CN104840966B - 一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构抗癌药物由核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒制备得到。本发明所述制备方法包括以下步骤：用DNA修饰金纳米颗粒，备用；将核酸纳米结构与化学抗癌药物进行组装；将负载化学抗癌药物的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米颗粒进行组装，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物。本发明的酸纳米结构抗癌复合药物提高了化学抗癌药物和金纳米颗粒在体循环中的稳定性，减少了化学抗癌药物由于非特异性产生的全身毒性，并且可发挥金纳米颗粒的热疗效应，具有化学治疗和光热治疗的协同效果，使癌细胞的细胞活力下降至10％左右，能更高效地治疗肿瘤疾病。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物领域，涉及一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤正在成为威胁人类生命的头号杀手，每年癌症在全世界范围的患病率正逐步提高，而且，癌症的死亡率也在不断上升。当前常用的治疗手段有化学疗法、手术治疗和放射性疗法，但是就现有的实际病例而言，任何一种手段都不能彻底地根治肿瘤，而且每种治疗方法都存在一定的弊端，因而亟需一种治疗手段能够结合上述治疗方法的优势，避免相应的不足。
化学治疗是最为常见的抑制肿瘤的方法，利用化学药物来抑制肿瘤的增殖、转移和浸润，可以有效地杀伤肿瘤，常见的化学治疗的药物有伊立替康、喜树碱、紫杉醇、阿霉素等。作为一种抗生素，阿霉素具有多种衍生结构，不同结构的物理化学性能具有很大的区别，因而被广泛的研究。作为一种广谱性抗癌抗生素，阿霉素能够有效地抑制DNA和RNA的扩增，从而治疗急性白血病、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌等。但是，由于阿霉素在体内的代谢效果不佳，而且不能针对特定的区域进行作用，因而会产生一系列不良反应，比如脱发、骨髓抑制、呕吐，甚至心脏衰竭。此外，与其他抗生素无异，长期使用阿霉素，会导致肿瘤对其产生抗性，进而提高癌症治疗的难度。
纳米材料的诞生为抗癌药物带来的新的契机，纳米材料具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应，特定的纳米药物载体为阿霉素等抗癌药物提供了靶向性、可控性等性能。美国FDA已批准脂质体和聚乙二醇(PEG)干扰素-α2a(Pegasys)作为内包阿霉素(Doxorubicin)的药物载体(Robby A.Petros&Joseph M.DeSimone,Strategies in thedesign of nanoparticles for therapeutic applications,Nature Reviews DrugDiscovery,2010,9,615-627.；Vladimir P.Torchilin,Recent advances with liposomesas pharmaceutical carriers,Nature Reviews Drug Discovery,2005,4,145-160.；G.Sharma,S.Anabousi,等.Liposomes as targeted drug delivery systems in thetreatment of breast cancer.J.Drug Target.2006,14,301-310；R.Duncan.Polymerconjugates as anticancer nanomedicines.Nature Review Cancer 2006,6,688-701)。但是现存的药物载体在多功能集成、药物可控释放等方面仍然存在一定局限。
随着纳米材料的发展，贵金属纳米颗粒成为了肿瘤治疗方面的另一研究热点，由于贵金属纳米颗粒的等离子共振效应，使其能够吸收可见光或者近红外光并将其转化为热量释放出来，这当中属金纳米颗粒最具代表。由于金元素的化学性质不活泼，金纳米颗粒具备制备简单、形貌丰富、尺寸可控以及生物安全性等优势，而且金纳米颗粒可以吸收近红外光，这种光的杀伤效果小，穿透深度高。金纳米颗粒容易合成、性质稳定，并且很容易修饰上不同的基团，这使得金纳米颗粒能够在生物体内实现稳定循环；相比于正常组织，金纳米颗粒更容易在肿瘤区域富集，从而有效杀伤肿瘤。现今已有关于金纳米棒、金纳米壳及金立方体等不同形貌的金纳米颗粒在光热治疗方面的研究。
DNA折纸技术的出现为纳米材料的制备提供了一个新的出路，所谓DNA折纸技术，即是利用长的单链核苷酸序列与若干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对进行杂交形成预先设计的结构，通过这项技术，可以简单方便的制备结构复杂的二维或三维DNA纳米材料。基于沃森-克里克的碱基互补配对原则，DNA纳米材料具备形貌可控性、可寻址性、可修饰性等优势，值得一提的是，作为生物大分子，DNA具有其他材料不可比拟的生物安全性，这为DNA纳米材料作为药物载体提供了强有力的支持。此外，由于DNA独特的双螺旋结构，使得阿霉素这一类的抗肿瘤药物能够嵌入DNA双链之间；而经过DNA单链修饰的金纳米颗粒，也能依靠DNA之间的杂交连接到DNA折纸结构上。例如CN 104368004A公开了一种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构是通过DNA折纸技术构建的任意二维和/或三维纳米结构，具体是脚手架链与辅助折叠的订书钉链通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成的核酸纳米结构。该发明所述核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的载体不但能够保证其运载的抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，而且能够提高抗肿瘤药物的靶向性，使抗肿瘤药物在肿瘤组织中富集，显著降低抗肿瘤药物由于非特异性而产生的全身毒性。这种核酸纳米结构运载抗肿瘤药物的策略仅能解决化学药物治疗中存在的问题，而不能解决其他治疗手段存在的缺陷。
因此，在本领域期望能够开发一种将核酸纳米结构、贵金属纳米颗粒以及化学抗癌药物结合在一起的抗癌产品，以期产生热疗和化疗的双重效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种核酸纳米结构抗癌复合药物，所述核酸纳米结构抗癌药物由核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒制备得到。
本发明将核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒组装在一起得到核酸纳米结构抗癌复合药物，提高了化学抗癌药物以及金纳米颗粒在体循环中的稳定性，以及对肿瘤细胞的靶向性，并且本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物对肿瘤细胞的杀伤作用明显优于核酸纳米结构单独负载化学抗癌药物或金纳米颗粒时对肿瘤细胞的杀伤作用，可以产生热疗和化疗的协同治疗效果，使治疗更加高效。
在本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物中，所述核酸纳米结构为利用DNA折纸技术制备的DNA二维和/或三维纳米结构。
优选地，所述核酸纳米结构是通过环状长序列的DNA单链和短序列的DNA单链按照碱基互补配对原则杂交组装成的DNA纳米结构。
在本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物中，所述化学抗癌药物可以为但不限于顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱、阿霉素或所述药物的药学上可接受的盐中的任意一种或至少两种的组合，优选为盐酸阿霉素。此类抗癌药物为能够和DNA作用，即能够嵌入DNA双螺旋中的药物。在药物联合应用时，应注意药物之间的相互作用，例如环磷酰胺与阿霉素同用时，可增加心脏毒性，因此在药物联合应用时，避免药物相互作用而对人体产生毒性。本发明所述药物组合可以为但不限于羟基喜树碱和顺铂的组合、羟基喜树碱和阿霉素的组合、顺铂和盐酸阿霉素的组合、羟基喜树碱与顺铂和阿霉素的组合、顺铂与环磷酰胺和羟基喜树碱的组合。
在本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物中，所述金纳米颗粒为金纳米棒、金纳米壳及金纳米立方体，优选为金纳米棒。
另一方面，本发明提供了所述核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用DNA修饰金纳米颗粒，备用；
(2)将核酸纳米结构与化学抗癌药物进行组装，分离纯化，备用；
(3)将步骤(2)得到的负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与步骤(1)得到的DNA修饰的金纳米颗粒进行组装，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物。
在本发明所述核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法中，步骤(1)中所述金纳米颗粒采用现有技术方法制备得到，例如根据Babak Nikoobakht和Mostafa A.El-Sayed.Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods(NRs)Using Seed-Mediated Growth Method.Chem Mater,2003,15(10):1957-1962中所述方法进行制备，该方法为以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为表面活性剂，抗坏血酸为还原剂，AgNO3辅助晶种生长金纳米棒，具体包括晶种的合成和金纳米棒的制备两个步骤。同样可以参考现有技术制备得到金纳米壳和金纳米立方体。
步骤(1)所述对金纳米颗粒进行DNA修饰参考文献Baoquan Ding,A facile andefficient method to modify gold nanorods with thiolated DNA at a low pHvalue,Chem.Commun.,2013,49,2533-2535.中所述方法来实现，具体方法为利用TCEP(三(2-羰基乙基)磷酸酯)还原巯基化DNA，向含有89mM Tris碱、89mM硼酸、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)、500mM NaCl和0.01％SDS(十二烷基硫酸钠)的修饰液中加入还原后的DNA(浓度高于金纳米棒1000倍)，混合均匀后，在高效震动的条件下迅速加入金纳米棒，混合均匀后，静置于30℃水浴中12小时备用。而后离心，洗去过量DNA，得到DNA修饰的金纳米颗粒。
利用DNA对金纳米颗粒进行修饰的目的是提高金纳米颗粒的稳定性，并且修饰后的金纳米颗粒更容易与负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构进行组装，得到负载有核酸纳米结构和化学抗癌药物的核酸纳米结构抗癌复合药物。
在本发明所述核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法中，步骤(2)所述核酸纳米结构与化学抗癌药物的摩尔比为1:2×103-1:9×107，优选为1:104；例如，核酸纳米结构与化学抗癌药物的摩尔比可以为1:2×103、1:3×103、1:5×103、1:8×103、1:104、1:3×104、1:5×104、1:8×104、1:9×104、1:105、1:3×105、1:5×105、1:8×105、1:106、1:3×106、1:5×106、1:8×106、1:107、1:3×107、1:5×107或1:9×107。
优选地，步骤(2)所述组装为向核酸纳米结构中加入化学抗癌药物，化学抗癌药物通过嵌入氢键和吸附两种方式组装到核酸纳米结构中。
步骤(2)所述分离纯化采用现有技术实现，例如可以采用超滤、离心分离等技术。
在本发明所述核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法中，步骤(3)所述DNA修饰的金纳米颗粒与负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构的摩尔比≥2，例如可以为2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50、100、200或500等。
在本发明所述核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法中，步骤(3)所述组装的步骤为：将负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米颗粒的混合，升温至40-50℃，而后降温至20-25℃，每摄氏度保持2-10分钟，重复10个循环以上，完成组装。例如可将温度升高至40℃、41℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃；而后降温至20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃；每摄氏度保持2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟；如此重复10个循环以上，例如重复10个循环、11个循环、12个循环、14个循环、16个循环、18个循环、20个循环、25个循环或30个循环。
优选地，步骤(3)所述组装的步骤为：将负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米颗粒混合，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复10个循环以上，完成组装。
步骤(3)所述的分离纯化采用现有技术实现，例如可以采用琼脂糖凝胶进行分离。
作为优选技术方案，本发明提供的核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)用DNA修饰金纳米棒，备用；
(2)将盐酸阿霉素与核酸纳米结构进行组装，即向核酸纳米结构的水分散液中加入盐酸阿霉素，盐酸阿霉素通过嵌入氢键和吸附两种方式组装到核酸纳米结构中，分离纯化，备用；
(3)将步骤(2)得到的负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与步骤(1)得到的DNA修饰的金纳米棒进行组装，所述组装的步骤为：将负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构的水分散液与DNA修饰的金纳米棒的水分散液混合，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复10个循环以上，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物。
另一方面，本发明提供了所述的核酸纳米结构抗癌复合药物在制备用于光热治疗和化学治疗的药物中的应用。本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物可利用核酸纳米结构负载化学抗癌药物和金纳米颗粒，其可以起到化学药物治疗和光热治疗的双重效果，对于肿瘤细胞的治疗更加高效。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒组装在一起得到核酸纳米结构抗癌复合药物，制备方法简单，易于操作。本发明制备得到的核酸纳米结构抗癌复合药物提高了化学抗癌药物以及金纳米颗粒在体循环中的稳定性，化学抗肿瘤药物在肿瘤组织中富集，显著降低化学抗肿瘤药物由于非特异性而产生的全身毒性，通过缓慢释放，可以对肿瘤起到抑制作用，能够有效逆转肿瘤细胞对化学抗肿瘤药物的抗性，并且金纳米颗粒能够吸收可见光或者近红外光并将其转化为热量释放出来，可以有效地杀伤癌细胞，本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物同时负载化学抗癌药物和金纳米颗粒，能够发挥化学治疗和光热治疗的协同效果，使癌细胞的细胞活力下降至10％左右，对癌细胞的杀伤作用明显优于核酸纳米结构单独负载化学抗癌药物或金纳米颗粒时对癌细胞的杀伤作用，因此能更高效地治疗肿瘤疾病。
附图说明
图1是实施例1中在自然光(A)和紫外光(B)下对产物核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)的凝胶电泳检测图，其中A图和B图中泳道1为核酸纳米结构；泳道2为核酸纳米结构-阿霉素，泳道3为核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒，泳道4为核酸纳米结构-金纳米棒；泳道5为金纳米棒；
图2是利用透射电子显微镜对实施例1制备的产物核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)的表征结果图，图中标尺为200nm；
图3是实施例12中本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)与核酸纳米结构-阿霉素以及核酸纳米结构-金纳米棒对癌细胞MCF-7 ADR的杀伤作用的效果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明所用仪器和材料如下：
仪器：Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，5810R小型高速离心机(Eppendorf，德国)，UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，透射电镜(HT7700，日立)，酶标仪(TECAN，瑞士)，双光子荧光显微镜(Olympus，日本)。
原料：订书钉链和捕获订书钉链(短链核苷酸序列)购自上海英潍捷基生物技术有限公司，M13噬菌体基因组DNA购自New England Biolabs公司，盐酸阿霉素、羟基喜树碱和顺铂等抗癌药物购自北京华奉有限公司，CTAB、氯金酸、硼氢化钠、硝酸银等其他原料均购自美国Sigma-Aldrich公司，细胞核和细胞膜染料购自美国Life Technology公司。
试剂：实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)和PBS缓冲溶液(pH7.4)。其中，1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为：4×10-2mol·L-1Tris，2×10-2mol·L-1乙酸，2.0×10-3mol·L-1EDTA和1.25×10-2mol·L-1醋酸镁；1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为：136.9×10-3mol·L-1(8.00g·L-1)NaCl，2.68×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KCl，9.75×10-3mol·L-1(1.56g L-1)Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KH2PO4；这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。
细胞：MCF-7 ADR抗阿霉素人乳腺癌细胞系，购自中国协和医科大学基础医学研究所。
培养基：DMEM高糖培养基，添加10％胎牛血清，细胞接种于100mm2培养皿中，置于5％CO2培养箱，37℃培养，当细胞生长至融合度80％左右时传代；所用培养基和胎牛血清购自Life Technology公司。
实施例1核酸纳米结构抗癌复合药物的制备
在本实施例中，通过以下方法制备核酸纳米结构抗癌复合药物，具体包括以下步骤：
(1)金纳米棒的合成
金纳米棒的合成方法采用Chem Mater,2003,15(10):1957-62中所述的方法制备，即以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为表面活性剂，抗坏血酸为还原剂，AgNO3辅助晶种生长金纳米棒，具体方法包括：
(a)晶种的合成：在将20mL圆底烧瓶中加入10mL的浓度为100mM的CTAB和50μL浓度为2％(w/v)的HAuCl4。搅拌均匀后，在高效搅拌的状态下迅速加入1000μL浓度为6mM预冷的NaBH4，再次搅拌均匀。溶液颜色逐渐由无色变为茶色后，将烧瓶移至30℃水浴中静置2小时，得到晶种溶液，备用。
b)金纳米棒的制备：在30mL圆底烧瓶中加入30mL浓度为100mM的CTAB和234μL浓度为2％(w/v)氯金酸HAuCl4。搅拌均匀后，加入210μL浓度为10mM AgNO3。再次搅拌均匀后，在高效搅拌的状态下加入144μL浓度为100mM的抗坏血酸。最后加入48μL步骤(a)合成的晶种溶液，搅拌均匀后，将溶液置于30℃温水浴中静置12小时，转移至15mL离心管内，以8000rpm的条件离心30分钟，遗弃上清后，加入10mL纯净水，再次以8000rpm的条件离心30分钟，保留底部沉淀，即金纳米棒，分散于20μL纯净水中得到金纳米棒溶液。
(2)用DNA修饰金纳米棒
取摩尔量为巯基化DNA的200倍的200mM TCEP还原100μM巯基化DNA，反应时间超过2小时，然后通过G-25体积排阻柱过滤除去未反应的TCEP。配制含有89mM Tris碱、89mM硼酸、2mM EDTA、500mM NaCl和0.01％SDS的修饰液，加入浓度高于金纳米棒1000倍的还原后的DNA，将上述溶液混合均匀后，在高效震动的条件下迅速加入金纳米棒，混合均匀后，静置于30℃水浴中12小时。以8000rpm的条件离心30分钟，回收所得DNA修饰的金纳米棒，加入适量纯净水，重复上面离心过程，以洗去过量DNA，得到DNA修饰的金纳米棒。
(3)核酸纳米结构的合成
将M13噬菌体基因组DNA和订书钉链及捕获订书钉链混合在1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH＝8.3)中，最终获得混合溶液的体积为100μL，其中M13噬菌体基因组DNA的浓度为10nM，订书钉链及捕获订书钉链的浓度均为100nM。控制上述混合溶液的温度从95℃逐步降至20℃，整个降温过程控制在12小时以上，从而获得既定的核酸纳米结构。
(4)阿霉素与核酸纳米结构组装
在步骤(3)获得的核酸纳米结构溶液中加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素的浓度为100μM(即溶液中核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比为1:104)，盐酸阿霉素将会通过嵌入氢键和吸附两种方式组装到核酸纳米结构中。利用截留分子量为100kDa的超滤柱子，以4700rpm的离心方式过滤掉未参与组装的订书钉链、捕获订书钉链以及未负载至核酸纳米结构的盐酸阿霉素分子，得到负载阿霉素的核酸纳米结构。
(5)负载有阿霉素的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米棒进行组装
将负载有阿霉素的核酸纳米结构分散在纯净水中得到负载阿霉素的核酸纳米结构溶液，将DNA修饰的金纳米棒分散于纯净水中得到DNA修饰的金纳米棒溶液，将两种溶液混合(其中，DNA修饰的金纳米棒与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为2)，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复10个循环，完成组装。以40mL 1×TBE缓冲溶液在加热条件下溶解1％的琼脂糖，加入2μL溴化乙锭对其预先染色，以所获得的琼脂糖凝胶对上述产物进行电泳分离，电泳所需要的电压为85V，所需要的离子环境为0.5×TBE缓冲溶液，电泳时间为40分钟。在自然光和紫外光下分别确定组合产物在琼脂糖凝胶中位置，如图1所示，取干净的刀片切下该区域的凝胶，利用凝胶纯化柱在4℃以离心的方法得到纯净浓缩的产物。
图1是对实施例1得到的产物核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)进行的凝胶分析，以核酸纳米结构、金纳米棒、负载金纳米棒的核酸纳米结构(核酸纳米结构-金纳米棒)(按照步骤(5)的方法将DNA修饰的金纳米棒与核酸纳米结构进行组装而得到)和负载阿霉素的核酸纳米结构(核酸纳米结构-阿霉素)作为对照材料。由图1的琼脂糖凝胶电泳图可知，无论是在核酸纳米结构上负载上阿霉素还是在核酸纳米结构上负载金纳米棒，对于核酸纳米结构在电泳泳道中条带的位置都没有任何影响。
利用透射电子显微镜对实施例1制备得到的核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)进行表征，方法如下：
取经等离子体处理机辉光溅射处理的碳支持膜，滴加6μL上述纯化的产物，沉积10分钟后，吸弃未沉积的液体。为了提高产物与背景的衬度，再次滴加0.7％的醋酸双氧铀对碳支持膜进行负染，沉积30秒钟后，以滤纸吸干染色液。利用透射电子显微镜在80kV的条件下，对产物进行表征，结果如图2所示。
由图2可见，在核酸纳米结构上负载金纳米棒或负载金纳米棒和阿霉素后，核酸纳米结构仍旧能够保持其三角形的完好形貌。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成负载有阿霉素的核酸纳米结构的过程中将核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:105，步骤(5)中DNA修饰的金纳米棒与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为10，反应条件调整为将混合溶液升温至45℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持10分钟，重复25个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)。
实施例3
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成负载有阿霉素的核酸纳米结构的过程中将核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:106，步骤(5)中DNA修饰的金纳米棒与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为7，反应条件调整为将混合溶液升温至40℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持6分钟，重复15个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)。
实施例4
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成负载有阿霉素的核酸纳米结构的过程中将核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:107，步骤(5)中DNA修饰的金纳米棒与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为20，反应条件调整为将混合溶液升温至40℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持10分钟，重复15个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒)。
实施例5
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成负载有阿霉素的核酸纳米结构的过程中将核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:2×103，利用金纳米壳代替金纳米棒，将金纳米壳用实施例1中所述步骤进行DNA修饰，步骤(5)中DNA修饰的金纳米壳与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为200，反应条件调整为将混合溶液升温至50℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持2分钟，重复20个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米壳)。
实施例6
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成负载有阿霉素的核酸纳米结构的过程中将核酸纳米结构与盐酸阿霉素的摩尔比设定为1:9×107，利用金纳米立方体代替金纳米棒，将金纳米立方体用实施例1中所述步骤进行DNA修饰，步骤(5)中DNA修饰的金纳米立方体与负载有阿霉素的核酸纳米结构的摩尔比为500，反应条件调整为将混合溶液升温至50℃，而后降温至20℃，每摄氏度保持8分钟，重复30个循环，完成组装。其余原料选用以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，同样制备得到了核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-阿霉素-金纳米立方体)。
实施例7
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成核酸纳米结构抗癌复合药物过程中选用的化学抗癌药物为羟基喜树碱，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-羟基喜树碱-金纳米棒)。
实施例8
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成核酸纳米结构抗癌复合药物过程中选用的化学抗癌药物为顺铂和阿霉素，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-(顺铂+阿霉素)-金纳米棒)。
实施例9
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成核酸纳米结构抗癌复合药物过程中选用的化学抗癌药物为顺铂，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-顺铂-金纳米棒)。
实施例10
本实施例与实施例1不同之处在于，在合成核酸纳米结构抗癌复合药物过程中选用的化学抗癌药物为顺铂、羟基喜树碱和阿霉素，除此之外，其余原料选择以及制备方法和反应条件均与实施例1相同，从而制备得到核酸纳米结构抗癌复合药物(核酸纳米结构-(顺铂+羟基喜树碱+阿霉素)-金纳米棒)。
实施例11核酸纳米结构抗癌复合药物的活细胞摄入
在本实施例中，通过以下方法考察核酸纳米结构抗癌复合药物的活细胞摄入情况，所述方法如下：
对阿霉素具有抗性的人乳腺癌细胞系MCF-7 ADR细胞培养在含有10％胎牛血清和1％双抗(双抗为一种含有青霉素(10,000IU)和链霉素(10,000μg/mL)的100倍工作浓度的混合液)的高糖DMEM完全培养基中，培养环境为37℃和5％CO2。当细胞生长至融合度为80％左右，将细胞消化，重新接种于35mm2共聚焦小皿中，培养12小时，将其培养基依次替换为含有游离金纳米棒的培养基、含有核酸纳米结构-金纳米棒的培养基、含有游离阿霉素的培养基和含有核酸纳米结构-阿霉素的培养基、含有核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒的培养基无以及任何添加的新鲜培养基(其中保持游离的阿霉素或金纳米棒与负载于核酸纳米结构的阿霉素或金纳米棒的量相当)，孵育24小时。
将上述各组孵育24小时后的细胞依次用PBS清洗三次，再加入1mL PBS溶液，利用激发波长为780nm的双光子荧光显微镜观察阿霉素和金纳米棒进入细胞的情况，结果显示，本发明制备的核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒能够被MCF-7 ADR细胞摄入，而只有极少的游离的阿霉素或者金纳米棒被细胞摄入，这是由于细胞的非特异性摄取造成的，将阿霉素和金纳米棒负载在核酸纳米结构上后其被细胞的摄入明显增强，这说明核酸纳米结构的确协助了药物和金属纳米颗粒的内化。
实施例12核酸纳米结构抗癌复合药物对癌细胞的杀伤作用
在本实施例中，通过以下方法考察核酸纳米结构抗癌复合药物对癌细胞的杀伤作用，所述方法如下：
对阿霉素具有抗性的人乳腺癌细胞系MCF-7 ADR细胞培养在含有10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM完全培养基中，培养环境为37℃和5％CO2。当细胞生长至融合度为80％左右，将细胞消化，重新接种于96孔板中，培养12小时。分别加入含有核酸纳米结构-阿霉素(阿霉素含量为5μM)、核酸纳米结构-金纳米棒(金纳米棒含量为2.5nM)、核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒(阿霉素含量为5μM，金纳米棒含量为2.5nM)和无任何添加的完全培养基(空白组)，孵育24小时后，将其培养基替换为新鲜培养基。利用808nm激光器，以2.5W的功率光照3分钟，以噻唑蓝测定活细胞的相对数目，结果如图3所示。
由图3可见，核酸纳米结构-阿霉素、核酸纳米结构-金纳米棒使得MCF-7 ADR细胞的细胞活力下降至70％和50％，这是由于核酸纳米结构协助阿霉素和金纳米棒进入细胞，有效地逆转了MCF-7 ADR的耐药性，对细胞有一定杀伤作用；本发明将阿霉素和金纳米结构负载至核酸纳米结构得到的核酸纳米结构-阿霉素-金纳米棒使得MCF-7 ADR细胞的细胞活力下降至10％左右，这说明核酸纳米结构同时协助阿霉素和金纳米棒进入细胞，能够将缓慢释放的阿霉素与吸收激光后释放热而起到热疗作用的金纳米棒的效果结合到一起，发挥了协同治疗效果，从而达到治疗癌症的更佳效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的核酸纳米结构抗癌复合药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸纳米结构抗癌复合药物，其特征在于，所述核酸纳米结构抗癌药物由核酸纳米结构、化学抗癌药物和金纳米颗粒制备得到；所述核酸纳米结构为利用DNA折纸技术制备的DNA二维和/或三维纳米结构，所述核酸纳米结构是通过环状长序列的DNA单链和短序列的DNA单链按照碱基互补配对原则杂交组装成的DNA纳米结构，所述化学抗癌药物为顺铂、环磷酰胺、羟基喜树碱、阿霉素或所述药物的药学上可接受的盐中的任意一种或至少两种的组合；
所述核酸纳米结构抗癌复合药物通过如下所述方法制备得到，所述方法包括以下步骤：
(1)用DNA修饰金纳米颗粒，备用；
(2)将核酸纳米结构与化学抗癌药物进行组装，分离纯化，备用；
(3)将步骤(2)得到的负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与步骤(1)得到的DNA修饰的金纳米颗粒进行组装，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物；
步骤(2)所述核酸纳米结构与化学抗癌药物的摩尔比为1:2×103-1:9×107，
步骤(3)所述DNA修饰的金纳米颗粒与负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构的摩尔比≥2。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构抗癌复合药物，其特征在于，所述化学抗癌药物为盐酸阿霉素。
3.根据权利要求1所述的核酸纳米结构抗癌复合药物，其特征在于，所述金纳米颗粒为金纳米棒、金纳米壳及金纳米立方体。
4.根据权利要求3所述的核酸纳米结构抗癌复合药物，其特征在于，所述金纳米颗粒为金纳米棒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸纳米结构抗癌复合药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)用DNA修饰金纳米颗粒，备用；
(2)将核酸纳米结构与化学抗癌药物进行组装，分离纯化，备用；
(3)将步骤(2)得到的负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与步骤(1)得到的DNA修饰的金纳米颗粒进行组装，分离纯化，得到所述核酸纳米结构抗癌复合药物；
步骤(2)所述核酸纳米结构与化学抗癌药物的摩尔比为1:2×103-1:9×107，
步骤(3)所述DNA修饰的金纳米颗粒与负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构的摩尔比≥2。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述核酸纳米结构与化学抗癌药物的摩尔比为1:104。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述组装为向核酸纳米结构中加入化学抗癌药物，化学抗癌药物通过嵌入氢键和吸附两种方式组装到核酸纳米结构中。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述组装的步骤为：将负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米颗粒混合，升温至40-50℃，而后降温至20-25℃，每摄氏度保持2-10分钟，重复10个循环以上，完成组装。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述组装的步骤为：将负载有化学抗癌药物的核酸纳米结构与DNA修饰的金纳米颗粒混合，升温至45℃，而后降温至25℃，每摄氏度保持5分钟，重复10个循环以上，完成组装。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸纳米结构抗癌复合药物在制备用于光热治疗和化学治疗的药物中的应用。
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