KR20210141399A - 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엠피레귤린 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 RNA/RNA, DNA/DNA, 또는 DNA/RNA hybrid 형태의 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 나노입자의 비만의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition for treating or preventing obesity associated disease containing amphiregulin specific double stranded oligonucleotide structure}
본 발명은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 엠피레귤린 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 나노입자를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
1995년 Guo와 Kemphues는 C. elegans에서 antisense를 이용한 유전자 발현을 억제하는데 antisense RNA와 마찬가지로 sense RNA도 유효하다는 것을 발견함으로써 그 원인을 규명하기 위한 연구가 진행되었으며, 1998년 Fire 등이 처음으로 double stranded RNA (dsRNA)를 주입하여 그에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자의 발현이 억제되는 현상을 확인하였고 이를 RNA interference (RNAi) 로 명명하였다. RNAi는 유전자 발현을 억제하기 위해 사용되는 방법으로 간편하면서 적은 비용으로 유전자 억제 효과를 뚜렷하게 볼 수 있기 때문에 그 기술의 응용 분야가 다양해지고 있다.
이러한 유전자의 발현을 억제하는 기술은 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있기 때문에 특정 유전자의 과잉 발현이 원인이 되는 암, 유전 질환 등의 표적 유전자를 mRNA 수준에서 제거할 수 있어, 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증의 중요한 도구로 활용될 수 있다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 종래의 기술로는 표적 유전자에 대한 전이 유전자를 도입하는 기술이 개시되어 있는데, 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이 유전자를 도입하는 방법과 프로모터 기준으로 정방향(sense)으로 이식 유전자를 도입하는 방법이 있다.
이러한 RNA를 표적으로 하는 RNA 치료법은 표적 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 해당 유전자의 기능을 제거하는 방법으로 기존의 항체와 화합물 (small molecule) 같은 종래의 치료제가 주로 단백질을 표적으로 하는 것과는 다르다고 할 수 있다. RNA를 표적으로 하는 접근법에는 크게 두 가지가 존재하는데, 하나는 이중나선-RNA가 매개된 RNAi이고 다른 하나는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 현재 다양한 질병에서 RNA를 표적으로 하여 임상이 시도되고 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, 이하 'ASO'라고 한다)는 왓슨-크릭 염기 반응에 따라 목적 유전자에 결합되도록 디자인된 짧은 길이의 합성 DNA 로서, 유전자의 특정 염기 서열의 발현을 특이적으로 억제할 수 있어 유전자의 기능을 연구하고 암과 같은 질환을 분자 수준에서 치료할 수 있는 치료제를 개발하는데 이용되어 왔다. 이러한 ASO는 유전자 발현을 억제하는 목표를 다양하게 설정하여 용이하게 제작될 수 있는 장점이 있어, 발암 유전자의 발현과 암세포의 성장을 억제하는데 활용하고자 하는 연구가 있어 왔다. ASO가 특정 유전자의 발현을 억제하는 과정은 상보적인 mRNA 서열과 결합하여 RNase H 활성을 유도하여 mRNA를 제거하거나 단백질 번역을 위한 리보좀 복합체의 형성 및 진행을 방해함으로써 이루어진다. 또한 ASO는 게놈 DNA와 결합하여 트리플-헬릭스 (Triple helix) 구조를 형성함으로 유전자의 전사를 억제한다고도 보고되었다. ASO는 위와 같은 잠재적 가능성이 있으나, 이를 임상에 활용되기 위해서는 뉴클레아제(nuclease)에 대한 안정성을 향상시키고, 목적 유전자의 염기 서열에 특이적으로 결합하도록 표적 조직이나 세포내로 효율적으로 전달되어야 한다. 또한, 유전자 mRNA의 2차 및 3차 구조는 ASO의 특이적 결합에 중요한 요소로, mRNA 2차 구조가 적은 부분이 ASO가 접근하는데 매우 유리하므로, ASO를 합성하기 전에 mRNA 2차 구조가 적게 생성되는 영역을 체계적으로 분석하여 생체 외 뿐 아니라 생체 내에서도 유전자-특이적 억제를 효과적으로 달성하기 위해 노력해왔다. 이러한 ASO는 RNA의 종류인 siRNA 보다 매우 안정적이고 물과 생리 식염수 등에 잘 용해되는 장점을 가지고 있으며, 현재 세 개의 ASO가 Federal Drug Administration (FDA)에 승인되었다(Jessica, C., J Postdoc Res, 4:35-50, 2016).
간섭 RNA(RNA interference, 이하 'RNAi'라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Barik, S., J Mol. Med. (2005) 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23개의 이중가닥(base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 'siRNA'라고 한다)로 변환되며, siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다. SiRNA를 이용한 유전자의 발현 억제 기술은 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제시키고 이로 인한 변화를 관찰하는 것으로 표적 세포에서의 표적 유전자의 기능을 규명하는 연구에 유용하게 사용된다, 특히, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 표적 유전자의 기능을 억제하는 것은 해당 질병의 치료 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이며, 생체 외(in vitro)에서의 연구 및 실험동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 연구를 수행한 결과, siRNA에 의한 표적 유전자의 발현 억제가 가능하다고 보고된 바 있다.
베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 의약품(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다.
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다. 체내 안정성 향상 및 siRNA의 비특이적인 세포 면역 반응(innate immune stimulation) 문제 해결을 위하여 siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체를 이용하는 등, 이에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficacy)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안정성(stability)이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization)하고, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되고 있다.
비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 방법이다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다.
또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(J Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스(antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다. 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는것(PEGylation) 만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 표적 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중가닥 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중가닥 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNATM (self assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호), SAMiRNATM 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
SAMiRNATM 기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG(polyethyleneglycol) 또는 HEG(Hexaethylenglycol)가 사용되는데, PEG는 합성 폴리머(synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성(solubility) 증가 및 약물동태학(pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 다분산계(polydisperse) 물질로, 한 배치(batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체(monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스 곡선 형태를 나타내며, 다분산지수(polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량(3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량(20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다. 따라서, PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 쉽지 않다는 단점이 있어 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 확인이 용이하지 않은 불편한 점이 있는 등 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점 들이 존재한다.
이에 따라 최근에는 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNATM 기술의 개량된 형태로, SAMiRNATM를 구성하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 1~15개의 단량체(monomer)와 필요에 따라 링커(linker)를 포함하는 기본단위를 블록(block)화 하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용함으로써, 기존의 SAMiRNATM에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선된 새로운 형태의 전달체 기술이 개발되었다. 또한 체내로 siRNA를 주입하였을 경우, 혈액 내에 존재하는 여러 다양한 효소들에 의해 siRNA가 급속하게 분해되어 표적 세포 또는 조직 등으로 전달 효율이 좋지 않음이 이미 알려져 있듯이 개량된 SAMiRNATM에서도 표적 유전자에 따라 안정성 및 발현 저해율의 편차가 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 개량된 자가조립 나노입자인 SAMiRNATM를 이용하여 표적 유전자를 보다 안정적이고 효과적으로 발현 저해하기 위해 가이드인 센스 가닥은 ASO인 DNA 서열을, 패신저인 안티센스 가닥은 RNA 서열을 이용하여 DNA-RNA hybrid 형태의 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 적용함으로써 표적 유전자에 대한 발현 저해 효과와 안정성을 증진시키고자 하였다.
한편, 비만은 전세계적으로 중요한 건강 문제이며, 심장질환, 제2형 당뇨병, 특정 암 등의 다수의 합병증이 증가 요인이 될 수 있다.
비만의 주된 요인 중 하나는 체내에 내장지방이 과도하게 쌓이기 때문이다[Carr DB, Diabetes. 2004 Aug;53(8):2087-94 ; Bouchard C, Int J Obes Relat Metab Disord 1996;20:420-7]. 내장지방은 체내장기를 둘러싸고 있는 지방을 말하는 것으로, 내장지방은 주로 유전적요인[Rosenberg B, Panminerva Med 2005; 47:229-44], 인종, 물리적 활동, 생활습관 및 염증인자[Deurenberg P, Int J Obes Relat Metab Disord 1998;22:1164-71] 등으로 인하여 발생한다. 또한 인종에 따라 아시아인의 경우 내장지방의 축적 정도가 심하며[WHO Expert Consultation. Lancet 2004;363:157-63; Hu FB, N Engl J Med 2001;345:790-7], 과식 또는 음주, 신체활동이 적으며[Wannamethee SG, Am J Clin Nutr 2003; 77:1312-7; Komiya H, Tohoku J Exp Med 2006;208:123-32], 흡연을 할수록 내장지방을 더 증가시킨다고 알려져 있다[Upadhyaya S, Adipocyte, 2014; 3(1): 39-45]. 이러한 내장지방이 축적이 되면 내장지방세포에서 분비되는 인터루킨-6 과 종양괴사인자-알파 및 단핵구 화학유인 물질 단백질-1 등과 염증반응물질들이 증가하여 다양한 합병증의 원인이 된다.[ Despres JP. Ann Med 2001;33:534-41].
내장지방은 대사이상과 심혈관질환을 일으킨다[Matsuzawa Y, Obes Res 1995;3 Suppl 5:645-7]. 내장지방이 많이 축적될수록 인슐린저항성이 높아지며, 또한 피하지방보다 많은 경우, 심장 기능에 대한 부분이 감소하고 고혈압 및 순환계 질환이 발생한다 [Schaffler , Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 005;2:273-80]. 또한 내장지방은 소화기 관련 질환을 일으키는데, 지방간 및 비알콜성지방간염의 요인으로 알려져 있다[Busetto L, Diabetes Obes Metab 2005;7:301-6]. 이러한 요인은 아디포넥틴은 낮아지면서 항염증 기작이 감소하고 간에 지방간 형성이 촉진되어 비알콜성 지방간이 발생하게 된다. 또한 호흡기관련 질환에서도 내장지방은 많은 문제들을 야기한다[Schapira DV, Cancer 1994;74:632-9]. 피하지방보다 내장지방이 많을수록 호기예비량이 낮아 제한성폐환기장애가 발생한다고 볼 수 있다. 또한 내장지방은 유방암 발생 비율을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 전립선암[Hsing AW, J Natl Cancer Inst 2001;93:783-9] 및 대장암[Manson JE, N Engl J Med 1995;333:677-85] 발생 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
내장지방의 치료는 다이어트 제한, 신체 운동 및 약물적 치료가 주로 이루어지지만, 그 효과는 아직까지는 제한적인 상황이다[Diamantis T, Surg Obes Relat Dis, 2014; 10(1): 177-83 ; Kelley GA, J Obes, 2013; 2013783103 ; Rhines SD, S D Med, 2013; 66(11): 471, 73 ; Sharma M, Adolesc Health Med Ther, 2010; 19-19]. 따라서 내장지방을 감소하면 심혈관질환, 대사질환, 당뇨병 및 기타질환 발생을 감소시켜 합병증을 예방할 수 있으며, 삶의 질을 개선시킬 수 있다.
이에 본 발명자들은 내장지방의 감소를 통한 비만 치료에 대한 연구를 진행하던 중, 엠피레귤린을 특이적으로 저해하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체를 이용하는 경우, 당뇨병 동물모델에서 피하지방을 포함한 내장지방을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
이와 더불어, 본 발명자들은, 고지방 식이 유도에 의한 비만동물 모델에서 부고환 지방에서의 엠피레귤린 발현량이 현저히 증가됨을 확인하고, 해당 비만동물 모델에서 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체를 이용하여 엠피레귤린 발현량을 감소시키는 경우, 체중, 피하지방, 내장지방의 무게를 현저히 감소시키고, 지방조직의 세포 크기 증가를 억제시킬 수 있으며, 지방조직에서 엠피레귤린 발현량을 감소시키고, 간에서의 지방축적을 억제시키는 효능이 발휘됨을 확인함으로써, 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 구조체의 항비만 용도에 대한 본 발명을 완성하였다.
미국특허 제5,034,323호; 미국특허 제5,231,020호; 미국특허 제5,283,184호 대한민국 등록특허 제883471호 대한민국 등록 특허 제1224828호
Jessica, C., J Postdoc Res, 4:35-50, 2016 Barik, S. J Mol. Med. (2005) 83: 764-773 MA Behlke, MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670) FY Xie, Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73 Akhtar S, J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632 J Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004 SH Kim, J Control Release 129(2):107-16, 2008 Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458 Goodpaster BH, Arch Intern Med, 2005; 165(7): 777-83 Blumentals WA, Med Sci Monit 2013; 19: 359-65 Oliveira Junior SA, Med Sci Monit. 2010; 16(12): BR367-73 Despres JP. Ann Med 2006;38:52-63. Carr DB, Diabetes. 2004 Aug;53(8):2087-94. Bouchard C, Int J Obes Relat Metab Disord 1996;20:420-7. Rosenberg B, Panminerva Med 2005; 47:229-44. Deurenberg P, Int J Obes Relat Metab Disord 1998;22:1164-71. WHO Expert Consultation. Lancet 2004;363:157-63. Hu FB, N Engl J Med 2001;345:790-7. Wannamethee SG, Am J Clin Nutr 2003; 77:1312-7. Komiya H, Tohoku J Exp Med 2006;208:123-32. Upadhyaya S, Adipocyte, 2014; 3(1): 39-45 Despres JP. Ann Med 2001;33:534-41. Matsuzawa Y, Obes Res 1995;3 Suppl 5:645-7. Schaffler , at lin ract astroenterol epatol 005;2:273-80. Busetto L, Diabetes Obes Metab 2005;7:301-6. Schapira DV, Cancer 1994;74:632-9. Hsing AW, J Natl Cancer Inst 2001;93:783-9. Manson JE, N Engl J Med 1995;333:677-85. Diamantis T, Surg Obes Relat Dis, 2014; 10(1): 177-83 Kelley GA, J Obes, 2013; 2013783103 Rhines SD, S D Med, 2013; 66(11): 471, 73 Sharma M, Adolesc Health Med Ther, 2010; 19-19
본 발명의 목적은 신규한 비만 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00001
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 약학 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형을 제공한다.
본 발명은 또한, 비만의 예방 또는 치료가 필요한 객체에 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00002
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 비만의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 비만의 예방 또는 치료방법에 사용하기 위한 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00003
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 비만의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00004
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 피하지방을 비롯하여 특히 내장지방의 감소 효과가 탁월한 바, 내장지방으로 인한 합병증이 문제되는 심혈관질환, 대사질환, 당뇨병 및 기타 다양한 질환의 치료 및 예방 단계에서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 인간 엠피레귤린을 타겟으로 하는 1,257개의 SAMiRNA 스크리닝의 결과를 나타낸다.
도 2는 선별된 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid의 나노입자 크기 분포를 나타낸다. (a) SAMi- AREG#10 (b) SAMi-AREG#11 (c) SAMi-AREG#12
도 3은 실시예 4의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 1 내지 14의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 또는 600 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 5의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리 하여(12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 600 nM 또는 1200 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고, (a) 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 (b) SAMiRNA의 IC50값을 확인한 그래프이다.
도 5는 실시예 5의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 11의 서열을 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 600 nM 또는 1200 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고, (a) 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 (b) SAMiRNA의 IC50값을 확인한 그래프이다.
도 6은 실시예 5의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 12의 서열을 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 600 nM 또는 1200 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고, (a) 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 (b) SAMiRNA의 IC50값을 확인한 그래프이다.
도 7은 실시예 6의 엠피레귤린 후보 서열에 대한 내재 면역 반응 실험(Innate immune response test) 분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 10(AR-1), 11(AR-2), 12(AR-3)를 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 SAMiRNA 2.5 μ M를 각각 인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 처리하고, 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA에 의한 내재 면역 관련 사이토카인의 mRNA의 상대적인 증가량을 분석하여, 인간 말초혈액 단핵세포를 이용한 in vitro 세포독성을 평가한 그래프이다. (a) DNA/RNA hybrid SAMiRNA (b) RNA/RNA hybrid SAMiRNA
도 8은 실시예 7의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 선별된 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid에 의한 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교한 분석 결과이다. 본 발명의 서열번호 10(AR-1), 11(AR-2), 12(AR-3)의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 nM, 600 nM 또는 1200 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고, 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스 엠피레귤린을 타겟으로 하는 237개의 SAMiRNA 스크리닝의 결과 및 그 중 선별된 9개 후보 서열의 효과를 나타낸다.
도 10A는 실시예 8의 마우스 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 19, 20, 21의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 또는 500 nM) Mouse lung fibroblast 세포주인 MLg에 처리하고, 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10B는 실시예 8의 마우스 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 19, 20, 21의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200, 500 또는 1000 nM) Mouse Lung epithelial 세포주인 LA-4에 처리하고, 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 사료 섭취량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 음수 섭취량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방비율 (subcutaneous fat ratio)을 나타낸 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 내장지방비율 (visceral fat ratio)을 나타낸 결과이다.
도 16은 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 본 발명에 따른 구조체의 내장지방 감소 효과를 보여주는 사진이다.
도 17은 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 희생 전 8주차 전혈에서 공복혈당 수치를 나타낸 결과이다.
도 18은 본 발명에 따른 마우스 동물모델 실험에서 대조군과 실험군의 희생 전 8주차 혈청에서 글루코오스 수치를 나타낸 결과이다.
도 19은 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 고지방사료 12주 급이 후 대조군과 실험군을 희생시켜 부고환지방에서의 엠피레귤린 발현량을 확인한 그래프이다.
도 20은 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21a는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 사료 섭취량 평균을 나타낸 그래프이다.
도 21b는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 음수 섭취량 평균을 나타낸 그래프이다.
도 22은 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 식이효율(Food efficiency ratio(%))을 나타낸 그래프이다.
도 23a는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방(subcutaneous fat pad, SFP), 부고환지방(epididymal fat pad, EFP), 신장주변지방(Perirenal fat pad, PFP), 장간막지방(mesenteric fat pad, MFP) 무게를 나타낸 결과이다.
도 23b는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방(subcutaneous fat pad, SFP), 부고환지방(epididymal fat pad, EFP), 신장주변지방(Perirenal fat pad, PFP), 장간막지방(mesenteric fat pad, MFP) 무게를 체중으로 나눈 ratio(%)를 나타낸 결과이다.
도 24a는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방무게(subcutaneous fat weight) 및 내장지방무게(visceral fat weight)을 나타낸 결과이다.
도 24b는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군에서 마우스 전체 무게 대비 각각 피하지방비율 (subcutaneous fat ratio) 및 내장지방비율 (visceral fat ratio)을 나타낸 결과이다.
도 25는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방 및 내장지방의 감소 효과를 비교한 Micro-CT 사진과 부피로 나타낸 그래프이다.
도 26는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방(subcutaneous fat pad, SFP), 부고환지방(epididymal fat pad, EFP), 신장주변지방(perirenal fat pad, PFP), 장간막지방(mesenteric fat pad, MFP) 감소 효과를 비교한 조직 사진과 지방 세포 크기를 나타낸 그래프이다.
도 27a는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 간 조직에서 지방축적의 감소 효과를 비교한 사진이다.
도 27b는 본 발명에 따른 고지방 식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 간 조직에서 지방축적의 감소 효과를 비교한 정량 그래프이다.
도 28는 본 발명에 따른 고지방식이 비만 마우스 모델 실험에서 대조군과 실험군의 피하지방(subcutaneous fat pad, SFP), 부고환지방(epididymal fat pad, EFP), 신장주변지방(perirenal fat pad, PFP)에서 엠피레귤린의 mRNA level 감소 효과를 비교한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 제2형 당뇨 동물모델을 이용하여 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 투여하는 경우, 피하지방과 내장지방이 현저히 감소되는 효과를 확인하여, 해당 물질을 비만의 치료 또는 예방용 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서는 비만 유도 동물모델에 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 투여하는 경우, 체중 감소, 식이 효율 감소, 피하지방 감소, 내장지방 감소, 지방세포 면적 감소, 간지방 생성 억제 효과가 발휘됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (i) 서열번호 1 내지 14로 구성된 군, 바람직하게는 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00005
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제공되는 바람직한 이중가닥 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열번호 10, 11 및 12의 서열은 다음과 같다
5'-CACCTACTCTGGGAAGCGT-3' (서열번호 10)
5'-ACCTACTCTGGGAAGCGTG-3' (서열번호 11)
5'-CTGGGAAGCGTGAACCATT-3' (서열번호 12)
본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념으로, 상기 엠피레귤린 단백질을 인코딩하는 mRNA 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드에는 엠피레귤린 특이적 shRNA 등도 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다. 즉, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 엠피레귤린에 대한 특이성이 유지되는 한, 상기 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥에서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 또는 삽입된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 엠피레귤린 특이적 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한 센스 가닥은 DNA, 안티센스 가닥은 RNA이거나, 센스 가닥은 RNA, 안티센스 가닥은 DNA인 하이브리드(hybrid) 형태가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 10, 11 및 12는 DNA 형태로 기재되어 있지만, RNA 형태가 사용될 경우, 서열번호 10, 11 및 12의 서열은 이와 대응되는 RNA 서열, 즉 T가 U로 변경된 서열이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 엠피레귤린에 대한 특이성이 유지되는 한, 서열의 센스 가닥이 엠피레귤린 유전자의 결합부위와 100% 상보적인 염기서열인 경우, 즉 완전 일치(perfect match)하는 것뿐만 아니라, 일부 염기서열이 일치하지 않는 경우, 즉 불완전 일치(mismatch)가 있는 것도 포함한다.
본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 양쪽 가닥의 3' 말단에 하나 또는 그 이상의 비결합된(unpaired) 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 바람직하게는 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 엠피레귤린(amphiregulin)에 특이적인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 생체 내 안정성 향상을 위해, 또는 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위해, 다양한 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(-OH)가 메틸기(-CH3), 메톡시기(-OCH3), 아민기(-NH2), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; DNA-RNA hybrid 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5):1823-1832, 2011), 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(Phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3개의 인산기가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 관한 것으로, 하기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
하나의 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 것이 바람직하다.
A-X-R-Y-B 구조식 (1)
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 형태로는 DNA-RNA hybrid, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(microRNA) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, miRNA에 대한 길항제(antagonist) 역할을 할 수 있는 단일가닥의 miRNA 저해제도 포함되는 것이다.
이하, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA를 중심으로 설명되나, 본 발명의 이중가닥 올리고뉴클레오티드와 동일한 특성을 가지는 다른 이중가닥 올리고뉴클레오티드에도 적용될 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 가진다.
A-X-S-Y-B
AS 구조식 (2)
상기 구조식 (2)에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 엠피레귤린 특이적 뉴클레오티드 서열의 센스 가닥, AS는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 의미한다.
보다 바람직하게는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 (4)의 구조를 가진다.
Figure pat00006
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 A, B, S, AS, X 및 Y는 상기 구조 식 (2)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 엠피레귤린 특이적 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다.
상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 상기 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 안티센스 가닥의 5´말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으며, RNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000인 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 (5) 또는 구조식(6)에서의 n)를 사용함으로써 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인한 문제점을 크게 개선할 수 있다.
(A'm-J)n 구조식 (5)
(J-A' m)n 구조식 (6)
상기 구조식 (5)에서 A'은 친수성 물질 단량체(monomer), J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오티드를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정 수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A'm-J) 또는 (J-A'm)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.
상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 친수성 물질 블록을 가질 경우, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)과 같은 구조를 가질 수 있다.
(A'm-J)n-X-R-Y-B 구조식 (7)
(J-A'm) n-X-R-Y-B 구조식 (8)
상기 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서, X, R, Y 및 B는 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, A', J. m 및 n은 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 정의와 동일하다.
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 친수성 물질 단량체(A')는 비이온성 친 수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (7) 또는 구조식 (8)에 따른 구조체 내에 포함된 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
본 발명에서의 친수성 물질 단량체 구조
화합물 (1) 화합물 (2) 화합물 (3)
Figure pat00007
G는 O, S 또는 NH
Figure pat00008
Figure pat00009
상기 구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol), 즉 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다. 특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 (A'm-J)n으로 또는 (J-A' m)n 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A와 링커인 J은 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록 별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 -PO3 --, - SO3- 및 -CO2-로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음 은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8) 에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50 의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발 명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발 명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합 시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C24 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 형태가 가장 바람직하다.
상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조 식 (8)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 제조과정에서 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유 결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 구조식(1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 엠피레귤린의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 이중가닥 올리고뉴클레오티드라면 모두 제한없이 사용 가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 10, 11 및 12번에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 있어서, 상기 구조체 내의 친수성 물질의 올리고뉴클레오티드와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입될 수 있다.
이는 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위한 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용할 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.
구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),
비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용될 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).
상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 물질 블록과 연결될 수 있다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (9)와 같은 구조를 가질 수 있다.
P-J1-J2-A-X-R-Y-B 구조식 (9)
상기 구조식 (9)에서 A, B, R, X 는 Y 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고,
P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며, J1과 J2는 링커로서, J1은 및 J2는 독립적으로 단순 공유결합, PO3 -, SO3, CO 2, C2-12 알킬, 알케닐, 알키닐에서 선택 될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J1과 J2는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
바람직하게는 아민기가 도입된 경우 에는, J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (9)에서는 J2 는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 화합물 (4)가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
Figure pat00010
화합물 (4)
또한, 구조식 (9)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질이 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록이고, 이에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (10) 또는 구조식 (11)과 같은 구조를 가질 수 있다.
P-J1-J2- (A'm-J)n -X-R-Y-B 구조식 (10)
P-J1-J2- (J-A'm)n -X-R-Y-B 구조식 (11)
상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에서, X, R, Y, B, A', J, m 및 n은 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 정의와 동일하며, P, J1 및 J2는 구조식 (9)에서의 정의와 동일하다.
특히, 상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에 있어서, 친수성 물질은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 3' 말단에 결합된 형태인 것이 바람직하며, 이 경우 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)은 다음 구조식 (12) 내지 구조식 (14)의 형태를 가질 수 있다.
Figure pat00011
구조식 (12)
Figure pat00012
구조식 (13)
Figure pat00013
구조식 (14)
상기 구조식 (12) 내지 구조식 (14)에서 X, R, Y, B, A, A' J, m, n. P, J1 및 J2는 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다.
본 발명에서 도입될 수 있는 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민 염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH3 + 의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도입될 수 있는 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비특이적인 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 전달을 방지할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 구조체에 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 이중가닥 올리고 RNA, 구조체를 제공하며, 예를 들어 구조식 (1)에 따른 이중가닥 올리고 RNA 구조체에 리간드가 결합된 형태는 하기 구조식 (15)과 같은 구조를 가진다.
(Li -Z)-A-X-R-Y-B 구조식 (15)
상기 구조식 (15)에서, A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드를 의미하며, i는 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
상기 구조식 (15)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟 세포 특이적으로 세포 내재화 (internalization)을 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산(Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (15)에서의 친수성 물질 A는 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 과정은 예를 들어,
(1) 고형지지체(solid support)를 기반으로 친수성 물질을 결합시키는 단계;
(2) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(4) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일 가닥을 분리 정제하는 단계 ;
(6) 제조된 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링을 통해 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 단계;를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서의 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등이 사용될 수 있다. CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500~3000Å의 공극 크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료되면 정제된 RNA-고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일가닥은 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일가닥이 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (5) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또한, (2) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥과 상보적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단일가닥은 5´말단에 인산기가 결합된 형태로 이용된 것을 특징으로 하는 제조방법도 될 수 있다.
한편, 본 발명의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 추가적으로 리간드가 결합된 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 제조방법을 제공한다.
리간드가 결합된 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하 는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 방법은 예를 들어,
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합시키는 단계;
(2) 기능기-친수성 물질이 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계;
(4) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올 리고뉴클레오티드 단일 가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 기능기- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 분리하는 단계;
(6) 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합하여 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 단일가닥을 제조하는 단계;
(7) 제조된 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링의 통해 리간드 -이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (6) 단계 이후, 제조가 완료되면 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 제조된 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링을 통해 리간드- 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 독립적인 합성과정으로서 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (6) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 경우, 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되는데 (대한민국 등록특허공보 제1224828호), 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐만 아니라, 입자 크기의 균일성이 우수하여 QC(Quality Control)가 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다.
본 발명에서, 상기 나노입자는 서로 다른 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 나노입자는 서열번호 10 내지 12 에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 한 종류의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 또 다른 양태로서, 서열번호 10 내지 12에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 서로 다른 종류의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 함께 포함할 수 있으며, 본 발명에서 개시되지 않은 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 함께 포함할 수도 있을 것이다.
본 발명의 조성물에는 투여를 위하여 상기 기재된 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희 석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기 술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다- 투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비 경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 흡입용, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 약학조성물을 포함하는 동결건조 된 형태의 제형에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 비만의 예방 또는 치료가 필요한 객체에 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00014
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 비만의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 비만의 예방 또는 치료방법에 사용하기 위한 (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00015
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
(ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]
Figure pat00016
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
(iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 비만의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 비만은 당뇨로 인한 내장지방형 비만인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 다음 중 어느 하나 이상의 효과를 발휘하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다:
(i) 체중 감소,
(ii) 식이 효율 감소,
(iii) 피하지방 감소,
(iv) 내장지방 감소,
(v) 지방세포 면적 감소 및
(vi) 간지방 생성 억제.
본 발명에 있어서, 상기 효과는 지방 조직 내 엠피레귤린 발현을 억제하여 발휘되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 상기 효과가 발휘되는 기전이 이에 한정되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명에서는 엠피레귤린의 발현을 저해할 수 있는 세 개의 특이적인 서열을 동정하고 이들이 엠피레귤린을 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합하여 엠피레귤린의 발현을 효과적으로 억제함으로써, 비만 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 1. 엠피레귤린을 타겟으로 하는 SAMiRNA 스크리닝을 위한 알고리즘과 후보 서열 선정
SAMiRNA 기초 치료제 고속대량스크리닝(SAMiRNA based drug high-throughput screening)은 mRNA 전체에 대해 1-염기(1-base) 또는 2-염기(2-base) 슬라이딩 윈도우 알고리즘(sliding window algorithm)을 적용하여 가능한 모든 후보 서열을 생성하고 상동성 필터링(homology filtering)을 진행하여 불필요한 후보 서열을 제거하고 최종적으로 선별된 모든 SAMiRNA에 대해 해당 유전자 발현 저해 정도를 확인하는 방법이다.
우선 엠피레귤린에 대한 SAMiRNA 후보 서열에 대한 디자인 과정은 인간 엠피레귤린 mRNA인 NM_001657.3 (1290bp)에 대해 1-염기 슬라이딩 윈도우 알고리즘(2- base sliding window algorithm)을 적용하여 19개의 염기로 구성된 1,257개의 SAMiRNA 후보 서열을 최종 선별하여 엠피레귤린 저해 정도 실험을 수행하였다.
실시예 2. 이중가닥 올리고 RNA 구조체의 합성
본 발명에서 제조된 이중가닥 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA)는 하기 구조식과 같은 구조를 갖는다.
C 24-5' S 3'- (헥사에틸렌글리콜-PO4 -)3-헥사에틸렌글리콜
AS 5'-PO4
monoSAMiRNA(n=4) 이중가닥 올리고 구조체의 센스 가닥은 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (3,4,6-triacetyl-1-Hexa(Ethylene Glycol)- N-Acetyl Galactosamine-CPG)를 지지체로 하여, 친수성 물질 단량체인 DMT 헥사에틸렌글리콜 포스포아미다이트(Demethoxytrityl hexaethylene glycol phosphoramidate) 3개를 상기 반응을 통해 연속하여 결합한 후, RNA 또는 DNA 합성을 진행한 다음, 추가적으로 5' 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 C24 (C6-S-S-C18) 을 결합시켜, 3' 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜-(-PO3 - 헥사에틸렌글리콜)3이 결합되어 있고, 5' 말단에 C24 (C6-S-S-C18) 이 결합되어 있는 monoSAMiRNA(n=4)의 센스 가닥을 만들었다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥 및 올리고(DNA 또는 RNA) -고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 올리고(DNA 또는 RNA)- 고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolid on), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2´를 제거하였다. 상기 반응물들로부터 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 RNA 단일 가닥, 올리고(DNA 또는 RNA)-고분자 구조체 및 리간드가 결합된 올리고(DNA 또는 RNA) -고분자 구조체를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 올리고-고분자 구조체와 부합하는지 확인하였다. 그 후, 각 각의 이중가닥 올리고 구조체를 제조하기 위하여 센스 가닥과 안티센스 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼에 넣고, 90℃항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 SAMiRNA를 제조하였다. 제조된 이중가닥 올리고 RNA 구조체들은 전기영동을 통해 어닐링을 확인하였다.
실시예 3. 인간(Human) 엠피레귤린을 타겟으로 하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자의 고속대량스크리닝(HTS)
3.1 SAMiRNA 나노입자의 제조
실시예 2에서 합성된 엠피레귤린 서열을 타겟으로 하는 1,257종의 SAMiRNA를 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)(WELGENE, KR)에 녹여 동결건조기(LGJ-100F, CN)로 5일 동안 동결건조하였다. 동결 건조된 나노입자 파우더를 탈염 증류수(deionized distilled water (Bioneer, KR)) 1.429 ml에 녹여 균질화하여 본 발명을 위한 실험에 사용하였다.
3.2 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법
엠피레귤린의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549(ATCC® CCL-185TM, Manassas, VA, USA)를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US)가 포함된 Gibco™F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 96-웰 플레이트 (Costar, US)에 2X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 500 nM 또는 1000 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
3.3 인간 (Human) 엠피레귤린 mRNA 발현 억제효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝
실시예 3-2에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량하였다.
엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량 분석을 위하여 AccuPower ® Dual-HotStart RT-qPCR 키트(Bioneer, Korea)의 각 well에 AREG forward primer 300 nM, AREG reverse primer 300 nM, AREG probe 300 nM, RPL13A forward primer 300 nM, RPL13A reverse primer 300 nM, RPL13A probe 300 nM, TBP forward primer 400 nM, TBP reverse primer 400 nM, TBP probe 300 nM이 추가되어 건조 제조되었다(표 2, 고속대량스크리닝(HTS) 실험에 사용된 primer 및 hydrolysis probe 서열). 제조된 키트의 성능은 A549 cell total RNA를 이용 검량곡선을 작성하여 PCR 증폭효율 (표 3) 로 판정하였다. RT-qPCR은 95 ℃, 5 min, (95 ℃, 5 sec, 58 ℃, 15 sec) × 45 cycle로 반응을 하고 각 사이클(cycle)마다 형광값이 검출(detection)되는 프로토콜을 사용하였다.
SAMiRNA 처리된 96-웰 플레이트 (Costar, US)는 전체 RNA 추출부터 RT-qPCR까지 자동화 장비인 ExiStation™HTKorea에 HT DNA/RNA 추출 키트(Bioneer, Korea)와 엠피레귤린 분석을 위한 primer 및 probe를 포함하여 별도로 제조된 AccuPower ® Dual-HotStart RT-qPCR 키트(Bioneer, Korea)를 자동화 프로그램에 따라 전체 RNA 추출 및 one-step RT-qPCR이 수행되었다.
qPCR array 후 도출되는 두 유전자의 Ct값을 2(-Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. Dec;25(4):4 02-8]을 통하여 상대정량 분석으로 대조군 대비 실험군인 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양(%)을 계산하였다.
고속대량스크리닝(HTS) 실험에 사용된 primer 및 hydrolysis probe 서열
AREG Forward primer CAGTGCTGATGGATTTGAGGT(서열번호 26)
AREG Reverse primer ATAGCCAGGTATTTGTGGTTCG(서열번호 27)
AREG probe 5'FAM - TGAACCGTCCTCGGGAGCCGACT - 3'EBQ(서열번호 28)
RPL13A Forward primer GTGTTTGACGGCATCCCACC(서열번호 29)
RPL13A Reverse primer TAGGCTTCAGACGCACGACC(서열번호 30)
RPL13A probe 5'TAMRA- AAGCGGATGGTGGTTCCTGCT - 3'EBQ(서열번호 31)
TBP Forward primer CACCACAGCTCTTCCACTC(서열번호 32)
TBP Reverse primer ATCCCAGAACTCTCCGAAGC(서열번호 33)
TBP probe 5'TEXASRED - ACCCTTGCCGGGCACCACTC - 3'EBQ(서열번호 34)
3-plex RT-qPCR 증폭 효율
Slope R2 Efficiency
AREG Y=-0.2778X+12.3894 0.9998 90%
RPL13A Y=-0.2863X+10.5964 0.9999 93%
TBP Y=-0.2892X+13.0351 0.9946 95%
고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 500 nM 또는 1000 nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 1 내지 14의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA 14종을 선별하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 엠피레귤린을 표적으로 하는 1,257종의 SAMiRNA로부터, 엠피레귤린 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 14종을 최종 선별하였으며, 해당 SAMiRNA의 서열 정보는 하기 표 4과 같다.
1-염기 슬라이딩 윈도우 스크리닝(1 base sliding window screening) 및 고속대량스크리닝(HTS)으로 선별된 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA 후보 서열
서열번호 Accession No. 위치 서열 (DNA/RNA)
1 NM_001657.3
 8-26
 Sense CCTATAAAGCGGCAGGTGC
35 Antisense GCACCUGCCGCUUUAUAGG
2 NM_001657.3 130-148 Sense GAGCGGCGCACACTCCCGG
36 Antisense CCGGGAGUGUGCGCCG CUC
3 NM_001657.3
 195-213 Sense GTCCCAGAGACCGAGTTGC
37 Antisense GCAACUCGGUCUCUGG GAC
4 NM_001657.3 224-242 Sense GAGACGCCGCCGCTGCGAA
38 Antisense UUCGCAGCGGCGGCGU CUC
5 NM_001657.3 270-288 Sense CCGGCGCCGGTGGTGCTGT
39 Antisense ACAGCACCACCGGCGC CGG
6 NM_001657.3 278-296 Sense GGTGGTGCTGTCGCTCTTG
40 Antisense CAAGAGCGACAGCACC ACC
7 NM_001657.3 289-307 Sense CGCTCTTGATACTCGGCTC
41 Antisense GAGCCGAGUAUCAAGA GCG
8 NM_001657.3 292-310 Sense TCTTGATACTCGGCTCAGG
42 Antisense CCUGAGCCGAGUAUCA AGA
9 NM_001657.3 329-347 Sense GGACCTCAATGACACCTAC
43 Antisense GUAGGUGUCAUUGAGG UCC
10 NM_001657.3 341-359 Sense CACCTACTCTGGGAAGCGT
44 Antisense ACGCUUCCCAGAGUAG GUG
11 NM_001657.3 342-360 Sense ACCTACTCTGGGAAGCGTG
45 Antisense CACGCUUCCCAGAGUA GGU
12 NM_001657.3 349-367 Sense CTGGGAAGCGTGAACCATT
46 Antisense AAUGGUUCACGCUUCC CAG
13 NM_001657.3 353-371 Sense GAAGCGTGAACCATTTTCT
47 Antisense AGAAAAUGGUUCACGC UUC
14 NM_001657.3 368-386 Sense TTCTGGGGACCACAGTGCT
48 Antisense AGCACUGUGGUCCCCA GAA
실시예 4. 인간(Human) 엠피레귤린을 타겟으로하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자 스크리닝
실시예 3에서 선별된 서열번호 1 내지 14의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 이용하여 폐암세포주인 A549에 처리하고, 상기 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하였다.
4.1 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법
엠피레귤린의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US) 가 포함된 Gibco™F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 12-웰 플레이트 (Costar, US)에 8X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 200 nM 또는 600 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
4.2 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA 발현 억제효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝
실시예 4-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량하였다.
4-2-1 SAMiRNA 처리된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 4-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25 ㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20 (Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 37 ℃에서 30초 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 48℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 12번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
4-2-2 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA의 상대 정량 분석
실시예 4-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 SAMiRNA control sample 대비로 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 4-2-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower® 2X GreenStar™ qPCR MasterMix (BIONEER, 한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 17 및 18 (표 5); 10 pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국)을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30 초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟 유전자의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현 저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA(SAMiCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다.
고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 200 nM 또는 600 nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 10, 11 및 12의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA 3종을 선별하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 엠피레귤린을 표적으로 하는 14종의 SAMiRNA로부터, 엠피레귤린 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 3종을 최종 선별하였으며, 해당 SAMiRNA의 서열 정보는 하기 표 6과 같다.
qPCR용 프라이머 서열 정보
프라이머 서열 서열번호
hGAPDH-F GGTGAAGGTCGGAGTCAACG 15
hGAPDH-R ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 16
hAREG-F ACACCTACTCTGGGAAGCGT 17
hAREG-R GCCAGGTATTTGTGGTTCGT 18
(F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)
엠피레귤린 발현을 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 서열
서열번호 Code Name 위치 센스가닥 서열
10 SAMi-AREG#10 341-359 CACCTACTCTGGGAAGCGT
11 SAMi-AREG#11 342-360 ACCTACTCTGGGAAGCGTG
12 SAMi-AREG#12 349-367 CTGGGAAGCGTGAACCATT
실시예 5. 폐암세포주(A549)에서 선별된 SAMiRNA를 이용한 인간(Human) 엠피레귤린의 발현 억제
실시예 4에서 선별된 서열 번호 10, 11 및 12의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 이용하여 폐암세포주인 A549에 처리하고, 상기 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하여 SAMiRNA의 IC50값을 확인하였다.
5.1 SAMiRNA 나노입자의 제조 및 입도 분석
실시예 2에서 합성된 엠피레귤린 서열을 타겟으로 하는 3종의 SAMiRNA를 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)(WELGENE, KR)에 녹여 동결건조기(LGJ-100F, CN)로 5일 동안 동결건조하였다. 동결 건조된 나노입자 파우더를 탈염 증류수(deionized distilled water (Bioneer, KR)) 2 ml에 녹여 균질화하여 본 발명을 위한 실험에 사용하였다. 제조된 SAMiRNA 나노입자의 입도분석을 위해 Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK)를 이용하여 SAMiRNA의 크기 및 다분산지 수(polydispersity index)를 측정한 결과, 선별된 SAMiRNA에 대한 나노입자의 크기 및 다분산지수는 하기 표 7과 같고, 그래프는 도 2와 같이 측정되었다.
엠피레귤린 특이적 SAMiRNA의 나노입자 크기 및 다분산 지수
Code Name Size PDI
SAMi-AREG#10 103.9±3.8 0.406±0.065
SAMi-AREG#11 99.9±4.0 0.501±0.005
SAMi-AREG#12 170.1±7.5 0.457±0.084
5.2 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법
엠피레귤린의 발현을 억제하는 선별된 SAMiRNA 효과를 확인하기 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin- Streptomycin (Hyclone, US)가 포함된 Gibco™Ham's F-12K (Kaighn 's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 12-웰 플레이트 (Costar, US)에 8X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 5.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 600 nM 또는 1200 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
5.3 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA 발현 억제 효능 분석을 통한 SAMiRNA IC 50 확인
실시예 5-2에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
5-3-1 SAMiRNA 처리된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-2에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20 (Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 37℃에서 30초 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 48 ℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 12번 반복한 뒤, 95 ℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
5-3-2 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
실시예 5-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 SAMiRNA control sample 대비로 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-3-1에 서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower® 2XGreenStar™ qPCR MasterMix (BIONEER, 한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 17 및 18 (표 5); 10 pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국)을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분 간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA(SAMiCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt값과 계산식 2(-ΔCt)× 100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다.
그 결과, 서열번호 10, 11 및 12의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA는 모두 100 nM의 저농도에서도 50% 이상의 엠피레귤린 mRNA 발현양의 감소를 보여 매우 고효율로 엠피레귤린 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 각각의 IC50는 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA의 경우 도 4에 나타난 바와 같이 28.75 nM, 서열번호 11의 서열을 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA의 경우 도 5에 나타난 바와 같이 26.04 nM, 서열번호 12의 서열을 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA의 경우 도 6에 나타난 바와 같이 12.07 nM로 확인되었다. 특히 서열번호 12의 서열을 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA의 경우, 도6에 나타난 바와 같이 25 nM의 저농도에서도 50% 이상의 엠피레귤린 mRNA 발현양의 감소를 보여 선별된 3종의 서열 중 가장 효과적으로 엠피레귤린 유전자 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 6. 인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 이용한 in vitro 세포독성평가
SAMi-hAREG에 의한 내재면역 관련 사이토카인의 mRNA 증가량을 확인하기 위하여 10% FBS(fetal bivine serum; Hyclone ™을 포함하는 RPMI1640 (Hyclone™) 배지에 ePBMC® Cryopreserved Human PBMC (인간 말초혈액 단핵세포, Cellular Technology Limited, USA)를 12-웰 플레이트 (Costar® USA)에 well 당 5X105 cell이 되도록 분주하였다. 세포가 안정화되도록 1시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에 배양한 후, 분주된 PBMC에 SAMi-CON(DNA/RNA), SAMi-hAREG#10(DNA/RNA), SAMi-hAREG#11(DNA/RNA), SAMi-hAREG#12(DNA/RNA), SAMi-CON(RNA/RNA), SAMi-hAREG#10(RNA/RNA), SAMi- hAREG#11(RNA/RNA), SAMi-hAREG#12(RNA/RNA)를 2.5μM이 되도록 각각 처리하여 6시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에 배양하였다. 양성대조군으로 20μg/ml의 Concanavalin A (Sigma Aldrich, USA)를 사용하였다.
그 다음, 모든 세포를 회수하여 RNA 추출 키트 (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Germany)와 RNase-Free DNase Set(Qiagen, Germany)로 제조사 제공 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출하였다.
추출된 RNA 200ng과 Deionized sterile DW(Bioneer, Korea), 그리고 RNA 역 전사 효소(AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 혼합하여, 이를 유전자 증폭기(MyGenie™96-Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)을 이용하여 (37℃ 30 sec, 48℃ 4min, 55℃ 30 sec) x 12 cycle, 95℃ 5 min 과 같은 조건으로 반응하여 총 20 μl cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA는 RPL13A, I L1B, IL6, IFNG, TNF, IL12B 유전자에 대한 qPCR 프라이머와 혼합한 후 Exicycler™ Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)을 이용하여 95℃ 5min, (95℃ 55 sec, 58℃ 15sec) x 45 cycle 조건으로 증폭하였다.
qPCR array 후 도출되는 두 유전자의 Ct값을 2(-Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. Dec;25(4):402-8]을 통하여 상대정량 분석으로 대조군 대비 실험군의 mRNA의 상대적인 양(%)을 계산하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 인간 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, human PBMC)에서 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA #10, SAMiRNA #11 및 SAMiRNA #12에 의한 내재면역 관련 사이토카인이 발현되지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 선별된 서열번호 10, 11 및 12의 서열을 센스 가닥으로 포함하는 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid SAMiRNA에 의한 인간(Human) 엠피레귤린의 발현 억제 비교 분석
실시예 4에서 선별된 서열번호 10, 11 및 12의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid를 이용하여 폐암세포주인 A 549에 처리하고, 상기 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교 분석하였다.
7.1 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법
엠피레귤린의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US)가 포함된 Gibco™ Ham's F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 12-웰 플레이트 (Costar, US)에 8X104 cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 200 nM, 600 nM 또는 1200 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
7.2 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA 발현억제 효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝
실시예 7-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량하였다.
7-2-1 SAMiRNA 처리된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 7-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25 ㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower®RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20 (Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 37℃에서 30초 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 48℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 12번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
7-2-2 인간(Human) 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
실시예 7-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 SAMiRNA control sample 대비로 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 7-2-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower® 2X GreenStar™qPCR MasterMix (BIONEER, 한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 17 및 18 (표 5); 10 pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 3 ㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국)을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분 간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA(SAMiCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대 정량하였다.
이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid 중 고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 200 nM, 600 nM, 1200 nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 12의 서열을 센스 가닥으로 가지는 DNA/RNA hybrid인 SAMiRNA (90% 이상의 유전자 발현을 억제)를 최종 선별하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 선별된 3종의 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid로부터, 엠피레귤린 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 DNA/RNA hybrid SAMiRNA 12를 최종 선별하였다.
실시예 8. 쥐(Mouse) 엠피레귤린을 타겟으로 하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자의 고속대량스크리닝(HTS)
siRNA 치료제의 경우 서로 다른 종(Strain)에 공통 적용 가능한 최적 서열 발굴이 힘들다. 이 경우 치료 효과를 분석하는 동물 모델 (in vivo efficacy test 확인) 특이적인 siRNA 서열 (surrogate sequence; mouse gene-specific siRNA)를 디자인해서 해당 유전자의 발현 저해에 따른 약제학적 효능(pharmacologically active) 및 해당 유전자 발현저해에 따른 독성부분을 검증하도록 미 FDA 가이드라인이 존재한다 (presentation by Robert T. Dorsam Ph.D. Pharmacology/Toxicology Reviewer, FDA/CDER).
기존 알고리즘 기반 siRNA 디자인 프로그램 (자사 보유한 Turbo-si- designer)을 통해 기존 발굴한 스크리닝을 보완하여, SAMiRNA 기반 서열 발굴 고속 대량 스크리닝 (SAMiRNA based siRNA sequence high-throughput screening)을 진행하였다. 타겟 유전자 전체를 대상으로 19mer 길이의 siRNA를 1 base sliding window scanning하여(상기 인간 엠피레귤린 타겟 스크리닝과 동일한 방법) 가능한 마우스 엠피레귤린 유전자 (NM_009704.4) full transcript 서열을 대상으로 총 1190개의 후보 siRNA 서열을 생성하고, 상동성 필터링(blast sequence homology filtering)을 진행하여 불필요한 다른 유전자 발현에 영향을 주는 후보 서열을 제거하여 최종적으로 선별된 237종의 SAMiRNA를 합성 후 마우스 유래 NIH3T3 세포주에 10% FBS가 존재하는 세포 배양 조건에서 1uM 농도로 처리하여 in vitro 발현 저해 효과를 표 8(qPCR용 프라이머 서열 정보)의 프라이머를 이용하여 1차 스크리닝하였다. (도 9)
이후 추가 스크리닝을 통해 상기 NIH3T3 세포주에서 선별된 2종 서열 (서열 번호 19, 20) 및 선행 마일스톤 연구를 통해 발굴한 서열번호 21의 마우스 SAMiRNA-엠피레귤린에 대해 Mouse lung fibroblast 세포주인 MLg cell line(ATCC® CCL-206TM, Manassas, VA, USA)에서 10% FBS가 존재하는 세포 배양 조건에서 200nM 및 500nM 처리 농도로 처리하여 추가 스크리닝을 수행한 결과 서열번호 20이 가장 우수한 발현 저해 효과를 확인하였다. (도 10a)
추가로 마우스 Lung epithelial cell line인 LA-4 세포주(ATCC® CCL-196TM, Manassas, VA, USA)에 선별된 2종 서열 (서열번호 19, 20) 및 선행 마일스톤 연구를 통해 발굴한 서열번호 21의 마우스 SAMiRNA-엠피레귤린을 10% FBS가 존재하는 세포 배양 조건에서 200nM, 500nM 및 1000nM 처리 농도로 처리하여 추가 발현저해 효과를 확인한 결과 서열번호 20이 가장 우수한 발현 저해 효과를 재확인하였다. (도 10b)
도 10에 나타난 바와 같이, 마우스 엠피레귤린을 표적으로 하는 237종의 SAMiRNA로부터, 엠피레귤린 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 2종을 최종 선별하였으며, 해당 SAMiRNA의 서열정보는 하기 표 9와 같다.
qPCR용 프라이머 서열 정보
프라이머 서열
mGAPDH-F AGGTCGGTGTGAACGGA TTTG(서열번호 22)
mGAPDH-R TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(서열번호 23)
mAREG-F GAGGCTTCGACAAGAAAACG(서열번호 24)
mAREG-R ACCAATGTCATTTCCGGTGT(서열번호 25)
(F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)
마우스 엠피레귤린 발현을 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 서열
서열번호 Code Name 위치 센스가닥 서열
19 SAMi-mAREG#19 936-954 AACGGGACTGTGCATGCCA
20 SAMi-mAREG#20 937-955 ACGGGACTGTGCATGCCAT
21 SAMi-mAREG#21 1071-1089 CAGTTGTCACTTTTTATGA
실시예 9. 제2형 당뇨 모델을 이용한 비만 억제 효과 확인
엠피레귤린 발현 억제제의 비만 억제 효과를 확인하고자, 엠피레귤린 발현 억제제로 하기 서열로 표시되는 센스가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 SAMiRNA-AREG (SAMi-mAREG#20)을 제2형 당뇨 모델에 투여하여 지방 감소에 대한 효과를 관찰하였다. 8주 동안 약물을 주 3회 투여 후 마우스를 희생한 후 다양한 지표를 관찰하였다.
9-1. 동물실험 방법
BKS.Cg- m +/+ Lepr db /(KRIBB; 한국생명공학연구원) 5주령 마우스를 분양 받아 실험을 진행하였다. 비만 당뇨군 (db/db 마우스)를 분양 후 3주 순화 후 8주 동안 설치류 식이(Rodent diet, 2918C, Harlan, USA) 를 유도하여 아래 실험 조건 대로 실험을 진행하였다. 비교를 위해서 비만이 아닌 정상 대조군 (C57BL/6 마우스) 5주령 마우스를 나라바이오텍에서 구매하여 실험을 진행하였으며, 이 역시 3주간 순화를 시키고 8주 동안 설치류 식이를 유도하였다. 모든 그룹은 각 6마리씩 분류하여 실험을 진행하였다.
정상 대조군 그룹에는 PBS(C-9011, Bioneer, Korea) 100 ul를, 비만 당뇨군은 3그룹으로 나누어 각각 PBS 100 ul, SAMiRNA-Cont 5mg/kg 100 ul, SAMiRNA-AREG 5mg/kg 100 ul씩 주 3회 피하 주사 방식으로 투여하였다. 사육환경 온도는 21± 2℃, 습도 55± 5%, 15~17/시간, 조도 150~300 Lux, 12시간 주기(점등: 06:00, 소등: 18:00)로 실험 기간동안 일정한 상태로 유지하였다. 8주 동안 약물을 투약 후 16시간 동안 절식하고 희생시켰다.
9-2. 체중, 사료 및 음수 섭취량 측정
체중, 사료 및 음수 섭취량은 매 측정 시마다 일정 시간에 측정하였고, 2회/주 측정하였다.
9-2-1. 체중 변화
마우스의 체중(g)은 주 2회 일정 시간마다 측정하였다. 정상 대조군은 시간이 지날수록 서서히 체중이 증가하는 경향을 보였으며, 마우스 희생 시 무게는 32.5±1.64 이었다. 비만 당뇨군 3 그룹은 PBS 투여시 평균 28.9±2.35, SAMiRNA-Cont 투여시 평균 27.4±3.93, SAMiRNA-AREG 투여시 평균 29.7±4.12의 체중을 나타내었다 (도 11). 8주에서 체중을 관찰하였을 때 각 그룹간 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나, 정상 대조군 마우스와 비교하였을 때, 비만 당뇨군 마우스 모든 그룹에서 미세하게 체중 감소 경향을 나타내었고, 비만 당뇨군 마우스 각 그룹 간 체중에서 통계적으로 유의미한 차이는 확인되지 않았다.
9-2-2. 사료 및 음수 섭취량 변화
마우스 사료섭취량 측정 결과, 정상 대조군은 1일 평균 사료섭취량이 약 4g 이었으며, 비만 당뇨군의 모든 그룹에서는 약 8g의 사료를 섭취하여 비만 당뇨군 마우스에서 사료 섭취량이 2배 이상 증가하는 것으로 확인되었다 (도 12). 음수 섭취량도 정상 대조군 마우스에서 약 5mL/day인데 비해, 비만 당뇨군 마우스에서는 20-35 mL/day로 섭취량이 현저히 높게 나타났다 (도 13).
9-3. 지방 무게 변화
지방의 무게 측정을 위해서 희생된 마우스에서 피하지방과 내장지방을 적출하여 그 무게를 측정하였으며, 마우스 무게 대비 지방의 비율을 평가하였다.
피하지방의 경우, 정상 대조군 마우스에서는 1.56±0.36, 비만 당뇨군 마우스에서 PBS 투여군은 4.32±0.73, SAMiRNA-Cont 투여군은 3.63±1.80, SAMiRNA-AREG 투여군은 3.15±0.58를 나타내었다. 이로써, 비만 당뇨군 마우스에서 본 발명에 따른 엠피레귤린 발현량 감소로 피하지방의 무게가 유의미하게 감소하는 효과를 확인할 수 있었다 (도 14).
내장지방의 경우, 정상 대조군 마우스에서는 1.28±0.31, 비만 당뇨군 마우스에서 PBS 투여군은 1.97±0.25, SAMiRNA-Cont 투여군은 1.59±0.38, SAMiRNA-AREG 투여군은 0.76±0.12을 나타내어, 특히 비만 당뇨군 마우스에서 본 발명에 따른 엠피레귤린 발현량 감소로 내장지방의 무게가 현저하게 감소하는 효과를 확인할 수 있었다 (도 15, 도 16).
9-4. 공복혈당 측정 및 혈청 내 글루코오스 수치 측정
공복혈당 측정(mg/dL)은 마우스 희생 1주 전에 간이 혈당기(Accu-ChekTM Active, Roche, Germany)를 통해 측정하였고, 케이피엔티 회사에 의뢰하여 혈청 내 글루코오스 수치를 측정하였다.
혈액 내 혈당의 경우, 정상 대조군 마우스의 혈당은 153.2±12.07 이었으며, 비만 당뇨군 마우스 중 PBS 투여군은 평균 551.8±53.73, SAMiRNA-Cont 투여군은 평균 577.3±40.25, SAMiRNA-AREG 투여군은 평균 555.7±49.15를 기록하였다 (도 17).
혈청 내 글루코오스 수치 (mg/dL)는 정상 대조군 마우스의 경우 149.6±20.4, 비만 당뇨군 마우스 중 PBS 투여군은 평균 689.1±185.4, SAMiRNA-Cont 투여군은 평균 755.5±89.4, SAMiRNA-AREG 투여군은 평균 874.3±119.4을 기록하였다 (도 18).
따라서, 비만 당뇨군 마우스에서 본 발명에 따른 엠피레귤린 발현량 감소가 당뇨 동물모델에서 공복혈당이나 혈청 내 글루코오스 수치를 조절하는데 큰 효과는 없는 것으로 확인되었다.
실시예 10. 고지방 식이 비만 모델을 이용한 비만 억제 효과 확인
엠피레귤린 발현 억제제의 비만 억제 효과를 확인하고자, 엠피레귤린 발현 억제제로 SAMiRNA-AREG (SAMi-mAREG#20)을 고지방 사료 식이 유도 비만 모델에 투여하여 지방 감소에 대한 효과를 관찰하였다. 식이 유도 5주 동안 약물을 주 3회 투여 후 마우스를 희생한 후 다양한 지표를 관찰하였다.
10-1. 고지방 사료 식이 유도에 의한 엠피레귤린 발현량 확인
C57BL/6 (나라바이오텍) 5주령 마우스를 분양 받아 실험을 진행하였다. 분양 후 1주 순화 후 60 kcal% Fat diet (D12492, Research Diets, Inc.)을 6주 동안 유도시킨 후에 부고환지방을 적출하여 mRNA level을 확인하였다.
지방 조직에서 Total RNA 추출은 QIAzol Lysis Reagent (QIAZEN., GER)와 RNeasy Mini Kit (QIAZEN., GER)의 조합으로 진행되었다. 100mg의 지방 조직을 QIAzol Lysis Reagent 1ml에 넣고 homogenization 후 실온에서 5분간 배양하였다. 4℃, 12000g에서 10분간 원심 분리한 다음 상단의 fat monolayer를 피하여 하단의 샘플을 회수 하였다. 200ul chloroform (Sigma-Aldrich, USA)을 넣고 잘 섞어준 후 3분간 실온에 둔 다음 4℃, 12000g로 30분간 원심분리 하였다. 분리된 3 phases에서 가장 상층을 회수한 다음 Lysate : 70% EtOH = 1 : 1의 비율로 넣고 잘 섞어준 다음 RNeasy Mini Kit의 RNeasy spin column에 넣어준다. 이후 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 추출된 RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량 및 순도를 평가하였다.
qPCR용 프라이머 서열 정보
Name F primer R primer probe
Areg AGTAGTAGCTGTCACTATCTTTGTC (서열번호 51) CCCGTTTTCTTGTCGAAGC (서열번호 52) CCTCGCAGCTATTGGCATCGGCA(서열번호 53)
Tfrc AAACTTGCCCAAGTATTCTCAG (서열번호 54) ATGAAAGGTATCCCTCCAACC (서열번호 55) TGCCAGCTGGACTGCAGGCGACT (서열번호 56)
(F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)
그 결과 고지방 사료 식이 유도에 의해 엠피레귤린 발현량이 정상 대조군 대비 12배 증가하였다 (도 19).
10-2. 동물실험 방법
C57BL/6 (나라바이오텍) 5주령 마우스를 분양 받아 실험을 진행하였다. 분양 후 1주 순화 후 1주 동안 60 kcal% Fat diet (D12492, Research Diets, Inc.)을 유도시킨 후 아래 실험 조건 대로 실험을 진행하였으며, 비교를 위해 비만이 아닌 정상 대조군도 동일한 조건으로 설치류 식이(Rodent diet, 2918C, Harlan, USA)를 유도하여 아래 실험 조건 대로 실험을 진행하였다. 그룹은 정상 대조군(ND+PBS)과 시험물질 투여군(HFD+SAMi-AREG)은 각 6마리씩, 음성 대조군(HFD+PBS)는 5마리씩 분류하여 실험을 진행하였다.
정상 대조군(ND+PBS)과 음성 대조군(HFD+PBS) 에는 PBS(LB 001-02, WELGENE, Korea) 100 ul를, 시험물질 투여군(HFD+SAMi-AREG) 은 SAMiRNA-AREG 5mg/kg 100 ul 씩 주 3회 피하 주사 방식으로 투여하였다. 사육환경 온도는 21± 2℃, 습도 55± 5%, 15~17/시간, 조도 150~300 Lux, 12시간 주기(점등: 06:00, 소등: 18:00)로 실험 기간동안 일정한 상태로 유지하였다. 5주 동안 약물을 투약 후 16시간 동안 절식하고 희생시켰다.
10-3. 체중, 사료 및 음수 섭취량 측정
체중, 사료 및 음수 섭취량은 매 측정 시마다 일정 시간에 측정하였고, 2회/주 측정하였다.
10-3-1. 체중 변화
마우스의 체중(g)은 주 2회 일정 시간마다 측정하였다. 음성 대조군은 PBS 투여 시 시간이 지날수록 고지방 식이에 의해 체중이 증가하는 경향을 보였으며, 마우스 희생 시 무게는 37.3±1.20 이었다. 정상 대조군 PBS 투여시 평균 26.57±0.36, 시험물질 투여군 SAMiRNA-AREG 투여시 평균 33.21±1.16의 체중을 나타내었다. 4주 및 5주에서 체중을 관찰하였을 때 음성 대조군 대비 시험물질 투여군에서 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었다.
정상 대조군 마우스와 비교하였을 때, 고지방 식이 유도 음성 대조군에서 체중이 유의미하게 증가한 반면 시험물질 투여군에서 마우스의 체중이 감소하였고, 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었다 (도 20).
10-3-2. 사료 및 음수 섭취량 변화
마우스 사료섭취량(g) 측정 결과, 정상 대조군은 1일 평균 사료섭취량이 3.69±0.15 이었고, 음성 대조군은 2.76±0.06 이었으며, 시험물질 투여군에서는 2.55±0.08의 사료를 섭취하여, 정상 대조군 보다 고지방 사료의 섭취량이 적었고, 음성대조군과 시험물질 투여군의 유의적인 사료섭취량 차이는 없었다 (도 21a).
마우스 음수섭취량(mL) 측정 결과, 정상 대조군은 1일 평균 음수섭취량이 3.27±0.10 이었고, 음성 대조군은 4.00±0.12 이었으며, 시험물질 투여군에서는 4.22±0.24의 음수를 섭취하여, 정상 대조군보다 고지방 식이 마우스의 음수 섭취량이 많았고, 음성 대조군과 시험물질 투여군의 유의적인 음수섭취량 차이는 없었다 (도 21b).
10-4. 식이효율 (Food efficiency ratio; %)
마우스의 체중증가량(g/day)을 사료섭취량(g/day)으로 나누어 식이효율을 측정한 결과, 정상 대조군은 0.02±0.001 이었으며, 음성 대조군은 0.12±0.007 시험물질 투여군에서는 0.08±0.011으로 나타나, 비록 음성 대조군과 시험물질 투여군 모두에서 정상 대조군 대비 식이효율은 증가하였으나, 시험물질 투여군은 음성대조군 대비 식이효율이 유의적으로 낮게 관찰되었다 (도 22).
10-5. 지방 무게 변화
지방의 무게 측정을 위해서 희생된 마우스에서 피하지방(subcutaneous fat pad), 부고환지방(epididymal fat pad), 신장주변지방(Perirenal fat pad), 장간막지방(mesenteric fat pad)을 마우스 희생 시 적출하여 그 무게를 측정하였으며, 마우스 무게 대비 지방 무게의 비율을 평가하였다.
마우스 피하지방 무게(g)의 경우, 정상 대조군은 0.38±0.02, 음성 대조군은 1.74±0.12, 시험물질 투여군은 1.05±0.14를 나타내었고, 부고환지방 무게(g)의 경우, 정상 대조군은 0.52±0.03, 음성 대조군은 2.32±0.09, 시험물질 투여군은 1.79±0.16를 나타내었고, 신장주변지방 무게(g)의 경우, 정상 대조군은 0.20±0.02, 음성 대조군은 0.86±0.04, 시험물질 투여군은 0.67±0.08를 나타내었고, 장간막지방 무게(g)의 경우, 정상 대조군은 0.25±0.01, 음성 대조군은 0.66±0.09, 시험물질 투여군은 0.45±0.04를 나타내었다 (도 23a).
마우스 피하지방 무게 비율(%)의 경우, 정상 대조군은 1.39±0.08, 음성 대조군은 4.65±0.23, 시험물질 투여군은 3.11±0.35를 나타내었고, 부고환지방 무게 비율(%)의 경우, 정상 대조군은 1.91±0.10, 음성 대조군은 6.23±0.09, 시험물질 투여군은 5.36±0.29를 나타내었고, 신장주변지방 무게 비율(%)의 경우, 정상 대조군은 0.73±0.06, 음성 대조군은 2.33±0.13, 시험물질 투여군은 2.01±0.17를 나타내었고, 장간막지방 무게 비율(%)의 경우, 정상 대조군은 0.91±0.02, 음성 대조군은 1.76±0.19, 시험물질 투여군은 1.35±0.07를 나타내었다 (도 23b).
마우스의 지방을 피하지방 (subcutaneous fat) 과 내장지방 (epididymal fat, Perirenal fat, mesenteric fat)으로 나누어 무게(g) 및 무게 비율(%)을 나타내었다.
마우스 피하지방의 경우 무게는 정상 대조군은 0.38±0.02, 음성 대조군은 1.74±0.12, 시험물질 투여군은 1.05±0.14를 나타내었고, 무게비율은 정상 대조군은 1.39±0.08, 음성 대조군은 4.65±0.23, 시험물질 투여군은 3.11±0.35를 나타내었다.
내장지방의 경우 무게는 정상 대조군은 0.97±0.06, 음성 대조군은 3.85±0.18, 시험물질 투여군은 2.92±0.27를 나타내었고, 무게비율은 정상 대조군은 3.56±0.17, 음성 대조군은 10.34±0.16, 시험물질 투여군은 8.73±0.50를 나타내었다.
결과적으로 정상 대조군 대비 음성대조군에서 피하지방 및 내장지방의 무게 및 무게 비율이 유의미하게 증가하였으며, 시험물질 투여군에서 음성대조군에서의 이러한 증가를 유의미하게 감소하는 효과를 확인할 수 있었다 (도 24a, 도 24b).
10-6. Micro CT 분석
마우스 지방의 Micro-CT 분석(한국기초과학지원연구원 광주센터)을 위해 각 그룹에서 체중이 중간 값을 나타내는 동물 2마리를 선별하였다. 사진촬영 후 피하지방 및 내장지방의 면적을 그래프로 나타내었다.
피하지방의 경우 면적(mm3)은 정상 대조군은 1661±289.5, 음성 대조군은 6356±217, 시험물질 투여군은 4040±284.5를 나타내었고, 내장지방의 경우 면적(mm3)은 정상 대조군은 1069±90, 음성 대조군은 3782±7, 시험물질 투여군은 2623±166를 나타내었다.
결과적으로 정상 대조군 대비 음성대조군에서 피하지방 및 내장지방의 면적이 증가하였으며, 시험물질 투여군에서 음성대조군 대비 면적이 감소하는 효과를 확인할 수 있었다 (도 25).
10-7. 지방조직의 조직병리학적 검사
마우스의 피하지방(subcutaneous fat pad), 부고환지방(epididymal fat pad), 신장주변지방(Perirenal fat pad), 장간막지방(mesenteric fat pad)을 적출하여 10% 중성완충포르말린(10% neutral buffered formalin, Sigma, HT50-1-640)에 24 시간 이상 고정하고 에탄올로 탈수시킨 다음 xylene 3단계의 투명과정을 거쳤다. 이후, 유동파라핀에서 침투(infilteration) 및 포매(embedding)과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였다. 이후, 5 μm 두께의 조직 구획을 탈파라핀화 및 재수화하고, Harris hematoxylin 염색용액으로 5분간 핵을 먼저 염색한 후 Eosin 용액으로 대조염색을 실시하였다. 염색이 끝나면 mounting solution 떨어트린 후 cover glass로 덮어 굳혔다. 보존액으로 굳어진 조직 슬라이드를 도립현미경(Nikon eclipse TS2)을 사용하여 200 배율로 사진촬영을 실시하였고, 지방 세포의 면적을 계산하였다.
피하지방의 경우 면적(mm2)은 정상 대조군은 913.8±129.9, 음성 대조군은 3575.0±346.7, 시험물질 투여군은 1337.0±211.1를 나타내었고, 부고환지방의 경우 면적(mm2)은 정상 대조군은 950.6±73.2, 음성 대조군은 1598.0±99.6, 시험물질 투여군은 1347.0±100.1를 나타내었고, 신장주변지방의 경우 면적(mm2)은 정상 대조군은 1734.0±158.8, 음성 대조군은 5365.0±190.4, 시험물질 투여군은 2516.0±288.3를 나타내었고, 장간막지방의 경우 면적(mm2)은 정상 대조군은 1552.0±680.3, 음성 대조군은 3495.0±425.3, 시험물질 투여군은 1436.0±163.3를 나타내었다.
결과적으로 정상 대조군 대비 음성 대조군에서 지방 세포의 면적이 증가하였으며, 시험물질 투여군에서 음성 대조군 대비 면적이 감소하는 효과를 확인할 수 있었다 (도 26).
10-8. 간조직의 조직병리학적 검사
마우스의 간을 적출하여 H&E 염색 및 Oil red O 분석을 위해 10% 중성완충포르말린(10% neutral buffered formalin, Sigma, HT50-1-640)에 24 시간 이상 고정 시킨 후 검사를 실시하였다.
10-8-1. H&E 염색
중성완충포르말린에 고정시킨 후 얻은 간조직의 전체적인 형태, 간조직 내 지질 축적 정도를 관찰하기 위하여 H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색을 실시하였다. 조직표본은 파라핀 침윤법으로 제작하였다. 에탄올로 탈수시킨 다음 xylene 3단계의 투명과정을 거쳤다. 이후, 유동파라핀에서 침투(infilteration) 및 포매(embedding)과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였다. microtome을 이용하여 조직블록을 5 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드 건조기에서 1시간 건조시킨 다음, xylene으로 파라핀을 제거하고 에탄올 단계를 거쳐 함수 시켰다. Harris hematoxylin 염색용액으로 5분간 핵을 먼저 염색한 후 Eosin 용액으로 대조염색을 실시하였다. 염색이 끝나면 mounting solution 떨어트린 후 cover glass로 덮어 굳혔다. 보존액으로 굳어진 조직 슬라이드를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
10-8-2. 오일레드 O 염색
중성완충포르말린에 고정시킨 후 얻은 간조직을 30% sucrose 용액에 침윤 시켰다. PBS solution에 수세한 후 물기를 제거하고 동결조직 포매제인 Optical cutting temperature (O.C.T) compound (SAKURA, U.S.A)에 고정시켜 동결 조직 block을 만들었다. 고정된 조직은 동결절편기(Cryostat CM3050 S, Leica)로 14 ㎛ 두께로 절편하여 조직표본을 만들었다. 지질성분에 특이적으로 민감하게 반응하여 붉은색을 나타냄으로써 지질 축적 정도를 확인할 수 있는 특수염색법인 오일레드 O 염색을 이용하여 AREG의 지질 축적 억제 효과를 확인하였다. 10% 중성완충포르말린(10% neutral buffered formalin, Sigma, HT50-1-640)으로 10분동안 고정 한 후, 고정액을 제거하고 100% 프로필렌 글라이콜(propylene glycol)올 이용하여 세척한 후, 세포내 생성된 지질방울(lipid droplet)과 특이적으로 반응하는 오일레드 O(Oil red O, O9755, Sigma) 용액을 이용하여 염색하였다. 염색이 끝나면 mounting solution 떨어트린 후 cover glass로 덮어 굳혔다. 보존액으로 굳어진 조직 슬라이드를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
10-8-3. 간 지방의 변화
오일레드 O 분석 후 정량분석을 실시한 결과 정상 대조군 대비 음성 대조군에서 6.6 배 증가된 지방이 생성되었으며, 시험물질 투여군의 경우는 정상 대조군 대비 2.8배 증가된 지방이 생성되었다. 따라서 시험물질 투여 군에서 간지방 생성 억제 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 27).
10-9. 유전자발현 분석
마우스의 피하지방(subcutaneous fat pad), 부고환지방(epididymal fat pad), 신장주변지방(Perirenal fat pad)에서 엠피레귤린의 발현량을 측정하였다. 지방 조직에서 Total RNA 추출은 TRI-Reagent (MRC Inc., USA)와 Universal RNA extraction kit (BIONEER, Korea)의 조합으로 진행되었다. 100mg의 지방 조직을 Tri reagent 1ml에 넣고 homogenization 후 실온에서 5분간 배양하였다. 4℃, 12000g에서 10분간 원심 분리한 다음 상단의 fat monolayer를 피하여 하단의 샘플을 회수 하였다. 200ul chloroform (Sigma-Aldrich, USA)을 넣고 잘 섞어준 후 3분간 실온에 둔 다음 4℃, 12000g로 30분간 원심분리 하였다. 분리된 3 phases에서 가장 상층을 회수한 다음 Lysate : Isopropanol = 400 : 300의 비율로 넣고 잘 섞어준 다음 Universal RNA extraction kit의 AccuPrep® Binding Column-Ⅲ에 넣어준다. 이후 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 추출된 RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량 및 순도를 평가하였으며, RNA gel-electrophoresis를 통하여 분해 정도를 판단 하였다.
qPCR용 프라이머 서열 정보
Name F primer R primer
Areg GAGGCTTCGACAAGAAAACG (서열번호 57) ACCAATGTCATTTCCGGTGT (서열번호 58)
Gapdh AGGGTGGAGCCAAAAGGGTC (서열번호 59) GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC (서열번호 60)
(F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)
10-9-1. 지방조직에서의 엠피레귤린 mRNA level
마우스의 피하지방(subcutaneous fat pad)의 경우, 정상 대조군 대비 음성 대조군에서 엠피레귤린 mRNA level이 1.8배 증가하였으나, 시험물질 투여군에서는 음성 대조군 대비 엠피레귤린 mRNA level이 1.6배 감소하였다.
부고환지방(epididymal fat pad)의 경우 정상 대조군 대비 음성 대조군에서 엠피레귤린 mRNA level이 3.2배 증가하였으나, 시험물질 투여군에서는 음성 대조군 대비 엠피레귤린 mRNA level이 1.3배 감소하였다.
신장주변지방(Perirenal fat pad)의 경우 정상 대조군 대비 음성 대조군에서 엠피레귤린 mRNA level이 3.7배 증가하였으나, 시험물질 투여군에서는 음성 대조군 대비 엠피레귤린 mRNA level이 1.5배 감소하였다 (도 28).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIONEER CORPORATION siRNAgen Therapeutics Corporation <120> A composition for treating or preventing obesity associated disease containing amphiregulin specific double stranded oligonucleotide structure <130> P21-B097 <150> KR 1020200057879 <151> 2020-05-14 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 1 cctataaagc ggcaggtgc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 2 gagcggcgca cactcccgg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 3 gtcccagaga ccgagttgc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 4 gagacgccgc cgctgcgaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 5 ccggcgccgg tggtgctgt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 6 ggtggtgctg tcgctcttg 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 7 cgctcttgat actcggctc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 8 tcttgatact cggctcagg 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 9 ggacctcaat gacacctac 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 10 cacctactct gggaagcgt 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 11 acctactctg ggaagcgtg 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 12 ctgggaagcg tgaaccatt 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 13 gaagcgtgaa ccattttct 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA sense <400> 14 ttctggggac 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21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH-R primer <400> 23 tgtagaccat gtagttgagg tca 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAREG-F primer <400> 24 gaggcttcga caagaaaacg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAREG-R primer <400> 25 accaatgtca tttccggtgt 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AREG Forward primer <400> 26 cagtgctgat ggatttgagg t 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AREG Reverse primer <400> 27 atagccaggt atttgtggtt cg 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AREG probe <400> 28 tgaaccgtcc tcgggagccg act 23 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A Forward primer <400> 29 gtgtttgacg gcatcccacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A Reverse primer <400> 30 taggcttcag acgcacgacc 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A probe <400> 31 aagcggatgg tggttcctgc t 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP Forward primer <400> 32 caccacagct cttccactc 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP Reverse primer <400> 33 atcccagaac tctccgaagc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBP probe <400> 34 acccttgccg ggcaccactc 20 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 35 gcaccugccg cuuuauagg 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 36 ccgggagugu gcgccgcuc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 37 gcaacucggu cucugggac 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 38 uucgcagcgg cggcgucuc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 39 acagcaccac cggcgccgg 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 40 caagagcgac agcaccacc 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 41 gagccgagua ucaagagcg 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 42 ccugagccga guaucaaga 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 43 guagguguca uugaggucc 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 44 acgcuuccca gaguaggug 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 45 cacgcuuccc agaguaggu 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 46 aaugguucac gcuucccag 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 47 agaaaauggu ucacgcuuc 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amphiregulin siRNA antisense <400> 48 agcacugugg uccccagaa 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMiRNA-Control(human) Sense <400> 49 cttacgctga gtacttcga 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMiRNA-Control(human) Antisense <400> 50 ucgaaguacu cagcguaag 19 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Areg Forward primer <400> 51 agtagtagct gtcactatct ttgtc 25 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Areg Reverse primer <400> 52 cccgttttct tgtcgaagc 19 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Areg probe <400> 53 cctcgcagct attggcatcg gca 23 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tfrc Forward primer <400> 54 aaacttgccc aagtattctc ag 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tfrc Reverse primer <400> 55 atgaaaggta tccctccaac c 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tfrc probe <400> 56 tgccagctgg actgcaggcg act 23 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Areg Forward primer <400> 57 gaggcttcga caagaaaacg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Areg Reverse primer <400> 58 accaatgtca tttccggtgt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Forward primer <400> 59 agggtggagc caaaagggtc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Reverse primer <400> 60 ggctaagcag ttggtggtgc 20

Claims (25)

  1. (i) 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드;
    (ii) 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
    [구조식 (1)]
    Figure pat00017

    상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 상기 (i)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다; 및
    (iii) 상기 (ii)의 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학적 변형은,
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(- OH)가 메틸기(-CH3), 메톡시기(-OCH3), 아민기(-NH2), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필 기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메 틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    [구조식 (2)]
    Figure pat00018

    상기 구조식 (2)에서, S 및 AS는 각각 제1항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제1항에서의 정의와 동일하다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    Figure pat00019
    ;
    상기 구조식 (3) 및 (4)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제8항에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3'은 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 및 3' 말단을 의 미한다.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    Figure pat00020

    상기 구조식 (5) 또는 구조 식 (6)에서 A′는 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
    친수성 물질 단량체 A'는 하기 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 -PO3 --, -SO3- 및 - CO2-로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (1)
    Figure pat00021

    상기 화합물 (1)에서 G는 O, S 및 NH로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (2)
    Figure pat00022
    ;
    화합물 (3)
    Figure pat00023
    .
  12. 제11항에 있어서, 상기 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (A'm-J)n -X-R-Y-B 구조식 (7)
    (J-A'm)n-X-R-Y-B 구조식 (8).
  13. 제1항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드 유도체, 글리세라이드 유도체, 글리세롤 에테르, 폴리프로필렌 글 리콜, C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산, 인지질, 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol) 및 토코트라이에 놀(tocotrienol)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 스테로이드 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-글리세라이드, 디-글리세라이드 및 트리-글리세라이드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유 결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테 르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 서로 다른 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 비만은 당뇨로 인한 내장지방형 비만인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 다음 중 어느 하나 이상의 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    (i) 체중 감소,
    (ii) 식이 효율 감소,
    (iii) 피하지방 감소,
    (iv) 내장지방 감소,
    (v) 지방세포 면적 감소, 및
    (vi) 간지방 생성 억제.
  24. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 지방 조직 내 엠피레귤린 발현을 억제하여 비만의 예방 또는 치료 효과를 발휘하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  25. 제1항의 약학 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
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