CN105194689A - 一种基于siRNA的双偶联复合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA，这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白能增加所携带的siRNA进入癌细胞，另外，脂溶性棕榈酸能帮助水溶性核酸进入细胞内，而叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入肿瘤细胞，从而抑制致癌基因的表达，因此，这种基于siRNA的双偶联复合物通过化学修饰核酸，改善了siRNA的生物相容性及毒性，且增强了siRNA的转染效果，此外这种复合物分子小，易于进入肿瘤细胞，且成分明确，易于大规模制备。

Description

一种基于siRNA的双偶联复合物

技术领域

本发明涉及一种基于siRNA的双偶联复合物。

背景技术

RNAi疗法能够使得特定的信使RNA(mRNA)沉默，防止产生造成疾病的蛋白质，从而针对疾病根源。RNAi疗法也可能以根本的新方式，治疗疾病和帮助患者。

近年来，基于小分子干扰RNA(siRNA)技术的基因治疗方法取得了成功。由于siRNA可直接在胞浆内进行表达，具有起效快速且给药的时间间隔灵活可控的优点。因此，通过siRNA输送进行基因治疗的相关生物医学技术得到了迅速的发展，这种技术可单独使用以治疗病毒感染性疾病及肿瘤等。

目前作为SiRNA基因输送的载体大多为合成阳离子分子、高分子，其实现基因负载与输送的原理为利用载体阳离子功能分子、高分子中的正电荷(+)与SiRNA基因序列中磷酸基团所携带的负电荷(-)的静电相互作用，结合组装形成稳定的复合物，保护所负载的SiRNA，同时可提高其在体内的稳定性，从而提高SiRNA输送的效率。

然而，到目前为止，虽然国内外已经开发报道了多种阳离子功能分子如阳离子聚合物、阳离子脂质体等，并作为载体应用于体外或体内细胞/组织水平的siRNA输送，但在实际应用中，大多数脂质阳离子功能分子在血液循环中不稳定，容易被网状内皮系统吞噬后清除而导致其失活。且许多阳离子载体具有免疫原性，可刺激、诱导细胞的免疫应激反应，进而导致毒副作用。

发明内容

基于此，有必要提供一种可改善合成基因载体的生物相容性、减低毒性且能增强siRNA转染效果的新型生物功能材料。

一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA，双偶联复合物的结构式为：

其中，siRNA的正义链与棕榈酸偶联时，siRNA的反义链与叶酸偶联；siRNA的反义链与棕榈酸偶联时，siRNA的正义链与叶酸偶联。

在其中一个实施例中，叶酸与siRNA之间偶联的连接体为聚乙二醇，双偶联复合物的结构式为：

其中6≤n≤18。

在其中一个实施例中，n＝12，双偶联复合物的结构式为：

这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白能增加所携带的siRNA进入癌细胞，另外，脂溶性棕榈酸能帮助水溶性核酸进入细胞内。而叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入肿瘤细胞，从而抑制致癌基因的表达。

因此，这种基于siRNA的双偶联复合物通过化学修饰核酸，改善了siRNA的生物相容性及毒性，且增强了siRNA的转染效果，此外这种复合物分子小，易于进入肿瘤细胞，且成分明确，易于大规模制备。

附图说明

图1为本发明一对比实验的细胞特异性荧光强度的平均值的柱状对比图；

图2为本发明一对比实验的裸鼠体内肿瘤摄取情况的全身摄影对比图；

图3为本发明一对比实验的siRNA在肿瘤组织中浓度随时间变化的折线图；

图4为本发明一对比实验的siRNA在排泄倒尿液中浓度随时间变化的折线图；

图5为本发明一对比实验的siRNA在不同器官中含量的体外摄影对比图；

图6为本发明一对比实验的肿瘤组织对siRNA摄取24h后的体内与体外摄影对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将用具体实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA。

棕榈酸与叶酸分别与siRNA的双链偶联。即当siRNA的正义链与棕榈酸偶联时，siRNA的反义链与叶酸偶联；当siRNA的反义链与棕榈酸偶联时，siRNA的正义链与叶酸偶联。

棕榈酸在合成RNA时加在3’端。叶酸与siRNA之间偶联的连接体为聚乙二醇，siRNA上的炔烃与叶酸链接的聚乙二醇叠氮化物形成稳定的三氮唑键。

这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白能增加所携带的siRNA进入癌细胞。

叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入肿瘤细胞，从而抑制致癌基因的表达。

以下结合具体实施例对上述基于siRNA的双偶联复合物进行详细说明。

实施例1，一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为6的聚乙二醇。实施例1的双偶联复合物的结构如下：

实施例2，一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为12的聚乙二醇。实施例2的双偶联复合物的结构如下：

实施例3，一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为18的聚乙二醇。实施例3的双偶联复合物的结构如下：

对比实验1：对比不同长度的聚乙二醇连接体对保持叶酸的细胞结合功能的影响。结合图1，通过血清培养基，在37℃环境下，分别让实施例1、实施例2、实施例3的siRNA摄入KB细胞株，放置4小时后，通过用流式细胞仪测量各实施例中的细胞特异性荧光强度的平均值，比较siRNA的细胞结合以及摄入效果。

通过对比实验1，可见长度为12的聚乙二醇作为连接体，对保持叶酸的细胞结合功能最强。

对比例1：在未经化学修饰的siRNA上标记Cy5.5荧光，准备用于后续对比实验中对小鼠的全身摄影。对比例1的结构及荧光标记位(如下圆球为荧光标记位)如下：

对比例2：一种基于siRNA的偶联物，包括棕榈酸，和与棕榈酸偶联的siRNA。在对比例1的偶联物上标记Cy5.5荧光，准备用于后续对比实验中对小鼠的全身摄影。对比例2的结构及荧光标记位(如下圆球为荧光标记位)如下：

对比例3：一种基于siRNA的偶联物，包括叶酸，和与叶酸偶联的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为12的聚乙二醇。在对比例2的偶联物上标记Cy5.5荧光，准备用于后续对比实验中对小鼠的全身摄影。对比例3的结构及荧光标记位(如下圆球为荧光标记位)如下：

对比例4：取实施例2中的基于siRNA的双偶联复合物，并为其标记Cy5.5荧光，准备用于后续对比实验中对小鼠的全身摄影。对比例4的结构及荧光标记位(如下圆球为荧光标记位)如下：

对比实验2：对比不同的基于siRNA的偶联物的生物相容性。

步骤1：取15只裸鼠皮下接种KB细胞肿瘤达到～500mm³，随机分为5组，每组3只；

步骤2：同时为第1组的每只裸鼠注射100μg的对比例1准备的siRNA，为第2组的每只裸鼠注射100μg的对比例2准备的siRNA偶联物，为第3组的每只裸鼠注射100μg的对比例3准备的siRNA偶联物，为第4组的每只裸鼠注射100μg的对比例4准备的siRNA，为第5组的每只裸鼠注射100μg的5％葡萄糖注射液。本步骤是以100μg的siRNA的量为基准作比较，偶联后的siRNA以Nanodrop定量，使各组的siRNA的量保持一致。

步骤3：用Maestroimagingsystem对各组的裸鼠分别在注射后的0.5h、2h、4h和24h进行全身摄影，通过荧光强度比较各组肿瘤摄取量；

步骤4：与步骤3同时进行，检测体内肿瘤组织摄取siRNA的情况

步骤5：摄影完成后，将裸鼠器官组织取出，进行体外摄影，通过荧光强度比较各组各部位的siRNA的含量；

步骤6：通过体外强度荧光强度证实体内摄影结果。

其中步骤3，全身摄影结果如图2所示，由步骤3结果看来，含有叶酸偶联siRNA的第2组和第4组比不含叶酸的第1组和第3组增加了2倍的荧光强度，可见叶酸偶联siRNA可增加肿瘤摄取量。

其中步骤4，siRNA在肿瘤组织中的浓度随时间的变化如图3所示，siRNA在排泄倒尿液中的浓度随时间的变化如图4所示。由步骤4结果看来，含有棕榈酸偶联siRNA的对比例2和对比例4，能减少尿液中排泄siRNA的量达50％。

其中步骤5，体外摄影结果如图5所示，由步骤5结果看来，肾、肝在24小时后荧光强度最高，含有叶酸偶联siRNA的对比例3和对比例4在肿瘤组织的浓度3倍高于对比例1。

其中步骤6，体内摄影肿瘤摄取24h后的荧光强度与体外摄影肿瘤摄取24h后的荧光强度对比如图6所示，肿瘤组织对siRNA摄取24h后，体内、体外检测荧光强度的结果相似，对比例4的siRNA含量比对比例1高出18倍。

由对比实验2可知，通过叶酸、棕榈酸与siRNA双偶联，可增加肿瘤组织对siRNA的摄取量，减少肾脏对siRNA的过滤排出。

综上，这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白能增加所携带的siRNA进入癌细胞。叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入肿瘤细胞，从而抑制致癌基因的表达。结合棕榈酸与叶酸的功能，能显著提高siRNA在体内的稳定性，改善siRNA的生物相容性，且成分明确，不具有阳离子载体所带来的毒性副作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种基于siRNA的双偶联复合物，其特征在于，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联所述棕榈酸和所述叶酸的siRNA，所述双偶联复合物的结构式为：

其中，所述siRNA的正义链与所述棕榈酸偶联时，所述siRNA的反义链与所述叶酸偶联；所述siRNA的反义链与所述棕榈酸偶联时，所述siRNA的正义链与所述叶酸偶联。

2.根据权利要求1所述的一种基于siRNA的双偶联复合物，其特征在于，所述叶酸与所述siRNA之间偶联的连接体为聚乙二醇，所述双偶联复合物的结构式为：

其中6≤n≤18。

3.根据权利要求2所述的一种基于siRNA的双偶联复合物，其特征在于，所述n＝12，所述双偶联复合物的结构式为：