CN104258416B

CN104258416B - 基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体及制备方法

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Publication number: CN104258416B
Application number: CN201410499166.2A
Authority: CN
Inventors: 张娜; 刘婷先; 刘永军; 刘春喜; 王明芳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2014-09-25
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2034-09-25
Also published as: CN104258416A

Abstract

本发明公开了一种基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体及制备方法，将寡聚核苷酸溶液与药物溶液混合，室温放置1～100min后，与siRNA混合得到混合溶液；将阳离子聚合物溶液加入步骤1)得到的混合溶液，室温放置孵育1～100min后获得共载药物与基因的聚阳离子复合物；将阴离子聚合物溶液，加入步骤2)得到的聚阳离子复合物，室温放置孵育1～100min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体。本发明制备的基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体制备工艺简单可行，可用于治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的治疗。

Description

基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体及制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种共输送递药系统，尤其涉及基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体及制备方法。

背景技术

癌症是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，在全球的死亡率高达13％，并且发病率呈逐年递增趋势，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。目前癌症的治疗手段主要有三种：药物治疗、基因治疗和放射疗法。其中药物治疗，也称化疗，是目前临床应用较为广泛的治疗手段，其使用的抗肿瘤药物多数能直接快速的杀死肿瘤细胞，然而，抗肿瘤药物的非特异性也增强了化疗所带来的恶心、呕吐、脱发等毒副作用，长时间使用一些化疗药物还会产生多药耐药，进一步降低治疗效果。基因治疗是一种将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因异常和缺陷引起的疾病，达到治疗疾病的目的。基因治疗能在分子水平发挥作用，从而达到根治疾病的目的，对靶细胞有特异性靶向作用，降低毒副作用。采用同一载体将抗肿瘤药物和治疗基因递送至同一细胞，可以实现化疗和基因治疗的协同作用，从而提高抗肿瘤效果，降低毒副作用。

RNA干扰技术是一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是外源性双链RNA比如短链干扰RNA(siRNA)进入细胞后，在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，随后反义链再与细胞内的一些酶(包括内切酶、外切酶和解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与靶向目的基因的mRNA同源区进行特异性结合，RISC有核酸酶的作用，在结合部位切割mRNA，从而引发宿主细胞对mRNA的降解作用。siRNA是约22个碱基对长度的双链核糖核酸序列，带有负电荷，易溶于水，因其高效的沉默效应得到广泛关注。然而，siRNA的体内递送是非常困难的，寻找合适的载体是实现有效的RNA干扰效能的主要途径。

近年来用于共递送药物和治疗基因的载体有多种，包括无机纳米粒、脂质复合物、聚合物胶束、树状大分子等。例如Shah等使用聚丙烯亚胺树状大分子作为载体，抗肿瘤药物紫杉醇通过琥珀酸连接在树状大分子上，靶向因子LHRH以PEG为连接基团连接在树状大分子上，靶向CD44mRNA的siRNA装载于DTBP中。该共载体系能够多功能化的实现药物与基因的共载，然而，不难发现该共载体系制备较为复杂，制备过程涉及多次化学反应，操作较繁琐。因此，寻找一种简便、易操作的装载方法实现药物与基因的共载具有重要意义的。

适配体是由核苷酸构成的单链或双链DNA或RNA序列，其组成为生物相容性的核苷酸，带有负电荷。另有报道称蒽环类抗肿瘤抗生素药物能够选择性插入5’-CG-3’或5’-GC-3’序列中，将药物与适配体孵育即能实现药物的装载。研究发现适配体A10可以摩尔比1.2：1装载抗肿瘤药物多柔比星，这种装载药物的方式对载体和药物均不进行修饰，操作简便可控，不引入有机试剂。然而，单纯的适配体装载药物载药量低，为提高装载药物的能力，Sanyong Jon的课题组中对适配体A10末端进行修饰。在A10末端修饰上寡聚核苷酸序列后，其装载药物的比例提高到7.5：1。由此可见，特定序列的寡聚核苷酸能够简便高效的装载药物。相比适配体来说，寡聚核苷酸分子更小，合成较为简便可控，装载药物效率高。另外，其核苷酸的性质使其与siRNA相容性好，二者混合后可经阳离子聚合物一步压缩，实现双载效果。

发明内容

本发明的目的就是为提供一种基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体及制备方法，它具有简单方便的实现药物与治疗基因的共载过程的优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将寡聚核苷酸与药物溶液混合，室温放置1～100min(优选10～50min)后，与siRNA混合得到混合溶液；

(2)将阳离子聚合物溶液加入步骤1)得到的混合溶液，室温放置孵育1～100min(优选10～50min)后获得共载药物与基因的聚阳离子复合物；

(3)将阴离子聚合物溶液，加入步骤2)得到的聚阳离子复合物，室温放置孵育1～100min，即得共递送药物与基因的纳米载体。

上述所述的共递送药物和基因的纳米载体的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将寡聚核苷酸与药物溶液混合，室温放置1～100min(优选10～50min)后，与siRNA混合，涡旋1～100s(优选5～50s，涡旋速度400～2000r/min)，得到均匀的混合溶液；

(2)将阳离子聚合物溶液在涡旋条件下，逐滴加入步骤1)得到的混合溶液，继续涡旋1～100s(优选5～50s，涡旋速度400～2000r/min)后，室温放置孵育1～100min(优选10～50min)，获得共载药物与基因的聚阳离子复合物；

(3)将阴离子聚合物溶液，在涡旋条件下，逐滴加入步骤2)得到的聚阳离子复合物，继续涡旋1～100s(优选5～50s，涡旋速度400～2000r/min)，室温放置孵育1～100min(优选10～50min)，即得共递送药物与基因的纳米载体。

上述两种制备方法，所述步骤1)中寡聚核苷酸溶液与药物溶液的体积比为1:2～2:1，其中寡聚核苷酸与药物的摩尔比为1:10～5:1，siRNA与药物的质量比是1:5～10:1；所述寡聚核苷酸序列由互补的两条由CGA重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₅、(CGA)₇、(CGA)₉、(CGA)₁₁或者适配体A9或A10中的任意一种。

上述两种制备方法，所述步骤2)中阳离子聚合物溶液的浓度为50～500μg/mL，所加入的阳离子聚合物溶液与步骤1)得到的混合溶液的体积比为1:2～2:1；所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMEAMA)、聚丙烯亚胺(PPI)、壳聚糖(CS)中的任意一种或一种以上的混合物；所制得的聚阳离子复合物的粒径范围为10～120nm，电位为+5mV～+50mV。

上述两种制备方法，所述步骤3)中阴离子聚合物溶液的浓度为50～500μg/mL，所加入的阴离子聚合物溶液与步骤2)得到的聚阳离子复合物的体积比为1:2～2:1；所述阴离子聚合物为透明质酸(HA)、羧甲基壳聚糖(CMCS)，PEG化聚合物如透明质酸-聚乙二醇(HA-PEG)、羧甲基壳聚糖-聚乙二醇(CMCS-PEG)以及连接靶向因子的嵌段共聚物透明质酸-聚乙二醇-叶酸(HA-PEG-FA)、透明质酸-聚乙二醇-NGR(HA-PEG-NGR)、羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-NGR(CMCS-PEG-NGR)、羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-叶酸(CMCS-PEG-FA)中的任意一种或一种以上的混合物。

所述溶液的介质为双蒸水、0.9％氯化钠水溶液、0.5％葡萄糖水溶液、含5％葡萄糖和0.9％氯化钠的注射用水、焦磷酸二乙酯(DEPC)处理水中的任意一种或一种以上的混合物。

上述制备方法所制备的基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的纳米载体，所述的纳米载体粒径范围为100nm～300nm，电位为-20mV～+5mV。

上述共递送药物和基因的纳米载体在治疗癌症上的应用。

本发明的有益效果：

本发明选择寡聚核苷酸装载药物，再与负电性siRNA混合，该混合物均为负电性核酸物质，通过静电作用与阳离子聚合物作用形成聚阳离子复合物，一步法简单方便的实现药物与治疗基因的共载过程。另外，正电性内核可吸附阴离子聚合物，比如羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-叶酸(CMCS-PEG-FA)，实现pH敏感(CMCS)、长循环(PEG)和主动靶向(FA)等多功能化修饰。同时，负电性阴离子聚合物可屏蔽内核正电荷，降低血液循环时与血浆蛋白的作用，降低毒副作用。

共载药物与基因的纳米载体，由于本身粒径范围为100～300nm，既适用于静脉注射，也可以用于静脉滴注。

采用寡聚核苷酸装载药物，载药量高，载体生物相容性良好，可降解，安全无毒。

外层负电性阴离子聚合物使得纳米载体在血液循环过程中内核正电荷被屏蔽，因此减少与血浆蛋白的作用，降低共载药物被网状内皮系统识别和清除的可能。

阴离子聚合物的修饰能实现主动靶向等功能化修饰，提高纳米载体在靶细胞的蓄积，提高抗肿瘤效果，在未来肿瘤治疗中有潜在意义。

附图说明

图1为实施例1的基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的聚阳离子复合物的透射电镜照片(19K×)；

图2为实施例1的基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的聚阳离子复合物的粒径分布图；

图3为实施例1的基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的纳米载体的透射电镜照片(19K×)；

图4为实施例1的基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的纳米载体的粒径分布图；

图5为实施例1基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的纳米载体在肿瘤细胞内分布的共聚焦照片；

图6为实施例1基于寡聚核苷酸的共递送药物和基因的纳米载体在pH5.0，pH6.0和pH7.4条件下药物的体外释放结果。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例中使用的寡聚核苷酸由互补的两条由(CGA)重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₇，链1：5’-CGACGACGACGACGACGACGA-3’；链2：5’-TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’，如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示；siRNA为特异性靶向血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA，序列为：正义链5’-ACAUCACCAUGCAGAUUAUdTdT-3’；反义链5’-dTdTUGUAGUGGUACGUCUAAUA-3’如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。

取浓度为50μM，100μL的多柔比星水溶液与120μL、浓度10μM的寡聚核苷酸溶液混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与多柔比星质量比为1:1的特异性靶向VEGF的siRNA，涡旋20s，混合均匀得混合溶液。

将200μL上述制得的混合溶液逐滴滴入涡旋条件下体积为200μL，浓度为80μg/mL的聚醚酰亚胺(PEI)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物，如图1、2所示，上述制得的多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为89.7nm，多分散指数为0.196，电位为12.07mV。

在涡旋条件下，将200μL的上述聚阳离子复合物逐滴滴入的浓度为160μg/m，体积为200μL的羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-NGR(CMCS-PEG-NGR)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体，如图3、图4所示，本实施例制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为142.1nm，多分散指数为0.205，电位为-6.72mV。

实施例2

本实施例中使用的适配体为适配体A10，序列为：5‘-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGC-3’，如SEQ ID NO.5所示；siRNA为特异性靶向VEGF的siRNA，序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。

取浓度为20μM，100μL的多柔比星水溶液与80μL、浓度为10μM的适配体A10混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与多柔比星质量比为1:2的特异性靶向VEGF的siRNA，涡旋20s，混合均匀，取200μL混合溶液逐滴滴入涡旋条件下的浓度为200μg/mL，体积为150μL的PLL溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物，上述制得的多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为107.9nm，多分散指数为0.204，电位为24.33mV。

取体积为300μL上述制得的聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件浓度为400μg/mL，体积为400μL透明质酸-聚乙二醇-NGR(HA-PEG-NGR)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得共递送药物与基因的纳米载体，本实施例制得制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为188.6nm，多分散指数为0.214，电位为-9.04mV。

实施例3

本实施例中使用的寡聚核苷酸由互补的两条由(CGA)重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₅，链1：5’-CGACGACGACGACGA-3’；链2：5’-TCGTCGTCGTCGTCG-3’，序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示，siRNA为特异性靶向多药耐药基因MDR-1的siRNA，序列为，正义链：5’-GGAUAUUAGGACCAUAAAUdTdT-3’，反义链5’-AUUUAUGGUCCUAAUAUCCdTdT-3’，如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9所示。

取浓度为40μM，100μL的柔红霉素水溶液与100μL、浓度为10μM寡聚核苷酸溶液混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与柔红霉素质量比为1:1的特异性靶向多药耐药基因1(MDR-1)的siRNA，涡旋20s，混合均匀，将200μL上述混合溶液逐滴滴入涡旋条件下浓度为100μg/mL，体积为300μL的PPI溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物，上述制得的柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为95.7nm，多分散指数为0.145，电位为16.34mV。

取200μL上述制得的聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件下浓度为300μg/mL，体积为300μL的羧甲基壳聚糖-聚乙二醇-叶酸(CMCS-PEG-FA)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体，本实施例制得的基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因纳米载体粒径为224.0nm，多分散指数为0.186，电位为-16.87mV。

实施例4

本实施例中使用的寡聚核苷酸由互补的两条由(CGA)重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₉，链1，5’-CGACGACGACGACGACGACGACGACGA-3’；链2，5’-TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’，如SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11所示，siRNA为特异性靶向VEFG的siRNA，序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。

取浓度为10μM，350μL的多柔比星水溶液与100μL、浓度为10μM的适配体A10混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与多柔比星质量比为1:1的特异性靶向VEGF的siRNA，涡旋20s，混合均匀，将体积为200μL的上述混合溶液逐滴滴入涡旋条件下的浓度为150μg/mL，体积为200μL的PLL溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物。上述制得的多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为116.4nm，多分散指数为0.205，电位为14.34mV。

取体积为300μL的上述聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件下浓度为300μg/mL，体积为300μL的羧甲基壳聚糖(CMCS)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于修饰型适配体共递送药物与基因的纳米载体。本实施例制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为204.6nm，多分散指数为0.191，电位为-14.09mV。

实施例5

本实施例中使用的寡聚核苷酸由互补的两条由(CGA)重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₁₁，链1，5’-CGACGACGACGACGACGACGACGACGACGACGA-3’；链2，5’-TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG-3’，序列如SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13所示；siRNA为特异性靶向VEGF的siRNA，序列如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。

取浓度为50μM，100μL多柔比星水溶液与100μL、浓度10μM的寡聚核苷酸混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与多柔比星质量比为2:1的特异性靶向VEGF的siRNA，涡旋20s，混合均匀，将200μL的上述混合溶液逐滴滴入涡旋条件下的浓度为80μM，体积为100μLPEI溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物。上述制得的多柔比星与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为107.3nm，多分散指数为0.210，电位为7.04mV。

取体积为200μL的上述聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件下浓度为160μg/mL，体积为200μL的羧甲基壳聚糖(CMCS)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体。本实施例制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为137.2nm，多分散指数为0.215，电位为-8.90mV。

实施例6

本实施例中使用的适配体为适配体A9，序列为：

5’-GGGAGGACGAUGCGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUCCCAGACGACUCGCCCGA-3’，如SEQ ID NO.14；siRNA为特异性靶向多药耐药基因MDR-1的siRNA，序列如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9所示。

取浓度为10μM，体积为100μL的柔红霉素水溶液与150μL、浓度为10μM的适配体A9混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与柔红霉素质量比为1:4的特异性靶向MDR-1的siRNA，涡旋20s，混合均匀，将体积为100μL的上述混合溶液逐滴滴入涡旋条件下的浓度为100μg/mL，体积为150μL的PEI溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物。上述制得的柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为95.9nm，多分散指数为0.212，电位为11.28mV。

取200μL的上述聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件浓度为200μg/mL，体积为300μL的透明质酸(HA)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体，本实施例制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为217.4nm，多分散指数为0.220，电位为-13.86mV。

实施例7

本实施例中使用的寡聚核苷酸由互补的两条由(CGA)重复序列构成的单链核苷酸退火形成的(CGA)₅，序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示，特异性靶向多药耐药基因MDR-1的siRNA序列如SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9所示。

取浓度为30μM，100μL的柔红霉素水溶液与150μL、浓度10μM的寡聚核苷酸溶液混合，涡旋20s，室温放置5min后，加入与柔红霉素质量比为1:2的特异性靶向MDR-1的siRNA，涡旋20s，混合均匀，将200μL上述混合溶液逐滴滴入涡旋条件下的浓度为100μg/mL，体积为150μL的PLL溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，得柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物。上述制得的柔红霉素与siRNA共载的聚阳离子复合物粒径为109.5nm，多分散指数为0.187，电位为14.03mV。

取200μL的上述聚阳离子复合物逐滴滴入涡旋条件浓度为300μg/mL，体积为200μL的羧甲基壳聚糖-聚乙二醇(CMCS-PEG)溶液，继续涡旋20s，室温放置孵育30min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体。本实施例制得的共递送药物与基因纳米载体粒径为189.7nm，多分散指数为0.194，电位为-14.47mV。

本发明制得的基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体的体外释放研究：

以实施例1中制备共递送药物与基因的纳米载体为例：

取实施例1所得纳米载体350μL置于截留分子量为8000-14000的透析袋中，再将其置于pH分别为5.0，6.0和7.4的20mL磷酸盐缓冲液(PBS)释放介质中，37℃条件下，水浴恒温振荡，振荡速度100转/min，考察药物在不同pH条件下的释放行为。于不同时间点，取1mL释放介质同时补充1mL新鲜的释放介质，取出的释放介质采用荧光分光光度法测定多柔比星的浓度，计算累积释放率，绘制释放曲线，如图6所示，结果发现：在pH5.0条件下，多柔比星的累计释放量达70％，其释放速度也显著性高于pH6.0和pH7.4条件下的释放速度(P＜0.05)。

本发明制得的基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体的细胞摄取情况

以实施例1中制备共递送药物与基因的纳米载体为例：

A549细胞以10万/孔的密度接种于直径为35mm的共聚焦小皿内，于5％CO₂，37℃培养24h后，加入实施例1所制备的纳米载体。于5％CO₂，37℃环境下继续培养4h，采用4℃PBS洗3遍后，与5μg/mL Hoechst室温孵育10min，细胞核染色。再用4℃PBS洗3遍，置于共聚焦显微镜下观察，拍照，如图5。

结果发现：观察到左下图(多柔比星)和由上图(FAM标记的siRNA)证实了细胞内多柔比星和siRNA的成功递送。其中叠加照片右下图，即多柔比星和细胞核的叠加荧光，证实多柔比星的成功细胞内释放和入核。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将寡聚核苷酸溶液与药物溶液混合，室温放置1~100min 后，与siRNA，涡旋1~100s，混合得到混合溶液,所述的寡聚核苷酸溶液与药物溶液的体积比为1:2~2:1，其中寡聚核苷酸与药物的摩尔比为1:10~5:1，siRNA 与药物的质量比是1:5~10:1；寡聚核苷酸为由互补的两条由CGA 重复序列构成的单链核苷酸退火形成的（CGA）5、（CGA）7、（CGA）9、（CGA）11,适配体A9 或A10 中的一种；

（2）将阳离子聚合物溶液在涡旋条件下，逐滴加入步骤1）得到的混合溶液，继续涡旋1~100s，室温放置孵育1~100min 后获得共载药物与基因的聚阳离子复合物；所述阳离子聚合物溶液的浓度为50~500μg/mL，聚阳离子复合物的粒径范围为10~120nm，电位为+5mV~+50mV；所加入的阳离子聚合物溶液与步骤1）得到的混合溶液的体积比1:2~2:1；阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚L-赖氨酸、聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、聚丙烯亚胺、壳聚糖中的一种或一种以上的混合物；

（3）将阴离子聚合物溶液，在涡旋条件下，逐滴加入步骤2）得到的聚阳离子复合物，继续涡旋1~100s，室温放置孵育1~100min，即得基于寡聚核苷酸的共递送药物与基因的纳米载体；阴离子聚合物溶液的浓度为50~500μg/mL，所加入的阴离子聚合物溶液与步骤2）得到的聚阳离子复合物的体积比1:2~2:1，阴离子聚合物为透明质酸、羧甲基壳聚糖、PEG化聚合物中的一种或一种以上的混合物。

2.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，所述溶液的介质为双蒸水、0.9%氯化钠水溶液、0.5%葡萄糖水溶液、含5%葡萄糖和0.9%氯化钠的注射用水、焦磷酸二乙酯处理水中的任意一种或一种以上的混合物。

3.如权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）、2）、3）中所述涡旋5~50s，涡旋速度400~2000r/min；室温放置10~50min。

4.如权利要求1-3 任一所述的制备方法制备的基于寡聚核苷酸共递送药物和基因的纳米载体，所述的纳米载体粒径范围为100nm~300nm，电位为-20mV~+5mV。