KR100883471B1 - siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의접합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의접합체 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 강력한 유전자 치료제로 사용가능한 siRNA (small interfering RNA)의 생체내 안정성 향상을 위해 이들 siRNA와 친수성 고분자를 공유결합으로 연결시킨 하이브리드 접합체 및 상기 접합체와 양이온성 화합물로 이루어진 고분자 전해질 복합체 미셀에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA와 친수성 고분자 간의 접합체 및 이로부터 형성된 고분자 전해질 복합체 미셀은 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있으며, 또한 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 활성을 나타낼 수 있다.

Description

siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의 접합체 및 그의 제조방법{siRNA-HYDROPHILIC POLYMER CONJUGATES FOR INTRACELLULAR DELIVERY OF siRNA AND METHOD THEREOF}
본 발명은 암 및 다른 감염성 질환의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 siRNA (small interfering RNA)와 친수성 고분자 간의 접합체 및 상기 접합체와 다양한 기능성 양이온성 화합물 간의 이온 결합을 통해 형성되는 고분자 전해질 복합체 미셀(polyelectrolyte complex micelle)에 관한 것이다.
유전자 치료에 있어서 안전하고 효율적인 유전자 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며 다양한 유전자 전달체와 전달기술이 개발되어 왔다. 특히, 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과, 리포좀과 양이온성 지질, 그리고 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 벡터(nonviral vector)를 이용한 유전자 전달기술들이 개발되어 왔다. 그러나, 바이러스 자체를 유전자 치료제의 전달체로 이용하는 방법은, 현재까지의 기술로는 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입되어 숙주 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않는다고 확신할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현되고 있을 경우 자가면역증을 유발하거나, 이러한 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발될 경우 효율적인 방어면역을 일으키지 못할 수도 있다. 따라서, 바이러스성 벡터를 사용하는 방법 대신 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등이 그들 각각의 단점을 개량하는 방향으로 연구되고 있다. 이들 비바이러스성 벡터들은 바이러스성 벡터보다는 그 효율성에 있어 많이 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴해 질 수 있다는 장점이 있다.
또한, 현재 약물 전달 및 유전자 전달 시스템에서 가장 중요하게 떠오르고 있는 접근법은 표적 특이적 전달성(target specific delivery)에 관한 부분이다. 약물을 생체내에 직접 투여하게 되면, 생체내 모든 장기 및 세포들이 동일하게 약물의 공격을 받음으로써 정상세포 및 정상 조직이 손상을 입게 되는 것은 자명한 사실이다. 이로 인해 현재 약물 전달시스템(DDS: drug delivery system)의 연구방향은 선택적 약물 전달 및 유전자 전달을 위한 기술 개발에 있다. 즉, 엽산(folate), 갈락토스(galactose), 항체(antibody) 등과 같은 대표적인 조직/세포 특이적 리간드를 약물에 직접 도입하거나, 또는 약물의 전달체에 접합시켜 전달함으로써, 전달 효율을 극대화하며 정상세포에 미치는 부작용을 최소화하는 노력을 하고 있다. 이러한 조직/세포 특이적 리간드를 유전자 치료제 개발을 위한 전달체 제조에 이용함으로써 세포내 전달 효율을 극대화할 수 있을 것으로 기대된다.
미셀이란 친수성과 소수성의 성질을 가진 물질 중 친수성과 소수성이 특정 비율로 결합될 때 수용액 상에서 열역학적 안정성으로 인해 자연적으로 자가조립 구조가 이루어지는 물질을 의미한다. 수용액 상에서 자가조립하여 미셀을 형성할 수 있는 물질의 내부는 소수성 성질을 갖고 있어 난용성 약물을 손쉽게 포획할 수 있고, 표면은 친수성 성질을 가지므로 난용성 제제의 가용화, 약물 전달 운반체 등에 사용된다. 이러한 소수성의 내부와 이를 둘러싼 친수성 표면에 의한 수용액 상에서의 미셀의 안정화에 대한 개념은 소수성 상호작용 뿐만 아니라 서로 다른 전하를 띄는 고분자 전해질 간의 상호작용까지 넓혀서 적용할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하, "PEG"라 약칭함)을 접합시킨 서로 다른 전하를 지닌 고분자 전해질들은 서로간의 상호작용으로 인해 자발적으로 형성되는 미셀 구조를 지닌 복합체를 형성하는데, 이를 고분자 전해질 복합체 미셀이라 한다(Kataoka K. et al., Macromolecules, 29, 8556-8557, 1996). 이들 고분자 전해질 복합체 미셀들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템, 즉 미소구체(microsphere), 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
생체내로 약물을 전달하기 위한 전달체에 사용되는 고분자는 생체적합성을 갖고 있어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 고분자로는 대표적으로 PEG가 있다. PEG는 미국 식품의약품안전청(FDA)의 승인을 받아 오랫동안 단백질의 특성 개선, 고분자의 표면개질 또는 유전자 전달에 광범위하게 사용되고 있다. PEG는 친수성이며 자체의 독성이 거의 나타나지 않고, 생체 내에서 면역반응을 거의 일으키지 않는 생체 적합성 폴리머이다. 또한, PEG로 표면의 성질을 개질함으로써 단백질의 흡 착을 크게 줄일 수도 있다.
한편, siRNA는 최근 동물세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 유전자 치료제로 각광을 받고 있는 물질로써, 이들의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기서열이 상보적인 치료하고자 하는 유전자의 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제시킨다.
그러나, siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되어 버리므로 그 치료 효율이 급격히 떨어지게 되고, 고가의 siRNA의 투여량을 높게 해야 하며, siRNA가 가지는 음이온성으로 인해 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기가 어려워 결과적으로 세포내로의 전달성이 떨어지게 된다는 문제점이 있다(Celia M. ＆ Henry, Chemical and Engineering News December, 22, 32-36, 2003). 또한, 비록 siRNA가 이중가닥으로 구성되어 있기는 하지만, RNA를 구성하는 리보스당의 결합은 DNA를 구성하는 디옥시리보스당의 결합에 비해 화학적으로 매우 불안정하여 대부분이 생체 내에서 반감기가 30분 내외로 빠르게 분해되어 버린다.
최근에는 siRNA에 여러 가지 작용기를 도입하여 이들을 분해효소로부터 보호하여 안정성을 향상시키고자 하는 시도를 하고 있으나(Frank Czauderna et al., Nucleic Acids Research 31, 2705-2716, 2003 참조), 현재까지 siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술은 개발 단계에 있다고 할 수 있다. 또 한, siRNA의 치료효과를 얻기 위해 이들의 혈액 내에서의 불안정성을 고려하여 단순히 고농도의 siRNA 만을 계속적으로 주입하는 방법을 사용하고 있으나 그 효율이 낮은 것으로 알려져 있으며, 경제적인 측면에서도 유전자 치료제로써 siRNA를 이용하기 위해서는 이들의 세포내 전달이 용이한 새로운 전달체 제조 기술개발이 필연적으로 요구된다고 할 수 있다.
기술적 과제
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 siRNA의 세포내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA의 센스 가닥 혹은 안티센스 가닥의 말단에 생체적합성 고분자인 친수성 고분자를 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 접합시킨 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 접합체와 양이온성 화합물을 상호작용시켜 형성되는 고분자 전해질 복합체 미셀을 제공하는 것이다.
기술적 해결방법
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 siRNA와 친수성 고분자를 공유결합으로 연결시킨 하기 구조의 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체를 제공한다.
P-X-Y
상기에서, P는 친수성 고분자이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, Y는 siRNA를 나타낸다.
본 발명의 접합체에 있어서, 상기 siRNA의 올리고 가닥은 분자량 10,000 내지 30,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. siRNA 올리고 가닥이 상기 범위의 분자량을 가질 경우, 19 내지 30개, 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드를 포함하게 된다. 이 때, 상기 siRNA는 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2 또는 VEGF (vascular endothelial growth factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF 유래의 siRNA를 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 친수성 고분자는 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 유래인 것이 바람직하다. 예를 들어, 친수성 고분자로는 PEG, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 등의 비이온성 친수성 고분자를 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 공유결합(즉, X)은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합(amide bond) 또는 포스페이트 결합(phosphate bond)이 있고, 분해성 결합으로는 이황화결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 생분해성 결합, 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 접합체는 바람직하게는 친수성 고분자와 siRNA의 접합체의 말단에 세포 선택적 리간드가 더 도입될 수도 있다. 상기 세포 선택적 리간드로는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 친수성 고분자와 siRNA의 말단기를 공유결합으로 연결하여 P-X-Y 형태의 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은, 바람직하게는 소정의 siRNA를 선택하는 단계; 및 상기 siRNA와 친수성 고분자를 공유결합시키는 단계를 포함한다. 상기에서, P는 친수성 고분자이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, Y는 siRNA를 나타낸다.
본 발명의 접합체의 제조 방법은 바람직하게는 siRNA가 갖는 기능기를 활성화시키는 단계를 더 포함하며, 상기 공유결합 단계는 바람직하게는 siRNA상의 기능기를 활성화시키는 단계와, 상기 활성화된 기능기를 친수성 고분자와 공유결합시키는 단계를 포함한다. 이때, 활성화되는 기능기로는 아민기, 티올기, 또는 포스페이트기인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. siRNA의 기능기를 활성화시키는 물질로는 바람직하게는 1-에틸-3, 3-디에틸아미로프로필 카보디이미드, 이미다졸, N-하이드록실숙신이미드와 디클로로헥실카보디이미드, N-β-말레이미도프로피온산, N-β-말레이미도프로필로실숙신이미드에스테르, N-숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트 등이 있다.
siRNA와 친수성 고분자, 예를 들면 PEG간의 접합체를 형성하는 과정이 개략적으로 도 1에 나타나 있다. 이중사슬 siRNA의 센스사슬 3'-말단에 있는 1차 아민 기가 이질기능성(heterofunctional) 결합제, 예컨대 N-숙시니미딜3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(이하, SPDP라 약칭함)의 활성형 NHS 기와 반응하여 2-피리딜 디설파이드로 활성화된 siRNA가 제조된다. 이후, 말단에 설프하이드릴 기가 도입된 메톡시-PEG (mPEG-SH)를 상기 2-피리딜 디설파이드로 활성화된 siRNA에 첨가하면 설프하이드릴 교환 반응에 의해 이황화결합으로 연결된 siRNA-s-s-PEG 접합체(siRNA-PEG)가 형성된다.
또한, 본 발명은 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체와 양이온성 화합물 간의 이온성 상호작용/결합(ionic interaction)에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합체 미셀을 제공한다. 상기 양이온성 화합물로는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기에서, 양이온성 펩타이드는 KALA (lysine-alanine-leucine-alanine), 폴리라이신(polylysine) 또는 프로타민(protamine) 등을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 양이온성 지질은 디올레일 포스페티딜에탄올아민, 또는 콜레스테롤 디올레일 포스페티딜콜린 등을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylene imine, 이하 "PEI"라 약칭함), 폴리아민, 폴리비닐아민 등을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA-친수성 고분자 접합체를 준비하는 단계와, 상기 siRNA-친수성 고분자 접합체를 양이온성 화합물을 혼합하는 단계를 포함하는 고분자 전해질 복합체 미셀의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 고분자 전해질 복합체 미셀의 제조 방법은 siRNA를 생체적합성 친수성 고분자에 공유결합시킨 접합체를 다가 양이온 고분자, 지질 또는 펩타이드 등과 혼합시킨 후 이온 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 이렇게 제조된 siRNA-친수성 고분자 접합체와 고분자 전해질 복합체 미셀은 siRNA의 세포내 전달을 향상시키며, 이를 질병 모델의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 접합체의 합성과 고분자 전해질 복합체 미셀의 형성, 그 특징, 세포전달 효율 및 치료 유전자의 질병모델 치료 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 전해질 복합체 미셀을 준비하는 단계와, 상기 고분자 전해질 복합체 미셀을 동물의 체내에 투입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료방법을 제공한다. 상기 동물은 특별히 한정되는 것은 아니나, 인간에게 적용되는 것이 바람직하다. 그러나, 인간을 제외한 다른 동물에게도 동일하게 적용될 수 있음은 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA-친수성 고분자 접합체 또는 고분자 전해질 복합체 미셀을 유효량 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능 하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체는 친수성 고분자와 siRNA의 말단기를 공유결합으로 연결시킨 형태로서, 하기와 같은 구조를 갖는다.
P-X-Y
상기에서, P는 친수성 고분자이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, Y는 siRNA를 의미한다.
상기 접합체 중 친수성 고분자(P)는 바람직하게는 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자에서 유래된다. 이와 같은 비이온성 고분자의 예로는 PEG, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자가 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기에서 분자량이 1,000 내지 10,000 범위인 경우, 특히 양이온성 고분자와 siRNA에 의해 형성된 복합체의 혈액내 안정성을 향상시키는데 적합하다.
상기 친수성 고분자의 기능기는 필요에 따라 다른 기능기로 치환되어도 무방하다. 예를 들어, 하이드록시기(-OH)는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 또는 아민기(-NH2) 등의 기능기로 적절하게 치환될 수 있다. 상기 친수성 고분자 중에서 특히 PEG는 다양한 분자량과 작용기를 도입할 수 있는 말단을 갖고 있으며, 생체내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않으며, 또한 물에 대한 용해도를 증가시켜 생체 내에서의 유전자 전달 효율을 증가시키므로 본 발명의 접합체의 제조에 매우 적합하다. 친수성 고분자의 접합시에, 예를 들어, PEG는 siRNA의 RNAi 효과 감소를 최소화하기 위하여 siRNA 센스 가닥의 3' 말단에 결합시키는 것이 바람직하다.
상기 접합체 중 siRNA의 올리고 가닥은 바람직하게는 분자량 10,000 내지 30,000 사에서 선택된다. siRNA의 분자량이 10,000 내지 30,000의 범위인 경우 siRNA는 고유의 유전자 저해기능을 가지는 19 내지 30개의 올리고뉴클레오티드를 갖는 두 가닥의 올리고머의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 19 내지 23개의 올리고뉴클레오타이드를 갖는다. 본 발명에서 사용가능한 siRNA는 치료용 또는 연구용으로 사용되어지고 있는 것인 한 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2, 또는 VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF 등과 같이 유전자 치료 또는 연구를 위해 사용되어지거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자 유래의 siRNA도 채택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor)를 억제하기 위해 hVEGF siRNA를 사용하였다. VEGF는 혈관내피세포의 표면에 존재하는 VEGF 수용체와 결합하여 내피세포의 성장, 이동을 촉진함으로써 새로운 혈관의 생성을 촉진하는 역할을 한다. 특히, 암세포의 성장이나 전이는 이러한 혈관의 신생과 밀접한 관계가 있기 때문에 혈관의 신생을 억제하여 암세포의 성장을 저해하는 방법이 새로운 암치료방법의 하나로 주목을 받고 있다.
상기 siRNA의 센스 또는 안티센스 말단기는 다른 기능기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 기능기의 예로서 3'의 하이드록시기는 아민기, 설프하이드릴기, 또는 포스페이트기 등으로서 치환될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 접합체의 구조 중 X는 친수성 고분자(P)와 siRNA로부터 유래된 잔기(Y)를 공유결합으로 연결시켜 주는 링커 또는 단순 공유결합을 나타낸다. 결합을 매개하는 링커는 친수성 고분자와 siRNA로부터 유래된 잔기 Y의 말단기를 공유적으로 결합시키며, 필요에 따라 소정의 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커 X는 접합체의 제조과정 중 siRNA 및/또는 친수성 고분자를 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 포함할 수 있다. 예를 들어, 3' 말단기가 아민기로 치환된 siRNA에 활성화 물질인 SPDP를 결합시켜 말단의 아민기가 피리딜디티올기로 활성화된 siRNA를 원료로 사용하고, 상기 친수성 고분자부 P가 설프하이드릴기로 치환된 PEG(SH-PEG)를 사용하는 경우, 접합체 구조내의 상기 X는 -NH-CO-CH2-CH2-S-S-가 된다. 이와 같이, 상기 X는 접합체의 제조과정에서 필요에 따라 반응물인 친수성 고분자와 siRNA의 활성화 과정에서 도입되는 반응 후 결합내 잔류부(링커)이거나, 또는 활성화 과정을 요하지 않는 경우 친수성 고분자와 siRNA 기능기 사이에 형성되는 특별한 링커가 없는 단순 공유결합일 수 있다. 상기한 바와 같은 X는 siRNA가 전달될 표적에 따라 달라질 수 있으며, 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합, 포스페이트 결합 등이 있고, 분해성 결합으로는 이황화결합, 산 분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합, 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하기로는, X는 이황화결합이다.
siRNA의 뉴클레오티드 길이가 긴, 예컨대 분자량 30,000 수준에서는 친수성 고분자가 결합된 경우에도 2가닥의 siRNA 올리고머가 이들의 유전자 저해작용에 관여하는 생체 내 효소 복합체인 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)와 안정적으로 결합할 수 있으나, 보통의 19개의 뉴틀레오티드인 10,000 수준의 siRNA의 경우 유전자 저해작용을 돕는 세포내 효소 복합체와 결합할 때 말단에 도입된 친수성 고분자에 의해 구조적 안정성이 떨어질 수 있으므로 생체 내에서 또는 세포내에서 이들 접합체가 분해될 수 있는 결합을 도입하는 것이 유리하다. 따라서, 세포질 내에 과량 존재하는 글루타치온(glutathione)에 의해 세포내에서 분해되는 이황화결합, 세포내 유입된 후 산성을 띄는 환경에서 효과적으로 분해될 수 있는 산 분해성 결합, 세포내로 유입된 후 세포 안에서 효과적으로 분해가 가능한 에스테르결합, 안하이드라이드 결합과 특정 세포 주변에 존재하는 효소들에 의해 세포내로 유입되기 직전에 분해될 수 있는 효소분해성 결합 등을 도입하는 것이 바람직하다.
siRNA의 구조를 화학적으로 변형시키는 경우 변형되는 위치에 따라 RNAi(RNA interference) 활성이 10 내지 50％ 정도 감소되며, 또한 어느 정도의 세포독성을 일으킨다는 것이 알려져 있다(M. Amarzguioui, et al., Nucleic Acids Res., 31, 589-595, 2003). 이에, 친수성 고분자, 예컨대 PEG와 접합체를 형성함에 따라 야기될 수 있는 RNAi 활성의 감소를 최소화하기 위하여, siRNA와 친수성 고분자간에 분해성 이황화결합을 도입하여 세포내와 같은 환원성 환경하에서 온전한 siRNA를 방출할 수 있으며(도 4 참조), 더 바람직하게는 친수성 고분자를 센스 사슬의 3' 말단에 접합시킬 수 있다. 세포내 환경에서는 글루타치온 디설파이드(GSSG) 리덕타제의 존재 때문에 세포내 글루타치온의 98％ 이상이 환원된 티올 형태(GSH)를 유지한다(W Wang., et al., Pharmacol. Rev., 50, 335-356, 1998). 따라서, siRNA와 친수성 고분자간의 이황화결합은 세포내에 존재하는 GSH에 의해 즉시 분해되어 온전한 siRNA를 생산할 수 있게 된다(도 10 참조). 분해된 siRNA 분자는 세포질 내에서 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC) 단백질과 상호작용하여 일련의 RNAi 과정이 일어나게 된다. 이러한 관점에서, 온전한 siRNA가 세포내에서 재생산되면 RNAi 활성 및 특이성을 충분히 유지할 수 있게 되는 장점이 있다. siRNA를 친수성 고분자, 예컨대 PEG에 접합시키는 경우에는 구조적인 측면에서 이황화결합을 도입하는 것이 더욱 바람직한데, 그 이유는 센스 사슬의 3' 말단에 도입된 PEG가 세포내에서 siRNA와 분리되어 siRNA와 RISC간의 복합체 형성을 방해하지 않을 것이기 때문이다.
한편, 본 발명자들은 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)와 PEG를 비분해성 결합으로 접합시켜 안티센스 ODN-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀을 제조한 바 있다(JH Jeong, et al., Bioconjug. Chem., 16, 1034-1037, 2005). 이러한 안티센스 ODN은 siRNA와는 매우 다른 유전자 억제 메카니즘을 갖는데, ODN은 siRNA와는 달리 단백질 복합체와 결합하는 일이 없이 직접적으로 표적 mRNA 서열에 결합하여 이를 분해시키므로, ODN이 친수성 고분자로부터 반드시 분리될 필요는 없다(A. Kalota, et al., Cancer Biol. Ther., 3, 4-12, 2004). 반면, siRNA는 친수성 고분자가 접합된 경우 siRNA가 RISC와 복합체를 형성하는 데 있어 상당한 입체장애(steric hindrance)를 줄 수 있으므로, siRNA 활성을 충분히 나타내기 위해서는 siRNA가 친수성 고분자로부터 분리되는 것이 바람직하다. 따라서, PEG와 안티센스 ODN의 공유결합의 경우 분해성 결합의 도입이 절대적이지 않은 반면, siRNA의 경우 PEG 도입시 분해성 결합을 도입하는 과정이 중요하게 인식된다. 또한, siRNA의 경우 안티센스 ODN에 비해 높은 유전자 선택성을 가지므로 다른 유전자를 비선택적으로 저해하는 부작용이 감소하며, 안티센스 ODN의 1/10에 해당하는 적은 투여량만으로도 특정 표적유전자 만을 효과적으로 저해할 수 있다(도 22 참조). 투여량이 적어지면 siRNA 고분자 전해질 복합체 미셀을 약학적 조성물의 형태로 실제 임상에 적용시 체내에 미치는 부담을 경감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비용 측면에서도 큰 장점이 있다. 아울러, ODN 유래 고분자 전해질 복합체의 경우에는 단일 사슬 구조의 DNA를 사용한 반면, 본 발명의 siRNA 유래 고분자 전해질 복합체에서는 이중 사슬 구조의 RNA 분자를 사용하였으므로, 그 안정성에 있어서도 ODN-PEG 고분자 전해질 복합체보다 월등히 뛰어나다. 따라서, 본 발명의 siRNA 고분자 전해질 복합체는 DNA에 기초한 종래 ODN 고분자 전해질 복합체에 비해 표적 유전자 mRNA에 대한 선택성, 투여량 및 안정성 측면에서 매우 뛰어난 효과를 갖는다.
한편, 상기 구조의 본 발명에 따른 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체는 그 말단부에 세포 선택적 리간드가 더 구비될 수도 있다. 상기 리간드로는 바람직하게는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있다. 이들 리간드는 이황화결합, 아미드 결합, 에스테르결합 등의 결합을 통해 상기 접합체의 말단, 바람직하게는 PEG 말단부의 OH기에 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 친수성 고분자와 siRNA의 말단기를 공유결합으로 연결하여 P-X-Y 형태의 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기에서, P는 친수성 고분자이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, Y는 siRNA를 의미한다.
상기 접합체의 제조 방법에 있어서, siRNA 또는 친수성 고분자가 갖는 기능기를 활성화하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기에서, 활성화되는 기능기는 바람직하게는 아민기, 티올기 또는 포스페이트기이다. 상기 기능기를 활성화시키는 물질은 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필카보디이미드, 이미다졸, N-하이드로실숙신이미드와 디클로로헥실카보디이미드, N-β-말레이미도프로피온산, N-β-말레이미도프로필로실숙신이미드에스테르, N-숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트 등이 있다.
친수성 고분자와 siRNA간의 반응은 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로는 상온에서 수행이 가능하고, 대략 24 내지 48시간 동안 반응시켜 얻어질 수 있다. 반응에 요구되는 상기 각 반응물의 첨가비는 특별히 한정되지는 않으며, 친수성 고분자와 siRNA가 몰비(％)로 10:90 내지 90:10으로 첨가될 수 있고, 이를 통해 siRNA의 친수성 고분자 도입률을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 친수성 고분자와 siRNA간 접합체는 고분자 전해질 복합체 미셀의 구성성분으로 사용될 수 있다. 고분자 전해질 복합체 미셀이란, 비이온성 친수성 고분자와 결합된 siRNA와 이와 반대 이온을 지닌 고분자(예를 들어, 양이온성 화합물)간의 상호작용에 의해 자가조립되어 형성되는 작은 집합체로서 100 내지 200 nm 정도의 크기와 구조를 갖는다(도 2 참조). 미셀의 중심부에는 siRNA와 양이온성 화합물간의 이온성 결합(ionic interaction)을 통해 형성된 핵이 존재하며, 이들 입자의 외부 표면막에는 친수성 고분자가 둘러싼 구조를 형성하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 전해질 복합체 미셀을 형성하기 위해 사용되는 양이온성 화합물로는 KALA, 폴리라이신 또는 프로타민 등의 양이온성 펩타이드, PEI, 폴리아민, 폴리비닐아민과 같은 양이온성 고분자, 디올레일 포스페티딜에탄올아민, 또는 콜레스테롤 디올레일 포스페티딜콜린 등의 양이온성 지질을 들 수 있다.
이와 같은 미셀의 제조과정은 다음과 같다. siRNA-친수성 고분자 접합체를 인산완충용액 등에 희석한 후, 여기에 양이온성 화합물을 첨가하여 수용액 상에서 고분자 전해질 복합체 미셀을 형성하고, 미셀의 안정화를 위해 수십분간 상온에 방치한다. 이때 양이온성 화합물의 첨가량은 사용되는 양이온성 화합물의 양전하와 siRNA의 음전하의 전하 비가 1 : 1 (+/- = 1/1) 내지 24 : 1 (+/- = 24/1)이 되도록 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 생체 내에서 siRNA-PEG 접합체의 세포내 전달을 용이하게 하기 위한 고분자 전해질 복합체 미셀 형성하기 위하여, 양이온성 펩타이드인 KALA를 이용하여 고분자 전해질 복합체 미셀을 형성하였다. 동적 광 산란법(dynamic light scattering (DLS) method)을 통해 siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 수용액 상에서의 크기를 측정한 결과, 150 nm 정도 크기의 매우 좁은 분산도를 지녔음을 알 수 있다(도 6 참조).
상기 siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 생체내 조건에서의 안정성을 평가하기 위하여, 변형되지 않은 siRNA와 합성된 siRNA-PEG 접합체의 안정성을 비교하여 조사한 결과, siRNA에 PEG가 도입된 경우 24시간까지 안정성을 나타내었으며, 고분자 전해질 복합체 미셀의 구조를 이루었을때에는 그 안정성이 급격히 향상되는 것을 확인할 수 있다(도 7 참조).
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 전립선 암세포주인 PC-3 세포를 이용하여 VEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀이 VEGF의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, VEGF siRNA/SALA와 VEGF siRNA-PEG/KALA고분자 전해질 복합체 미셀을 처리하였을 경우, 혈관내피세포 성장인자의 발현을 크게 억제하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8 참조).
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서 VEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 생체 내에서 암세포주 증식저해 활성도를 알아보기 위해 인간 유래의 암세포가 이식된 실험용 쥐에 siRNA 전달체를 쥐의 혈관을 통해 투여한 후 이식된 암세포주의 증식 정도를 관찰한 결과, siRNA-PEG/KELA 고분자 전해질 복합체 미셀의 경우 동물 모델에 이식된 암세포주의 성장을 크게 억제하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
본 발명의 다른 실시예에 의하면, siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 뉴클레아제 매개성 siRNA 분해에 대한 강력한 저항성을 보였으며(도 10 참조), 시험관 내에서 인간 전립선암 세포주(PC-3)의 VEGF 유전자 발현을 효과적으로 억제하였다(도 11 참조). VEGF 유전자의 억제 효과는 N/P 비율을 증가하거나 siRNA의 투여량이 증가할 경우 더욱 확연하게 나타났다. 또한, siRNA-PEG 고분자 전해질 복합체 미셀은 혈청의 존재 여부에 상관없이 동일하게 VEGF 유전자의 발현을 억제하였으며(도 12 참조), 고분자 전해질 복합체 미셀에 의해 유발되는 VEGF 유전자의 억제는 매우 서열-특이적인 양상으로 나타났다(도 13 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 동물 모델에서 siRNA가 종양의 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, VEGF siRNA를 처리한 경우에는 모두 대조군에 비해 다양한 정도의 종양 성장 지연 효과를 나타내었다. 이중에서도 VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 VEGF siRNA/PEI 복합체에 비해 큰 정도로 종양의 성장을 지연시켰다(도 14 및 도 15 참조).
또한, 종양내 VEGF 단백질 및 mRNA 양을 측정한 결과, VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 VEGF siRNA/PEI 복합체에 비해 유의미한 정도로 VEGF 단백질의 발현을 더 많이 억제하였으며(도 16 참조), 종양내 VEGF mRNA 농도는 VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 처리에 의해 완전히 억제되었다. 온전한 siRNA 및 siRNA/PEI 복합체는 VEGF mRNA 농도를 약간 감소시켰으며, 서열이 일치하지 않은 siRNA 고분자 전해질 복합체 미셀은 전혀 감소시키지 않았다(도 17 참조). 이러한 결과는 고분자 전해질 복합체 미셀이 널리 사용되고 있는 siRNA/PEI 복합체에 비해 생체내에서 VEGF 발현을 억제시키는데 명확하게 이점이 있음을 보여준다.
생체내 조건에서 이러한 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 유전자 사일런싱 효과는 다음과 같은 고분자 전해질 복합체 미셀의 독특한 구조적인 특징으로부터 유래될 수 있다: (1) 고분자 전해질 복합체 미셀의 표면에 노출된 PEG 사슬이 세포내로 섭취되기 전에 조직액에서의 콜로이드 안정성을 부여한다. (2) 엔도사이토시스에 의해 세포내로 섭취된 후 세포질 내에서 siRNA-s-s-PEG 접합체가 특이적인 부위에서 절단된다.
본 발명의 다른 실시예에서 면역조직화학 염색을 통해 종양내 미세혈관의 분포를 조사해본 결과, VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀로 처리된 군의 경우 대조군에 비해 단위 면적당 종양내 미세혈관의 수가 현저하게 감소하였다(도 18 참조). 이러한 결과는 종양내 혈관형성 활성은 고형 종양 부위에서의 VEGF 양에 주로 의존한다는 것을 보여준다. 따라서, VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀에 의해 유도된 RNAi-매개성 VEGF 발현 억제는 종양내 신혈관 형성을 효과적으로 감소시킴으로써 종양의 성장을 유의미하게 지연시킨다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀을 전신 투여한 경우, 대조군 siRNA 제형과 비교할 때 종양의 성장을 효과적으로 감소시켰다(도 19 참조). 또한, 종양내 VEGF의 양을 확인한 결과, 감소된 VEGF 발현이 고분자 전해질 복합체 미셀이 처리된 이종이식된 PC-3 종양에서 주로 일어났다(도 20 및 도 21 참조). 이러한 결과는 VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀이 더 오랜 기간 동안 혈관을 순환하면서 EPR (enhanced permeation and retention) 효과에 의해 종양 부위에서 더 효과적으로 축적된다는 것을 보여준다. 나노미터 크기의 담체 또는 고분자-접합 약제가 종양 부위에서 보다 느슨해진 혈관 구조를 통해 더 쉽게 축적된다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 따라서, 종양에 대한 VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 수동적인 표적화가 이러한 종양 성장의 지연에 영향을 미칠 수도 있다.
본 발명에서는 음이온성 올리고머인 siRNA와 친수성 고분자를 이황화결합 혹은 다양한 형태의 생분해성 결합 혹은 비분해성 결합을 도입하여 접합시킨 하이브리드 접합체를 여러 양이온성 고분자, 지질, 펩타이드들과 상호작용시킴으로써 형성되는 고분자 전해질 복합체 미셀을 siRNA의 새로운 세포전달용 전달체로 사용할 수 있다. 또한, 이들 siRNA-PEG 접합체에 세포에 특이적으로 결합하는 리간드를 도입하여 선택적 유전자 치료효과를 증대시킬 수 있다. 특히, 이황화결합에 의해 형성된 siRNA-친수성 고분자 접합체와 양이온성 고분자, 지질, 펩타이드를 이용한 고분자 전해질 복합체 미셀을 사용한 경우, siRNA 자체보다 높은 siRNA의 세포 전달효율을 나타냈으며, 암세포 치료를 위해 표적 유전자로 이용되는 혈관내피세포 성장인자인 VEGF siRNA를 사용하는 경우, 이들 혈관내피세포 성장인자의 저해 및 생체 내의 종양의 증식을 저농도에서 억제할 수 있다. 이러한 결과는 hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀이 혈관내피세포 성장인자의 발현 억제를 통한 암세포의 성장 억제에 있어서 우수한 억제 효과와 급격히 향상된 생체내 안정성을 가지고 있음을 시사한다.
도 1은 세포내 분해성 결합인 이황화결합을 포함한 siRNA와 친수성 고분자인 PEG간의 접합과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 siRNA 고분자 전해질 복합체 미셀의 개념을 간략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 생분해성 이황화결합을 포함한 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체와 변형되지 않은 형태의 siRNA를 역상(reversed phase) HPLC를 사용해 분석한 크로마토그램이다.
도 4는 세포내 환경과 동일한 10 mM 농도의 글루타치온 환경 하에서 생분해성 이황화결합을 포함한 siRNA와 친수성 고분자간의 접합체의 이황화결합 분해능을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 5는 siRNA와 암세포 선택성 리간드(folate)가 도입된 친수성 고분자인 PEG간의 비분해성 결합을 도입한 접합체의 형성 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 6은 siRNA-PEG와 양이온 펩타이드 KALA에 의한 고분자 전해질 복합체 미셀의 입자크기를 동적 광 산란법을 통해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 원래 형태의 siRNA와 친수성 고분자인 PEG가 도입된 siRNA 및 siRNA-PEG/KALA에 의해 제조된 고분자 전해질 복합체 미셀의 3가지 형태의 전달체에 대한 혈액내 안정성 평가를 위해, 혈청 단백질이 존재하는 환경 하에서 시간에 따른 siRNA의 분해 정도를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 8은 생분해성 이황화결합을 포함한 hVEGF siRNA-PEG 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자 전해질 복합체 미셀이 전립선 암 세포주인 PC-3 세포의 혈관내피세포 성장인자의 발현을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 생분해성 이황화결합을 포함한 hVEGF siRNA-PEG 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자 전해질 복합체 미셀이 전립선 암 세포주인 PC-3 세포가 이식된 동물 모델에서 이식된 종양의 성장을 저해하는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 10은 (a) 미변형(naked) siRNA, (b) siRNA-PEG 접합체,및 (c) siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 안정성을 보여주는 전기영동 사진으로서, 각 샘플들은 50％ FBS를 포함하는 배지에서 37℃로 배양되었다.
도 11은 siRNA/PEI 복합체 및 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀로 처리된 PC-3 세포에서 N/P 비율(A) 및 siRNA 농도(B)에 따른 VEGF 유전자 발현의 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 12는 siRNA/PEI 복합체 및 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀로 전달감염된 PC-3 세포에서 10％ FBS가 VEGF 유전자 사일런싱에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 13은 VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀에 의해 PC-3 세포내에서 VEGF mRNA의 양이 줄어드는 것을 보여주는 RT-PCT 전기영동 사진이다.
레인 1 : 미처리, 레인 2 : VEGF siRNA/PEI 복합체,
레인 3 : VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀,
레인 4 : GFP siRNA/PEI 복합체,
레인 5 : 스크램블 siRNA/PEI 복합체,
레인 6 : 스크램블 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀.
도 14는 다양한 VEGF siRNA 제형을 종양내에 주입한 후의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 PC-3 종양을 이식한 마우스의 종양내에 (a) PBS, (b) 스크램블 siRNA-PEG/PEI, (c) VEGF siRNA, (d) VEGF siRNA/PEI, 및 (e) VEGF siRNA-PEG/PEI를 주입한 후의 항암 효과를 보여주는 사진이다.
도 16은 다양한 siRNA 제형으로 처리한 후의 종양내 VEGF 단백질 양을 보여주는 그래프이다.
도 17은 다양한 siRNA 제형으로 처리한 후의 종양내 VEGF mRNA 양을 RT-PCR로 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진으로, 인간 β-액틴이 대조군으로 사용되었다.
레인 1 : 미처리, 레인 2 : 스크램블 siRNA-PEG/PEI,
레인 3 : 미변형 VEGF siRNA, 레인 4 : VEGF siRNA/PEI,
레인 5 : VEGF siRNA-PEG/PEI
도 18은 PC-3 세포주로 이식된 마우스의 면역조직화학 염색 사진으로서, 각각 (A) PBS, (B) 스크램블 siRNA-PEG/PEI, (C) 미변형 VEGF siRNA, (D) VEGF siRNA/PEI, 및 (E) VEGF siRNA-PEG/PEI로 처리된 경우를 나타내고, 도 18의 F는 종양내 미세혈관의 분포를 보여주는 그래프이다.
도 19는 다양한 VEGF siRNA 제형을 정맥내로 전신 투여한 후의 종양의 부피 변화를 보여주는 그래프이다.
도 20은 다양한 VEGF siRNA 제형을 정맥내로 전신 투여한 후의 종양내 VEGF 단백질 양을 보여주는 그래프이다.
도 21은 다양한 VEGF siRNA 제형을 정맥내로 전신 투여한 후의 종양내 VEGF mRNA 양을 RT-PCR로 분석한 결과를 보여주는 전기영동 사진으로, 인간 β-액틴이 대조군으로 사용되었다.
레인 1 : PBS 처리, 레인 2 : 스크램블 siRNA-PEG/PEI,
레인 3 : 미변형 VEGF siRNA, 레인 4 : VEGF siRNA/PEI,
레인 5: VEGF siRNA-PEG/PEI
도 22는 siRNA 고분자 전해질 복합체(A)와 올리고데옥시튜클레오티드(ODN) 고분자 전해질 복합체(B)의 유전자 저해 효과를 비교한 그래프이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 구현예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포질 내에서 자발적으로 분해되는 생분해성 결합인 이황화결합을 지닌 siRNA-PEG 접합체의 합성
이하, 실시예에서는 혈관내피세포 성장인자를 억제하는 hVEGF (human vascular endothelial growth factor) siRNA를 사용하였으며, hVEGF siRNA의 표적 서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열(hVEGF, 189-207 bp)을 가지며, hVEGF siRNA의 센스 사슬은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖고, 안티센스 사슬은 이와 상보적인 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는다. 또한, 스크램블 siRNA의 센스 사슬은 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖고, 안티센스 사슬은 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는다.
siRNA의 센스 가닥(sense strand)의 3' 말단에 아민기를 도입한 siRNA(Qiagen사)를 이질이중기능(heterobifunctional) 제제이자 분해성 크로스 링커(cross linker)인 SPDP를 이용하여 말단의 아민기가 피리딜디티올기로 활성화된(pyridyldithiol-activated) siRNA 중간체를 형성하였다. 먼저, 800 ㎕의 5 mM phosphate buffer (pH 7.5) 에 녹인 siRNA 300 ㎍ (20 nmol)이 녹아 있는 용액에 20 mM 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹아 있는 SPDP 20 ㎕를 가하고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 cut-off가 10,000인 투석막을 이용하여 5 mM phosphate buffer (pH 7.5) 에서 3시간 동안 투석시켜 반응이 가지 않은 SPDP를 제거하였다. 합성된 siRNA-피리딜디티을 중간체에 5 mM phosphate buffer (pH 7.5) 에 20 mM 농도로 녹아있는 PEG-SH (분자량; 3,400, Nektar, USA) 100 ㎕를 첨가하고 상온에서 18시간 동안 반응시켜 siRNA와 PEG 사이에 이황화결합을 도입시킨 후, 다시 한 번 cut-off가 10,000인 투석막을 이용하여 24시간 동안 투석하여 반응이 가지 않은 PEG를 제거하여 생분해성 결합인 이황화결합을 지닌 siRNA-PEG 반응물을 얻었다. 상기 합성된 siRNA-PEG를 역상 HPLC (C-4)를 통해 분리하였다. siRNA-PEG는, 100 mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)와 50％ 아세토니트릴 (acetonitrile in 100 mM ammonium acetate)의 농도 구배법을 이용하여 분리하였다(도 3).
다음으로, 세포내와 유사한 환경에서 siRNA-s-s-PEG 접합체의 디설파이드 결합이 절단되는 정도를 평가하기 위하여, 0.5 ㎍의 siRNA-PEG 접합체를 10 mM의 글루타치온 배지에서 총 부피 25 ㎕로 배양하였다. 절단 반응은 37℃에서 2시간동안 수행하였다. 10 ㎕의 젤 로딩 버퍼(0.25％ (w/v) 브로모페놀 블루 및 40％ (w/v) 수크로즈)를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 절단된 siRNA를 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, siRNA는 GSH의 처리에 의해 siRNA-PEG 접합체로부터 온전한 형태로 절단되었다(도 4). 이는 원래 형태의 siRNA가 활성의 손실없이 RNAi 반응에 참여할 수 있음을 의미한다.
실시예 2. 암세포 선택성을 지닌 리간드인 엽산이 도입된 비분해성 결합을 지닌 siRNA-PEG 접합체의 합성
암세포 선택적 리간드인 엽산 및 비분해성 결합을 통한 PEG를 siRNA로 도입하기 위하여, siRNA 센스 가닥의 3' 말단에 아민기(-NH2)를 도입한 siRNA를 사용하였다. 먼저, 130 mg (0.3 mmole)의 엽산을 DMSO에 녹인 후 DCC (dicyclohexyl carbodiimide) 60 mg과 NHS (N-hydroxyl succinimide) 34 mg을 넣어 상온에서 30분간 반응시켜 엽산의 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시켰고, 시스타민(cystamine) 34 mg을 넣은 후 3시간 동안 더 반응시켰다. 이때 엽산과 시스타민의 반응 몰비(reaction molar stoichiometry)는 2 : 1 이었다. 반응물을 물에서 투석 하여 반응이 가지 않은 부산물들을 제거한 후 동결건조하였다. 엽산-시스타민-엽산(cystamine-FOL2)을 물과 DMSO가 50:50으로 섞인 용액에 녹인 후 0.1 M 농도의 멀캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 상에서 유리 티올기(free thiol group, -SH)가 생성되도록 하여 엽산-SH를 얻었다. 다음으로 300 ㎍의 siRNA와 이질기능성 PEG (NHS-PEG-MAL(maleimide)) 200 ㎍을 10 mM sodium phosphate buffer에서 1시간 반 동안 반응시켜 siRNA의 센스가닥 3' 말단 쪽에 PEG가 도입된 siRNA-PEG-MAL를 형성하였다. 상기 siRNA-PEG-MAL가 존재하는 용액에 준비한 엽산-SH를 0.1 mg 첨가하여 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응물은 cut-off 5,000의 투석막을 이용하여 물에서 투석시킨 후 역상 HPLC (C-4)를 통해 siRNA-PEG-FOL 접합체를 분리하였다(도 5).
실시예 3. siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 형성과 특성화
상기 실시예 1에서 합성, 분리한 siRNA-PEG 접합체를 세포 전달을 위한 형태인 고분자 전해질 복합체 미셀로 형성하기 위하여, 양이온 펩타이드인 KALA(Peptrone, Korea) 또는 프로타민(Sigma Aldrich, U.S.A.) 양이온 고분자인 PEI (Sigma Aldrich, U.S.A.), 양이온성 지질인 디올레일 포스페티딜콜린(DOPC, Nutfield, UK) 등을 사용하였다. KALA를 이용했을 경우의 예를 들어 자세히 설명하면, 먼저 siRNA-PEG 접합체(50 pmol)를 2x 인산화버퍼(PBS)와 1:1로 희석한 후, 역시 PBS에 녹인 KALA를 첨가하여 수용액 상에서 고분자 전해질 복합체 미셀을 형성하고 미셀의 안정화를 위해 15분간 상온에서 방치하였다. 이때, KALA 펩타이드의 양전하와 siRNA의 음전하의 전하 비는 1:1 (+/- = 1/1)이었다.
상기 siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 수용액 상에서의 크기를 측정하기 위해 동적 광 산란법(dynamic light scattering (DLS) method)을 사용하였다. DLS를 통한 측정 결과, siRNA-PEG/KALA 미셀은 150 nm 정도 크기에 매우 좁은 분산도를 지녔음을 알 수 있었다(도 6).
실시예 4. siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 생체내의 동일한 조건에서의 안정성 평가
변형되지 않은 원래 형태의 siRNA에 비해 PEG가 도입된 siRNA, 또는 이들이 양이온 펩타이드인 KALA에 의해 고분자 전해질 복합체 미셀의 형태가 되었을때 siRNA의 안정성을 얼마나 향상시키는지 여부를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 siRNA와 상기 실시예 1에서 제조한 siRNA-PEG 접합체 및 상기 실시예 3에서 제조한 siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 3가지를 생체 내 조건을 모방한 형태인 10％의 FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 배지에서 각각 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 후, 원래 siRNA에 비해 분해된 정도를 전기영동으로 검토하였다.
그 결과, PEG가 도입된 경우 24시간 까지도 안정성을 나타내었으며, 고분자 전해질 복합체 미셀의 구조를 이루었을 때에는 그 안정성이 급격히 향상되는 것을 확힌할 수 있었다(도 7).
실시예 5. hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀이 전립선 암 세포주의 혈관내피세포 성장인자의 생성에 미치는 영향
hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀이 전립선 암세포주의 hVEGF 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 인간 전립선 암 세포주인 PC-3 세포를 이용하여 이들 세포주가 만들어내어 배양액으로 분비한 hVEGF의 양을 ELISA (enzyme linked immonosorbent assay) 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저, 전립선 암 세포주인 PC-3 세포를 12-well plate에 한 well 당 1 x 105개가 되도록 분주하고 10％ FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 다시 배지를 10％ FBS가 포함된 RPMI1640으로 교환해주었다. 다음으로, 상기 실시예 1에서 합성된 hVEGF siRNA-PEG 10 pmol을 siRNA의 음전하와 전하비가 1 : 1 (+/- = 1 : 1)이 되는 양전하의 KALA 펩타이드 용액을 섞어 상온에서 15분 이상 방치하여 고분자 전해질 복합체 미셀을 형성한 후, 적정농도(10 pmole)의 고분자 전해질 복합체 미셀을 미리 준비한 세포주에 처리하여 혈청이 포함되지 않은 1 ㎖의 RPMI1640 배지에서 37℃에서 4시간 동안 전달감염시켰다. 10％ FBS가 포함된 RPMI1640 배지로 교체해준 후 6시간동안 배양하였다. 이후, 세포내에서 발현이 저해된 hVEGF의 양을 정량하기 위해 10％ FBS가 포함된 RPMI1640 배지를 1 ㎖ 첨가한 후, 37℃에서 18시간 동안 방출되는 hVEGF를 모아서 ELISA 방법을 통해 hVEGF의 양을 측정하였다. 대조군으로는 PEG가 도입되지 않은 hVEGF siRNA와, siRNA-PEG 접합체만을 처리한 것과, siRNA/KALA로 복합체와, 스크램블 siRNA가 포함된 고분자 전해질 복합체 미셀, 및 GFP (green fluorescent protein) siRNA의 고분자 전해질 복합체 미셀을 처리한 세포와 아무것도 처리하지 않은 PC3 세포를 사용하였다.
그 결과, siRNA/KALA와 siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 경우 혈관내피세포 성장인자의 발현을 현저하게 억제하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8).
실시예 6. 동물모델에서 hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀이 암세포 성장 억제에 미치는 영향
hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 생체내 암세포주 증식저해 활성도를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1 및 실시예 3에서 제조된 siRNA 전달체를 인간의 암세포가 이식된 실험용 쥐의 혈관을 통해 투여한 후 이식된 암세포주의 증식 정도를 관찰하였다. 먼저, 7-8 주령의 면역결핍 생쥐(nude mice)에 5×106 개의 전립선 암 세포주인 PC-3 세포를 옆구리쪽 피하로 투여한 후 종양의 크기가 0.1 cm3가 될 때, hVEGF siRNA-PEG/KALA, hVEGF siRNA/KALA, 스크램블 siRNA/KALA, 스크램블 siRNA-PEG를 한 번에 7.5 ㎍씩 혈관 내로 투여하였다. 이때, 1일, 10일째에 각각 투여하였고, 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 18일에 각각 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, hVEGF siRNA-PEG/KALA 고분자 전해질 복합체 미셀의 경우 동물모델에 이식된 암세포주의 성장을 크게 억제하는 것을 관찰할 수 있었다(도 9).
실시예 7. 고분자 전해질 복합체 미셀의 제조 (2)
siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀을 제조하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 siRNA-PEG 접합체를 PEI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 소정의 N/P 비율로 혼합한 후, 이를 실온에서 방치하여 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합 체 미셀을 형성하였다.
실시예 8. siRNA-PEG 접합체 및 이로부터 형성된 미셀의 혈청내 안정성 분석
미변형 siRNA, siRNA-PEG 접합체 및 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16)의 혈청내 안정성을 조사하였다. 구체적으로, 10 ㎍의 siRNA를 포함하는 각각의 제형을 50％ FBS (Gibco BRL, Grand Island, NY)를 포함하는 배지에서 배양하였다. 소정 시간(0, 1, 2, 4, 8, 16, 24 및 48시간)에 샘플로부터 당량의 배양액을 제거하였고, 트리스-아세테이트(TAE) 버퍼에서 젤 전기영동(1.2％ 아가로즈 젤)으로 분석하였다. siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀을 헤파린 나트륨 염 용액(50 mg/㎖)으로 전처리하여 양이온성 PEI를 제거함으로써 비복합 siRNA-PEG 접합체를 얻었다.
그 결과, 미변형 siRNA는 혈청을 포함하는 배지에서 8시간 배양하면 거의 완전히 분해되었다(도 10의 (a)). 반면, siRNA-PEG 접합체는 동일한 조건 하에서 16시간동안 특별한 손실이 없었다(도 10의 (b)). siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 경우에는 뉴클레아제에 의해 매개되는 siRNA 분해가 48시간이 경과한 후에도 전혀 검출되지 않았다(도 10의 (c)). 이는 PEG 접합만으로도 어느 정도까지는 siRNA의 구조를 혈청 존재하에서도 안정적으로 유지시킬 수 있다는 것을 의미한다. 고분자 전해질 복합체 미셀의 경우에서 관찰되는 보다 지속적인 안정화는 바깥 껍질 층의 PEG 사슬이 뉴클레아제가 siRNA/PEI 내부 중심부로 접근하는 것을 구조적으로 가려주기 때문에 얻어지는 것으로 생각된다.
실시예9. 세포 배양 및 전달감염
인간 전립선 암 세포주(PC-3)를 12웰 플레이트에 1.5×105 세포/웰의 농도로 접종한 후 24시간동안 부착시졌다. 배양 배지를 미리 데운 혈청 제거 배지로 교체한 후, 원하는 siRNA 제형을 세포에 첨가하여 전달감염시켰다. 4시간 경과 후, 전달감염 배지를 혈청을 포함하는 신선한 배지로 교체한 후 6시간동안 배양하였다. 이후, 상기 배지를 10％ FBS와 헤파린(20 ㎍/㎖)을 포함하는 RPMI1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY)로 교체하였다. 16시간 후, hVEGF를 포함하는 배양 배지를 수집한 후 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 세포로부터 분비된 VEGF의 양을 QuantikineR hVEGF 면역분석 키트(Q＆D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 결정하였다.
그 결과, siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 효율적으로 PC-3 세포에서의 hVEGF 발현을 감소시켰다. siRNA/PEI 복합체와 비교할 때, 상기 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 낮은 N/P 비율에서 hVEGF의 발현을 더 많이 억제하는 것으로 나타났다(N/P 비율 2 및 4, 도 11의 A). N/P 비율이 16인 경우, 50 pmol의 siRNA를 함유하는 제형들은 모두 PC-3 세포로부터의 hVEGF 분비를 거의 완전히 억제하였다. 상기 hVEGF 발현은 또한 농도-의존적으로 억제되었다(도 11의 B).
비록 혈청이 존재하지 않은 경우에는 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀 및 siRNA/PEI 복합체 간에 hVEGF 발현 억제에 있어서 유의한 차이는 없었지만, 10％ FBS의 존재 하에서는 매우 다른 hVEGF 유전자 사일런싱 효과를 보였다(도 12). 즉, siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 10％ FBS 첨가시 조금 감소된 hVEGF 분비 사일런싱 효과를 보이는 반면(14.6 내지 25.9 pg/mg), 상기 siRNA/PEI 복합체는 동일한 혈청 조건 하에서 훨씬 낮은 유전자 사일런싱 효과를 보였다(21.2 내지 91.3 pg/㎖).
실시예 10. RT-PCR에 의한 정량 분석
VEGF의 발현 억제가 실제로 세포내 hVEGF mRNA 양의 감소로부터 기인하는 지 여부를 확인하기 위하여, hVEGF mRNA의 세포내 농도를 RT-PCR 분석에 의해 결정하였다. hVEGF siRNA/PEI 복합체, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16), GFP siRNA/PEI 복합체, 스크램블 siRNA/PEI 복합체, 또는 스크램블 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀로 전달감염된 PC-3 세포를 16시간 배양한 후 트립신 처리를 하여 수확하였다.
상기에서, GFP siRNA의 센스 사슬은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖고, 안티센스 사슬은 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는다. 총 RNA를 RNeasy R 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다.
SuperScriptTM Ⅲ One-Step RT-PCR 시스템을 이용하여 PlatinumR Taq DNA Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 상기 추출된 총 RNA (1 ㎍)에 대한 반-정량 RT-PCT을 수행하였다. RT-PCR을 위한 열 사이클링 조건은 하기와 같다: cDNA 합성, 55℃에서 25분간 1회 반복; 변성, 94℃에서 2분간 1회 반복; PCR증폭, 94℃에서 20초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간26회 반복; 최종 연장 70℃에서 5 분간 1회 반복. hVEGF 및 인간 β-액틴을 검출하기 위한 PCR 프라이머는 바이오니아사(대전, 대한민국)로부터 구입하였다. hVEGF를 검출하기 위한 프라이머는 서열번호 8 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 가지며, 인간 β-액틴을 검출하기 위한 프라이머는 서열번호 10 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는다. hVEGF 및 β-액틴의 PCR 산물의 길이는 각각 522 bp 및 1,126 bp 였다. 상기 PCR 산물을 0.8％ 아가로즈 젤 전기영동으로 분석하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색하여 시각화하였다.
그 결과, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 매우 약한 hVEGF mRNA 밴드를 보였지만(도 13, 레인 3), hVEGF mRNA와 일치하지 않거나 또는 무관한 서열을 포함하는 siRNA(즉, 스크램블 siRNA 및 GFP siRNA)의 경우에는 전달감염되지 않은 세포의 경우와 비견되는 정도의 온전한 mRNA 밴드 강도를 보였다(도 13, 레인 1). 이는 hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀이 전사후 단계에서 매우 서열 특이적인 양상으로 hVEGF의 발현을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 11. 생체내 종양 모델에서 siRNA의 효능 확인
7주령의 암컷 누드 마우스(nu/nu)(Charles River, Wilmington, MA)의 옆구리 부분에 인간 전립선암 세포주(PC-3) 1.5×106 세포를 피하 주입하였다.
이종이식된 PC-3 종양의 부피가 50 ㎣가 되었을 때, 500 pmol의 siRNA를 포함하는 siRNA 제형(VEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16), hVEGF siRNA/PEI, 미변형 hVEGF siRNA, 스크램블 RNA-PEG/PEI)을 각각 종양내에 주 입하였다(제1일째). 목(Mock)-처리된 대조군의 경우 PBS를 주입하였다. 제10일째에 siRNA 제형을 다시 한번 추가로 주입하였다. 이때, 종양의 크기는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 수직 직경을 측정함으로써 관찰하였다. 종양의 부피는 주축의 길이×종축의 길이2×π/6의 식에 의해 계산하였다(McPhillips, et al, Br. J. Cancer, 85, 1753-1758, 2001). 스튜던츠 t-테스트로 통계적인 분석을 수행하여 종양 부피의 차이를 평가하였다.
그 결과, 3가지 hVEGF siRNA를 처리한 경우에는 모두 대조군(즉, 스크램블 RNA-PEG/PEI 및 PBS 용액)에 비해 다양한 정도의 종양 성장 지연 효과를 나타내었다(도 14 및 도 15). 3가지 siRNA 제형 중에서 hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 hVEGF siRNA/PEI 복합체에 비해 큰 정도로 종양의 성장을 지연시켰다. 미변형 siRNA도 종양내의 주사 부위 영역에서 어느 정도의 유전자 사일런싱 효과를 보였다. 38일 후, PBS 처리된 대조군의 부피를 100％로 했을 때의 siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀, siRNA/PEI, 미변형 siRNA의 상대 부피비는 각각 13.3％, 32.8％, 및 55.4％ 였다.
실시예 12. 종양내 hVEGF 단백질 및 mRNA 양의 정량
고형 종양 부위에서의 hVEGF 양을 측정하기 위하여, siRNA를 10일간 처리한지 3일후에 고형 종양을 수집하였다. 종양의 무게를 잰 후 균질기(Kinematica AG, Switzerland)를 이용하여 PBS내에서 종양을 균질화시켰다. 조직 균질액을 4℃, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였고, 추가 분석을 위해 상등액을 보관하였다.
hVEGF의 양을 ELISA (QuantikineR hVEGF 면역분석 키트, R＆D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 결정하였다.
그 결과, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16)은 hVEGF siRNA/PEI 복합체에 비해 유의미한 정도로 hVEGF의 발현을 더 많이 억제하였다(도 16). 상기 고분자 전해질 미셀, siRNA/PEI 복합체 및 미변형 siRNA는 대조군인 PBS 투여군(100％)에 비해 hVEGF의 양이 각각 74.8％, 36.3％ 및 20.0％ 감소하였다. 반대로, 스크램블 RNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀은 hVEGF의 발현을 억제하지 않았다.
다음으로, hVEGF mRNA의 종양내 농도를 결정하기 위하여, RNeasyR Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 종양 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. SuperScriptTM Ⅲ One-Step RT-PCR 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 반-정량 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR은 하기 열 순환 조건에서 수행하였다: cDNA 합성, 55℃에서 25분간 1회 반복; 변성, 94℃에서 2분간 1회 반복; PCR 증폭, 94℃에서 20초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간 26회 반복; 최종 연장, 70℃에서 5분간 1회 반복. hVEGF 및 인간 β-액틴을 검출하기 위한 PCR 프라이머는 바이오니아사(대전, 대한민국)로부터 구입하였다. 상기 PCR 산물을 0.8％ 아가로즈 젤 전기영동으로 분석하고 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 시각화하였다.
그 결과, 종양내 hVEGF mRNA 농도는 hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복 합체 미셀의 처리에 의해 완전히 억제되었다(도 17). 온전한 siRNA 및 siRNA/PEI 복합체는 hVEGF mRNA 농도를 약간 감소시켰으며, 서열이 일치하지 않은 siRNA 고분자 전해질 복합체 미셀은 전혀 감소시키지 않았다. 이러한 결과는 고분자 전해질 복합체 미셀이 널리 사용되고 있는 siRNA/PEI 복합체에 비해 생체내에서 hVEGF 발현을 억제시키는데 명확하게 이점이 있음을 보여준다.
실시예 13. 면역조직화학 염색 및 종양내 미세혈관의 밀도분석
종양을 갖고 있는 마우스를 28일째에 희생시킨 후 면역조직화학 염색을 수행하였다. 고형 종양 부위를 수집한 후 10％ 인산염-완충 포름알데히드 용액에 고정하고 파라핀 처리하였다. 파라핀 처리된 종양 조직을 3 ㎛ 두께의 절편으로 자른 후 Von Willebrand 인자(Facto
Figure 112006090075326-pct00001
)에 대한 항체를 이용하여 염색하였다. 상기 절편들을 자일렌에서 파라핀 제거한 후, 에탄올(100％, 95％, 70％, 및 50％) 내에서 수화시켰고, 최종적으로 PBS 내에 첨지시켰다. 에피토프 회복(epitope retrieval) 및 면역염색을 위한 전처리는 자동화 면역염색기(Ventana ES, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 이용하여 수행하였다. 이후, 수화된 절편을 프로테아제 2 (20 mg/㎖)로 4분간 처리하여 효소-유도성 에피토프 회복을 수행하였다. 상기 절편을 마우스 인자
Figure 112006090075326-pct00002
을 인식하는 1:100으로 희석시킨 1차 항체(rabbit monoclonal IgG, Dako Cytomation, Carpinteria, CA)로 실온에서 30분간 배양하였고, 이후 바이오틴-표지된 항-토끼 IgG (1:300 희석, Sigma, St. Louis, MO)로 실온에서 30분간 배양하였다. 미세혈관의 발색 검출은 IView DAB 검출 키트(Ventana Medical Systems)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
상기 조직 절편을 헤마톡실린(Ventana Medical Systems)을 이용하여 카운터염색시킨 후, 50％, 70％, 95％, 및 100％의 에탄을 농도구배 하에서 탈수시켰다.
종양내 미세혈관 밀도를 결정하기 위하여, 염색된 절편내의 독립적인 5군데 부위(현미경 영역: 2.3mm×2.3mm, 6.9㎟)를 무작위로 선택하고, 이들 영역의 이미지를 CCD 카메라를 장착한 위상차 현미경하에서 100 배율로 확인하였다.
인자
Figure 112006090075326-pct00003
-양성 미세혈관을 선별된 영역으로부터 계수하였고, 평균 종양내 미세혈관 밀도를 하기 식에 의해 계산하였다: 미세혈관 밀도(인자
Figure 112006090075326-pct00004
-양성 혈관의 수/㎟) = 인자
Figure 112006090075326-pct00005
-양성 혈관의 수×6.9. PC-3 종양 이종이식 부위에서의 미세혈관 형성은 내피세포에 대한 마커인 von Willebrand factor 항체 (인자
Figure 112006090075326-pct00006
)로 염색하여 시각화하였다.
그 결과, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16)로 처리된 군의 경우 대조군에 비해 단위 면적당 종양내 미세혈관의 수가 현저하게 감소하였다(도 18). 이러한 결과는 종양내 혈관형성 활성은 고형 종양 부위에서의 hVEGF 양에 주로 의존한다는 것을 보여준다. 따라서, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀에 의해 유도된 RNAi-매개성 hVEGF 발현 억제는 종양내 신혈관 형성을 효과적으로 감소시킴으로써 종양의 성장을 유의미하게 지연시킨다는 것을 확인하였다.
실시예 14. 동물모델에서 hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 전신 투여에 의한 암세포 성장 억제 확인
siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀의 전신 투여에 의한 항암 효과를 평가하기 위하여, PC-3 종양이 이종이식된 누드 마우스에 5회(제1일, 제4일, 제10일, 제18일 및 제28일)에 걸쳐 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 이때, 1회 투여시마다 20 ㎍의 siRNA를 단일 용량으로 정맥 투여하였다.
그 결과, hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀(N/P 비율=16)을 전신 투여한 경우 대조군 siRNA 제형과 비교할 때 종양의 성장을 효과적으로 감소시켰다(도 19). 또한, 종양내 hVEGF의 양을 확인한 결과, 감소된 hVEGF 발현이 고분자 전해질 복합체 미셀이 처리된 이종이식된 PC-3 종양에서 주로 일어났다(도 20 및 도 21). 이러한 결과는 hVEGF siRNA-PEG/PEI 고분자 전해질 복합체 미셀이 더 오랜 기간동안 혈관을 순환하면서 EPR (enhanced permeation and retention) 효과에 의해 종양 부위에서 더 효과적으로 축적된다는 것을 보여준다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 siRNA와 친수성 고분자 간의 접합체 및 이로부터 형성된 고분자 전해질 복합체 미셀은 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할수 있으며, 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 활성을 나타낼 수 있으므로, 암 및 다른 감염성 질환을 위한 siRNA 치료용 도구뿐만 아니라 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구와 의학 산업상의 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (26)

  1. 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자(P)와 siRNA(Y)가 공유결합(X)으로 연결된 하기 구조의 siRNA-비이온성 친수성 고분자 접합체:
    P-X-Y
    상기에서, P는 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자이고, X는 단순 분해성 공유결합 또는 비이온성 친수성 고분자와 siRNA를 공유결합으로 연결시켜 주는 링커가 매개된 분해성 공유결합이며, Y는 siRNA이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 siRNA(Y)는 19 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분해성 공유결합(X)은 이황화결합, 산 분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 분해성 공유 결합(X)은 이황화결합인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제1항에 있어서,
    X가 siRNA 센스 가닥의 3'말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 siRNA-분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자 접합체의 말단에 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산, 갈락토스, 만노스, 알지디 및 트렌스페린으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 세포 선택적 리간드가 더 구비되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 siRNA는 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PIGF로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 유래인 것을 특징으로 하는 접합체.
  13. 소정의 siRNA를 선택하는 단계;
    상기 siRNA와 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자를 분해성 공유결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 siRNA-비이온성 친수성 고분자 접합체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 공유결합 단계는 아민기, 티올기 및 포스페이트기로 구성된 군으로부터 선택되어 도입된 siRNA상의 기능기를 활성화시키는 단계와, 상기 활성화된 기능기를 비이온성 친수성 고분자와 공유결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서,
    상기 siRNA의 기능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디에틸아미노프로필 카보디이미드, 이미다졸, N-하이드로실숙신이미드, 디클로로헥실카보디이미드, N-β-말레이미도프로피온산, N-β-말레이미도프로필로실숙신이디드에스테르 및 N-숙신이미딜피리딜디티오 프로피오네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 기재의 siRNA-분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자 접합체와 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 양이온성 화합물간의 이온성 결합에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합체 미셀.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서,
    상기 양이온성 펩타이드는 KALA, 폴리라이신 및 프로타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고분자 전해질 복합체 미셀.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 디올레일 포스페티딜에탄올아민, 또는 콜레스테롤 디올레일 포스페티딜콜린인 것을 특징으로 하는 고분자 전해질 복합체 미셀.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민 및 폴리비닐아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고분자 전해질 복합체 미셀.
  22. 제1항 기재의 siRNA-분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자 접합체를 준비하는 단계와, 상기 siRNA-비이온성 친수성 고분자 접합체를 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 양이온성 화합물과 혼합하는 단계를 포함하는 제17항의 고분자 전해질 복합체 미셀의 제조 방법.
  23. 제17항 기재의 고분자 전해질 복합체 미셀을 준비하는 단계와, 상기 고분자 전해질 복합체 미셀을 동물의 체내에 투입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에서의 유전자 치료방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 고분자 전해질 복합체 미셀은 경구 투여 또는 정맥 주사의 방법으로 체내에 투여되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료방법.
  25. 제1항 기재의 siRNA-분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 친수성 고분자 접합체를 유효량 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  26. 제17항 기재의 고분자 전해질 복합체 미셀을 유효량 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
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