CN109316465A - 一种无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统、其制备方法及应用 - Google Patents
一种无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其制备方法及应用。所述多靶点靶向安全可控智能纳米给药系统以具有多靶点病灶靶向的无机纳米可生物降解材料为纳米给药系统,负载所需药物,实现对两种以上病灶内源刺激或外源刺激特异响应的药物智能释放。该给药系统不仅在药物输送过程中可有效阻止药物泄漏,而且可以准确定位、可控释放药物,有效地提高给药量、降低毒副作用,彻底避免了对正常细胞/组织的毒副作用。本发明制备的多靶点靶向安全可控智能纳米给药系统原料廉价易得、制备方法简捷、重现性好、有利于大规模加工生产,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及功能材料领域,特别是涉及一种无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统、其制备方法及应用。
背景技术
如何有效地提高给药量,降低毒副作用,提高治疗效率是当前大多数药物应用中面临的难题,随着纳米材料制备技术的不断发展,基于纳米材料研制的纳米药物载体为解决这一问题提供了有效途径,正逐渐成为国内外研究者们关注的热点。
介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料由于具有负载量大,表面易于修饰,生物相容性好和易于降解等优点,引起纳米载药领域研究者们的广泛关注。在前期工作基础上(Chemical Society Reviews,2017,46,6024-6045;Scientific Reports 6,38931),我们首次提出系统靶向药剂学(Systematic Targeting Pharmaceutics,STP)理念,致力于开发肿瘤等病灶多靶点靶向、多参数控制智能释放、精准定位、安全给药纳米系统。首先用介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料制备得到多靶点靶向安全可控智能纳米给药系统,再包载所需药物,改善药物的水/脂溶性,延长药物的体内半衰期,将药物准确无误地递送到病灶部位。同时,纳米给药系统对肿瘤等病灶部位的微环境或外界刺激具有智能响应性,可以达到精准定位、高效释放药物,减少毒副作用的目的。此外,纳米给药系统可以有效生物降解,避免了在体长期积累造成的毒副作用。
基于上述思想,设计合成基于介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料的多靶点靶向智能纳米给药系统并将其应用于肿瘤等病灶的检测治疗当中,既可以有效地提高给药量,又可以增强其病灶靶向治疗效果,具有良好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了有效地提高药物给药量、降低毒副作用,提供多靶点靶向智能纳米给药系统。所述的给药系统不仅在药物输送过程中可有效阻止药物泄漏,而且只有待其在任意三种或三种以上靶向基团作用下选择性地进入肿瘤等病灶细胞/组织后,才能在特定任意两种以上病灶内源或外源刺激下,定位、可控释放药物,实现安全精准给药,达到高效治疗肿瘤等病灶的目的,彻底避免了对正常细胞/组织的毒副作用。本发明制备的纳米给药系统原料廉价易得、制备方法简捷、重现性好、有利于大规模加工生产,具有良好的应用前景。
本发明首先提供一种多靶点靶向智能纳米给药系统,是以具有多靶点病灶靶向性的介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料为纳米载体,负载所需药物,实现对病灶内源或外源刺激特异响应的药物智能释放。
根据需要再提供一种基于上述多靶点靶向智能纳米给药系统的制备方法,包括以下步骤:
A.将预先制备的纳米载体分散在水中,制备浓度为0.1mg-20mg/mL;具有多靶点病灶靶向性的介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料的制备;
B.在A得到的水溶液中加入药物,混合溶液中药物与纳米载体的质量比为1:1-1:30。将此混合溶液4-37℃搅拌0.5-24h;
C.将B中得到的混合溶液通过离心收集沉淀,并水洗数次后真空干燥,即得到所述的给药系统。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所述的病灶内源或外源刺激包括pH、 GSH、活性氧物种、氨基酸、ATP、金属离子、核酸、酶等病灶内源刺激或磁场、温度、超声波、光照、辐射等病灶外源刺激中的两种以上。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所述的纳米给药系统包括具有多靶点病灶靶向性的介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料等无机纳米可生物降解材料。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统形貌包括球、棒、片、立方、三角、圆锥、多面体等。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所负载的药物包括小分子药物、光敏剂、核酸、蛋白质、多肽等中的任意一种,两种或多种。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所述的多靶点包括病灶部位特异表达的蛋白受体、糖受体、氨基酸受体、核酸、靶细胞膜等的识别物中的任意两种以上。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所述的多靶点靶向智能纳米给药系统粒径在50-300nm。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统,所述的多靶点靶向智能纳米给药系统药物负载量为0.1%-30%。
本发明提供的多靶点靶向智能纳米给药系统采用具有良好生物相容性的,可生物降解的纳米材料制备,对人正常细胞安全,避免了材料长期在体累积带来的毒副作用;同时,制备工艺稳定,原料价格低廉,易于工业化,有良好的市场开发前景。
附图说明
图1为本发明中载体二氧化硅纳米材料高分辨透射电镜的表征结果。
图2为本发明中载体二氧化硅纳米材料的傅里叶红外光谱的表征结果。
图3为本发明中载体二氧化硅纳米材料负载紫杉醇的高分辨透射电镜的表征结果。
图4为本发明中药物智能释放控制开关氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅纳米材料的高分辨透射电镜的表征结果。
图5为本发明中叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅纳米材料的高分辨透射电镜的表征结果。
图6为本发明中叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性。
图7为本发明中叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统在不同环境中紫杉醇的模拟释放曲线。
图8为本发明中叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统及紫杉醇裸药对肝癌细胞的细胞毒性实验结果。
图9为本发明中RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载光敏剂血卟啉的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统在不同环境中光敏剂血卟啉的模拟释放曲线。
图10为本发明中透明质酸接枝的碳量子点封堵负载葡萄糖氧化酶的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统在不同环境中葡萄糖氧化酶的模拟释放曲线。
图11为本发明中叶酸接枝的温敏共聚物P(NIPAM-co-AM)封堵负载Si RNA的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统在不同环境中Si RNA的模拟释放曲线。
图12为本发明中RGD肽接枝的细胞色素C(Cyt C)适配子封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统在不同环境中治疗性多肽的模拟释放曲线。
图13为本发明中寡肽接枝的氧化石墨封堵负载小核酸的脂质体安全可控智能纳米给药系统在不同环境中小核酸的模拟释放曲线。
图14为本发明中叶酸接枝的β-环糊精封堵负载阿霉素的聚合物安全可控智能纳米给药系统在不同环境中阿霉素的模拟释放曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明,但本发明并不限定于此。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,这些都应当落入本发明的保护范围内。
实施例1叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的介孔二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。如图1所示,羧基化的二氧化硅纳米材料粒径为100nm左右。如图2所示,羧基化的二氧化硅纳米材料在1716cm-1处出现一个新的震动为C=O的伸缩震动,证明羧基的成功修饰。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整;
(2)羧基化二氧化硅负载紫杉醇
取1mg紫杉醇溶解于1mL DMF中,将配好的紫杉醇溶液逐滴加入到20mL羧基化二氧化硅水分散液中(10mg/mL),搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。紫杉醇负载量为0.1%。如图3所示,负载紫杉醇的羧基化的二氧化硅纳米材料粒径仍然为100nm左右。
上述步骤(2)中紫杉醇、DMF、与羧基化二氧化硅的比例范围是1~2mg:0.5~2mL:10~50mL;最优选的比例为1mg:1mL:20mL;
(3)氧化锌的制备
量取25mL三乙二醇,转入三口烧瓶中于120℃下通气除水1小时。冷却至80℃后向其加入2mmol(0.53g)乙酰丙酮锌,并保温搅拌20min以混合均匀,然后在Ar2保护下以 10℃/min的速度升至260℃,保温回流1小时,自然冷却至室温,以酒精为清洗溶剂离心分离至上清液无色透明后,再反复清洗3次。在烘箱中干燥过夜,得到氧化锌粉末。
上述步骤(3)中氧化锌的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
300mg负载紫杉醇的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入2.25mL氧化锌(10mg/mL)搅拌10分钟,接着反应体系加热到130℃搅拌15小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料。如图4所示,氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化的二氧化硅纳米材料表面变得粗糙,粒径为110nm左右,证明氧化锌的成功封堵。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载紫杉醇的羧基化二氧化硅、乙二醇、氧化锌的使用比例范围为100~200mg:0.5~2mL:0.25~1mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2.25mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肝癌细胞靶向的氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
称取制备的氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料0.2g,于40mLPBS (pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015mol,室温搅拌3小时;称叶酸0.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到叶酸修饰的氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料。如图5所示,叶酸修饰的氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化的二氧化硅纳米材料粒径仍然为110nm左右。
上述步骤(5)的方法中,氧化锌封堵的负载紫杉醇的羧基化二氧化硅纳米材料、EDC、 NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性:
将上述制备的紫杉醇纳米载药系统置于10mM磷酸盐缓冲液(pH为7.2),每隔一段时间取样,测定包封率,评价紫杉醇的负载稳定性。结果见图6。
叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的体外释放:
采用透析袋法对上述制备的紫杉醇安全可控智能纳米给药系统进行体外释放实验,释放介质为10mM磷酸盐缓冲液(pH分别为5.4和7.2),透析袋截留分子量为1000。将1mL上述样品装入透析袋中,分别放入50不同的透析介质当中,在37℃摇床中100rmp振摇,在不同时间点取1mL释放介质,再补充1mL新鲜释放介质。紫外分光光度法测定紫杉醇的浓度,计算累计释放效率,见图7。由图7可知,上述制备的紫杉醇可控释放的安全可控智能纳米给药系统确实具有pH和GSH双响应释放紫杉醇的特性。
叶酸接枝的氧化锌封堵负载紫杉醇的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的细胞毒性:
采用噻唑蓝体外实验法(MTT法)检测上述制备的紫杉醇可控释放的安全可控智能纳米给药系统及紫杉醇裸药的细胞毒性。人肝癌细胞HepG2细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、 1%盘尼西林-链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,取对数生长期的细胞进行实验。细胞以每孔5×103的密度培养在96孔板上,24小时后换用100μL含有不同浓度的紫杉醇纳米给药系统及对应浓度的紫杉醇裸药的培养基,再培养24小时。然后换掉培养液,加入含有0.5mg/mL MTT的培养基,培养4小时后,吸取培养基,加入100μL二甲基亚砜溶解产生的贾瓒。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度OD值。人正常肝细胞HL7702的培养条件及操作同上。如图8所示,相比于紫杉醇裸药,紫杉醇纳米给药系统确实对肝癌细胞有显著增强的杀伤力。同时,紫杉醇纳米给药系统对正常肝细胞基本没有伤害,表明本发明提供的紫杉醇可控释放的安全可控智能纳米给药系统安全可靠。
实施例2RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载光敏剂血卟啉的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载光敏剂血卟啉的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整。
(2)羧基化二氧化硅负载光敏剂血卟啉
取3mg光敏剂血卟啉溶解于1mL DMF中,将配好的光敏剂血卟啉溶液逐滴加入到20mL 羧基化二氧化硅水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。光敏剂血卟啉负载量为10%。
上述步骤(2)中血卟啉、DMF、与羧基化二氧化硅的比例范围是1~2mg:0.5~2mL:10~50mL;最优选的比例为3mg:1mL:20mL;
(3)石墨烯量子点的制备
取10mL 50mg/mL的氧化石墨溶液与5mL硝酸和5mL硫酸混合,加入到聚四氟乙烯的密封容器中,在微波反应器中200℃加热5分钟,微波福射条件为800W,30Mpa。冷却后,加入NaCO3固体粉末进行中和,通过离心收集上层清液,最后经过透析获得石墨烯量子点溶液。
上述步骤(3)中石墨烯量子点的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)石墨烯量子点封堵的负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
300mg负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL 石墨烯量子点搅拌10分钟,60℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到石墨烯量子点封堵的负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载血卟啉的羧基化二氧化硅、乙二醇、石墨烯量子点的使用比例范围为100~200mg:0.5~2mL:0.25~1mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)乳腺癌细胞靶向的石墨烯量子点封堵的负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
称取制备的石墨烯量子点封堵的负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料0.2g,于 40m L PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称RGD 肽0.4g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到RGD 肽修饰的石墨烯量子点封堵的负载光敏剂血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料。粒径约为200nm。
上述步骤(5)的方法中,石墨烯量子点封堵的负载血卟啉的羧基化二氧化硅纳米材料、 EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载光敏剂血卟啉的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图9所示,其具有过氧化氢、pH响应释放光敏剂血卟啉的特性。
实施例3透明质酸接枝的碳量子点封堵负载葡萄糖氧化酶的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
透明质酸接枝的碳量子点封堵负载葡萄糖氧化酶的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整。
(2)羧基化二氧化硅负载葡萄糖氧化酶
取5mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中,将配好的葡萄糖氧化酶溶液逐滴加入到20mL羧基化二氧化硅水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。葡萄糖氧化酶负载率为15%。
上述步骤(2)中葡萄糖氧化酶、水、与羧基化二氧化硅的比例范围是1~2mg:0.5~8mL: 10~50mL;最优选的比例为5mg:1mL:20mL;
(3)碳量子点的制备
将20毫升乙二胺和12毫升水加入到8毫升甘油/水(2:1,wt)混合溶液中,混合物先超声处理5分钟至形成澄清溶液。然后将上述溶液用700W微波处理6分钟,此时得到的棕色溶液即为碳量子点的粗品。碳量子点的粗品用二氯甲烷和石油醚洗涤多次,最后减压蒸馏得到棕色油状物即为目标产物碳量子点。
上述步骤(3)中碳量子点的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
300mg负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL 碳量子点点搅拌10分钟,60℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅、乙二醇、碳量子点的使用比例范围为100~200mg:0.5~2mL:0.25~1mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肺癌细胞靶向的碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
称取制备的碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料0.2g,于40 mL PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称透明质酸1.0g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到透明质酸修饰的碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料。粒径约为160nm。
上述步骤(5)的方法中,碳量子点封堵的负载葡萄糖氧化酶的羧基化二氧化硅纳米材料、 EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对透明质酸接枝的碳量子点封堵负载葡萄糖氧化酶的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图10所示,其具有光照、磁场双响应释放葡萄糖氧化酶的特性。
实施例4叶酸接枝的温敏共聚物P(NIPAM-co-AM)封堵负载Si RNA的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
叶酸接枝的温敏聚合物封堵负载Si RNA的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整。
(2)羧基化二氧化硅负载Si RNA
取12mg Si RNA溶解于1mL水中,将配好的Si RNA溶液逐滴加入到20mL羧基化二氧化硅水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。Si RNA负载率为20%。
上述步骤(2)中Si RNA、水、与羧基化二氧化硅的比例范围是10~20mg:0.1~5mL:5~30mL;最优选的比例为12mg:1mL:20mL;
(3)P(NIPAM-co-AM)的制备
称取4-氰基-4-乙基三硫代戊酸61.7mg,异丙基丙烯酰胺0.844g,丙烯酰胺72.3mg和偶氮异二丁腈9.3mg放入单口圆底烧瓶中,加入10mL二氧六环溶解。用橡胶塞将瓶子密封,除氧30分钟,75℃反应7小时。结束反应后,用乙醚沉淀3次,真空干燥。
上述步骤(3)中P(NIPAM-co-AM)的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是5-20nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料的制备。
300mg负载Si RNA的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL温敏聚合物10分钟,37℃反应48小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到P(NIPAM-co-AM) 封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载Si RNA的羧基化二氧化硅、乙二醇、温敏聚合物的使用比例范围为100~300mg:0.5~6mL:0.25~10mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肝癌细胞靶向的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料的制备。
称取制备的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料0.2g,于 40m L PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称叶酸 0.6g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到叶酸修饰的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料。粒径约为300nm。
上述步骤(5)的方法中,P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对叶酸修饰的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载Si RNA的羧基化二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图11所示,其具有温度响应释放Si RNA的特性。
实施例5RGD肽接枝的细胞色素C(Cyt C)适配子封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
RGD肽接枝的细胞色素C(Cyt C)适配子封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整。
(2)羧基化二氧化硅负载治疗性多肽
取5mg治疗性多肽溶解于1mL水中,将配好的治疗性多肽溶液逐滴加入到20mL羧基化二氧化硅水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理 2小时,离心得到固体,干燥备用。治疗性多肽负载率为30%。
上述步骤(2)中治疗性多肽、水、与羧基化二氧化硅的比例范围是10~20mg:0.1~5mL: 5~30mL;最优选的比例为12mg:1mL:20mL;
(3)Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
300mg负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入2mLCyt C适配子点搅拌10分钟,37℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(3)封堵的方法中,负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅、乙二醇、Cyt C适配子的使用比例范围为100~300mg:0.5~8mL:0.25~8mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(4)肝癌细胞靶向的Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
称取制备的Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料0.2g,于40 m L PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称RGD肽0.4g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到RGD 肽修饰的Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料。粒径约为250nm。
上述步骤(4)的方法中,Cyt C适配子封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对RGD肽接枝的Cyt C适配子封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图12所示,其具有镁离子、 ATP、超声三响应释放治疗性多肽的特性。
实施例6透明质酸接枝的氧化锌封堵负载顺铂的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备。
透明质酸接枝的氧化锌封堵负载顺铂的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)二氧化锰纳米材料的制备
5.915g MnSO4·H2O和13.925g NH4HCO3分别溶解在300mL的超纯水中。快速搅拌中将NH4HCO3溶液加入到MnSO4溶液中,溶液变为乳白色,混合液在室温下反应3小时。将生成的沉淀过滤并用超纯水清洗三次。将生成的MnCO3真空干燥6小时得到前体物。将500 mL0.05M的KMnO4溶液加入到得到的前体物中,反应2小时。接着将混合物过滤并用超纯水清洗三次,将得到的固体加入到500mL 0.01M的HCl中,反应12小时。过滤真空干燥6 小时,然后453K处理4小时,得到二氧化锰纳米材料。
上述步骤(1)中二氧化锰纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是 50-300nm;例如,可以选用不同的锰源试剂对试剂MnSO4·H2O进行替换,例如:反应温度和时间可以调整。
(2)二氧化锰纳米材料负载顺铂
取5mg顺铂溶解于1mL DMF中,将配好的顺铂溶液逐滴加入到20mL二氧化锰纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。顺铂负载率为5%。
上述步骤(2)中顺铂、DMF、与二氧化锰纳米材料的比例范围是10~20mg:0.5~2mL: 10~50mL;最优选的比例为5mg:1mL:20mL;
(3)氧化锌的制备
量取25mL三乙二醇,转入三口烧瓶中于120℃下通气除水1小时。冷却至80℃后向其加入2mmol(0.53g)乙酰丙酮锌,并保温搅拌20min以混合均匀,然后在Ar2保护下以 10℃/min的速度升至260℃,保温回流1小时,自然冷却至室温,以酒精为清洗溶剂离心分离至上清液无色透明后,再反复清洗3次。在烘箱中干燥过夜,得到氧化锌粉末。
上述步骤(3)中氧化锌的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料的制备
300mg负载顺铂的二氧化锰纳米材料超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入2mL氧化锌搅拌10分钟,30℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载顺铂的二氧化锰、乙二醇、氧化锌的使用比例范围为 100~300mg:0.5~8mL:0.25~4mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肺癌细胞靶向的氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料的制备
称取制备的氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料0.2g,于40m L PBS(pH=5.0) 中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称透明质酸1.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到透明质酸修饰的氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料。粒径约为50nm。
上述步骤(5)的方法中,氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对透明质酸接枝的氧化锌封堵的负载顺铂的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例1,其具有pH和GSH双响应释放顺铂的特性。
实施例7叶酸、RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载喜树碱的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备。
叶酸、RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵负载喜树碱的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)二氧化锰纳米材料的制备
5.915g MnSO4·H2O和13.925g NH4HCO3分别溶解在300mL的超纯水中。快速搅拌中将NH4HCO3溶液加入到MnSO4溶液中,溶液变为乳白色,混合液在室温下反应3小时。将生成的沉淀过滤并用超纯水清洗三次。将生成的MnCO3真空干燥6小时得到前体物。将500 mL0.05M的KMnO4溶液加入到得到的前体物中,反应2小时。接着将混合物过滤并用超纯水清洗三次,将得到的固体加入到500mL 0.01M的HCl中,反应12小时。过滤真空干燥6 小时,然后453K处理4小时,得到二氧化锰纳米材料。
上述步骤(1)中二氧化锰纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是 50-300nm;例如,可以选用不同的锰源试剂对试剂MnSO4·H2O进行替换,例如:反应温度和时间可以调整。
(2)二氧化锰纳米材料负载喜树碱
取6mg喜树碱溶解于1mL DMF中,将配好的喜树碱溶液逐滴加入到20mL二氧化锰纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。喜树碱负载率为6%。
上述步骤(2)中喜树碱、DMF、与二氧化锰纳米材料的比例范围是10~20mg:0.5~2mL:10~50mL;最优选的比例为6mg:1mL:20mL。
(3)石墨烯量子点的制备
取10mL 50mg/mL的氧化石墨溶液与5mL硝酸和5mL硫酸混合,加入到聚四氟乙烯的密封容器中,在微波反应器中200℃加热5分钟,微波福射条件为800W,30Mpa。冷却后,加入NaCO3固体粉末进行中和,通过离心收集上层清液,最后经过透析获得石墨烯量子点溶液。
上述步骤(3)中石墨烯量子点的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰纳米材料的制备
300mg负载喜树碱的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL石墨烯量子点搅拌10分钟,60℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载喜树碱的羧基化二氧化硅、乙二醇、石墨烯量子点的使用比例范围为100~200mg:0.5~2mL:0.25~1mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2.25 mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肝癌细胞靶向的石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰纳米材料的制备
称取制备的石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰纳米材料0.2g,于40mLPBS (pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称叶酸1.0g、RGD 肽0.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到叶酸、 RGD肽修饰的石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰纳米材料。粒径约为80nm。
上述步骤(5)的方法中,石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的羧基化二氧化硅纳米材料、 EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对叶酸、RGD肽接枝的石墨烯量子点封堵的负载喜树碱的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例2,其具有过氧化氢、pH双响应释放喜树碱的特性。
实施例8RGD肽、透明质酸接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵负载吉西他滨的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备。
RGD肽、透明质酸接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵负载吉西他滨的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)二氧化锰纳米材料的制备
5.915g MnSO4·H2O和13.925g NH4HCO3分别溶解在300mL的超纯水中。快速搅拌中将NH4HCO3溶液加入到MnSO4溶液中,溶液变为乳白色,混合液在室温下反应3小时。将生成的沉淀过滤并用超纯水清洗三次。将生成的MnCO3真空干燥6小时得到前体物。将500 mL0.05M的KMnO4溶液加入到得到的前体物中,反应2小时。接着将混合物过滤并用超纯水清洗三次,将得到的固体加入到500mL 0.01M的HCl中,反应12小时。过滤真空干燥6 小时,然后453K处理4小时,得到二氧化锰纳米材料。
上述步骤(1)中二氧化锰纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是 50-300nm;例如,可以选用不同的锰源试剂对试剂MnSO4·H2O进行替换,例如:反应温度和时间可以调整。
(2)二氧化锰纳米材料负载吉西他滨
取9mg吉西他滨溶解于1mL DMF中,将配好的吉西他滨溶液逐滴加入到20mL二氧化锰纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理 2小时,离心得到固体,干燥备用。吉西他滨负载率为12%。
上述步骤(2)中吉西他滨、DMF、与二氧化锰纳米材料的比例范围是10~20mg:0.5~2mL: 10~50mL;最优选的比例为9mg:1mL:20mL。
(3)P(NIPAM-co-AM)的制备
称取4-氰基-4-乙基三硫代戊酸61.7mg,异丙基丙烯酰胺0.844g,丙烯酰胺72.3mg和偶氮异二丁腈9.3mg放入单口圆底烧瓶中,加入10mL二氧六环溶解。用橡胶塞将瓶子密封,除氧30分钟,75℃反应7小时。结束反应后,用乙醚沉淀3次,真空干燥。
上述步骤(3)中P(NIPAM-co-AM)的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料的制备
300mg负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL温敏聚合物搅拌10分钟,60℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载吉西他滨的二氧化锰、乙二醇、温敏聚合物的使用比例范围为100~300mg:0.5~8mL:0.25~20mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)乳腺癌细胞靶向的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料的制备
称取制备的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料0.2g,于40mL PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称RGD肽1.2g、透明质酸0.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到 RGD肽、透明质酸修饰的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料。粒径约为140nm。
上述步骤(5)的方法中,P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰纳米材料、 EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对RGD肽、透明质酸接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载吉西他滨的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例4,其具有温度、pH双响应释放吉西他滨的特性。
实施例9叶酸、透明质酸接枝的碳量子点封堵负载伊立替康的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备。
叶酸、透明质酸接枝的碳量子点封堵负载伊立替康的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)二氧化锰纳米材料的制备
5.915g MnSO4·H2O和13.925g NH4HCO3分别溶解在300mL的超纯水中。快速搅拌中将NH4HCO3溶液加入到MnSO4溶液中,溶液变为乳白色,混合液在室温下反应3小时。将生成的沉淀过滤并用超纯水清洗三次。将生成的MnCO3真空干燥6小时得到前体物。将500 mL0.05M的KMnO4溶液加入到得到的前体物中,反应2小时。接着将混合物过滤并用超纯水清洗三次,将得到的固体加入到500mL 0.01M的HCl中,反应12小时。过滤真空干燥6 小时,然后453K处理4小时,得到二氧化锰纳米材料。
上述步骤(1)中二氧化锰纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是 50-300nm;例如,可以选用不同的锰源试剂对试剂MnSO4·H2O进行替换,例如:反应温度和时间可以调整。
(2)二氧化锰纳米材料负载伊立替康
取12mg伊立替康溶解于1mL DMF中,将配好的伊立替康溶液逐滴加入到20mL二氧化锰纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。伊立替康负载率率为21%。
上述步骤(2)中伊立替康、DMF、与二氧化锰纳米材料的比例范围是10~20mg:0.5~2mL: 10~50mL;最优选的比例为12mg:1mL:20mL。
(3)碳量子点的制备
将20毫升乙二胺和12毫升水加入到8毫升甘油/水(2:1,wt)混合溶液中,混合物先超声处理5分钟至形成澄清溶液。然后将上述溶液用700W微波处理6分钟,此时得到的棕色溶液即为碳量子点的粗品。碳量子点的粗品用二氯甲烷和石油醚洗涤多次,最后减压蒸馏得到棕色油状物即为目标产物碳量子点。
上述步骤(3)中碳量子点的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰纳米材料的制备
300mg负载伊立替康的二氧化锰纳米材料超声分散在5mL超纯水中,再加入2mL碳量子点搅拌10分钟,50℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载伊立替康的二氧化锰、乙二醇、碳量子点的使用比例范围为100~200mg:0.5~2mL:0.25~1mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2.25mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肺癌细胞靶向的碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰纳米材料的制备
称取制备的碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰纳米材料0.4g,于60mL PBS(pH=7.2)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.03M,室温搅拌3小时;称叶酸1.5g、透明质酸2g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到叶酸、透明质酸修饰的碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰纳米材料。粒径约为170nm。
上述步骤(5)的方法中,碳量子点封堵的负载伊立替康的羧基化二氧化硅纳米材料、EDC、 NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对叶酸、透明质酸修饰的碳量子点封堵的负载伊立替康的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例3,其具有光照、磁场双响应释放伊立替康的特性。
实施例10透明质酸、叶酸、RGD肽接枝的Cyt C适配子封堵负载阿霉素的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备。
透明质酸、叶酸、RGD肽接枝的Cyt C适配子封堵负载阿霉素的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)二氧化锰纳米材料的制备
5.915g MnSO4·H2O和13.925g NH4HCO3分别溶解在300mL的超纯水中。快速搅拌中将NH4HCO3溶液加入到MnSO4溶液中,溶液变为乳白色,混合液在室温下反应3小时。将生成的沉淀过滤并用超纯水清洗三次。将生成的MnCO3真空干燥6小时得到前体物。将500 mL0.05M的KMnO4溶液加入到得到的前体物中,反应2小时。接着将混合物过滤并用超纯水清洗三次,将得到的固体加入到500mL 0.01M的HCl中,反应12小时。过滤真空干燥6 小时,然后453K处理4小时,得到二氧化锰纳米材料。
上述步骤(1)中二氧化锰纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是 50-300nm;例如,可以选用不同的锰源试剂对试剂MnSO4·H2O进行替换,例如:反应温度和时间可以调整。
(2)二氧化锰纳米材料负载阿霉素
取10mg阿霉素溶解于1mL DMF中,将配好的阿霉素溶液逐滴加入到20mL二氧化锰纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2 小时,离心得到固体,干燥备用。阿霉素负载率为11%。
上述步骤(2)中阿霉素、DMF、与二氧化锰纳米材料的比例范围是10~20mg:0.5~2mL: 10~50mL;最优选的比例为10mg:1mL:20mL。
(3)Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料的制备
300mg负载阿霉素的二氧化锰纳米材料超声分散在5mL超纯水中,再加入2mL CytC 适配子搅拌10分钟,37℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料。
上述步骤(3)封堵的方法中,负载阿霉素的二氧化锰、水、Cyt C适配子的使用比例范围为100~300mg:0.5~8mL:0.25~20mL;最优选的比例为300mg:5mL:2mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(4)肝癌细胞靶向的Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料的制备
称取制备的Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料0.4g,于60mLPBS (pH=7.2)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.03M,室温搅拌3小时;称透明质酸1.6g、叶酸0.8g、RGD肽0.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa) 后即得到透明质酸、叶酸、RGD肽修饰的Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料。粒径约为270nm。
上述步骤(4)的方法中,Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料、EDC、 NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对透明质酸、叶酸、RGD肽修饰的Cyt C适配子封堵的负载阿霉素的二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例5,其具有镁离子、ATP、超声三响应释放阿霉素的特性。
实施例11寡肽接枝的氧化石墨封堵负载小核酸的脂质体安全可控智能纳米给药系统的制备。
寡肽接枝的氧化石墨封堵负载小核酸的脂质体安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)脂质体纳米材料的制备
将大豆卵磷脂(soybean Phosphatidylcholine,SPC)、培化磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE) 及紫杉醇以100∶0.5∶5(摩尔比)混合并溶解于氯仿中,采用油水相研磨成乳,然后高压均质的方法制备得到脂质体。
上述步骤(1)中脂质体纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300 nm即可用于本发明;例如,豆卵磷脂(soybean Phosphatidylcholine,SPC)、培化磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)及紫杉醇的比例范围是100-150∶0.5-2∶5-10(摩尔比)。
(2)脂质体纳米材料负载小核酸
精密称取摩尔比为100∶0.5∶3~8的SPC、mPEG2000-DSPE及小核酸溶解于适量氯仿中,此为油相溶液。将适量10%蔗糖水溶液加入胶体磨中,开启研磨,然后将油相溶液缓慢滴入其中,控制油水相比为2%,继续研磨数分钟。将得到的乳剂使用小型高压挤出仪,安装0.22μm滤膜,挤出得到粒径均一的脂质体。将脂质体在30~40℃水浴下旋转蒸发,真空度达到40hPa后维持5~10分钟。最后将载小核酸的脂质体浓缩后分装于西林瓶中备用。小核酸负载率为12%。
(3)氧化石墨的制备
先在双颈圆底烧瓶中加入46mL 98%浓硫酸中,再用冰水浴冷却,直至液体的温度下降到约4℃。在不断搅拌下将2g的天然石墨粉和1g硝酸钠混合物加入到硫酸体系中。在维持剧烈搅拌的条件下,慢慢向反应体系内加入6g高锰酸钾,并且保持体系温度在20℃以下。加料完毕后移去冰水浴,控制体系温度在35℃左右,继续搅拌约30分钟。随后缓慢加入超纯水90mL,体系剧烈放热,温度骤升,维持体系温度在98℃,继续搅拌15分钟。然后将 280mL温水加入到反应体系中,再加入20mL 30%的过氧化氢终止反应,继续搅拌,直到没有气体放出为止。趁热过滤,用5%的稀盐酸充分洗涤,直到滤液中检测不出硫酸根离子为止 (用BaCl2检测)。然后将产物放在50℃的烘箱中,干燥48小时即得到氧化石墨。
上述步骤(3)中氧化石墨的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-20nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料的制备
300mg负载小核酸的脂质体纳米材料超声分散在5mL超纯水中,再加入5mL氧化石墨分散液搅拌10分钟,50℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载小核酸的脂质体、水、氧化石墨的使用比例范围为 100~300mg:0.5~6mL:0.25~10mL;最优选的比例为300mg:5mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)成骨细胞靶向的氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料的制备
称取制备的氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料0.4g,于60mL PBS(pH=7.2) 中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.03M,室温搅拌3小时;称成骨细胞靶向性寡肽1.6g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到寡肽修饰的氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料。粒径约为50nm。
上述步骤(5)的方法中,氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对寡肽修饰的氧化石墨封堵的负载小核酸的脂质体安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图13所示,其具有基质金属蛋白酶、核酸双响应释放小核酸的特性。
实施例12叶酸接枝的β-环糊精封堵负载光敏剂Ce 6的聚合物安全可控智能纳米给药系统的制备。
叶酸接枝的β-环糊精封堵负载光敏剂Ce 6的聚合物安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)聚合物纳米材料的制备
采用迈克尔加成反应合成聚合物P123-PAE。称取P123(1eq.)和三乙胺(2eq.)置于烧杯中,加入无水二氯甲院,超声,并揽拌至溶解均匀,在0℃的条件下将丙烯酰氯(1.5eq.)逐滴缓慢加入上述溶液中,冰浴条件下反应2小时,再置于室温下反应24小时;将反应液真空干燥后,加入四氢呋喃,过滤除盐。乙醚/石油醚沉淀分离,真空干燥箱干燥,即得P123-丙烯酰盐。然后称取一定质量的1,4-丁二醇丙烯酸酯(1eq.),1-氨基-3-丁醇(1.1eq.)和P123-丙烯酰盐(0.1eq.)共溶于无水氯仿中,氮气保护下50℃反应48小时。加入乙醚/石油醚,4℃静置过夜,沉淀析出后除去上清液,即得到P123-PAE。
上述步骤(1)中聚合物P123-PAE纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm即可用于本发明;例如反应温度和时间可以进行调整。
(2)聚合物纳米材料负载光敏剂Ce 6
取21mg光敏剂Ce 6溶解于1mL DMF中,将配好的光敏剂Ce 6溶液逐滴加入到20mL聚合物纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。光敏剂Ce 6负载率为28%。
上述步骤(2)中Ce 6、DMF、与聚合物纳米材料的比例范围是10~30mg:0.5~2mL:10~50mL;最优选的比例为21mg:1mL:20mL。
(3)β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料的制备
300mg负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料超声分散在5mL超纯水中,再加入5mLβ-环糊精分散液搅拌10分钟,50℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料。
上述步骤(3)封堵的方法中,负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料、水、β-环糊精的使用比例范围为100~300mg:0.5~6mL:0.25~10mL;最优选的比例为300mg:5mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(4)肝癌细胞靶向的β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料的制备
称取制备的β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料0.4g,于60mL PBS(pH=7.2)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.03M,室温搅拌3小时;称叶酸1.6g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到叶酸修饰的β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物纳米材料。粒径约为250nm。
上述步骤(4)的方法中,β-环糊精封堵的负载Ce 6的聚合物纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对叶酸修饰的β-环糊精封堵的负载光敏剂Ce 6的聚合物安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。如图14所示,其具有磁场、辐射双响应释放光敏剂Ce 6的特性。
实施例13RGD肽接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵负载紫杉醇的聚合物胶束安全可控智能纳米给药系统的制备。
肝癌靶向基团接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵负载二氧化锰安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)聚合物胶束纳米材料的制备
将两条嵌段共聚物分别溶于的pH 10的NaOH溶液中,浓度为2mg/mL。其次PNIPAM以及PEG比例为4:6的混合聚合物,以6滴/秒的速度往混合液中滴加pH 2的HCl溶液,直到pH6形成胶束。胶束溶液加入截留分子量为14KD的透析袋中,置于去离子水中透析。最后聚合物浓度固定在0.5mg/mL待用。
上述步骤(1)中聚合物P(NIPAM-co-AM)纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm即可用于本发明;例如反应温度和时间可以进行调整。
(2)聚合物胶束纳米材料负载紫杉醇
取7mg紫杉醇溶解于1mL DMF中,将配好的紫杉醇溶液逐滴加入到30mL聚合物胶束纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2 小时,离心得到固体,干燥备用。紫杉醇负载率为7%。
上述步骤(2)中紫杉醇、DMF、与聚合物胶束材料的比例范围是5~20mg:0.1~2mL:10~50mL;最优选的比例为7mg:1mL:30mL。
(3)P(NIPAM-co-AM)的制备
称取4-氰基-4-乙基三硫代戊酸61.7mg,异丙基丙烯酰胺0.844g,丙烯酰胺72.3mg和偶氮异二丁腈9.3mg放入单口圆底烧瓶中,加入10mL二氧六环溶解。用橡胶塞将瓶子密封,除氧30分钟,75℃反应7小时。结束反应后,用乙醚沉淀3次,真空干燥。
上述步骤(3)中P(NIPAM-co-AM)的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是3-20nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料的制备
300mg负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入5mL温敏聚合物搅拌10分钟,60℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料、乙二醇、乙二醇的使用比例范围为100~300mg:0.5~5mL:0.25~10mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:5mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肝癌细胞靶向的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料的制备
称取制备的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料0.2g,于40mL PBS(pH=5.0)中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称RGD肽1.2g 加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到RGD肽修饰的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料。粒径约为90nm。
上述步骤(5)的方法中,P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束纳米材料、 EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对RGD肽接枝的P(NIPAM-co-AM)封堵的负载紫杉醇的聚合物胶束安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例4,其具有温度、pH双响应释放紫杉醇的特性。
实施例14透明质酸接枝的氧化锌封堵负载阿霉素的囊泡安全可控智能纳米给药系统的制备。
透明质酸接枝的氧化锌封堵负载阿霉素的囊泡安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)囊泡纳米材料的制备
分别称取处方量大豆卵磷脂于丙二醇中,待其基本分散于丙二醇中时加入处方量的磷酸缓冲溶液,常温搅拌至形成均一的初乳。取磷脂初乳1份,进行超声处理(功率为400W,超声时间为6s,间隙时间为10s),超声12min后,加入适量的PBS溶液,搅拌均匀后,制得囊泡纳米材料。
上述步骤(1)中囊泡纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300 nm即可用于本发明;例如反应温度和时间可以进行调整。
(2)囊泡纳米材料负载阿霉素
取2mg阿霉素溶解于1mLDMF中,将配好的阿霉素溶液逐滴加入到10mL囊泡纳米材料水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理2小时,离心得到固体,干燥备用。阿霉素的负载率为2%。
上述步骤(2)中阿霉素、DMF、与囊泡纳米材料的比例范围是5~20mg:0.1~2mL:10~50 mL;最优选的比例为7mg:1mL:10mL。
(3)氧化锌的制备
量取25mL三乙二醇,转入三口烧瓶中于120℃下通气除水1小时。冷却至80℃后向其加入2mmol(0.53g)乙酰丙酮锌,并保温搅拌20min以混合均匀,然后在Ar2保护下以 10℃/min的速度升至260℃,保温回流1小时,自然冷却至室温,以酒精为清洗溶剂离心分离至上清液无色透明后,再反复清洗3次。在烘箱中干燥过夜,得到氧化锌粉末。
上述步骤(3)中氧化锌的制备方法可以通过多种现有方法制备,只要满足粉末粒径范围是3-10nm即可用于本发明;例如,可以对反应时间和温度进行调整。
(4)氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡纳米材料的制备
300mg负载阿霉素的二氧化锰纳米材料超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入2mL氧化锌搅拌10分钟,30℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,干燥,得到氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡纳米材料。
上述步骤(4)封堵的方法中,负载阿霉素的二氧化锰、乙二醇、氧化锌的使用比例范围为100~200mg:0.5~5mL:0.25~10mL;最优选的比例为300mg:4.3mL:2mL;反应体系加热温度范围是37-150℃搅拌1-24小时。
(5)肝癌细胞靶向的氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡纳米材料的制备
称取制备的氧化锌封堵的负载阿霉素的二氧化锰纳米材料0.2g,于40m L PBS(pH=5.0) 中充分搅拌分散,之后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)各0.015M,室温搅拌3小时;称透明质酸1.5g加入上述溶液中,在室温下搅拌48小时;离心收集上述反应所得的纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇多次洗涤以去除反应残余溶剂,真空冷冻干燥(<1000Pa)后即得到透明质酸修饰的氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡纳米材料。粒径约为120nm。
上述步骤(5)的方法中,氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对透明质酸接枝的氧化锌封堵的负载阿霉素的囊泡安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。参照实施例1,其具有pH、GSH双响应释放阿霉素的特性。
实施例15肝癌细胞细胞膜封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备。
肝癌细胞细胞膜封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的制备:
(1)羧基化二氧化硅的制备
称取N-溴化十六烷基三甲铵1.0g、氢氧化钠0.28g于三颈瓶中,加入480mL双蒸水并充分溶解,在水浴锅中加热至80℃并持续搅拌;将5mL正硅酸乙酯(TEOS)匀速逐滴加入上述溶液中,快速搅拌反应2小时直至溶液变为白色混浊液,后缓慢滴加1mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐,继续搅拌4小时,其沉淀物即为本体二氧化硅纳米材料;通过离心收集纳米颗粒,并用双蒸水和无水乙醇充分洗涤固体粗制品。最后,60℃真空干燥,即得到羧基化二氧化硅纳米材料。
上述步骤(1)中羧基化的二氧化硅纳米材料可以通过多种现有方法制备,只要满足粒径范围是50-300nm,羧基化水平达10%以上即可用于本发明;例如,可以选用不同的羧基化试剂对试剂3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐进行替换,例如:N-溴化十六烷基三甲铵、氢氧化钠、水及TEOS的摩尔比可以调整,例如:加热温度可以调整,例如:搅拌时间可以调整。
(2)羧基化二氧化硅负载治疗性多肽
取5mg治疗性多肽溶解于1mL水中,将配好的治疗性多肽溶液逐滴加入到20mL羧基化二氧化硅水分散液中,搅拌1小时,4℃静置过夜后,置于透析袋中,用超纯水透析处理 2小时,离心得到固体,干燥备用。治疗性多肽负载率为30%。
上述步骤(2)中治疗性多肽、水、与羧基化二氧化硅纳米材料的比例范围是5~20mg: 1~5mL:10~50mL;最优选的比例为5mg:1mL:20mL。
(3)肝癌细胞细胞膜封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料的制备
300mg负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅超声分散在4.3mL乙二醇中,再加入2mL分离的肝癌细胞HepG2的细胞膜搅拌10分钟,37℃反应24小时。冷却至室温后,离心,收集固体,冷冻干燥,得到肝癌细胞细胞膜封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料。粒径约为250nm。
上述步骤(3)的方法中,肝癌细胞细胞膜封堵的负载治疗性多肽的羧基化二氧化硅纳米材料、EDC、NHS、叶酸的使用比例范围为1-2g:0.05-1mL:0.05-1mL:1.5-3g。
根据实施例1对肝癌细胞细胞膜封堵负载治疗性多肽的二氧化硅安全可控智能纳米给药系统的稳定性、体外释放、细胞毒性等进行测试。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言,在不脱离本发明技术方案范围情况下,都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰,均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:以可生物降解无机纳米材料为纳米载体,负载所需药物,实现对病灶二种以上的内源或外源刺激特异响应的药物智能释放,其中,所述的可生物降解无机纳米材料选自具有多靶点病灶靶向性的介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料。
2.根据权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:所述的病灶内源刺激包括pH、GSH、活性氧物种、氨基酸、ATP、金属离子、核酸、酶;所述的病灶外源刺激包括磁场、温度、超声波、光照、辐射。
3.根据权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:所述的智能给药系统形貌包括球、棒、片、立方、三角、圆锥或多面体。
4.根据权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:所负载的药物包括小分子药物、光敏剂、核酸、蛋白质、多肽等中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:所述的多靶点包括病灶部位特异表达的蛋白受体、糖受体、氨基酸受体、核酸、靶细胞膜识别物中的二种以上。
6.根据权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统,其特征在于:所述的多靶点靶向安全可控智能纳米给药系统粒径在50-300nm。
7.如权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
A.将预先制备的可生物降解无机纳米材料载体分散在水中,制备浓度为0.1mg-20mg/mL;其中,所述的可生物降解无机纳米材料选自具有多靶点病灶靶向性的介孔二氧化硅、二氧化锰、氧化锌、金属有机框架配合物、层状双金属氢氧化物及其复合衍生材料;
B.在A得到的水溶液中加入药物,混合溶液中药物与纳米载体的质量比为1:1-30;将此混合溶液4-37℃搅拌0.5-24h;
C.将B中得到的混合溶液通过离心收集沉淀,并水洗数次后真空干燥,即得到所述的给药系统。
8.如权利要求1所述的无机纳米可生物降解多靶点靶向智能给药系统在制药领域的应用。
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