CN101249266B - 纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统及制备方法。以可生物降解并具有良好生物相容性的肝靶向两亲性嵌段共聚物作为载体材料，通过溶剂透析法或溶剂挥发法包埋治疗肝脏疾病的药物得到纳米肝靶向给药系统，其中载体材料与药物的质量比为1∶0.1～1.2。本发明操作简单、条件温和、原料廉价，制备的给药系统具有良好的生物相容性，兼具主动和被动靶向的双重功效，可通过注射的方法实现对肝脏的高度靶向和缓释给药，可以解决目前抗癌药物靶向性差和生物利用率低的缺点，提高患者生存质量，具有广阔应用前景。

Description

纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统及制备方法

技术领域

本发明涉及一种可生物降解的纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统及制备方法。将肝靶向化合物修饰至可生物降解并具有良好生物相容性的两亲性嵌段共聚物药物载体上，通过溶剂透析法或溶剂挥发法制备包封治疗肝脏疾病的药物得到纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统。

背景技术

肝脏是人体最大的解毒器官，其在人体代谢、凝血、免疫等各方面机能的调节中均起到至关重要的作用，因此肝脏的病变严重危害着人类健康。我国是肝癌高发区，每年肝癌发病人数约为30万，占全球肝癌发病死亡人数的45％。目前肝癌的治疗首推肝移植，但供体短缺，价格昂贵，导致大多数患者在等待供肝过程中死亡。而现有的抗癌药生物利用率低、靶向性差，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有较大毒副作用，并严重抑制机体免疫系统，导致病人常死于化疗药物的并发症。因此研制新型的肝靶向给药系统，提高药物疗效、选择性和生物利用率成为增加肝癌临床疗效的关键。

目前，肝靶向给药系统的研究尚处于初始阶段。以单克隆抗体为靶向基团，连接药物或放射性核素，是目前国际上研究靶向材料的主要方法，但价格昂贵，难以大规模应用。此外还有基于受体介导的肝靶向体系，如“乳糖靶向”，利用肝脏上存在的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR，半乳糖受体)特异性识别半乳糖配体，将乳糖类物质修饰至载体材料上，实现肝靶向定位的目的。虽然目前关于乳糖受体介导的肝靶向制剂报导较多，但ASGPR的密度和结合活性会随许多生理和病理条件的变化而变化，大多数肝脏疾病患者的血清中均存在结合抑制剂，可导致ASGPR的结合活性降低，使其对半乳糖的特异性识别作用降低(Stockert R.J.，Morell A.G.Hepatic binding protein：the galactose-specific receptor of mammalian hepatocytes，Hepatology，1983，3：750-757)。因此仅通过ASGPR介导实现肝细胞靶向给药的能力是有限的。

1991年，Negishi等人发现大鼠肝细胞膜上含有大量的甘草次酸结合位点和少量甘草酸结合位点(Negishi M.，Irie A.，Nagata N.，et al.Specific binding of glycyrrhetinic acid to the rat livermembrane，Biochim.Biophys.Acta.，1991，1066：77-82)。随后国内外的一些学者相继报导了以甘草酸修饰的脂质体或血清蛋白可在肝脏富集(Sayoko Osaka，Hideki Tsuji，Hiroshi Kiwada.Uptake of liposomes surface-modified with glycyrrhizin by primary cultures rat hepatocytes，Biol.Pham.Bull.，1994，17：940-943)，为肝靶向给药系统的研究带来了一片曙光。但是脂质体在血液中容易被快速清除，被包载物也容易从体系中渗漏，成为制约其应用的瓶颈。因此发现具有更强肝靶向性和稳定性的给药系统对于实现高效受体介导的肝脏靶向意义重大。

生物医药与纳米技术相互融合集成，诞生了纳米生物医药技术。其中靶向纳米药物载体技术由于其特异性强、效果显著，避免了对正常组织的损伤，为人类提高现有肝癌治疗药物的临床疗效和生物利用度，降低毒副作用提供了理想的解决方案。在众多的纳米靶向药物载体材料中，两亲性嵌段共聚物胶束由于其结构稳定，对药物具有较大增溶空间而显示出诱人的潜力：(1)两亲性嵌段共聚物由疏水链段和亲水链段组成，其中疏水段构筑成疏水内核，用于包封抗癌药，载药量大，对药物具有控释作用。柔性的亲水链段形成胶束外壳，一方面可提高抗癌药的溶解度，克服网状内皮系统(RES)的非选择性清除及在血液中易吸附血红蛋白生成沉淀的缺陷，另一方面可在亲水外壳上修饰靶向基团，使胶束能够主动向病变组织输送药物，增加药物疗效，降低不良反应。另外，疏水内核与外部水环境间可能存在的疏水作用力、静电作用力以及嵌段共聚物组分间的氢键等各种分子间作用力使得两亲性嵌段共聚物胶束具有高度的热力学和动力学稳定性，在靶向给药的过程中能保持药物活性。(2)两亲性嵌段共聚物结构可调，通过改变嵌段比例和长度从而调控药物释放速率，以满足患者不同治疗时期的剂量需求。(3)材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，且降解产物能参与人体的新陈代谢，从而保证机体安全。

专利EP0583955公开了聚乙二醇-聚氨基酸两亲性嵌段共聚物胶束，用于物理包埋疏水活性成分(如阿霉素、吲哚美辛、丝裂霉素等)，包封率高，具有缓释给药的作用。但该专利未涉及肝靶向基团的修饰，不具备肝靶向定位的功效。

中国专利CN 1733309A公开了一种叶酸类化合物介导的主动靶向载体的制备方法，利用叶酸在肿瘤细胞表面超量表达的特点，将其修饰至聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物上，得到具有主动靶向功能的药物载体。本专利是将具有高度肝靶向性的甘草次酸修饰至两亲性嵌段共聚物上，得到肝靶向给药系统。

洪玮，魏东芝等制备了18β-甘草次酸与聚乙二醇的轭合物，小鼠黑色素瘤细胞毒性实验表明该轭合物对细胞的杀伤力与18β-甘草次酸相当，同时水溶性较18β-甘草次酸高出约280倍，具有更优异的生物活性，但未涉及到利用甘草次酸作为肝靶向配基的功能。(洪玮，何明磊，魏东芝.18-β甘草次酸聚乙二醇轭合物的合成及体外抗肿瘤活性华东理工大学学报2006，32：415-417)

中国专利CN 1743008A公开了一种纳米肝靶向生物降解药物载体材料和给药系统及其制备方法。将甘草次酸与聚氨基酸(聚赖氨酸、聚谷氨酸苄酯、聚丙氨酸)通过乙二胺或己二胺进行连接，得到药物载体材料，采用超声乳化法制备肝靶向给药系统。该专利中呈现的实施例是以甘草次酸-乙(己)二胺-聚谷氨酸苄酯为基础的胶束。但在我们的后期研究中发现该体系不够稳定，重现性差，并且在纳米粒子的制备过程中易残留有机溶剂，严重制约其作为一种药物载体材料的应用。本发明主要针对上述不足进行改进。有关甘草次酸修饰的聚氨基酸或聚酯的两亲性嵌段共聚物体系，即将具有明确肝靶向性的甘草次酸和聚氨基酸酯或聚酯通过亲水性聚乙二醇进行连接，该项技术目前尚未见相关文献报导。

发明内容：

本发明目的是提供一种纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统及其制备方法，将具有高度肝靶向性的小分子物质修饰至可生物降解的两亲性嵌段共聚物上，制备肝靶向材料，包埋治疗肝脏疾病药物得到纳米肝靶向给药系统。该系统具有良好的生物相容性，兼具主动和被动靶向的双重功效，可有效克服给药系统在体内输送过程中易被网状内皮系统(RES)清除的缺点，提高体系稳定性。并且可通过注射的方法实现对肝脏的高度靶向和缓释给药，可以解决目前抗癌药物靶向性差和生物利用率低的缺点，提高患者生存质量。本发明操作简单、条件温和、原料廉价，具有广阔应用前景。

具体地讲，本发明是将甘草次酸修饰至可生物降解并具有良好生物相容性的两亲性嵌段共聚物(如聚乙二醇-聚氨基酸酯或聚乙二醇-聚酯)，通过溶剂透析或溶剂挥发法制备得到肝靶向给药系统。与中国专利CN 1743008A相比，在甘草次酸与聚氨基酸酯或聚酯间引入亲水性氨基聚乙二醇后，很容易得到纳米粒子，并且材料的稳定性明显提高，可稳定放置两个月以上，在肝脏富集率达78％。

本发明分别从甘草次酸的羧基和羟基与双端氨基聚乙二醇反应，得到单端修饰甘草次酸的氨基聚乙二醇，再引发氨基酸酯氮羧酸酐单体聚合或是与聚酯偶联，制备肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料。

本发明提供一种纳米肝靶向给药系统，包括以肝靶向两亲性嵌段共聚物作为载体材料，包埋治疗肝脏疾病药物制成，粒径为50～500nm。

所述的肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料与治疗肝脏疾病药物的质量比为1∶0.1～1.2。

所述的药物为蒽环类、喜树碱类、长春花碱类、紫杉醇及紫杉烷类或顺铂中的一种或一种以上。

所述的肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料是以下述化合物为原料制备而成：

肝靶向化合物：甘草次酸；

亲水性聚合物：分子量为2000～20000的双端氨基聚乙二醇；

疏水性聚合物：分子量为2000～50000的

聚酯类：包括聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸，或是上述三种聚合物的单体中任意两种单体的共聚物；或

聚氨基酸酯类：包括聚谷氨酸甲酯、聚谷氨酸苄酯、聚天冬氨酸苄酯，分别由谷氨酸甲酯氮羧酸酐单体、谷氨酸苄酯氮羧酸酐单体、天冬氨酸苄酯氮羧酸酐单体聚合得到。

所述的氨基酸酯氮羧酸酐单体的结构为：

R＝-CH₂CH₂COOCH₃     谷氨酸甲酯氮羧酸酐

天冬氨酸苄酯氮羧酸酐

谷氨酸苄酯氮羧酸酐

摩尔配比为：肝靶向化合物与亲水性聚合物的比例为1∶0.5～5；

亲水性聚合物与聚酯的比例为1∶0.2～1；或

亲水性聚合物与氨基酸酯氮羧酸酐单体的比例为1∶15～250；

具体制备方法：将肝靶向化合物、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按比例分别加入有机溶剂(例如，四氢呋喃或N，N’-二甲基甲酰胺)中反应，纯化干燥得到肝靶向化合物活性酯；

将上述产品溶于有机溶剂(N，N’-二甲基甲酰胺)，加入双端氨基聚乙二醇，乙醚沉淀，粗品过Sephadex G-25柱，冻干，得到单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇；再在有机溶剂(N，N’二甲基甲酰胺)中与氨基酸酯氮羧酸酐单体反应，或是在有机溶剂(二甲基亚砜)中与羧基活化的聚酯反应，产品在乙醚中沉淀得到肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料。

所述的肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料的制备方法包括如下步骤：

1.肝靶向化合物活性酯的制备：

1.1甘草次酸活性酯的制备

将甘草次酸溶于四氢呋喃，浓度为20～500mg/mL；冷却下加入DCC，搅拌0.5～1h后加入NHS，继续搅拌10～20h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到甘草次酸活性酯；或

1.2甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯的制备

将甘草次酸溶于甲醇，加入对甲苯磺酸，回流24～72小时，水沉淀。二氯甲烷萃取，浓缩得到甘草次酸甲酯。

按计量将甘草次酸甲酯、丁二酸酐溶于吡啶，加入少量三乙胺，回流12～20h，体系用盐酸调节pH至酸性，过滤，得到丁二酸修饰的甘草次酸甲酯，记为mGA-Suc。

将丁二酸修饰的甘草次酸甲酯溶于N，N’-二甲基甲酰胺，浓度为20～500mg/mL；冷却下加入DCC，搅拌0.5～1h后加入NHS，继续搅拌10～20h，过滤，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥，得到甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯；

2.单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇的制备

将双端氨基聚乙二醇溶于N，N’-二甲基甲酰胺，浓度为50～500mg/mL，搅拌下加入步骤1制备的肝靶向化合物活性酯，40℃反应15～40h，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥。产品过Sephadex G-25柱，冻干，得到单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇；

3.肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

3.1以聚氨基酸酯为疏水链段的肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

将步骤2制备的单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇和氨基酸酯氮羧酸酐单体置于反应瓶中，加入N，N’-二甲基甲酰胺，氮气保护室温搅拌1～3天。无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料；或

3.2以聚酯为疏水链段的肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

将聚酯、DCC、NHS分别加入二氯甲烷中，室温反应10～36h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到羧基活化的聚酯。

将步骤2制备的单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇和羧基活化的聚酯溶于二甲基亚砜，氮气保护室温搅拌1～3天。无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料。

其中各步骤物料摩尔比为：

步骤1肝靶向化合物∶DCC∶NHS＝1∶1～2∶1～2；

步骤1.2甘草次酸甲酯∶丁二酸酐＝1∶1～10；

步骤2肝靶向化合物活性酯∶双端氨基聚乙二醇＝1∶0.5～5；

步骤3.1单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇∶氨基酸酯氮羧酸酐＝1∶15～250；

步骤3.2单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇∶聚酯＝1∶0.2～1；

聚酯∶DCC∶NHS＝1∶1～2∶1～2。

所述的给药系统是通过溶剂透析法或溶剂挥发法将治疗肝脏疾病的药物以物理方式包埋入肝靶向药物载体的疏水内核，该疏水内核由两亲性嵌段共聚物的疏水链段构成。

所述的溶剂透析法包括下述步骤：将肝靶向药物载体材料溶于有机溶剂，肝靶向药物载体材料的质量分数为1～10％，加入治疗肝脏疾病的药物，搅拌使充分混合，体系转移至透析袋，对选择性溶剂透析1～3天；

所述的选择性溶剂为水；有机溶剂为N，N’-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或它们的混合，混合溶剂的体积比为N，N’-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃＝1∶0.1～10。

所述的溶剂挥发法包括下述步骤：将肝靶向药物载体材料溶于有机溶剂，肝靶向药物载体材料的质量分数为1～10％，加入治疗肝脏疾病的药物，搅拌使充分混合，形成油相，超声或搅拌下将上述油相滴加至含水介质中，减压或自然挥发除去有机溶剂。

所述的有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃。所述的含水介质为含有聚乙烯醇或吐温-80的水溶液或纯水。油水相体积比为：油相∶含水介质＝1∶5～50。含水介质中聚乙烯醇或吐温-80的质量分数为1～10％。

所述的给药系统是用于制备注射用治疗肝脏疾病的药物，用于注射靶向缓释治疗肝脏疾病。

本发明的有益效果：

1)作为疏水链段的聚酯或聚氨基酸酯具有良好的生物相容性，能在生物体内自行降解、代谢并被机体吸收和排泄。亲水的聚乙二醇链段能减小材料被网状内皮系统(RES)摄取的机会，增加抗癌药溶解度，进入体内后可由肾脏排出体外。另外，在亲水的聚乙二醇端基修饰肝靶向物质-甘草次酸，并包封抗癌药后，该体系能主动向病变组织输送药物，增加药物疗效，降低不良反应。同时由聚乙二醇和聚酯或聚氨基酸酯构成的两亲性嵌段共聚物具有高度的热力学和动力学稳定性，可稳定存在两个月以上，并能在靶向给药的过程中充分保持药物活性。

2)本发明采用注射给药的方式靶向缓释治疗肝脏疾病。药物肝脏富集率达78％，缓释给药可达26天以上，药物累积释放率为80.93％。

3)靶向物质是具有明确肝靶向性的小分子化合物，对人体没有副作用。本发明得到的肝靶向材料可制成含各种抗肝癌药物的靶向缓释制剂，操作简便、条件温和，具有规模生产的优势。该纳米肝靶向给药系统在高度靶向肝脏的同时还兼具缓释给药的功能，可以解决目前抗癌药物靶向性差和生物利用率低的缺点，提高治疗效果和患者生存质量，具有较高的应用前景。

附图说明

图1是纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统制备过程示意图。

图2是实施例3.1包埋阿霉素的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯纳米粒的透射电镜图。

图3是实施例3.2包埋羟基喜树碱的甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-聚天冬氨酸苄酯纳米粒的原子力显微镜图。

图4是实施例3.3包埋紫杉醇的甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀-聚(乳酸-乙醇酸)纳米粒的粒度分析图。

图5是实施例3.4包埋阿霉素的甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀-聚乳酸纳米粒的粒度分析图。

图6是实施例4包封阿霉素的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯纳米粒体外释放曲线图。

图7是实施例5荧光标记的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯纳米粒在大鼠各组织分布图。

图8是实施例6肝靶向纳米粒的平均粒径随时间变化关系图。

具体实施方式

实施例1：肝靶向化合物修饰的双端氨基聚乙二醇的制备

1.1甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀(GA-PEG₂₀₀₀-NH₂)的制备

将10mmol甘草次酸溶于35mL四氢呋喃，冷却下加入2.54g(12.3mmol)DCC，搅拌0.5h后，加入1.42g(12.3mmol)NHS，继续搅拌15h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得甘草次酸活性酯。

取5mmol甘草次酸活性酯和10mmol双端氨基聚乙二醇(分子量为2000)溶于N，N’-二甲基甲酰胺中，40℃反应15h，乙醚沉淀，收集固体，真空干燥。产品过Sephadex G-25柱，冻干。得到甘草次酸修饰的氨基聚乙二醇₂₀₀₀，记为GA-PEG₂₀₀₀-NH₂。

1.2甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀的制备(双端氨基聚乙二醇分子量为3400)，操作步骤同实施例1.1，得到GA-PEG₃₄₀₀-NH₂。

1.3甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀的制备(双端氨基聚乙二醇分子量为6000)，操作步骤同实施例1.1，得到GA-PEG₆₀₀₀-NH₂。

1.4甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₃₄₀₀(mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-NH₂)的制备

将10mmol甘草次酸溶于50mL甲醇，加入对甲苯磺酸，回流48h。水沉淀，二氯甲烷萃取，浓缩得到甘草次酸甲酯。

将10mmol甘草次酸甲酯、20mmol丁二酸酐溶于吡啶中，加入少量三乙胺，回流20h，体系用盐酸调节pH至酸性。过滤，得到丁二酸修饰的甘草次酸甲酯，记为mGA-Suc。

将10mmol丁二酸修饰的甘草次酸甲酯溶于50mL N，N’-二甲基甲酰胺，冷却下加入DCC，搅拌0.5h后加入NHS，继续搅拌15h，过滤，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥，得到甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯。

搅拌下，将10mmol甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯和10mmol双端氨基聚乙二醇(分子量3400)溶于120mL N，N’-二甲基甲酰胺，40℃反应15h，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥。产品过Sephadex G-25柱，冻干，得到甘草次酸甲酯-丁二酸修饰的氨基聚乙二醇₃₄₀₀，记为mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-NH₂。

1.5甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀的制备(双端氨基聚乙二醇分子量为12000)，操作步骤同实施例1.4，得到mGA-Suc-PEG₁₂₀₀₀-NH₂。

实施例2：肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料的制备

2.1甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯(GA-PEG₃₄₀₀-PBLG)的制备，摩尔比为GA-PEG₃₄₀₀-NH₂∶谷氨酸苄酯氮羧酸酐单体＝1∶15

称取1mmol甘草次酸修饰的氨基聚乙二醇₃₄₀₀(GA-PEG₃₄₀₀-NH₂)，15mmol谷氨酸苄酯氮羧酸酐单体于反应瓶中，加入120mL N，N’-二甲基甲酰胺，氮气保护室温搅拌48h。无水乙醚沉淀，过滤，干燥得白色固体，得到甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯，记为GA-PEG₃₄₀₀-PBLG。

2.2甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-聚天冬氨酸苄酯(GA-PEG₂₀₀₀-PBLA)的制备，摩尔比为GA-PEG₂₀₀₀-NH₂∶天冬氨酸苄酯氮羧酸酐单体＝1∶50

称取1mmol甘草次酸修饰的氨基聚乙二醇₂₀₀₀(GA-PEG₂₀₀₀-NH₂)，50mmol天冬氨酸苄酯氮羧酸酐单体于反应瓶中，加入250mL N，N’-二甲基甲酰胺，氮气保护室温搅拌48h。无水乙醚沉淀，过滤，干燥得白色固体，得到甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-聚天冬氨酸苄酯，记为GA-PEG₂₀₀₀-PBLA。

2.3甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚己内酯(GA-PEG₃₄₀₀-PCL)的制备，摩尔比为GA-PEG₃₄₀₀-NH₂∶PCL＝1∶1，聚己内酯(PCL)分子量为8000

取8g(1mmol)聚己内酯、0.24g(1.2mmol)DCC、0.14g(1.2mmol)NHS溶于50mL二氯甲烷中，室温搅拌15h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到羧基活化的聚己内酯。

取1mmol甘草次酸修饰的氨基聚乙二醇₃₄₀₀(GA-PEG₃₄₀₀-NH₂)和1mmol羧基活化的聚己内酯加入80mL二甲基亚砜，氮气保护室温搅拌2天。无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚己内酯，记为GA-PEG₃₄₀₀-PCL。

2.4甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀-聚(乳酸-乙醇酸)(GA-PEG₆₀₀₀-PLGA)的制备，摩尔比为GA-PEG₆₀₀₀-NH₂∶PLGA＝1∶1，聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)分子量为12000

将6g(0.5mmol)聚(乳酸-乙醇酸)、0.12g(0.6mmol)DCC、0.07g(0.6mmol)NHS分别加入至30mL二氯甲烷中，室温下反应15h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到羧基活化的聚(乳酸-乙醇酸)共聚物。

取0.5mmol甘草次酸修饰的氨基聚乙二醇₆₀₀₀(GA-PEG₆₀₀₀-NH₂)和0.5mmol羧基活化的聚(乳酸-乙醇酸)溶于50mL二甲基亚砜，氮气保护室温搅拌2天。无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀-聚(乳酸-乙醇酸)，记为GA-PEG₆₀₀₀-PLGA。

2.5甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸甲酯(mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-PMLG)的制备，摩尔比为mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-NH₂∶谷氨酸甲酯氮羧酸酐单体＝1∶100

取1mmol甘草次酸甲酯-丁二酸修饰的氨基聚乙二醇₃₄₀₀(mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-NH₂)和100mmol谷氨酸甲酯氮羧酸酐单体溶于350mL N，N’-二甲基甲酰胺，氮气保护室温搅拌48h。无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥，得到甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸甲酯，记为mGA-Suc-PEG₃₄₀₀-PMLG。

2.6甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀-聚乳酸(mGA-Suc-PEG₁₂₀₀₀-PLA)的制备，摩尔比为mGA-Suc-PEG₁₂₀₀₀-NH₂∶PLA＝1∶1，聚乳酸分子量为20000

将20g(1mmol)聚乳酸、0.3g(1.5mmol)DCC、0.17g(1.5mmol)NHS溶于100mL二氯甲烷，室温搅拌15h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到羧基活化的聚乳酸。

取1mmol甘草次酸甲酯-丁二酸修饰的氨基聚乙二醇₁₂₀₀₀(mGA-Suc-PEG₁₂₀₀₀-NH₂)和1mmol羧基活化的聚乳酸溶于120mL二甲基亚砜，氮气保护室温搅拌3天。无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀-聚乳酸，记为mGA-Suc-PEG₁₂₀₀₀-PLA。

实施例3：纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统的制备

3.1制备甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯为载体的纳米肝靶向给药系统

室温磁力搅拌下，将20mg阿霉素和实施例2.1制备的30mg甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯溶于20mL N，N’-二甲基甲酰胺。体系转移至透析袋，5L蒸馏水透析2天，得到包埋阿霉素的肝靶向纳米粒子溶液即给药系统。采用透射电镜对纳米粒形态及粒径进行分析，结果见附图2，粒径140～160nm，粒子为圆整球形，大小均匀。

3.2制备甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-聚天冬氨酸苄酯为载体的纳米肝靶向给药系统

室温磁力搅拌下，将15mg羟基喜树碱和实施例2.2制备的30mg甘草次酸-聚乙二醇₂₀₀₀-聚天冬氨酸苄酯溶于20mL THF和DMF的混合溶液(3∶7，V/V)。体系转移至透析袋，5L蒸馏水透析2天，得到包埋羟基喜树碱的肝靶向纳米粒子溶液即给药系统。采用原子力显微镜对纳米粒表面形态及粒径进行分析，结果见附图3，粒径230～250nm，粒子表面光滑，大小均匀，为圆整球形。

3.3制备甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀-聚(乳酸-乙醇酸)为载体的纳米肝靶向给药系统

室温磁力搅拌下，将5mg紫杉醇和10mg实施例2.4制备的甘草次酸-聚乙二醇₆₀₀₀-聚(乳酸-乙醇酸)溶于3mL二氯甲烷，充分混合，搅拌下将上述体系滴加至45mL 1％的PVA水溶液，除去二氯甲烷，得到包埋紫杉醇的肝靶向纳米粒子溶液即给药系统。采用激光粒度仪对其进行粒径分析，结果见附图4，平均粒径为157nm。

3.4制备甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀-聚乳酸为载体的纳米肝靶向给药系统

室温磁力搅拌下，将1mg阿霉素和实施例2.6制备的3mg甘草次酸甲酯-丁二酸-聚乙二醇₁₂₀₀₀-聚乳酸溶于2mL丙酮，充分混合，搅拌下将上述体系滴加入30mL水中，除去丙酮。得到包埋阿霉素的肝靶向纳米粒子溶液即给药系统。采用激光粒度仪对其进行粒径分析，结果见附图5，平均粒径为183nm。

实施例4：纳米肝靶向两亲性嵌段共聚物给药系统体外释放特征

4.1载阿霉素的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯给药系统的制备

室温磁力搅拌下，将20mg阿霉素和30mg实施例2.1制备的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯溶于20mLN，N’-二甲基甲酰胺，体系转移至透析袋，5L蒸馏水透析2天，得到包封阿霉素的肝靶向纳米粒子溶液即给药系统。

4.2未载药的肝靶向纳米粒的制备

室温磁力搅拌下，将30mg实施例2.1制备的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯溶于20mL N，N’-二甲基甲酰胺，体系转移至透析袋，5L蒸馏水透析2天，得到未载药的肝靶向纳米粒子溶液。

4.3载药率和包封率的计算：

实施例4.1制备的载药纳米粒子溶液在紫外可见分光光度计上于波长480nm处检测阿霉素含量，用实施例4.2制备的未载药纳米粒子溶液作空白对照。载药纳米粒冷冻干燥称重后置于真空干燥器中保存备用。纳米粒载阿霉素率(LC)和包封率(EE)的计算公式分别如式(1)，式(2)所示：

包封率(EE)＝包封阿霉素量/加入阿霉素量×100％    (2)

载阿霉素率(LC)达30.82％，包封率(EE)达80.93％

4.4纳米粒体外控释阿霉素性能：

精确称取一定量冻干的上述肝靶向载阿霉素纳米粒，置于10mL PBS缓冲液中(pH＝7.4)，37℃恒温振荡，速度为(100±5)次·min^-1。定期取样离心，更换介质。HPLC检测释放介质中阿霉素含量。

该给药系统在初始2天存在突释，体外缓释达26天以上，累积释放率达80.93％，其实验结果见附图6。

实施例5：肝靶向纳米粒在大鼠各组织分布

5.1肝靶向材料的荧光标记

取100mg实施例2.1制备的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯，溶于5mL二甲基亚砜，加入2.5mg异硫氰酸荧光素FITC，60μL吡啶，50℃反应3h，乙醇沉淀。产品依次对氢氧化钠水溶液和纯水透析3天。

5.2荧光标记肝靶向纳米粒在大鼠各组织分布

将上述荧光标记的纳米粒子溶液，经大鼠尾部静脉注射给药500μL，以大鼠尾部静脉注射500μL生理盐水为对照。给药后，分别于0.5、1、3h将大鼠断颈处死，提取各个组织。匀浆，离心，测定上清液荧光强度，得到荧光标记肝靶向纳米粒在各组织分布，结果见附图7。

实施例6：肝靶向纳米粒的稳定性实验

取实施例4.2制备的甘草次酸-聚乙二醇₃₄₀₀-聚谷氨酸苄酯纳米粒，激光粒度仪测定平均粒径150nm。每隔十天取样，激光粒度仪检测样品粒径，在检测的七十天内未发现体系粒径有明显变化，没有沉淀产生，说明该肝靶向纳米粒子体系可以稳定存在，结果见附图8。

Claims (6)

1.一种治疗肝脏疾病的纳米肝靶向给药系统，其特征在于它包括以肝靶向两亲性嵌段共聚物作为载体材料，包埋治疗肝脏疾病药物制成，粒径为50～500nm；

所述的肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料与治疗肝脏疾病药物的质量比为1∶0.1～1.2；

所述的药物为阿霉素、羟基喜树碱、紫杉醇或顺铂中的一种；

所述的肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料是用下述化合物为原料制备而成：

肝靶向化合物：甘草次酸；

亲水性聚合物：分子量为2000～20000的双端氨基聚乙二醇；

疏水性聚合物：分子量为2000～50000的

聚酯类：包括聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸，或是上述三种聚合物的单体中任意两种单体的共聚物；或

聚氨基酸酯类：包括聚谷氨酸甲酯、聚谷氨酸苄酯、聚天冬氨酸苄酯；

所述的氨基酸酯氮羧酸酐单体的结构为：

R＝-CH₂CH₂COOCH₃谷氨酸甲酯氮羧酸酐

天冬氨酸苄酯氮羧酸酐

谷氨酸苄酯氮羧酸酐

摩尔配比为：肝靶向化合物与亲水性聚合物的比例为1∶0.1～1；

亲水性聚合物与聚酯的比例为1∶0.2～1；或

亲水性聚合物与氨基酸酯氮羧酸酐单体的比例为1∶15～250；

具体制备方法：将肝靶向化合物、N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺按比例分别加入有机溶剂中反应，纯化干燥得到肝靶向化合物活性酯；

将上述产品溶于有机溶剂中，向溶液中加入双端氨基聚乙二醇，反应物用乙醚沉淀，粗品过Sephadex G-25柱，冻干，得到单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇；再在有机溶剂中与氨基酸酯氮羧酸酐单体反应；或是在有机溶剂中与羧基活化的聚酯反应，产品在乙醚中沉淀得到肝靶向两亲性嵌段共聚物载体材料。

2.权利要求1所述的纳米肝靶向给药系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

.1肝靶向化合物活性酯的制备：

2.1.1甘草次酸活性酯的制备

将甘草次酸溶于四氢呋喃，浓度为20～500mg/mL；冷却下加入N，N-二环己基碳二亚胺，搅拌0.5～1h后加入N-羟基琥珀酰亚胺，继续搅拌10～20h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到甘草次酸活性酯；或

2.1.2甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯的制备

将甘草次酸溶于甲醇，加入对甲苯磺酸，回流24～72h，水沉淀，二氯甲烷萃取，浓缩得到甘草次酸甲酯；

按计量将甘草次酸甲酯、丁二酸酐溶于吡啶中，加入少量三乙胺，回流12～20h，体系用盐酸调节pH至酸性，过滤，得到丁二酸修饰的甘草次酸甲酯；

将丁二酸修饰的甘草次酸甲酯溶于N，N’-二甲基甲酰胺，浓度为20～500mg/mL；冷却下加入N，N-二环己基碳二亚胺，搅拌0.5～1h后加入N-羟基琥珀酰亚胺，继续搅拌10～20h，过滤，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥，得到甘草次酸甲酯-丁二酸活性酯；

2.2单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇的制备

将双端氨基聚乙二醇溶于N，N’-二甲基甲酰胺，浓度为50～500mg/mL，搅拌下加入步骤2.1制备的肝靶向化合物活性酯，40℃反应15～40h，无水乙醚沉淀，收集固体，真空干燥，产品过Sephadex G-25柱，冻干，得到单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇；

2.3肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

2.3.1以聚氨基酸酯为疏水链段的肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

将步骤2.2制备的单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇和氨基酸酯氮羧酸酐单体置于反应瓶中，加入N，N’-二甲基甲酰胺，氮气保护室温搅拌1～3天，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料；或

2.3.2以聚酯为疏水链段的肝靶向两亲性嵌段共聚物的制备

将聚酯、N，N-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺分别加入二氯甲烷中，室温反应10～36h，过滤，无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到羧基活化的聚酯；

将步骤2.2制备的单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇和羧基活化的聚酯溶于二甲基亚砜，氮气保护室温搅拌1～3天；无水乙醚沉淀，收集白色固体，真空干燥，得到肝靶向两亲性嵌段共聚物药物载体材料。

3.根据权利要求2所述的纳米肝靶向给药系统的制备方法，其特征在于各步骤物料摩尔比为：

步骤2.1肝靶向化合物∶N，N-二环己基碳二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶1～2∶1～2；

步骤2.1.2甘草次酸甲酯∶丁二酸酐＝1∶1～10；

步骤2.2肝靶向化合物活性酯∶双端氨基聚乙二醇＝1∶0.5～5；

步骤2.3.1单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇∶氨基酸酯氮羧酸酐单体＝1∶15～250；

步骤2.3.2单端修饰肝靶向化合物的氨基聚乙二醇∶聚酯＝1∶0.2～1；

聚酯∶N，N-二环己基碳二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺＝1∶1～2∶1～2。

4.权利要求1所述的纳米肝靶向给药系统的制备方法，其特征在于它是通过溶剂透析法或溶剂挥发法将治疗肝脏疾病药物以物理方式包埋入肝靶向药物载体的疏水内核，该疏水内核由两亲性嵌段共聚物的疏水链段构成。

5.根据权利要求4所述的纳米肝靶向给药系统的制备方法，其特征在于所述的溶剂透析法包括下述步骤：将肝靶向药物载体材料溶于有机溶剂，肝靶向药物载体材料的质量分数为1～10％，加入治疗肝脏疾病的药物，搅拌使充分混合，体系转移至透析袋，对选择性溶剂透析1～3天；

所述的选择性溶剂为水；有机溶剂为N，N’-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或它们的混合，混合溶剂的体积比为N，N’-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃＝1∶0.1～10。

6.根据权利要求4所述的纳米肝靶向给药系统的制备方法，其特征在于所述的溶剂挥发法包括下述步骤：将肝靶向药物载体材料溶于有机溶剂，肝靶向药物载体材料的质量分数为1～10％，加入治疗肝脏疾病的药物，搅拌使充分混合，形成油相，超声或搅拌下将上述油相滴加至含水介质中，减压或自然挥发除去有机溶剂；

所述的有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃，所述的含水介质为含有聚乙烯醇或吐温-80的水溶液以及纯水；油水相比例为：油相∶含水介质＝1∶5～50；含水介质中聚乙烯醇或吐温80的质量分数为1～10％。

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