CN106806343A - 一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒及制备方法与应用，具体地，其制备方法包括如下步骤：1)将介孔二氧化硅和药物溶于溶剂中，反应至完全，分离；2)将步骤1)所得介孔二氧化硅初始纳米粒加入溶液中，并加入多巴胺盐酸盐，反应至完全，分离；3)将步骤2)所得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒加入弱碱水溶液，依次加入还原剂和聚乙二醇修饰的接有巯基的靶向配体叶酸，反应至完全后分离获得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。本发明的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒的制备方法简单；且具有良好肿瘤靶向性、生物相容性以及生物可降解性。

Description

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒及 制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法与应用。

背景技术

据世界卫生组织报道，癌症已经成为威胁人类生命健康的一个主要原因，目前每年在全球夺去700多万人的生命。癌症治疗的方法目前主要有如下几种，如：化学治疗、放射疗法、外科手术、生物疗法、基因治疗、光动力学治疗、癌症疫苗等。发展比较早且使用广泛的治疗方法是化学治疗和放射疗法，其主要缺点在于：治疗手段对癌细胞的靶向性不高，不能有效区分癌细胞和正常细胞，特别是化疗及一些蛋白质药物具有很高的细胞毒性，在治疗的同时也对正常机体器官造成很大损伤。按照传统的给药方式，小分子药物在体内随机分布，真正蓄积到病患部位进而发挥药效的只是少部分药物，多数都被代谢排出体外，生物利用度很低。

靶向性药纳米物传递是一种既可以提高治疗靶向性又比较容易实现的治疗途径，主要依靠药物分子通过靶向特异性到达病变部位，杀灭致病病毒、修复受损组织或消除疾病症状。概括而言，靶向性药物输送体系具有如下主要优点：高度靶向性，减少毒副作用；增加非水溶性药物在体内的分散量，稳定药物在体内的存在；浓集药物并能够调节药物的释放速度；改变药物给药途径，如将需要静脉注射的药物制成方便的口服药物。目前关于体内靶向功能的药物载体成功用于临床报道极其少见，导致靶向药物的临床应用进展缓慢。

介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)由于其缓释、控释的特点，被公认为是一种优良的抗癌药物载体系统。介孔二氧化硅具有良好的生物相容性和生物可降解性，在人体无毒，无积累。由于其高比表面和大孔隙度的特点，介孔二氧化硅拥有高的药物包封率和载药量。因此它在生物医学领域具有很诱人的应用前景和极高的商业价值，广泛应用于负载抗癌药的纳米药物。另外，通过对硅球表面的修饰，可以较方便引入其他基团，增加药物性能。但是这种纳米药物不具有主动靶向的功能。靶向治疗已经成为癌症纳米技术领域非常重要的研究方向。与正常细胞相比，肿瘤细胞表面常会出现一些受体的表达异常，这为靶向治疗提供了基础。

肿瘤细胞表面存在特异的叶酸受体((Folate Receptor，FR)，可专一性识别含有叶酸的载体，并与之特异性结合，通过细胞内吞作用进入肝癌细胞并释放药物。靶向配体的导入要求纳米粒子表面有可链接的反应官能团，在纳米药物表面修饰一层聚多巴胺(polydopamine，pD，PDA)被认为是一种在纳米药物表面引入化学反应官能团较简单的方法，多巴胺的分子结构如下：

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

本发明的第二个目的是提供一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的应用。

本发明的技术方案概述如下：

本发明一个方面提供了一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1)将介孔二氧化硅和药物溶于溶剂中，反应至完全，分离获得载有药物的介孔二氧化硅初始纳米粒；

2)将步骤1)所得介孔二氧化硅初始纳米粒加入溶液中，并加入多巴胺盐酸盐，反应至完全，分离获得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒；

3)将步骤2)所得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒加入弱碱水溶液，依次加入还原剂和靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸，反应至完全后分离获得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

在本发明的技术方案中，所述药物为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、香豆素-6、顺铂、5-氟尿嘧啶、喜树碱、布洛芬或10-羟基喜树碱。

在本发明的技术方案中，权利要求1中的溶剂选自能够溶解药物的溶剂，优选为水溶液或有机试剂，更优选为水、缓冲盐溶液、丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。

在本发明的技术方案中，步骤1)中介孔二氧化硅与药物的比例为，介孔二氧化硅：药物＝10：1-10，优选地，步骤1)中药物加入溶液中的浓度为0.2mg/ml-5mg/ml。

在本发明的技术方案中，步骤2)中加入多巴胺盐酸盐至其浓度为0.2-1.0mg/mL。

在本发明的技术方案中，步骤2)中的溶液选自pH＝8-9的PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液。

在本发明的技术方案中，步骤3)中弱碱性溶液的pH为8.5～12，优选地，弱碱性溶液选自PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液；

在本发明的技术方案中，步骤3)中的还原剂选自三(2-羧乙基)膦。

在本发明的技术方案中，步骤3)中加入还原剂至其浓度为0.1～1mg/mL，加入巯基-聚乙二醇-叶酸至其浓度为0.1～10mg/mL；优选地，步骤1)和步骤2)中纳米粒加入溶液中的浓度为0.1mg/ml-1mg/ml。

在本发明的技术方案中，步骤1)或步骤2)中的分离为机械分离，选自离心分离、过滤分离。

本发明另一个方面提供了前述制备方法制备获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

本发明再一个方面提供了叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米在制备治疗抗肿瘤的药物中的用途，或在作为药物靶向传递载体的药物中的用途。

在本发明的一个具体技术方案中，提供了一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)按比例，称取100mg介孔二氧化硅和10～100mg的亲水或疏水性药物，溶于8～10ml去离子水(亲水性药物)或2～8ml有机溶剂(疏水性药物)中，在搅拌条件下，反应6～24小时，10000～20000rpm离心15～30min，弃上清液，洗涤，沉淀经真空干燥得载有药物的介孔二氧化硅初始纳米粒；

(2)按1mg～10mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2～1.0mg/mL，反应3～12小时，10000～20000rpm离心15～30min，收集沉淀，用去离子水洗涤，真空干燥，获得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒；

(3)按1mg～10mg:1mL的比例将载有药物的被聚多巴胺包裹的纳米粒分散在pH为8.5～12的弱碱水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.1～1mg/mL，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸使浓度为0.1～10mg/mL，反应3～12小时，10000～20000rpm离心15～30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

在本发明中所用的巯基-聚乙二醇-叶酸为市售产品，其分子量为1000-5000，优选为2000。

有益效果

本发明的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒的制备方法简单，无污染。所获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒具有良好肿瘤靶向性、生物相容性以及生物可降解性，实验证明，可靶肿瘤细胞，并对肿瘤有治疗作用。

附图说明

图1为动态光散射测的实施例1制备的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒MSN-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素)粒度分布。

图2为实施例1制备的叶酸和聚多巴胺修饰的宫颈癌靶向纳米粒MSN-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素)的透射电子显微镜(TEM)图谱。

图3为载阿霉素(DOX)的MSNs、MSNs-DOX和MSNs-DOX@PDA的氮气吸附/脱附曲线。

图4为载阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA的体外粒释放曲线。

图5为空白MSNs、MSNs@PDA-PEG-FA纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)在72小时对Hela细胞的细胞活性实验结果。

图6为载阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA与空白MSNs、MSNs@PDA、MSNs@PDA-PEG-FA纳米粒(与载药纳米粒相同纳米粒悬液浓度)72小时内对Hela细胞的细胞活性实验结果，商品化的阿霉素DOX做对比。

图7为激光共聚焦扫描电子显微镜(CLSM)观察用载阿霉素的纳米粒孵育2小时的Hela细胞。细胞核用DAPI染成蓝色，载阿霉素纳米颗粒是红色的，分别通过DAPI通道和Cy3通道观察细胞摄取情况。

图8为载阿霉素的纳米粒对肿瘤的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和10mg的阿霉素，溶于8ml去离子水中，在搅拌条件下，避光反应6小时，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤，以除去游离的阿霉素，沉淀经真空干燥得载阿霉素的介孔二氧化硅初始纳米粒MSNs-DOX；

(2)按5mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐至其浓度为0.5mg/mL，避光反应3小时，10000rpm离心30min，收集沉淀，用去离子水洗涤，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，真空干燥后获得载阿霉素的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX@PDA；

(3)按5mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs-DOX@PDA分散在pH为8.5的碳酸氢钠水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.1mg/mL，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为5mg/mL，避光反应3小时，10000离心30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素(Doxorubicin，DOX))。

步骤(1)，步骤(2)，步骤(3)获得的纳米粒的Zeta电位(Zetasizer Nano ZS)分别在-16mV、-7mV和-5mV左右，表面电荷的绝对值比较高，颗粒之间相互排斥作用较强，因而在分散相中高度稳定。

为测试纳米粒子的载药量，在制备纳米粒子的过程中，所有的上清液和清洗液均被收集混合，收集的样品经0.45μm滤膜过滤后，用HPLC测试溶液中药品浓度。HPLC使用反相C-18色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液(25mmol/L Na₂HPO₄ 30mmol/L NaH₂PO₄,pH 5.0)：乙腈：水(30:50:20,v/v/v)，流动相使用前经0.45μm滤膜过滤，并超声处理。每次进样20μl，流动相流速为1mL/min，紫外波长为233nm。测得三种纳米粒子的载药量分别为10.53％、8.76％、7.82％。

如图1所示，动态光散射测的实施例1制备的纳米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素)粒度分布较均匀，平均粒径大约在200nm左右。

如图2所示，实施例1制备的纳米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素)的透视电镜结果，可以看出纳米粒子粒径呈单一分布，形状为球形，表面有规则分布的孔道，粒子粒径大约在200nm左右。

如图3所示，通过BJH法计算出的纳米粒子的孔径大小。可以看出，空白纳米粒MSNs的孔径约为2.56nm，载入阿霉素(DOX)以后MSNs-DOX的孔径减小至2.32nm，当载药以后的纳米粒包被多巴胺得到的MSNs-DOX@PDA孔径进一步减小到了2.07nm。

如图4所示，透析法测定纳米粒的粒缓释曲线，实施例1各步骤获得的三种纳米粒子各15mg分别分散于5ml释放介质PBST溶液(由8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄、0.3g NaH₂PO₄、1.0g吐温-80和去离子水1000ml组成，并经高压灭菌而得，调节pH为5.6。)中，形成悬液。将纳米颗粒悬液置于透析袋中，封好袋口。密闭的透析袋放入50ml离心管中，加入15ml PBST，置于恒温水浴摇床中于37℃，120rpm振荡。在一定时间间隔内，从离心管中取出10ml溶液用于分析，同时补充等量的新鲜PBST于离心管中。收集的样品经0.45μm滤膜过滤后，用HPLC测试溶液中药品浓度，测试条件和测载药量时所用HPLC的条件相同。根据数据绘制载药纳米颗粒体外释放曲线，所得结果见图4。图4显示载阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA的体外粒释放曲线，由图可见，7天后，三种纳米粒产品的体外粒释放率分别达到了46.9％,37.2％和38.3％，三种纳米粒具有相似的释放曲线，呈两相释放特征并伴随初始的“突释效应”，易满足临床要求。

如图5和图6分别为纳米粒在24小时和48小时对宫颈癌细胞Hela细胞毒性结果，采用MMT发测定该纳米粒子的细胞毒性：将Hela细胞(ATCC,Rockville,MD)接种于96孔细胞培养板中，细胞培养12h贴壁后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，加入待测样品、阳性对照、阴性对照分别培养24h、48h。在规定的时间间隔后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，每孔加入100μl含MTT 1mg/ml的细胞培养基，37℃孵育4h后，弃去MTT，每孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)，黑暗37℃培养2h，振荡10min，用酶标仪测定490nm波长的吸光度。

结果表明，不载药的纳米粒MSN@PDA-PEG-FA具有良好的生物相容性，因为在不同纳米粒悬液浓度下它对Hela细胞没有明显的毒性；而载阿霉素的三种纳米粒具有明显的细胞毒性。

此外，MTT实验结果说明载阿霉素的MSN-DOX、MSN-DOX@PDA和MSN-DOX@PDA-PEG-FA对Hela细胞的毒性具有时间和浓度依赖性。

将Hela细胞悬液均匀接种于6孔细胞培养板中，再加入1ml培养基，37℃、5％CO₂孵箱中培养24h。于Hela细胞中加入5μg/ml的载阿霉素的纳米颗粒，继续培养2h。另外，在MSN-DOX@PDA-PEG-FA组同时加入叶酸作为受体竞争实验观测细胞对纳米粒子的摄取情况，来观察MSN-DOX@PDA-PEG-FA的靶向情况。纳米粒子与细胞孵育相应的时间后，去除培养基，用冰冷的PBS冲洗三次，加入多聚甲醛固定细胞20min，弃去多聚甲醛，加入DAPI染液孵育5min，再用PBS冲洗三次，可以在细胞摄取实验中通过对细胞核的定位来确定载阿霉素纳米粒在细胞中的位置。

图7是用激光共聚焦扫描电子显微镜观察Hela细胞对载阿霉素的两种纳米颗粒(MSN-DOX@PDA和MSN-DOX@PDA-PEG-FA)的摄取结果。从图中可以看出，仅仅在与细胞孵育2h后，纳米粒就已经被细胞所摄取，并且与没有叶酸修饰的纳米粒子MSN-DOX@PDA相比，加入载阿霉素的叶酸和聚多巴胺修饰的MSNs-DOX@PDA-PEG-FA一组显示出更强的荧光信号。但是当MSN-DOX@PDA-PEG-FA同时加入叶酸后，则荧光减弱。这些结果表明制备的MSN-DOX@PDA-PEG-FA有较好的肝脏靶向性。

实施例2

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg阿霉素，溶于8ml去离子水中，在搅拌条件下，反应6小时，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤，以除去游离的阿霉素，沉淀真空干燥得载阿霉素的介孔二氧化硅初始纳米粒MSNs-DOX；

(2)按1mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX重悬于10mM，pH＝8.5的PBS缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2mg/mL，反应5小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，真空干燥后得载阿霉素的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX@PDA；

(3)按1mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs-DOX@PDA分散在pH为10的PBS缓冲溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.2mg/mL，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为10mg/mL，反应5小时，20000离心15min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(载阿霉素)。

图8显示的是载阿霉素的纳米粒子(MSNs-DOX@PDA-PEG、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA)体内抑制肿瘤生长的效果。将实验动物(4-5周龄)随机分为五组，每只动物右侧腋下注射2×106Hela细胞，待肿瘤长到体积约80mm3左右的时候开始腹腔注射治疗，一组注射saline作为空白对照，一组注射商业化的阿霉素，其他三组分别注射不载药的空白纳米粒子MSNs@PDA-PEG-FA和载DOX的MSNs-DOX@PDA-PEG、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA分别在0、4、8、12天进行注射，16天后将实验动物处死，分离出移植瘤。如图8所示，可以看出DOX和两种载药的纳米粒子都较为明显的抑制了肿瘤的生长，两种载药的纳米粒子的抑制效果要比DOX抑制效果好，其中载DOX的MSNs-DOX@PDA-PEG-FA表现出最好的治疗效果。

实施例3

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和20mg的紫杉醇，溶于10ml二甲基亚砜中，在搅拌条件下，反应12小时，15000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤，以除去游离的紫杉醇和溶剂二甲基亚砜，沉淀真空干燥得载紫杉醇的介孔二氧化硅初始纳米粒MSNs-DTX；

(2)按10mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DTX重悬于10mM，pH＝8.5的氢氧化钠水溶液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为1.0mg/mL，避光反应12小时，15000rpm离心20min，收集沉淀，用去离子水洗涤，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，真空干燥后得载紫杉醇的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DTX@PDA；

(3)按10mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs-DTX@PDA分散在pH为10的Tris缓冲溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.1mg/mL，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为1mg/mL，避光反应3小时，10000离心30min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DTX@PDA-PEG-FA(载紫杉醇(Paclitaxel，DTX))。

实验证明，本实施例所获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DTX@PDA-PEG-FA的表征数据与实施例1无实质性差别。

实施例4

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和20mg的地昔帕明，溶于10ml二氧六环中，在搅拌条件下，反应24小时，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤，以除去游离的地昔帕明，沉淀真空干燥得载地昔帕明的介孔二氧化硅初始纳米粒MSNs-DES；

(2)按5mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DES重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.5mg/mL，反应3小时，15000rpm离心20min，收集沉淀，用去离子水洗涤，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，真空干燥后得载地昔帕明的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DES@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSN@PDA分散在pH为10的碳酸钠水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.1mg/mL，加入配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DES@PDA-PEG-FA(载地昔帕明(Desipramine，DES))。

实验证明，本实施例所获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-DES@PDA-PEG-FA的表征数据与实施例1无实质性差别。

实施例5

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和10mg10-羟基喜树碱(OPT)粉末溶于10ml乙腈中，在搅拌条件下，反应24小时，10000rpm离心30min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去游离的10-羟基喜树碱，沉淀真空干燥得载10-羟基喜树碱的初始纳米粒MSNs-OPT；

(2)按2mg:1mL的比例将所述初始纳米粒MSNs-OPT重悬于10mM，pH＝8.5的碳酸氢钠水溶液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.5mg/mL，反应3小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，真空干燥后得载10-羟基喜树碱的被聚多巴胺包裹的纳米粒MSNs-OPT@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs-OPT@PDA分散在pH为9的碳酸钠水溶液中，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000rpm离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒MSNs-OPT@PDA-PEG-FA(载10-羟基喜树碱)。

实验证明，本实施例所获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-OPT@PDA-PEG-FA的表征数据与实施例1无实质性差别。

实施例6

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg布洛芬(Brufen)，溶于8ml二氯甲烷中，在搅拌条件下，反应6小时，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤，以除去游离的布洛芬，沉淀真空干燥得载布洛芬的介孔二氧化硅初始纳米粒MSNs-Brufen；

(2)按1mg:1mL的比例将所述初始介孔二氧化硅纳米粒MSNs-Brufen重悬于10mM，pH＝8.5的PBS缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为0.2mg/mL，反应5小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，以除去未反应的多巴胺盐酸盐，真空干燥后获得载布洛芬的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒MSNs-Brufen@PDA；

(3)按1mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs-Brufen@PDA分散在pH为10的PBS缓冲溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.2mg/mL，加入靶向配体叶酸巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为10mg/mL，反应5小时，20000离心15min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs-Brufen@PDA-PEG-FA(载布洛芬)。

实施例7

一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg 5-氟尿嘧啶(5-FU)，溶于10ml N,N-二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下，避光反应12小时，20000rpm离心15min，弃上清液，用去离子水洗涤三次以除去游离的5-氟尿嘧啶，沉淀真空干燥得载5-氟尿嘧啶的初始纳米粒MSNs-5-FU；

(2)按2mg:1mL的比例将所述初始纳米粒MSNs-5-FU重悬于10mM，pH＝8.5的Tris缓冲液中，加入多巴胺盐酸盐使浓度为1.0mg/mL，反应3小时，20000rpm离心15min，收集沉淀，用去离子水洗涤，真空干燥后获得载5-氟尿嘧啶的被聚多巴胺包裹的纳米粒MSNs-5-FU@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例将步骤(2)获得的MSNs5-FU@PDA分散在pH为10的碳酸氢钠水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使浓度为0.2mg/mL，加入靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸(M＝2000)使浓度为1mg/mL，反应2小时，15000rpm离心20min，收集纳米粒子，用去离子水洗涤，冷冻干燥得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒MSNs-5-FU@PDA-PEG-FA(载5-氟尿嘧啶)。

实验证明，本实施例所获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒MSNs5-FU@PDA-PEG-FA的表征数据与实施例1无实质性差别。

本实施例中还可以采用四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂。

Claims (10)

1.一种叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1)将介孔二氧化硅和药物溶于溶剂中，反应至完全，分离获得载有药物的介孔二氧化硅初始纳米粒；

2)将步骤1)所得介孔二氧化硅初始纳米粒加入溶液中，并加入多巴胺盐酸盐，反应至完全，分离获得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒；

3)将步骤2)所得载有药物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅纳米粒加入弱碱水溶液，依次加入还原剂和靶向配体巯基-聚乙二醇-叶酸，反应至完全后分离获得叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述药物为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、香豆素-6、顺铂、5-氟尿嘧啶、喜树碱、布洛芬或10-羟基喜树碱。

3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，权利要求1中的溶剂选自能够溶解药物的溶剂，优选为水溶液或有机试剂，更优选为水、缓冲盐溶液、丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，步骤1)中介孔二氧化硅与药物的比例为，介孔二氧化硅：药物＝10：1-10，优选地，步骤1)中药物加入溶液中的浓度为0.2mg/ml-5mg/ml。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤2)中加入多巴胺盐酸盐至其浓度为0.2-1.0mg/mL。

6.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤2)中的溶液选自pH＝8-9的PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液。

7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤3)中弱碱性溶液的pH为8.5～12，优选地，弱碱性溶液选自PBS缓冲溶液、Tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液；

步骤3)中的还原剂选自三(2-羧乙基)膦。

8.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤3)中加入还原剂至其浓度为0.1～1mg/mL，加入聚乙二醇修饰的接有巯基的靶向配体叶酸至其浓度为0.1～10mg/mL；优选地，步骤1)和步骤2)中纳米粒加入溶液中的浓度为0.1mg/ml-1mg/ml。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备获得的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米粒。

10.权利要求9所述的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向介孔二氧化硅纳米在制备治疗抗肿瘤的药物中的用途，或在作为药物靶向传递载体的药物中的用途。