CN116157158A - 用于预防或治疗肥胖症相关疾病的含有双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：可以高度特异性地且有效地抑制双调蛋白表达的双链寡核苷酸，优选包含RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合体形式的序列的双链寡核苷酸；以及包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构和纳米颗粒用于预防或治疗肥胖症的用途。

Description

用于预防或治疗肥胖症相关疾病的含有双调蛋白特异性双链 寡核苷酸结构的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗肥胖症相关疾病的包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构的组合物，更具体地涉及能够以非常特异性且高效的方式抑制双调蛋白表达的双链寡核苷酸，以及用于预防或治疗肥胖症相关疾病的包含含有所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构和纳米颗粒的组合物。
背景技术
1995年，Guo和Kemphues报道了，不仅有义RNA，而且反义RNA也有效抑制秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的基因表达，并且从那时起，进行了研究以鉴定其原因。1998年，Fire等人首先描述了一种现象，其中注射双链RNA(dsRNA)通过特异性降解与其对应的mRNA而抑制基因表达。这种现象称为RNA干扰(RNAi)。RNAi是一种用于抑制基因表达的过程，可以以简单的方式以低成本展现出独特的抑制基因表达的作用，并且因此该技术的应用范围已经扩大。
由于这种抑制基因表达的技术可以调节特定基因的表达，因此它可以在mRNA水平上去除与癌症、遗传疾病等相关的特定基因，并且可以用作开发用于疾病治疗的治疗剂和验证靶标的重要工具。作为用于抑制靶基因表达的常规技术，已经公开了针对靶基因引入转基因的技术。这些技术包括相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法和相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法。
这种靶向RNA的RNA疗法是针对靶RNA使用寡核苷酸去除目的基因的功能的方法，并且可以被认为与其中治疗剂(如抗体和小分子)主要靶向蛋白质的常规方法不同。用于靶向RNA的方法大致分为两种类型：双链RNA介导的RNAi和反义寡核苷酸(ASO)。目前，正在通过靶向各种疾病中的RNA尝试临床试验。
反义寡核苷酸(在下文中称为“ASO”)是一种短的合成DNA，其被设计成根据Watson-Crick碱基配对与靶基因结合，并且可以特异性地抑制基因的特定核苷酸序列的表达。因此，反义寡核苷酸已被用于研究基因的作用以及开发能够在分子水平上治疗疾病(如癌症)的治疗剂。这些ASO具有能够通过设定各种抑制基因表达的靶标而容易地产生的优点，并且为了抑制癌基因表达和癌细胞生长，已经对ASO的使用进行了研究。通过将ASO结合到互补的mRNA序列以诱导RNase H活性并且去除所述mRNA，或者通过干扰用于蛋白质翻译的核糖体复合物的形成和进展来完成通过ASO抑制特定基因表达的过程。此外，据报道，ASO与基因组DNA结合以形成三螺旋结构，从而抑制基因转录。ASO具有如上所述的潜力，但为了在临床实践中使用ASO，需要提高ASO对核酸酶的稳定性，并且将ASO有效地递送到靶组织或细胞中，以便特异性地结合靶基因的核苷酸序列。此外，遗传mRNA的二级和三级结构是ASO特异性结合的重要因素，并且其中mRNA二级结构的形成减少的区域对于ASO的进入非常有利。因此，在合成ASO之前，已经作出努力通过系统地分析其中mRNA二级结构的形成减少的区域来不仅在体外而且在体内有效地实现基因特异性抑制。这些ASO比siRNA(一种RNA)更稳定，并且具有易溶于水和生理盐水的优点。迄今为止，联邦药品管理局(FDA)已批准了三种ASO(Jessica,C.,JPostdoc Res,4:35-50,2016)。
由于发现了RNA干扰(在下文中称为“RNAi”)的作用，因此已经发现RNAi在各种类型的哺乳动物细胞中作用于序列特异性mRNA(Barik,S.,J Mol.Med.(2005)83:764-773)。当双链RNA的长链被递送到细胞中时，所递送的双链RNA被Dicer核酸内切酶转化为加工成21至23个碱基对(bp)的小干扰RNA(在下文中称为“siRNA”)。siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，并且通过其中引导(反义)链识别并且降解靶mRNA的过程以序列特异性方式抑制靶基因表达。使用SiRNA抑制基因表达的技术被用于抑制靶细胞中的靶基因表达并且观察由此产生的变化，并且有效地用于鉴定靶细胞中的靶基因的功能的研究。特别地，抑制传染性病毒或癌细胞中的靶基因的功能可以有效地用于开发针对目的疾病的治疗方法。作为使用实验动物进行体外研究和体内研究的结果，已经报道了通过siRNA抑制靶基因表达是可能的。
Bertrand等人报道，siRNA在体外和体内对mRNA表达的抑制作用好于针对相同靶基因的反义寡核苷酸(ASO)，并且这种作用持续更久。此外，关于作用机理，siRNA通过与靶mRNA互补结合以序列特异性方式调节靶基因表达。因此，siRNA优于常规的基于抗体的药物或化学药物(小分子药物)，因为siRNA适用的受试者的范围可以显著扩大。
siRNA具有优异的作用，并且可以用于各种应用中，但为了将siRNA开发为治疗剂，应改善siRNA的体内稳定性及其细胞递送效率，使得siRNA可以有效递送到靶细胞。为了提高体内稳定性并且解决与siRNA的非特异性先天免疫刺激相关的问题，已积极尝试通过修饰siRNA的一些核苷酸或其骨架以具有核酸酶抗性，或使用病毒载体、脂质体或纳米颗粒来对其进行研究。
包含病毒载体(如腺病毒或逆转录病毒)的递送系统具有高转染功效，但具有高免疫原性和致癌性。另一方面，含有纳米颗粒的非病毒递送系统具有比病毒递送系统更低的细胞递送效率，但具有优点，包括体内高安全性、靶标特异性递送、RNAi寡核苷酸向细胞或组织中的有效摄取和内化、以及低细胞毒性和免疫刺激。因此，非病毒递送系统目前被认为是比病毒递送系统更有前途的递送方法。
在非病毒递送系统中，使用纳米载体的方法是其中使用各种聚合物(如脂质体和阳离子聚合物复合物)形成纳米颗粒并且其中将siRNA装载到此类纳米颗粒(即，纳米载体)中并且递送到细胞的方法。在使用纳米载体的方法中，常用的方法包括使用聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、脂质复合物(lipoplex)等的方法。其中，脂质复合物由阳离子脂质构成，并且功能是与细胞内体的阴离子脂质相互作用以诱导内体的不稳定，从而允许细胞外递送外来体。
此外，已知可以通过将化合物等缀合至到siRNA的随从(有义)链的末端区域以赋予其改善的药代动力学特征来提高体内siRNA的效率(J.Soutschek,Nature 11；432(7014):173-8,2004)。在这种情况下，siRNA的稳定性取决于与siRNA的有义(随从)链或反义(指导)链的末端缀合的化学化合物的特性而变化。例如，与聚合物化合物(如聚乙二醇(PEG))缀合的siRNA在阳离子化合物存在下与siRNA的阴离子磷酸基团相互作用以形成复合物，从而提供具有提高的siRNA稳定性的载体。特别地，与其他药物递送系统(如微球或纳米颗粒)相比，由聚合物复合物构成的胶束具有非常小的大小和非常均匀的大小分布，并且是自发形成的。因此，这些胶束的优点在于容易管理胶束配制品的质量并且容易确保其可再现性。
为了提高siRNA的细胞内递送效率，已经开发了使用siRNA缀合物来确保siRNA的稳定性和增加siRNA的细胞膜渗透性的技术，所述siRNA缀合物是通过经由简单的共价键或接头介导的共价键将作为生物相容性聚合物的亲水性化合物(例如，聚乙二醇(PEG))与siRNA缀合而获得的(韩国专利号883471)。然而，即使当siRNA被化学修饰并且缀合到聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)时，其仍具有低的体内稳定性以及不容易将其递送到靶器官中的缺点。为了克服这些缺点，已经开发了双链寡RNA结构，其包含与寡核苷酸，特别是双链寡RNA(如siRNA)结合的亲水性和疏水性化合物。此结构通过疏水性化合物的疏水性相互作用而形成称为SAMiRNATM(自组装胶束抑制性RNA)的自组装纳米颗粒(韩国专利号1224828)。SAMiRNATM技术相对于常规递送技术具有的优点是可以获得大小非常小的均匀纳米颗粒。
具体地，在SAMiRNATM技术中，将PEG(聚乙二醇)或HEG(六乙二醇)用作亲水性化合物。PEG是合成聚合物，通常用于增加医用药物(特别是蛋白质)的溶解度并且调节药物的药代动力学。PEG是多分散材料，并且单批聚合物由不同数量的单体构成，并且因此显示出具有高斯曲线的分子量分布。此外，材料的均匀性表示为多分散指数(Mw/Mn)。换句话说，当PEG具有低分子量(3至5kDa)时，其具有约1.01的多分散指数，而当PEG具有高分子量(20kDa)时，其具有约1.2的高多分散指数，从而表明PEG的均匀性随其分子量的增加而降低。因此，当PEG与药物缀合时，存在的缺点在于，PEG的多分散特性反映在缀合物中，并且因此不容易验证单一材料。由于这种缺点，已经改进了用于合成和纯化PEG的方法，以便产生具有低多分散指数的材料。然而，当PEG与具有低分子量的化合物缀合时，存在与所述化合物的多分散特性相关的问题，包括不容易确认是否容易地实现缀合的问题。
因此，近年来，已经通过以下方式改进了SAMiRNATM技术(即自组装纳米颗粒)：将双链RNA结构的亲水性化合物(构成SAMiRNATM)形成为基本单元嵌段，每个嵌段包含1至15个具有均匀分子量的单体；以及(如果需要)接头，使得根据需要使用合适数量的嵌段。因此，已经开发了与常规SAMiRNATM相比具有小的大小和显著改善的多分散特性的新型递送系统技术。已经知道，当注射siRNA时，siRNA被存在于血液中的各种酶快速降解，并且因此将其递送到靶细胞或组织的效率很差。因此，改进的SAMiRNATM中也出现稳定性和表达抑制率的变化，取决于靶基因。因此，为了使用由改进的自组装纳米颗粒构成的SAMiRNATM更稳定且有效地抑制靶基因的表达，本发明诸位发明人已试图通过应用双链寡核苷酸来增强SAMiRNATM对靶基因的表达抑制作用和SAMiRNATM的稳定性，所述双链寡核苷酸包含作为指导(有义)链的ASO的DNA序列和作为随从(反义有义)序列的RNA序列。
同时，肥胖症是世界范围内的重要健康问题，并且可能引起许多并发症如心脏病、2型糖尿病和某些癌症的增加。
肥胖症的主要原因之一是内脏脂肪在体内过度积累[Carr DB,Diabetes.2004年8月；53(8):2087-94；Bouchard C,Int J Obes Relat Metab Disord 1996；20:420-7]。内脏脂肪是指内脏周围的脂肪，并且内脏脂肪主要由遗传因素[Rosenberg B,Panminerva Med2005；47:229-44]、种族、身体活动、生活方式和炎症因子[Deurenberg P,Int J ObesRelat Metab Disord 1998；22:1164-71]引起。此外，已知在不同种族中，亚洲人内脏脂肪积累严重[WHO Expert Consultation.Lancet 2004；363:157-63；Hu FB,N Engl J Med2001；345:790-7]，并且暴饮暴食、运动少[Wannamethee SG,Am J Clin Nutr 2003；77:1312-7；Komiya H,Tohoku JExp Med 2006；208:123-32]、和吸烟进一步增加内脏脂肪[Upadhyaya S,Adipocyte,2014；3(1):39-45]。当内脏脂肪积累时，内脏脂肪细胞的促炎性因子(如白介素-6、肿瘤坏死因子-α和单核细胞趋化蛋白-1)的分泌增加，引起各种并发症[Despres JP.Ann Med2001；33:534-41]。内脏脂肪引起代谢异常和心血管疾病[MatsuzawaY,Obes Res 1995；3Suppl 5:645-7]。增加的内脏脂肪积累导致胰岛素抗性增加，并且如果内脏脂肪重量超过皮下脂肪，则心脏功能下降，并发生高血压和循环系统疾病[Schaffler,Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 005；2:273-80]。内脏脂肪还引起消化障碍，并且已知引起脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎[Busetto L,Diabetes Obes Metab 2005；7:301-6]。由于这些因素，抗炎性机制随着脂联素降低而退化，并且促进肝脏中脂肪肝的形成，导致非酒精性脂肪肝。内脏脂肪还引起呼吸系统疾病的许多问题[Schapira DV,Cancer1994；74:632-9]。可以看出，当内脏脂肪重量超过皮下脂肪时，呼气储备量减小，导致限制性肺通气功能障碍。还已知内脏脂肪增加乳腺癌的发病率。还已知内脏脂肪与前列腺癌[Hsing AW,J Natl Cancer Inst 2001；93:783-9]和结直肠癌的增加的发病率相关[Manson JE,N Engl J Med 1995；333:677-85]。
内脏脂肪的治疗主要由饮食限制、体育锻炼和药物治疗组成，但其效果仍不够[Diamantis T,Surg Obes Relat Dis,2014；10(1):177-83；Kelley GA,J Obes,2013；2013783103；Rhines SD,S D Med,2013；66(11):471,73；Sharma M,Adolesc Health MedTher,2010；19-19]。因此，减少内脏脂肪可以降低心血管疾病、代谢疾病、糖尿病和其他疾病的发病率，从而预防并发症并提高生活质量。
因此，本发明人已经对通过减少内脏脂肪来治疗肥胖症进行了研究，并且作为结果，已发现在糖尿病动物模型中使用包含特异性抑制双调蛋白的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的结构可显著减少内脏脂肪，包括皮下脂肪。
此外，本发明人已经发现，在高脂肪饮食诱导的肥胖症动物模型中，附睾脂肪中双调蛋白的表达水平显著高，并且当使用根据本发明的包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的结构降低肥胖症动物模型中双调蛋白的表达水平时，可以显著降低体重、皮下脂肪重量和内脏脂肪重量，抑制脂肪组织细胞大小的增加，降低脂肪组织中双调蛋白的表达，以及抑制肝脏中的脂肪积累，从而完成涉及包含所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸的结构的抗肥胖症用途的本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗或预防肥胖症的新型药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于治疗或预防肥胖症的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的任一种：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
本发明还提供了一种包含所述药物组合物的冻干配制品。
本发明还提供了一种预防或治疗肥胖症的方法，所述方法包括向需要预防或治疗肥胖症的受试者施用选自以下的任一种的步骤：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
本发明还提供了一种用于预防或治疗肥胖症的方法中的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的任一种：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
本发明提供了选自以下的任一种在制造用于预防或治疗肥胖症的药物中的用途：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
附图说明
图1示出了筛选靶向人双调蛋白的1,257个SAMiRNA的结果。
图2示出了包含选择的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡DNA/RNA杂合体的纳米颗粒大小分布。(a)：SAMi-AREG#10；(b)：SAMi-AREG#11；和(c)：SAMi-AREG#12。
图3描绘了显示实施例4中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(200和600nM)的SAMiRNA处理肺癌细胞系A549，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:1至14的序列中的每一个，并分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)。
图4描绘了显示实施例5中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的SAMiRNA处理肺癌细胞系A549，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:10的序列，分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)(图4a)，并且测定SAMiRNA的IC50值(图4b)。
图5描绘了显示实施例5中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的SAMiRNA处理肺癌细胞系A549，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:11的序列，分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)(a)，并且测定SAMiRNA的IC50值(b)。
图6描绘了显示实施例5中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的SAMiRNA处理肺癌细胞系A549，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:12的序列，分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)(a)，并且测定SAMiRNA的IC50值(b)。
图7描绘了显示实施例6中双调蛋白候选序列的先天免疫应答测试的结果的图。在此，用2.5μM双调蛋白特异性SAMiRNA处理外周血单个核细胞(PBMC)，所述双调蛋白特异性SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:10(AR-1)、11(AR-2)和12(AR3)的序列中的每一个，分析双调蛋白特异性SAMiRNA的先天免疫相关细胞因子的mRNA表达水平的相对增加，并使用人外周血单个核细胞评价体外细胞毒性。(a)：DNA/RNA杂合SAMiRNA，和(b)：RNA/RNA杂合SAMiRNA。
图8是显示实施例7中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，比较分析依据各自包含选择的双调蛋白特异性SAMiRNA的双链寡DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体的双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)。具体地，比较分析用不同浓度(200nM、600nM和1,200nM)的SAMiRNA处理的肺癌细胞系A549和相对双调蛋白mRNA表达水平(％)，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:10(AR-1)、11(AR-2)和12(AR-3)的序列中的每一个。
图9显示了筛选237个靶向小鼠双调蛋白的SAMiRNA的结果，以及从其中选择的9个候选序列。
图10A描绘了显示实施例8中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(200和500nM)的SAMiRNA处理小鼠肺成纤维细胞系MLg，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:19、20和21的序列中的每一个，并分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)。
图10B描绘了显示实施例7中定量分析双调蛋白mRNA表达水平的结果的图。在此，用不同浓度(200和500nM)的SAMiRNA处理小鼠肺上皮细胞系LA-4，所述SAMiRNA具有作为有义链的本发明的SEQ ID NO:19、20和21的序列中的每一个，并分析细胞中的相对双调蛋白mRNA表达水平(％)。
图11是显示根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组的体重变化的图。
图12是显示根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组的食物摄入量变化的图。
图13是显示根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组的水摄入量变化的图。
图14显示了根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组中每一个的皮下脂肪比率的测量结果。
图15显示了根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组中每一个的内脏脂肪比率的测量结果。
图16描绘了显示根据本发明的小鼠动物模型实验中根据本发明的结构的内脏脂肪减少效果的照片。
图17显示了根据本发明的小鼠动物模型实验中在对照组和实验组处死之前8周全血中的空腹血糖水平的测量结果。
图18显示了根据本发明的小鼠动物模型实验中对照组和实验组处死之前8周血清葡萄糖水平的测量结果。
图19是显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中在高脂肪喂养12周后对照组和实验组处死后附睾脂肪中双调蛋白表达水平的分析结果的图。
图20是显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组的体重变化的图。
图21a是显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的平均食物摄入量的图。
图21b是显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的平均水摄入量的图。
图22是显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的食物效率比率(％)的图。
图23a显示根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的皮下脂肪垫(SFP)、附睾脂肪垫(EFP)、肾周脂肪垫(PFP)、肠系膜脂肪垫(MFP)、皮下脂肪垫(SFP)、附睾脂肪垫(EFP)、肾周脂肪垫(PFP)和肠系膜脂肪垫(MFP)重量的测量结果。
图23b显示了根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的皮下脂肪垫(SFP)、附睾脂肪垫(EFP)、肾周脂肪垫(PFP)、肠系膜脂肪垫(MFP)、皮下脂肪垫(SFP)、附睾脂肪垫(EFP)、肾周脂肪垫(PFP)和肠系膜脂肪垫(MFP)重量除以体重得到的比率(％)。
图24b显示了根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组和实验组中每一组的皮下脂肪和内脏脂肪中每一种与小鼠总重量的比率的测量结果。
图25描绘了比较在根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组与实验组之间减少皮下脂肪和内脏脂肪的效果的显微CT图像，并且描绘了显示皮下脂肪和内脏脂肪中每一种的体积的图。
图26描绘了比较在根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组与实验组之间减少皮下脂肪垫(SFP)、附睾脂肪垫(EFP)、肾周脂肪垫(PFP)和肠系膜脂肪垫(MFP)的效果的组织学图像，并且描绘了显示每组中脂肪细胞面积的图。
图27a描绘了比较在根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组与实验组之间减少肝组织中脂肪积累的效果的图像。
图27b是包含在根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组与实验组之间减少肝组织中脂肪积累的效果的定量图。
图28描绘了比较在根据本发明的高脂肪饮食肥胖症小鼠模型实验中对照组与实验组之间减少皮下脂肪垫(SFP)、肾周脂肪垫(EFP)和肠系膜脂肪垫(PFP)中双调蛋白mRNA水平的效果的图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本说明书中所用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的技术人员通常理解相同的含义。通常，本说明书中所用的命名法是本领域熟知且常用的。
在本发明中，已经发现，当将双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构施用于2型糖尿病动物模型时，其展现出显著减少皮下脂肪和内脏脂肪的效果，表明双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构可用作预防或治疗肥胖症的组合物。
此外，在本发明中，已经发现，当将双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构施用于肥胖症诱导的动物模型时，其展现出减轻体重、降低食物效率比率、减少皮下脂肪、减少内脏脂肪、减少脂肪细胞面积和抑制肝脏脂肪形成的效果。
因此，在一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防肥胖症的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的任一种：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
各自包含在根据本发明提供的优选双链寡核苷酸中的SEQ ID NO:10、11和12的序列如下：
5'-CACCTACTCTGGGAAGCGT-3'(SEQ ID NO:10)
5'-ACCTACTCTGGGAAGCGTG-3'(SEQ ID NO:11)
5'-CTGGGAAGCGTGAACCATT-3'(SEQ ID NO:12)
如本文所用，术语“双链寡核苷酸”旨在包括具有一般RNAi(RNA干扰)活性的所有材料，并且对于本领域技术人员将显而易见的是，编码双调蛋白的mRNA特异性双链寡核苷酸还包括双调蛋白特异性shRNA等。即，所述寡核苷酸可以是siRNA、shRNA或miRNA。
此外，对于本领域技术人员将清楚的是，包含有义链和反义链的双调蛋白特异性siRNA或反义寡核苷酸(各自包含由有义链或与其互补的反义链中一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入产生的序列，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列)也在本发明的范围内，只要保持其对双调蛋白的特异性。
在本发明中，有义或反义链可以独立地是DNA或RNA。此外，有义和反义链可以呈杂合体的形式，其中有义链是DNA并且反义链是RNA，或者有义链是RNA并且反义链是DNA。
在本发明中，SEQ ID NO:10、11和12以DNA的形式列出，但当使用RNA的形式时，SEQID NO:10、11和12的序列可以是与其对应的RNA序列，即其中T被U取代的序列。
此外，根据本发明的双链寡核苷酸不仅包括其中序列的有义链与双调蛋白基因的结合位点完全互补(完全匹配)的情况，而且还包括其中有义链与结合位点部分互补(错配)的情况，只要保持对双调蛋白的特异性。
根据本发明的双链寡核苷酸可以在一条或两条链的3'端处包含突出物，所述突出物包含一个或多个未配对的核苷酸。
在本发明中，有义链或反义链优选地由19至31个核苷酸组成，但不限于此。
在本发明中，包含有义链和反义链的双链寡核苷酸可以对双调蛋白具有特异性，但不限于此，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列。
在本发明中，双链寡核苷酸的有义链或反义链可以包含各种化学修饰，以便增加其体内稳定性或赋予核酸酶抗性并且减少非特异性免疫应答。化学修饰可以是选自但不限于以下化学修饰中的一种或多种：其中一个或多个核苷酸中的糖结构的2'碳位置处的OH基被选自甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、胺基(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨丙基、-O-3-二甲基氨丙基、-O-N-甲基乙酰胺基和-O-二甲基酰胺基氧乙基中的任一种取代的修饰；其中核苷酸中的糖结构的氧被硫取代的修饰；将核苷酸之间的键修饰成选自硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键和甲基膦酸酯键的任一个键；修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)；以及修饰为DNA-RNA杂合体(Ann.Rev.Med.55,61-652004；US 5,660,985；US 5,958,691；US 6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；NucleicAcid Res.31:589-595,2003；Nucleic Acids Research,38(17)5761-773,2010；NucleicAcids Research,39(5):1823-1832,2011)。
在本发明中，可以将一个或多个磷酸酯基团，优选一至三个磷酸酯基团结合到双链寡核苷酸的反义链的5'端。
在另一方面，本发明涉及一种包含由以下结构式(1)表示的结构的双链寡核苷酸结构，其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示双链寡核苷酸。
在优选的实施方案中，包含根据本发明的双调蛋白特异性序列的双链寡核苷酸结构优选地具有由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸。
根据本发明的双链寡核苷酸优选地呈DNA-RNA杂合体、siRNA(短干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)或miRNA(微RNA)的形式，但不限于此，并且还可以包括可以充当miRNA拮抗剂的单链miRNA抑制剂。
在下文中，将以RNA为重点来描述根据本发明的双链寡核苷酸，但对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明还可以应用于具有与本发明双链寡核苷酸相同特征的其他双链寡核苷酸。
更优选地，包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构具有由以下结构式(2)表示的结构：
[结构式(2)]
A-X-S-Y-B
AS
其中A、B、X和Y如以上结构式(1)所定义，S表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链，并且AS表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的反义链。
更优选地，包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构具有由以下结构式(3)或(4)表示的结构：
[结构式(3)]
A-X-5′S 3′-Y-B
AS
[结构式(4)]
A-X-3′S 5′-Y-B
AS
其中A、B、S、AS、X和Y如以上结构式(2)所定义，并且5'和3'分别表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的5'端和3'端。
亲水性化合物可以选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉，但不限于此。
对于本发明所属领域的技术人员将清楚的是，可以将一至三个磷酸酯基团可以结合到包含如结构式(1)至结构式(4)所示的双调蛋白特异性siRNA的双链寡核苷酸RNA结构的反义链的5'端，并且shRNA可以代替RNA使用。
以上结构式(1)至结构式(4)中的亲水性化合物优选地是分子量为200至10,000的聚合物化合物，更优选地是分子量为1,000至2,000的聚合物化合物。例如，作为亲水性聚合物化合物，优选使用非离子性亲水性聚合物化合物，如聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮或聚噁唑啉，但不必限于此。
特别地，结构式(1)至结构式(4)中的亲水性化合物(A)可以以如以下结构式(5)或(6)所示的亲水性嵌段的形式使用，并且可以根据需要使用合适数量(结构式(5)或(6)中的n)的此类亲水性嵌段，从而克服在使用一般合成聚合物化合物时可能发生的与多分散特性相关的问题：
[结构式(5)]
(A'm-J)n
[结构式(6)]
(J-A'm)n
其中A'表示亲水性单体，J表示将m个亲水性单体连接在一起或将m个亲水性单体与双链寡核苷酸连接的接头，m是范围从1至15的整数，n是范围从1至10的整数，并且由(A’m-J)或(J-Am’)表示的重复单元对应于亲水性嵌段的基本单元。
当使用如以上结构式(5)或(6)所示的亲水性嵌段时，包含根据本发明的双调蛋白特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸结构可以具有由以下结构式(7)或(8)表示的结构：
[结构式(7)]
(A'm-J)n-X-R-Y-B
[结构式(8)]
(J-A'm)n-X-R-Y-B
其中X、R、Y和B如以上结构式(1)所定义，并且A'、J、m和n如以上结构式(5)和(6)所定义。
作为以上结构式(5)和(6)中的亲水性单体(A’)，可以使用但不限于选自非离子亲水性聚合物的一种，只要其与本发明的目的相容即可。优选地，可以使用选自下表1中所列出的化合物(1)至化合物(3)的单体。更优选地，可以使用化合物(1)的单体。在化合物(1)中，G可优选地选自O、S和NH。
特别地，在亲水性单体中，由化合物(1)表示的单体非常适合于生产根据本发明的结构，因为所述单体的优点在于可以将各种官能团引入到所述单体中，并且所述单体通过具有良好的体内亲和力和优异的生物相容性而诱导很少免疫反应，可以增加包含在由结构式(7)或(8)表示的结构中的双链寡核苷酸的体内稳定性，并且可以增加双链寡核苷酸的递送效率。
[表1]用于本发明的亲水性单体的结构
Figure GDA0004195565220000101
结构式(5)至结构式(8)中的亲水性化合物的总分子量优选地在1,000至2,000的范围内。因此，例如，当结构式(7)和结构式(8)中的化合物(1)是六乙二醇时，即，其中G是O并且m是6的化合物时，重复数量(n)优选地是3至5，因为六乙二醇空间的分子量为344。特别地，本发明的特征在于，可以根据需要使用合适数量(以n表示)的由结构式(5)和结构式(6)中的(A′m-J)或(J-A′m)n表示的亲水性基团(亲水性嵌段)的重复单元。每个亲水性嵌段中包含的亲水性单体J和接头J在亲水性嵌段之间可以是相同或不同的。换句话说，当使用3个亲水性嵌段(n＝3)时，可以分别在第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段中使用化合物(1)的亲水性单体、化合物(2)的亲水性单体和化合物(3)的亲水性单体，表明可以在所有亲水性嵌段中使用不同的单体。可替代地，选自化合物(1)至(3)的亲水性单体的任何一种亲水性单体也可用于所有亲水性嵌段中。类似地，作为介导亲水性单体键合的接头，可以在亲水性嵌段中使用相同的接头，或者还可以在亲水性嵌段中使用不同的接头。此外，亲水性单体的数量m在亲水性嵌段之间也可以是相同或不同的。换句话说，在第一亲水性嵌段中，连接三个亲水性单体(m＝3)，在第二亲水性嵌段中，连接五个亲水性单体(m＝5)，并且在第三亲水性嵌段中，连接四个亲水性单体(m＝4)，表明在亲水性嵌段中可以使用不同数量的亲水性单体。可替代地，也可以在所有亲水性嵌段中使用相同数量的亲水性单体。
此外，在本发明中，接头(J)优选地选自-PO3 --、-SO3-和-CO2-，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以使用在考虑到所使用的亲水性单体的情况下而选择的任何接头，只要其与本发明的目的相容即可。
结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)中的疏水性化合物(B)的功能是通过疏水性相互作用形成由结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)所示的寡核苷酸结构构成的纳米颗粒。疏水性化合物优选地具有250至1,000的分子量，并且可以是选自类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚和生育三烯酚的任一种，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以使用任何疏水性化合物，只要其与本发明的目的相容即可。
类固醇衍生物可以选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾烷基胺，并且甘油酯衍生物可以选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯等。在此，甘油酯的脂肪酸优选地为C12-C50不饱和或饱和脂肪酸。
特别地，在疏水性化合物中，优选地使用饱和或不饱和烃或胆固醇，因为其可以在根据本发明的双链寡核苷酸结构的合成步骤中容易地结合。最优选地，使用C24烃，特别是含有二硫键的疏水性烃。
疏水性化合物可以结合到亲水性化合物的远端，并且可以结合到双链寡核苷酸的有义链或反义链上的任何
根据本发明的结构式(1)至(4)、(7)和(8)中的亲水性化合物或疏水性化合物通过单共价键或接头介导的共价键(X或Y)与双调蛋白特异性寡核苷酸结合。介导共价键的接头在双调蛋白特异性寡核苷酸的末端处共价键合到亲水性或疏水性化合物，并且没有特别的限制，只要如果需要，其在特定环境中提供可降解键即可。因此，本发明中使用的接头可以是在根据本发明的双链寡核苷酸结构的生产过程中，为了激活双调蛋白特异性双链寡核苷酸和/或亲水性(或疏水性)化合物而结合的任何化合物。共价键可以是不可降解键和可降解键中的任一种。在此，不可降解键的例子包括但不限于酰胺键和磷酸键，并且可降解键的例子包括但不限于二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、可生物降解的键和酶可降解键。
此外，作为结构式(1)至(4)、(7)和(8)中由R(或S和AS)表示的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，可以使用但不限于具有特异性结合双调蛋白mRNA的特性的任何双链寡核苷酸。优选地，根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列。
此外，在包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构中，可以将胺或多组氨酸基团另外引入到与所述结构中的寡核苷酸结合的亲水性化合物的远端。
这促进了包含双链寡核苷酸结构的载体的细胞内摄取和内体逃逸，所述双链寡核苷酸结构包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，并且已经报道了引入胺基和多组氨酸基团可以用于促进载体(如量子点、树状聚合物或脂质体)的细胞内摄取和内体逃逸。
具体地，已知引入到载体末端或外部的伯胺基团在生物学pH下被质子化，同时通过与带负电荷的基因相互作用形成缀合物，并且由于细胞内摄取后在低pH下具有缓冲作用的内部叔胺，促进了内体逃逸，由此可以保护载体免受溶酶体降解(Gene Delivery andExpression Inhibition Using Polymer-Based Hybrid Material,PolymerSci.Technol.,第23卷,第3期,第254-259页)。
此外，已知组氨酸(非必需氨基酸)在其残基(-R)处具有咪唑环(pKa＝6.04)，并且因此具有增加在内体和溶酶体中的缓冲能力的作用，并且因此组氨酸修饰可以用于非病毒基因载体(包括脂质体)，以便增加内体逃逸效率(Novel histidine-conjugatedgalactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective genetransfer in human hepatoma HepG2 cells.J.Controlled Release 118,第262-270页)。
胺基或多组氨酸基团可以通过一个或多个接头与亲水性化合物或亲水性嵌段连接。
当将胺基或多组氨酸基团引入到由根据本发明的结构式(1)表示的双链寡核苷酸结构的亲水性化合物时，RNA结构可以具有以下结构式(9)所示的结构：
[结构式(9)]
P-J1-J2-A-X-R-Y-B
其中A、B、R、X和Y如以上结构式(1)所定义，P表示胺基团或多组氨酸基团，并且J1和J2是接头，其各自独立地选自简单的共价键、PO3 -、SO3、CO2、C2-12烷基、烯基和炔基，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，在考虑到本文所使用的亲水性化合物的情况下而选择的任何接头都可以用作J1和J2，只要它们与本发明的目的相容即可。
优选地，当引入胺基团时，J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是C6烷基，但不限于此。
此外，当引入多组氨酸基团时，优选的是结构式(9)中的J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是化合物(4)，但不限于此。
[化合物(4)]
Figure GDA0004195565220000121
此外，当结构式(9)所示的双链寡核苷酸结构的亲水性化合物是由结构式(5)或(6)表示的亲水性嵌段并且向其引入胺基或多组氨酸基团时，双链寡核苷酸结构可以具有由以下结构式(10)或(11)表示的结构：
[结构式(10)]
P-J1-J2-(A'm-J)n-X-R-Y-B
[结构式(11)]
P-J1-J2-(J-A'm)n-X-R-Y-B
其中X、R、Y、B、A’、J、m和n如以上结构式(5)或(6)所定义，并且P、J1和J2如以上结构式(9)所定义。
特别地，结构式(10)和结构式(11)中的亲水性化合物优选地结合到双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的3'端。在这种情况下，结构式(9)至结构式(11)可以对应于以下结构式(12)至结构式(14)：
[结构式(12)]
P-J1-J2-A-X-3′S 5′-Y-B
AS
[结构式(13)]
P-Jl-J2-(A′m-J)n-X-3′S 5′-Y-B
AS
[结构式(14)]
P-Jl-J2-(J-A′m)n-X-3′S 5′·Y-B
AS
其中X、R、Y、B、A、A′J、m、n、P、J1和J2如以上结构式(9)至结构式(11)所定义，并且5'和3’表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的5'端和3'端。
可以在本发明中引入的胺基可以是伯、仲或叔胺基团。特别地，优选地使用伯胺基团。引入的胺基可以作为胺盐的形式存在。例如，伯胺基团的盐可以作为NH3 +的形式存在。
此外，可以在本发明中引入的多组氨酸基团优选地包含3至10个组氨酸，更优选5至8个组氨酸，并且最优选6个组氨酸。除组氨酸之外，还可以包括一个或多个半胱氨酸。
同时，当在包含根据本发明的双调蛋白特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸结构和由其形成的纳米颗粒中提供靶向部分时，它可以促进所述结构或纳米颗粒向靶细胞的有效递送，使得所述结构或纳米颗粒甚至可以以相对低的浓度递送到靶细胞，因此展现出调节靶基因表达的强作用。此外，靶向部分可以防止双调蛋白特异性双链寡核苷酸向其他器官和细胞的非特异性递送。
因此，本发明提供了一种双链寡RNA结构，其中配体(L)，特别是具有特异性结合到通过受体介导的内吞作用(RME)增强靶细胞内化的受体的特性的配体，进一步结合到由结构式(1)至(4)、(7)和(8)中任一个表示的结构。例如，其中配体与由结构式(1)表示的双链寡RNA结构结合的结构具有以下结构式(15)所示的结构：
[结构式(15)]
(Li-Z)-A-X-R-Y-B
其中A、B、X和Y如以上结构式(1)所定义，L是具有特异性结合到通过受体介导的内吞作用(RME)增强靶细胞内化的受体的特性的配体，并且“i”是范围从1至5，优选从1至3的整数。
结构式(15)中的配体可以优选地选自：具有增强靶细胞内化的RME特性的靶受体特异性抗体、适体和肽；叶酸盐(术语“叶酸盐(folate)”通常与叶酸(folic acid)互换使用，并且如本文所用的术语“叶酸盐”意指呈天然形式或在人体中激活的叶酸)；和化学化合物，包括己糖胺，如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)，以及糖或碳水化合物，如葡萄糖和甘露糖，但不限于此。
此外，以上结构式(15)中的亲水性化合物(A)可以以由结构式(5)或(6)表示的亲水性嵌段的形式使用。
在仍另一方面，本发明提供了一种用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的方法。
例如，根据本发明的用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的方法可以包括以下步骤：
(1)将亲水性化合物结合到固体支持物；
(2)在结合亲水性化合物的固体支持物上合成寡核苷酸单链；
(3)将疏水性化合物共价结合到寡核苷酸单链的5'端；
(4)合成具有与步骤(2)的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链；
(5)在合成完成后，从固体支持物分离并且纯化寡核苷酸-聚合物结构和寡核苷酸单链；以及
(6)用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的寡核苷酸-聚合物结构，从而产生双链寡核苷酸结构。
本发明中使用的固体支持物优选地是控孔玻璃(CPG)，但不限于此，并且还可以使用聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅胶、纤维素纸等。当使用CPG时，其优选地具有40至180mm的直径和500至
Figure GDA0004195565220000131
的孔径。在步骤(5)之后，可以使用MALDI-TOF质谱仪测量所产生和纯化的RNA-聚合物结构和寡核苷酸单链的分子量，以便确认产生了所希望的寡核苷酸-聚合物结构和寡核苷酸单链。在以上生产方法中，合成具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链的步骤(4)可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(5)的任一个步骤期间进行。
此外，具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链可以以磷酸酯基团结合到寡核苷酸单链的5'端的状态使用。
同时，本发明提供了一种用于生产双链寡核苷酸结构的方法，其中配体进一步结合到包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构。
例如，所述用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的配体结合的双链寡核苷酸结构的方法可以包括以下步骤：
(1)将亲水性化合物结合到具有与其结合的官能团的固体支持物；
(2)在具有与其结合的官能团和亲水性化合物的固体支持物上合成寡核苷酸单链；
(3)将疏水性化合物共价结合到寡核苷酸单链的5'端；
(4)合成具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链；
(5)在合成完成后，从固体支持物分离官能团-寡核苷酸-聚合物结构和具有互补序列的寡核苷酸单链；
(6)通过官能团将配体与亲水性化合物的末端结合，以产生配体-寡核苷酸-聚合物结构单链；以及
(7)用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的配体-寡核苷酸-聚合物结构，从而产生配体/双链寡核苷酸结构。
在步骤(6)之后，可以分离并且纯化产生的配体-寡核苷酸-聚合物结构和具有互补序列的寡核苷酸单链，并且然后可以使用MALDI-TOF质谱仪测量其分子量，以便确认产生了所希望的配体-RNA-聚合物结构和所希望的具有互补序列的RNA单链。通过用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的配体/RNA-寡核苷酸结构，可以产生配体/双链-寡核苷酸结构。在以上生产方法中，合成具有与步骤(3)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链的步骤(4)可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(6)的任一个步骤期间进行。
在又另一方面，本发明涉及一种包含根据本发明的双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。根据本发明的双链寡核苷酸通过疏水性化合物的疏水性相互作用形成自组装的纳米颗粒(韩国专利号1224828)。这些纳米颗粒具有优异的体内递送效率和体内稳定性。此外，纳米颗粒的高粒度均匀性使质量控制(QC)容易，并且因此将这些纳米颗粒制备为药物的方法是容易的。
在本发明中，纳米颗粒还可以由包含含有不同序列的双链结构的双链寡核苷酸结构的混合物构成。例如，纳米颗粒可以包含一种双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10至12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列；然而，在另一个实施方案中，纳米颗粒可以包含不同种类的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其各自包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10至12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列，并且还可以包含未在本发明中公开的双调蛋白特异性双链寡核苷酸。
对于施用，除上述活性成分之外，本发明的组合物还可以进一步含有一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体应与所述活性成分相容，并且可以选自生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其两种或更多种的混合物。如果需要，则所述组合物可以含有其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂或细菌抑制剂。此外，可以将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂另外添加到组合物中以制备可注射配制品(如水性溶液、悬浮液和乳液)。特别地，所述组合物优选地作为冻干配制品提供。为了制备冻干制剂，可以使用本发明所属领域中已知的常规方法，并且还可以加入用于冻干的稳定剂。此外，所述组合物可以优选地通过本领域已知的合适方法或通过Remington’s Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的方法取决于各种疾病或组分来配制。
本发明的组合物的剂量可以由本领域技术人员基于患者的状况和疾病的严重程度来确定。此外，所述组合物可以被配制成各种剂型，包括粉剂、片剂、胶囊剂、液体剂、注射溶液、软膏剂和糖浆配制品，并且可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿或小瓶)中提供。
本发明的组合物可以口服或肠胃外施用。根据本发明的组合物可以例如通过口服、经由吸入、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、直肠内、舌下或局部施用，但不限于此。根据本发明的组合物的剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、施用持续时间、施用方式、排泄率、疾病严重程度等而变化，并且可以由本领域技术人员容易地确定。此外，对于临床施用，可以使用已知技术将本发明的组合物制备成合适的配制品。
在仍又另一个方面，本发明涉及一种包含药物组合物的冻干配制品。
在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗肥胖症的方法，其包括向需要预防或治疗肥胖症的受试者施用选自以下的任一种的步骤：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
在又另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗肥胖症的方法的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的任一种：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
在又另一方面，本发明涉及选自以下的任一种在制造用于预防或治疗肥胖症的药物中的用途：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一个序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
在本发明中，肥胖症可以是由糖尿病引起的内脏脂肪型肥胖症，但不限于此。
在本发明中，根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构可以展现出一种或多种以下效果，但不限于：
(i)体重减轻，
(ii)食物效率比率降低，
(iii)皮下脂肪减少，
(iv)内脏脂肪减少，
(v)脂肪细胞面积减小，以及
(vi)对肝脏脂肪形成的抑制。
在本发明中，所述效果可以通过抑制脂肪组织中的双调蛋白表达展现，但展现效果的机制不限于此。
在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域技术人员来说清楚的是，本发明的范围不被解释为受这些实施例的限制。
在本发明中，鉴定了能够抑制双调蛋白表达的三种特异性序列，并且证实这些序列可以与编码双调蛋白的mRNA互补地结合并且有效地抑制双调蛋白表达，从而有效地治疗肥胖症相关疾病。
实施例1.用于筛选靶向双调蛋白的SAMiRNA的算法和候选序列的选择
基于SAMiRNA的药物高通量筛选是这样的方法，其中通过对整个mRNA应用1碱基或2碱基滑动窗口算法产生所有可能的候选序列，通过进行同源性过滤去除不必要的候选序列，并且确定目的基因的表达被所有最终选择的SAMiRNA抑制的程度。
首先，进行针对双调蛋白的SAMiRNA候选序列的设计过程。具体地，通过对人双调蛋白mRNA NM_001657.3(1,290bp)应用1碱基滑动窗口算法，选择各自由19个核苷酸组成的1,257个SAMiRNA候选序列，并且进行对双调蛋白的抑制程度的实验。
实施例2.双链寡RNA结构的合成
本发明中产生的双链寡RNA结构(SAMiRNA)由以下结构式表示：
C24-5'S 3'-(六乙二醇-PO3 -)3-六乙二醇AS 5’-PO4
为了合成monoSAMiRNA(n＝4)双链寡核苷酸结构的有义菌株，将3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG用作支持物，并且通过反应将作为亲水性单体的三个去甲氧基三苯甲基(DMT)六乙二醇氨基磷酸酯连续结合到支持物。接下来，进行RNA或DNA的合成，并且然后将含有二硫键的疏水性C24(C6-S-S-C18)结合到5'端区域，从而合成monoSAMiRNA(n＝4)的有义链，其中NAG-六乙二醇-(-PO3 -六乙二醇)3结合到3'端，并且C24(C6-S-S-C18)结合到5'端。
在合成完成后，通过在60℃水浴中用28％(v/v)氨处理，将合成的RNA单链和寡(DNA或RNA)-聚合物结构从CPG分离，并且然后通过去保护反应去除保护残基。在去除保护残基后，在70℃的烘箱中，用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三甲胺和三乙胺三氢氟化物处理RNA单链和寡(DNA或RNA)-聚合物结构，以去除2’-TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。通过高效液相色谱(HPLC)从反应产物分离RNA单链、寡(DNA或RNA)-聚合物结构和配体结合的寡(DNA或RNA)-聚合物结构，并且使用MALDI-TOF质谱分光光度计(MALDI TOF-MS，SHIMADZU，日本)测量其分子量，以确认它们是否与希望合成的核苷酸序列和聚合物结构匹配。此后，为了产生每个双链寡核苷酸结构，将有义链和反义链混合在一起，添加到1X退火缓冲液(30mM HEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁，pH 7.0至7.5)中，允许在90℃的水浴中反应3分钟，并且然后允许在37℃下反应，从而产生所希望的SAMiRNA。通过电泳确认产生的双链寡RNA结构的退火。
实施例3.靶向人双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的高通量筛选(HTS)
3-1SAMiRNA纳米颗粒的产生
将实施例2中合成的1,257个靶向双调蛋白序列的SAMiRNA溶解在1X杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，韩国)中，并且在冷冻干燥器(LGJ-100F，中国)中冷冻干燥5天。将冷冻干燥的纳米颗粒粉末溶解在1.429ml去离子蒸馏水(Bioneer，韩国)中并且均质化，并且用于本发明的实验中。
3-2用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，美国)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，美国)的GibcoTMHam’F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，美国)中于37℃在5％CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以2X104个细胞/孔的密度接种到96孔板(Costar，美国)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并以500nM或1,000nM的SAMiRNA浓度用稀释液处理细胞。总共进行四次(每12小时一次)用SAMiRNA的处理，并且将细胞在37℃下在5％CO2下培养。
3-3通过对人双调蛋白mRNA表达的抑制的分析来筛选SAMiRNA
从实施例3-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。为了分析双调蛋白基因的mRNA表达水平，将300nM AREG正向引物、300nM AREG反向引物、300nM AREG探针、300nM RPL13A正向引物、300nM RPL13A反向引物、300nM RPL13A探针、400nM TBP正向引物、400nM TBP反向引物和300nM TBP探针添加到
Figure GDA0004195565220000174
Dual-HotStart RT-qPCR试剂盒(Bioneer，韩国)的每个孔中，并且干燥(下表2显示在高通量筛选(HTS)实验中使用的引物和水解探针的序列)。为了评价所制备试剂盒的性能，使用A549细胞总RNA创建校准曲线，并且确定PCR扩增效率(表3)。在以下条件下执行RT-qPCR：95℃5分钟，并且然后45个循环，每个循环由95℃ 5秒和58℃ 15秒组成。使用在每个循环中检测荧光值的方案。
使经SAMiRNA处理的96孔板(Costar，美国)进行总RNA提取，并根据自动化程序使用自动化系统韩国ExiStation HTTM的和单独制备的包含用于分析双调蛋白的引物和探针的
Figure GDA0004195565220000171
Dual-HotStart RT-qPCR试剂盒(Bioneer，韩国)进行一步RT-qPCR。
基于qPCR阵列后获得的两个基因的Ct值，通过2(-ΔΔC(T))方法分析相比于对照组中的双调蛋白，测试组中的双调蛋白的相对mRNA表达水平[Livak KJ,SchmittgenTD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.12月；25(4):4 02-8]。
[表2]在高通量筛选(HTS)实验中使用的引物和水解探针的序列
Figure GDA0004195565220000172
[表3]3-plex RT-qPCR扩增功效
斜率 R2 效率
AREG Y＝-0.2778X+12.3894 0.9998 90％
RPL13A Y＝-0.2863X+10.5964 0.9999 93％
TBP Y＝-0.2892X+13.0351 0.9946 95％
为了选择高效的SAMiRNA，选择14个SAMiRNA，其具有SEQ ID NO:1至14中的每种序列作为有义链。在此，所选择的SAMiRNA显示出最高的效率，其中与对照相比，在500nM或1,000nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图1所示，最终从1,257个靶向双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的14个SAMiRNA。下表4中示出了关于所选择的SAMiRNA的序列的信息。
[表4]通过1-碱基滑动窗口筛选和高通量筛选(HTS)选择的双调蛋白特异性SAMiRNA候选序列
Figure GDA0004195565220000173
Figure GDA0004195565220000181
实施例4.靶向人双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的筛选
用具有SEQ ID NO:1至14中的每种序列作为有义链的SAMiRNA(在实施例3中选择)处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白mRNA的表达模式。
4-1用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，美国)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，美国)的GibcoTMHam’F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，美国)中于37℃在5％CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以8X104个细胞/孔的密度接种到12孔板(Costar，美国)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并以200nM或600nM的SAMiRNA浓度用稀释液处理细胞。总共进行四次(每12小时一次)用SAMiRNA的处理，并且将细胞在37℃下在5％CO2下培养。
4-2通过对人双调蛋白mRNA表达的抑制分析来筛选SAMiRNA
从实施例4-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
4-2-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例4-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的
Figure GDA0004195565220000191
RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25ml Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的/>
Figure GDA0004195565220000192
RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μL。在基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA 4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
4-2-2人双调蛋白mRNA的相对mRNA表达水平的定量分析
使用实施例4-2-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例4-2-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl
Figure GDA0004195565220000193
2X GreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；每种引物10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)x100定量用双调蛋白特异性SAMiRNA处理的细胞中靶基因的相对表达水平。
为了选择高效的SAMiRNA，选择三个SAMiRNA，其具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链。在此，所选择的SAMiRNA显示出最高的效率，其中与对照相比，在200nM或600nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图3所示，最终从14个靶向双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的3个SAMiRNA。下表6中示出了关于所选择的SAMiRNA的序列的信息。
[表5]关于qPCR的引物序列的信息
引物 序列 SEQ ID NO
hGAPDH-F GGTGAAGGTCGGAGTCAACG 15
hGAPDH-R ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 16
hAREG-F ACACCTACTCTGGGAAGCGT 17
hAREG-R GCCAGGTATTTGTGGTTCGT 18
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
[表6]有效抑制双调蛋白表达的SAMiRNA序列
SEQ ID NO 代码名称 位置 有义链序列
10 SAMi-AREG#10 341-359 CACCTACTCTGGGAAGCGT
11 SAMi-AREG#11 342-360 ACCTACTCTGGGAAGCGTG
12 SAMi-AREG#12 349-367 CTGGGAAGCGTGAACCATT
实施例5.通过所选择SAMiRNA抑制肺癌细胞系(A549)中的人双调蛋白表达
用具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的SAMiRNA(在实施例4中选择)处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白mRNA的表达模式，以确定SAMiRNA的IC50值。
5-1SAMiRNA纳米颗粒的生产和粒度分析
将实施例2中合成的3个靶向双调蛋白序列的SAMiRNA中的每个都溶解在1X杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，韩国)中，并且在冷冻干燥器(LGJ-100F，日本)中冷冻干燥5天。将冷冻干燥的纳米颗粒粉末溶解在2ml去离子蒸馏水(Bioneer，韩国)中并且均质化，并且用于本发明的实验中。为了分析产生的SAMiRNA纳米颗粒的粒度，使用ZetasizerNano ZS(Malvern，英国)测量SAMiRNA的大小和多分散指数。SAMiRNA纳米颗粒的大小和多分散指数的测量结果在下表7中示出，并且以图形方式在图2中示出。
[表7]双调蛋白特异性SAMiRNA纳米颗粒的大小和多分散指数
代码名称 大小 PDI
SAMi-AREG#10 103.9±3.8 0.406±0.065
SAMi-AREG#11 99.9±4.0 0.501±0.005
SAMi-AREG#12 170.1±7.5 0.457±0.084
5-2用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了评价所选择的SAMiRNA抑制双调蛋白表达的作用，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，美国)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，美国)的GibcoTMHam’F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，美国)中于37℃在5％CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以(Costar，美国)8X104个细胞/孔的密度接种到12孔板(Costar，美国)中。第二天，将以上实施例5.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1XDPBS稀释，并且将细胞用稀释液处理至SAMiRNA浓度为12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM或1200nM。用SAMiRNA处理细胞，总共进行四次(每12小时一次)，并且将细胞在37℃在5％CO2下培养。
5-3通过对人双调蛋白mRNA表达的抑制分析来测定SAMiRNA的IC50
从实施例5-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
5-3-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例5-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的
Figure GDA0004195565220000201
RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25ml Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的/>
Figure GDA0004195565220000202
RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μl。在基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA 4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
5-3-2人双调蛋白的相对mRNA表达水平的定量分析
使用实施例5-3-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例5-3-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl
Figure GDA0004195565220000211
2X GreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；每种引物10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)x100定量用双调蛋白特异性SAMiRNA处理的细胞中靶基因的相对表达水平。
结果是，证实了具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的所有双调蛋白特异性SAMiRNA即使在100nM的浓度下也显示出双调蛋白的mRNA表达水平的50％或更多降低，表明双调蛋白特异性SAMiRNA展现出以高效率抑制双调蛋白表达的作用。证实了对于具有SEQ ID NO:10的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA的IC50值如图4所示为28.75nM，对于具有SEQ ID NO:11的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA如图5所示为26.04nM，以及对于具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA如图6所示为12.07nM。特别地，证实了如图6所示即使在25nM的低浓度下，具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA也显示出双调蛋白的mRNA表达水平的50％或更多降低，表明其在三种所选择序列中展现出最有效地抑制双调蛋白基因表达的作用。
实施例6.使用人外周血单个核细胞(PBMC)评价体外细胞毒性
为了检查先天免疫相关细胞因子的mRNA表达水平是否因SAMi-hAREG而增加，将
Figure GDA0004195565220000212
冷冻保存的人PBMC(人外周血单个核细胞)，Cellular Technology Limited，美国)以每孔5x105个细胞的密度接种到12孔板(/>
Figure GDA0004195565220000213
美国)中，所述板具有含有10％FBS(胎牛血清；HycloneTM)的RPMI1640(HycloneTM)培养基。将细胞在5％CO2培养箱中于37℃下培养1小时以使其稳定，并且然后将接种的PBMC用2.5μM的SAMiCON(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#10(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#11(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#12(DNA/RNA)、SAMiCON(RNA/RNA)、SAMi-hAREG#10(RNA/RNA)、SAMi-hAREG#11(RNA/RNA)和SAMi-hAREG#12(RNA/RNA)中的每一种处理，并且在5％CO2培养箱中于37℃下培养6小时。作为阳性对照，使用20μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma Aldrich，美国)。
此后，收获所有细胞，并且根据制造商的方案，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，德国)和RNase-Free DNase Set(Qiagen，德国)从其中提取总RNA。
将200ng提取的RNA与去离子无菌DW(Bioneer，韩国)和RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的
Figure GDA0004195565220000214
RocketScriptTMCycle RT Premix)混合，并且允许使用基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)使混合物在12个循环的条件下反应，每个循环由37℃ 30秒、48℃ 4min和55℃ 30秒以及然后95℃5min组成，从而合成总共20μl的cDNA。
将合成的cDNA与针对RPL13A、IL1B、IL6、IFNG、TNF和IL12B基因中的每一种的qPCR引物混合，并且然后使用ExicyclerTM96实时定量热模块(Bioneer，韩国)在以下条件下扩增：95℃ 5min，并且然后45个循环，每个循环由95℃ 5秒和58℃ 15秒组成。
基于qPCR阵列后获得的两个基因的Ct值，通过2(-ΔΔC(T))方法分析相比于对照组，测试组中的相对mRNA表达水平(％)[Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.12月；25(4):4 02-8]。
结果是，如图7所示，证实了未观察到由双调蛋白特异性SAMiRNA#10、SAMiRNA#11和SAMiRNA#12中的每一种导致的在人外周血单个核细胞(人PBMC)中先天免疫相关细胞因子的表达。
实施例7.包含SEQ ID NO:10、11和12中的每种所选择序列作为有义链的DNA/RNA杂合和RNA/RNA杂合SAMiRNA对人双调蛋白表达的抑制的比较分析
用包含具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA(在实施例4中选择)的每种双链DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)。
7-1用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，美国)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，美国)的GibcoTMHam’F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，美国)中于37℃在5％CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以8X104个细胞/孔的密度接种到12孔板(Costar，美国)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并以200nM、600nM或1200nM的SAMiRNA浓度用稀释液处理细胞。用SAMiRNA处理细胞，总共进行四次(每12小时一次)，并且将细胞在37℃在5％CO2下培养。
7-2通过对人双调蛋白mRNA表达的抑制分析来筛选SAMiRNA
从实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
7-2-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的
Figure GDA0004195565220000221
RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25μl Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的/>
Figure GDA0004195565220000222
RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μl。在基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA 4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
7-2-2相对人双调蛋白mRNA表达水平的定量分析
使用实施例7-2-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例7-2-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl
Figure GDA0004195565220000223
2X GreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；每种引物10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)x100定量靶基因的相对表达水平。
为了从双链DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体选择高效的SAMiRNA，最终选择具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的DNA/RNA杂合SAMiRNA。在此，所选择的序列DNA/RNA杂合SAMiRNA(基因表达抑制为90％或更高)显示出最高的效率，其中与对照相比，在200nM、600nM或1200nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图8所示，最有效地抑制双调蛋白基因表达的DNA/RNA杂合SAMiRNA 12最终选自分别包含三种所选择的双调蛋白特异性SAMiRNA的DNA/RNA和RNA/RNA杂合体。
实施例8.靶向小鼠双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的高通量筛选(HTS)在siRNA治疗剂的情况下，难以鉴定可适用于不同菌株的最佳序列。在这种情况下，应用美国FDA指南，根据所述指南，设计对用于分析治疗作用(体内功效测试)的动物模型具有特异性的DNA序列(替代序列；小鼠基因特异性siRNA)，以便验证由抑制目的基因表达导致的药理学活性和由抑制目的基因表达导致的毒性(由FDA/CDER的药理学博士/毒物学审查员Robert T.Dorsam呈现)。
先前发现的筛选已通过基于现有算法的siRNA程序(由申请人公司拥有的Turbo-si-designer)进行了修改，并且进行基于SAMiRNA的siRNA序列高通量筛选。针对整个靶基因进行19-mer siRNA的1碱基滑动窗口扫描(与上述人双调蛋白靶筛选相同的方法)，并且针对可能的小鼠双调蛋白基因(NM_009704.4)完整转录物序列产生总共1,190个候选siRNA序列。进行blast序列同源性过滤以去除影响其他基因表达的不必要的候选序列，并且合成237个最终选择的SAMiRNA。用在含有10％FBS的细胞培养基中浓度为1μM的每种所选择SAMiRNA处理小鼠NIH3T3细胞系，并且首先使用表8(qPCR的引物序列信息)中所示的引物筛选SAMiRNA的体外表达抑制作用(图9)。
此后，以在含有10％FBS的细胞培养基中200nM和500nM的处理浓度，用在NIH3T3细胞系中选择的两个序列(SEQ ID NO:19和20)中的每个和通过先前的里程碑式研究发现的SEQ ID NO:21的小鼠SAMiRNA-双调蛋白处理小鼠肺成纤维细胞系MLg，并且进行另外的筛选。作为结果，证实了SEQ ID NO:20展现出最好的表达抑制作用(图10a)。
另外，以在含有10％FBS的细胞培养基中200nM、500nM和1,000nM的处理浓度，用两个所选择序列(SEQ ID NO:19和20)中的每个和通过先前的里程碑式研究发现的SEQ IDNO:21的小鼠SAMiRNA-双调蛋白处理小鼠肺上皮细胞系LA-4(
Figure GDA0004195565220000232
CCL-196TM，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并且另外评价表达抑制作用。结果是，再次证实了SEQ ID NO:20展现出最好的表达抑制作用(图10b)。
如图10所示，最终从237个靶向小鼠双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的两种SAMiRNA，并且所选择SAMiRNA的序列信息在下表9中示出。
[表8]关于qPCR的引物序列的信息
Figure GDA0004195565220000231
Figure GDA0004195565220000241
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
[表9]有效抑制小鼠双调蛋白表达的SAMiRNA序列
SEQ ID NO 代码名称 位置 有义链序列
19 SAMi-mAREG#19 936-954 AACGGGACTGTGCATGCCA
20 SAMi-mAREG#20 937-955 ACGGGACTGTGCATGCCAT
21 SAMi-mAREG#21 1071-1089 CAGTTGTCACTTTTTATGA
9-1.动物测试方法
购买5周龄BKS.Cg-m+/+Leprdb/(KRIBB；韩国生物科学与生物技术研究所)并使用小鼠进行实验。使购买的肥胖症糖尿病小鼠(db/db小鼠)适应3周，然后喂食啮齿动物饮食(2918C，Harlan，美国)8周，并在以下条件下使用小鼠进行实验。为了比较，从Nara BiotechCo.,Ltd.(韩国)购买5周龄非肥胖症正常小鼠(C57BL/6小鼠)并使用小鼠进行实验。使这些小鼠也适应3周并喂食啮齿动物饮食。用于实验的所有小鼠组均由6只动物组成。
将100μl PBS(C-9011，Bioneer，韩国)施用给正常对照组，并将肥胖症糖尿病小鼠分成三组，每周三次通过皮下注射分别施用100μl PBS、100μl SAMiRNA-对照(5mg/kg)和100μl SAMiRNA-AREG(5mg/kg)。在实验期间，将小鼠置于温度21℃±2℃、湿度55％±5％、15至17/小时、照明度150至300Lux和12小时光照/12小时黑暗循环(开启：06:00，关闭：18:00)的恒定环境中。药物施用8周后，将小鼠禁食16小时并处死。
9-2.体重、食物摄入量和水摄入量的测量
每周两次在预定时间点测量体重、食物摄入量和水摄入量。
9-2-1.体重变化
每周两次在预定时间点测量每只小鼠的体重(g)。正常对照组体重随时间逐渐增加，并且小鼠处死时体重为32.5±1.64g。三个肥胖症糖尿病组分别显示平均体重28.9±2.35g(施用PBS)、27.4±3.93g(施用SAMiRNA-对照)和29.7±4.12g(施用SAMiRNA-AREG)(图11)。
作为观察第8周体重的结果，各组之间的体重没有统计学上显著的差异，但是与正常对照小鼠相比，所有肥胖症糖尿病小鼠组都显示出轻微的体重减轻，并且肥胖症糖尿病小鼠组与肥胖症和糖尿病组之间的体重没有统计学上显著的差异。
9-2-2.食物摄入量和水摄入量的变化
作为测量小鼠食物摄入量的结果，证实了正常对照组的平均每日食物摄入量为约4g，而所有肥胖症糖尿病组为约8g，表明肥胖症糖尿病小鼠的食物摄入量是正常对照组的食物摄入量的多于两倍(图12)。此外，正常对照小鼠的水摄入量为约5mL/天，但肥胖症糖尿病小鼠为20至35mL/天，这显著更高(图13)。
9-3.脂肪重量变化
对于脂肪重量测量，从处死的小鼠中提取皮下脂肪和内脏脂肪，测量它们的重量，并评价脂肪重量与小鼠重量的比率。
皮下脂肪比率在正常对照小鼠中为1.56±0.36，在施用PBS的肥胖症糖尿病小鼠中为4.32±0.73，在施用SAMiRNA-对照的肥胖症糖尿病小鼠中为3.63±1.80，并且在施用SAMiRNA-AREG的肥胖症糖尿病小鼠中为3.15±0.58。因此，可以证实，在肥胖症糖尿病小鼠中，通过根据本发明降低双调蛋白的表达水平可显著降低皮下脂肪的重量(图14)。
内脏脂肪比率在正常对照小鼠中为1.28±0.31，在施用PBS的肥胖症糖尿病小鼠中为1.97±0.25，在施用SAMiRNA-对照的肥胖症糖尿病小鼠中为1.59±0.38，并且在施用SAMiRNA-AREG的肥胖症糖尿病小鼠中为0.76±0.12。因此，可以证实，在肥胖症糖尿病小鼠中，通过根据本发明降低双调蛋白的表达水平显著降低内脏脂肪的重量(图15和图16)。
9-4.空腹血糖水平测量和血清葡萄糖水平测量
在小鼠处死前一周使用简单血糖仪(Accu-ChekTM Active,Roche,德国)测量空腹血糖水平(mg/dL)，并通过KP&T Co.,Ltd测量血清葡萄糖水平。
血糖水平在正常对照小鼠中为153.2±12.07，在施用PBS的肥胖症糖尿病小鼠中平均为551.8±53.73，在施用SAMiRNA-对照的肥胖症糖尿病组中平均为577.3±40.25，并且在施用SAMiRNA-AREG的肥胖症糖尿病组中平均为555.7±49.15(图17)。
血清葡萄糖水平(mg/dL)在正常对照小鼠中为149.6±20.4，在施用PBS的肥胖症糖尿病小鼠中平均为689.1±185.4，在施用SAMiRNA-对照的肥胖症糖尿病组中为755.5±89.4，在施用SAMiRNA-AREG的肥胖症糖尿病组中平均为874.3±119.4(图18)。
因此，证实了根据本发明的肥胖症糖尿病小鼠中双调蛋白表达水平的降低对糖尿病动物模型中空腹血糖水平或血清葡萄糖水平的控制没有显著影响。
实施例10.使用高脂肪饮食肥胖症模型评价抗肥胖症效果
为了评价双调蛋白表达抑制剂的抗肥胖症效果，将双调蛋白表达抑制剂SAMiRNA-AREG(SAMi-mAREG#20)施用给高脂肪饮食诱导的肥胖症模型，并观察其对脂肪减少的效果。施用高脂肪饮食后，每周施用药物三次，持续5周，然后分析各种指标。
10-1.高脂肪饮食施用后双调蛋白表达水平的分析
购买5周龄C57BL/6小鼠(Nara Biotech Co.,Ltd.)并使用小鼠进行实验。使购买的小鼠适应1周，然后喂食60kcal％脂肪饮食(D12492，Research Diets,Inc.)6周。接着，提取附睾脂肪并测量其中的mRNA水平。
使用QIAzol裂解试剂(QIAZEN.，德国)和RNeasy微型试剂盒(QIAZEN.，德国)的组合从脂肪组织中提取总RNA。将100mg脂肪组织添加至1ml QIAzol裂解试剂中，均质化，然后在室温下孵育5分钟。在4℃下以12,000g离心10分钟后，收集除上部脂肪单层外的下部样品。将200μl氯仿(Sigma-Aldrich，美国)添加到样品中并且与样品充分混合，将混合物在室温下保持3分钟，随后在4℃下以12,000g离心30分钟。在三个分离相中，收集最上层，向其中添加70％EtOH，并以裂解物:70％EtOH＝1:1的比率与之充分混合，然后装入RNeasy微型试剂盒的RNeasy旋转柱中。随后的过程根据制造商的方案进行。使用分光光度计定量提取的RNA并评价其纯度。
[表9]关于qPCR的引物序列的信息
Figure GDA0004195565220000251
Figure GDA0004195565220000261
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
作为结果，证实了与正常对照组相比，通过施用高脂肪饮食使双调蛋白的表达水平增加12倍(图19)。
10-2.动物测试方法
购买5周龄C57BL/6小鼠(Nara Biotech Co.,Ltd.)并使用小鼠进行实验。使购买的小鼠适应1周，然后喂食60kcal％脂肪饮食(D12492，Research Diets,Inc.)1周，然后使用小鼠在以下条件下进行实验。为了比较，在相同条件下给非肥胖症的正常小鼠喂食啮齿动物饮食(2918C，Harlan，美国)，并且在以下条件下使用小鼠进行实验。对于实验，将小鼠分成正常对照组(ND+PBS)和测试物质施用组(HFD+SAMi-AREG)，每组由6只动物组成，并且阴性对照组(HFD+PBS)由5只动物组成。
将100μl PBS(LB 001-02，WELGENE，韩国)施用给正常对照组(ND+PBS)和阴性对照组(HFD+PBS)，并将100μl SAMiRNA-AREG(5mg/kg)通过皮下注射施用给测试物质施用组(HFD+SAMi-AREG)，每周三次。
在实验期间，将小鼠置于温度21℃±2℃、湿度55％±5％、15至17/小时、照明度150至300Lux和12小时光照/12小时黑暗循环(开启：06:00，关闭：18:00)的恒定环境中。药物施用8周后，将小鼠禁食16小时并处死。
10-3.体重、食物摄入量和水摄入量的测量
每周两次在预定时间点测量体重、食物摄入量和水摄入量。
10-3-1.体重变化
每周两次在预定时间点测量每只小鼠的体重(g)。阴性对照组的体重在PBS施用后随着时间的推移由于高脂肪饮食而趋于增加，并且在小鼠处死时体重为37.3±1.20g。施用PBS的正常对照组的体重(g)平均为26.57±0.36，并且SAMiRNA-AREG施用组平均为33.21±1.16。作为观察第4周和第5周体重的结果，测试物质施用组与阴性对照组之间的体重存在统计学上显著的差异。
与正常对照小鼠的体重相比，高脂肪饮食诱导的阴性对照组中小鼠的体重显著增加，而测试物质施用组中小鼠的体重降低，这是统计学上显著的(图20)。
10-3-2.食物摄入量和水摄入量的变化
作为测量小鼠食物摄入量的结果，证实了正常对照组的平均每日食物摄入量为3.69±0.15g，阴性对照组为2.76±0.06g，并且测试物质施用组为2.55±0.08g，表明高脂肪饮食组的食物摄入量小于阴性对照组，并且阴性对照组与测试物质施用组之间的食物摄入量没有显著差异(图21a)。
因此，作为测量小鼠水摄入量(mL)的结果，证实了正常对照组的每日平均水摄入量为3.27±0.10，阴性对照组为4.00±0.12，并且测试物质施用组为4.22±0.24，表明高脂肪饮食组的水摄入量大于阴性对照组，并且阴性对照组与测试物质施用组之间的水摄入量没有显著差异(图21b)。
10-4.食物效率比率(％)
作为通过将每只小鼠的体重增加(g/天)除以食物摄入量(g/天)来测量食物效率比率的结果，证实了正常对照组的食物效率比率为0.02±0.001，阴性对照组为0.12±0.007，并且测试物质施用组为0.08±0.011，表明即使阴性对照组和测试物质施用组的食物效率比率与正常对照组相比均增加，但测试物质施用组中的食物效率比率显著低于阴性对照组(图22)。
10-5.脂肪重量变化
为了测量脂肪的重量，从处死的小鼠中提取皮下脂肪垫、附睾脂肪垫、肾周脂肪垫和肠系膜脂肪垫，测量其重量，并评价脂肪重量与小鼠重量的比率。
正常对照组中小鼠皮下脂肪垫重量(g)为0.38±0.02，阴性对照组为1.74±0.12，并且测试物质施用组为1.05±0.14，以及正常对照组中附睾脂肪垫重量(g)为0.52±0.03，阴性对照组为2.32±0.09，并且测试物质施用组为1.79±0.16。此外，正常对照组中肾周脂肪垫重量(g)为0.20±0.02，阴性对照组为0.86±0.04，并且测试物质施用组为0.67±0.08，以及正常对照组中肠系膜脂肪垫重量(g)为0.25±0.01，阴性对照组为0.66±0.09，并且测试物质施用组为0.45±0.04(图23a)。
正常对照组中小鼠皮下脂肪垫重量的比率(％)为1.39±0.08，阴性对照组为4.65±0.23，并且测试物质施用组为3.11±0.35，以及正常对照组中附睾脂肪垫重量的比率(％)为1.91±0.10，阴性对照组为6.23±0.09，并且测试物质施用组为5.36±0.29。此外，正常对照组中肾周脂肪垫重量的比率(％)为0.73±0.06，阴性对照组为2.33±0.13，并且测试物质施用组为2.01±0.17，以及正常对照组中肠系膜脂肪垫重量的比率(％)为0.91±0.02，阴性对照组为1.76±0.19，并且测试物质施用组为1.35±0.07(图23b)。
将小鼠脂肪分成皮下脂肪和内脏脂肪(附睾脂肪、肾周脂肪和肠系膜脂肪)，并测量重量(g)和重量比率(％)。
对于小鼠皮下脂肪，正常对照组中重量为0.38±0.02，阴性对照组为1.74±0.12，并且测试物质施用组为1.05±0.14，以及正常对照组中重量比为1.39±0.08，阴性对照组为4.65±0.23，并且测试物质施用组为3.11±0.35。
对于内脏脂肪，正常对照组中重量为0.97±0.06，阴性对照组为3.85±0.18，并且测试物质施用组为2.92±0.27，以及正常对照组中重量比为3.56±0.17，正常对照组为10.34±0.16，并且测试物质施用组为8.73±0.50。
因此，可以证实与正常对照组相比，阴性对照组中皮下脂肪的重量和重量比以及内脏脂肪的重量和重量比显著增加，并且阴性对照组中重量和重量比的这种增加在测试物质施用组中显著降低(图24a和24b)。
10-6.显微CT分析
对于小鼠脂肪的显微CT分析(Korea Basic Science Institute，GwangjuCenter)，从每组中选择两只中等体重动物。对选择的小鼠拍照，并绘制皮下脂肪和内脏脂肪的体积。
正常对照组中皮下脂肪体积(mm3)为1661±289.5，阴性对照组为6356±217，并且测试物质施用组为4040±284.5，以及正常对照组中内脏脂肪体积(mm3)为1069±90，阴性对照组为3782±7，并且测试物质施用组为2623±166。
作为结果，可以证实，与正常对照组相比，阴性对照组中皮下脂肪和内脏脂肪的体积增加，并且与阴性对照组相比，测试物质施用组中皮下脂肪和内脏脂肪的体积减少(图25)。
10-7.脂肪组织的组织病理学检查
从小鼠中提取皮下脂肪垫、附睾脂肪垫、肾周脂肪垫和肠系膜脂肪垫，在10％中性缓冲福尔马林(Sigma，HT50-1-640)中固定24小时或更长时间，用乙醇脱水，然后用二甲苯清除三次。然后，将组织样品浸润并包埋在液体石蜡中，从而制备石蜡块。接着，将5μm厚的组织切片脱蜡并再水合，并将细胞核用Harris苏木精染色溶液染色5分钟，随后用伊红溶液反染色。染色后，将封固溶液滴在组织载玻片上，然后用盖玻片覆盖并硬化。使用倒置显微镜(Nikon Eclipse TS2)在200x放大率下对用防腐溶液硬化的组织载玻片拍照，并计算脂肪细胞的面积。
对于皮下脂肪垫，正常对照组中脂肪细胞面积(mm2)为913.8±129.9，阴性对照组为3,575.0±346.7，并且测试物质施用组为1,337.0±211.1，以及对于附睾脂肪垫，正常对照组中脂肪细胞(mm2)为950.6±73.2，阴性对照组为1,598.0±99.6，并且测试物质施用组为1347.0±100.1。对于肾周脂肪垫，正常对照组中脂肪细胞面积(mm2)为1,734.0±158.8，阴性对照组为5,365.0±190.4，并且测试物质施用组为2,516.0±288.3，以及对于肠系膜脂肪垫，正常对照组中脂肪细胞面积(mm2)为1,552.0±680.3，阴性对照组为3,495.0±425.3，并且测试物质施用组为1,436.0±163.3。
作为结果，可以证实，与正常对照组相比，阴性对照组中脂肪细胞面积增加，并且与阴性对照组相比，测试物质施用组中脂肪细胞面积减少(图26)。
10-8.肝组织的组织病理学检查
从小鼠中提取肝脏，在10％中性缓冲福尔马林(Sigma，HT50-1-640)中固定超过24小时，并进行H&E染色和油红O分析，然后检查。
10-8-1.H&E染色
进行H&E(苏木精和伊红)染色以观察在中性缓冲福尔马林中固定后获得的肝组织的整体形态和肝组织中脂质积累的程度。通过石蜡渗透制备组织样品。用乙醇脱水后，用二甲苯清理组织样品三次。使用切片机将组织块切成5μm厚的切片，并将切片在玻片干燥器中干燥1小时，用二甲苯脱蜡，用乙醇处理，然后水合。细胞核首先用Harris苏木精染色溶液染色5分钟，然后用伊红反染色。染色后，将封固溶液滴在组织载玻片上，然后用盖玻片覆盖并硬化。使用显微镜观察用防腐溶液硬化的组织载玻片。
10-8-2.油红O染色
将在中性缓冲福尔马林中固定后获得的肝组织在30％蔗糖溶液中浸润。用PBS溶液洗涤后，将组织脱水并固定在最佳切割温度(O.C.T)化合物(SAKURA，美国)(一种冷冻组织包埋剂)中，以获得冷冻组织块。使用Cryostat CM3050 S(Leica)将固定组织切成14μm厚度以获得组织样品。使用油红O染色评价AREG的脂质积累抑制作用，所述油红O染色是一种特殊的染色方法，其可以通过与脂质组分特异性地且灵敏地反应并显示红色来确定脂质积累的程度。在10％中性缓冲福尔马林(Sigma，HT50-1-640)中固定后，去除固定剂，用100％丙二醇洗涤样品，并用与细胞内脂滴特异性反应的油红O溶液染色。染色后，将封固溶液滴在组织载玻片上，然后用盖玻片覆盖并硬化。使用显微镜观察用防腐溶液硬化的组织载玻片。
10-8-3.肝脏脂肪变化
作为油红O分析后进行定量分析的结果，证实了与正常对照组相比，阴性对照组中脂肪形成增加了6.6倍，与正常对照组相比，测试物质施用组中脂肪形成增加了2.8倍。因此，可以看出，在测试物质施用组中脂肪形成受到抑制(图27)。
10-9.基因表达分析
测定小鼠皮下脂肪垫、附睾脂肪垫和外周脂肪垫中双调蛋白的表达水平。使用TRI试剂(MRC Inc.，美国)和通用RNA提取试剂盒(BIONEER，韩国)的组合从脂肪组织中提取总RNA。将100mg脂肪组织添加至1ml TRI试剂中，均质化，然后在室温下孵育5分钟。在12,000g和4℃下离心10分钟后，收集除上部脂肪单层外的下部样品。将200μl氯仿(Sigma-Aldrich，美国)添加到样品中并且与样品充分混合，将混合物在室温下保持3分钟，随后在4℃下以12,000g离心30分钟。在三个分离相中，收集最上层，向其中添加异丙醇，并以裂解物:异丙醇＝400:300的比率与之充分混合，然后装入通用RNA提取试剂盒的
Figure GDA0004195565220000291
结合柱III中。根据制造商的方案进行随后的过程。使用分光光度计定量提取的RNA，评价其纯度，并通过RNA凝胶电泳测定其降解程度。
[表10]关于qPCR的引物序列的信息
Figure GDA0004195565220000292
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
10-9-1.脂肪组织中双调蛋白mRNA水平
与正常对照组相比，阴性对照组中小鼠皮下脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平增加了1.8倍，而与阴性对照组相比，测试物质施用组中小鼠皮下脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平降低了1.6倍。
与正常对照组相比，阴性对照组中附睾脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平增加了3.2倍，而与阴性对照组相比，测试物质施用组中附睾脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平降低了1.3倍。
与正常对照组相比，阴性对照组中肾周脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平增加了3.7倍，而与阴性对照组相比，测试物质施用组中肾周脂肪垫中的双调蛋白mRNA水平降低了1.5倍(图28)。
尽管已经参考具体特征详细地描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，此描述仅是本发明的优选实施方案的描述，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同方案限定。
工业实用性
根据本发明的药物组合物具有减少内脏脂肪以及皮下脂肪的优异效果，因此可有效地用于治疗和预防心血管疾病、代谢疾病、糖尿病和由内脏脂肪引起的并发症成为问题的各种其他疾病。
<110> 柏业公司
思耐基因
<120> 用于预防或治疗肥胖症相关疾病的含有双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构的组合物
<130> P21-B097
<150> KR 1020200057879
<151> 2020-05-14
<160> 60
<170> KoPatentIn 3.0
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<223> Amphiregulin siRNA sense
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtgtttgacg gcatcccacc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPL13A Reverse primer
<400> 30
taggcttcag acgcacgacc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPL13A probe
<400> 31
aagcggatgg tggttcctgc t 21
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBP Forward primer
<400> 32
caccacagct cttccactc 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBP Reverse primer
<400> 33
atcccagaac tctccgaagc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBP probe
<400> 34
acccttgccg ggcaccactc 20
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 35
gcaccugccg cuuuauagg 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 36
ccgggagugu gcgccgcuc 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 37
gcaacucggu cucugggac 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 38
uucgcagcgg cggcgucuc 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 39
acagcaccac cggcgccgg 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 40
caagagcgac agcaccacc 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 41
gagccgagua ucaagagcg 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 42
ccugagccga guaucaaga 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 43
guagguguca uugaggucc 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 44
acgcuuccca gaguaggug 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 45
cacgcuuccc agaguaggu 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 46
aaugguucac gcuucccag 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 47
agaaaauggu ucacgcuuc 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amphiregulin siRNA antisense
<400> 48
agcacugugg uccccagaa 19
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAMiRNA-Control(human) Sense
<400> 49
cttacgctga gtacttcga 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAMiRNA-Control(human) Antisense
<400> 50
ucgaaguacu cagcguaag 19
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Areg Forward primer
<400> 51
agtagtagct gtcactatct ttgtc 25
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Areg Reverse primer
<400> 52
cccgttttct tgtcgaagc 19
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Areg probe
<400> 53
cctcgcagct attggcatcg gca 23
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tfrc Forward primer
<400> 54
aaacttgccc aagtattctc ag 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tfrc Reverse primer
<400> 55
atgaaaggta tccctccaac c 21
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tfrc probe
<400> 56
tgccagctgg actgcaggcg act 23
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Areg Forward primer
<400> 57
gaggcttcga caagaaaacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Areg Reverse primer
<400> 58
accaatgtca tttccggtgt 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapdh Forward primer
<400> 59
agggtggagc caaaagggtc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gapdh Reverse primer
<400> 60
ggctaagcag ttggtggtgc 20

Claims (25)

1.一种用于治疗或预防肥胖症的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的任一种：
(i)双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：10、11和12的任一个序列以及含有与所述有义链的序列互补的序列的反义链；
(ii)双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式(1)表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸(i)；以及
(iii)含有所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构(ii)的纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述有义链或所述反义链由19至31个核苷酸组成。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述寡核苷酸是siRNA、shRNA或miRNA。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述有义链或所述反义链独立地是DNA或RNA。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述双链寡核苷酸的所述有义链或所述反义链包含化学修饰。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述化学修饰是选自以下的任何一种或多种：
其中一个或多个核苷酸中的糖结构的2′碳位置处的OH基被选自甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、胺基(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨丙基、-O-3-二甲基氨丙基、-O-N-甲基乙酰胺基和-O-二甲基酰胺基氧乙基中的任一种取代的修饰；
其中核苷酸中的糖结构的氧被硫取代的修饰；将核苷酸之间的键修饰成选自硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键和甲基膦酸酯键的任一个键；
修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)；以及
修饰为DNA-RNA杂合体。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中至少一个磷酸酯基团结合至所述双链寡核苷酸的反义链的5′端。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构包含由以下结构式(2)表示的结构：
[结构式(2)]
A-X-S-Y-B
AS
其中S和AS分别表示根据权利要求1所述的双链寡核苷酸的所述有义链和所述反义链，并且A、B、X和Y是根据权利要求1中所述的。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构包含由以下结构式(3)或(4)表示的结构：
[结构式(3)]
A-X-5′S3′-Y-B
AS
[结构式(4)]
A-X-3′SS′-Y-B
AS
其中A、B、X、Y、S和AS与根据权利要求8所述的相同，并且5′和3′分别表示所述双链寡核苷酸有义链的所述有义链的5′端和3′端。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述亲水性化合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述亲水性化合物具有由以下结构式(5)或(6)表示的结构：
[结构式(5)]
(A′m-J)n
[结构式(6)]
(J-A′m)n
其中A′表示亲水性单体，J表示将m个亲水性单体连接在一起或将m个亲水性单体与所述双链寡核苷酸连接的接头，m是范围从1至15的整数，n是范围从1至10的整数，
所述亲水性单体(A′)是选自以下化合物(1)至(3)中的任一种化合物，并且所述接头(J)选自-PO3 --、-SO3-和-CO2-：
[化合物(1)]
Figure FDA0004042597620000021
其中G选自O、S和NH；
[化合物(2)]
Figure FDA0004042597620000022
[化合物(3)]
Figure FDA0004042597620000023
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构具有由以下结构式(7)或结构式(8)表示的结构：
[结构式(7)]
(A′m-J)n-X-R-Y-B
[结构式(8)]
(J-A′m)n-X-R-Y-B
13.根据权利要求l所述的药物组合物，其中所述亲水性化合物的分子量为200至10,000。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述亲水性化合物的分子量为250至1,000。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述疏水性化合物是选自类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚和生育三烯酚的任一种。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述类固醇衍生物是选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾烷基胺的任一种。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述甘油酯衍生物是选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的任一种。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，其中由X和Y中的每一个表示的所述共价键是不可降解键或可降解键。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述不可降解键是酰胺键或磷酸酯键。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述可降解键是选自二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键的任一种。
21.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒由包含含有不同序列的双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的混合物构成。
22.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肥胖症是由糖尿病引起的内脏脂肪型肥胖症。
23.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物展现出一种或多种以下效果：
(i)体重减轻，
(ii)食物效率比率降低，
(iii)皮下脂肪减少，
(iv)内脏脂肪减少，
(v)脂肪细胞面积减小，以及
(vi)对肝脏脂肪形成的抑制。
24.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物展现出通过抑制脂肪组织中的双调蛋白表达预防或治疗肥胖症的效果。
25.一种冻干配制品，所述冻干配制品包含根据权利要求1所述的药物组合物。
CN202180049663.0A 2020-05-14 2021-05-13 用于预防或治疗肥胖症相关疾病的含有双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构的组合物 Pending CN116157158A (zh)

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