0004026495390000023
13.根据权利要求12所述的双链寡核苷酸构建体，所述双链寡核苷酸构建体具有以下结构式(7)或结构式(8)的结构：
结构式(7)
(A'm-J)n-X-R-Y-B
结构式(8)
(J-A'm)n-X-R-Y-B。
14.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述亲水性材料具有200至10,000的分子量。
15.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述疏水性材料具有250至1,000的分子量。
16.根据权利要求15所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述疏水性材料是选自类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚和三烯生育酚的任一种。
17.根据权利要求16所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述类固醇衍生物是选自胆固醇、胆固烷醇、胆酸、胆固醇甲酸酯、胆固烷醇甲酸酯和胆固醇胺的任一种。
18.根据权利要求16所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述甘油酯衍生物是选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的任一种。
19.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸构建体，其中由X和Y表示的所述共价键是不可降解键或可降解键。
20.根据权利要求19所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述不可降解键是酰胺键或磷酸酯键。
21.根据权利要求19所述的双链寡核苷酸构建体，其中所述可降解键是选自二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键的任一种。
22.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含根据权利要求8至21中任一项所述的双链寡核苷酸构建体。
23.根据权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒被配置为使得混合包含不同的双链寡核苷酸的至少两种双链寡核苷酸构建体。
24.一种用于治疗COVID-19的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的双链寡核苷酸或根据权利要求9至21中任一项所述的双链寡核苷酸构建体作为活性成分。
25.一种用于治疗COVID-19的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求22所述的纳米颗粒作为活性成分。
26.一种冻干配制品，所述冻干配制品包含根据权利要求24所述的药物组合物。
27.一种冻干配制品，所述冻干配制品包含根据权利要求25所述的药物组合物。
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