CN107049991A - 一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统及其制备方法 - Google Patents

一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统及其制备方法，该介孔二氧化硅纳米给药系统中以环五肽‑透明质酸作为靶向材料、以阿霉素作为模型药物、以介孔二氧化硅作为药物载体。制备方法包括：1)将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化1‑1.5h后加入环五肽ADH‑1，反应24～48h后，对反应液进行透析纯化后得到靶向材料环五肽‑透明质酸。2)将靶向材料溶于去离子水中，再加入EDC与NHS，活化后，加入氨基化介孔二氧化硅，反应液离心、洗涤、纯化、冷冻干燥得到产品。本发明能够提高对肿瘤细胞迁移与侵袭的抑制率；制备工艺简单，具有广阔应用前景。

Description

一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅 纳米给药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，提供了一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统。
技术背景
肿瘤转移是癌症成功治疗的主要障碍，超过90％的癌症患者死于肿瘤转移。因此，如何抑制肿瘤转移，尤其是抑制肿瘤的早期转移对于提高癌症患者的生存率至关重要。肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段、多因素的复杂生物学过程。越来越多的证据表明，上皮间质转化(EMT)是许多肿瘤侵袭和转移早期的一个重要的过程，是肿瘤细胞转移中的关键步骤。原发肿瘤细胞发生EMT而获得运动和侵袭能力，从而使肿瘤细胞的侵袭与转移能力增强。因此，针对EMT的治疗能切实抑制肿瘤的侵袭和转移。
肿瘤细胞发生EMT时，会失去与基质膜之间的联系，细胞的形态和细胞分子标志物的表达会发生变化。其中，N-钙粘蛋白(N-cadherin)是肿瘤细胞发生 EMT时显著高表达的分子标志物，在肿瘤的早期侵袭与转移中发挥着至关重要的作用。研究表明，肿瘤细胞中N-cadherin表达的上调会促进其侵袭与转移。因此，下调或是抑制N-cadherin的表达，是抗肿瘤转移的一个很有潜力的治疗策略。环五肽ADH-1是一种N-cadherin的拮抗剂，能够选择性地结合并阻断 N-cadherin的功能，从而有效地抑制N-cadherin介导的肿瘤细胞的迁移与侵袭。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统，该介孔二氧化硅纳米给药系统中环五肽-透明质酸ADH-1-HA作为靶向材料、阿霉素作为模型药物、氨基化的介孔二氧化硅作为载体。靶向材料中的环五肽 ADH-1作为发生EMT的肿瘤细胞表面N-cadherin的靶向抑制剂；靶向材料中的透明质酸(HA)作为主动靶向递送的靶头分子，利用其与肿瘤细胞表面CD44 受体的特异性结合，实现对肿瘤细胞的靶向识别，同时HA还作为ADH-1与氨基化的介孔二氧化硅之间的偶联分子；采用氨基化的介孔二氧化硅作为药物载体，利用其有序的介孔结构、大的比表面积、良好的生物相容性及表面易于修饰等特点，实现对药物DOX的高效包载及对自身的表面修饰；该新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统对发生EMT的肿瘤细胞具有主动靶向结合与靶向抑制能力，能够有效地抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。
上述双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的制备方法：
第一步，合成靶向材料环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
1.1)将透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下溶胀12～24h，得到透明质酸钠水溶液。所述的透明质酸钠水溶液的浓度为15～31mg/ml，透明质酸钠的分子量为37KDa。
1.2)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化透明质酸钠中的羧基 1～1.5h，得到混合溶液。所述的EDC与NHS的摩尔比为1:1～0.5，透明质酸钠中的羧基与EDC的摩尔比为1:1～1.5。
1.3)将环五肽ADH-1加到上述混合溶液中，室温、搅拌条件下反应24～48h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析纯化24～48h；将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到产物ADH-1-HA，产物可用核磁共振氢谱进行鉴定。所述的透明质酸钠中羧基与环五肽ADH-1的摩尔比为10:1～5:1。所述的透析袋的截留分子量为3500～37500。
第二步，合成新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统
2.1)将靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下溶胀 12～24h。所述的靶向材料ADH-1-HA的浓度为16～32mg/ml。
2.2)将EDC与NHS依次滴加到步骤2.1)得到的溶液中，活化1.5～2h后，将氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室温条件下搅拌2～4h得到反应液。所述的EDC/NHS的摩尔比为1:1～0.5，靶向材料ADH-1-HA中的羧基与EDC的摩尔比为1:1～1.5。
2.3)反应液离心并用去离子水洗涤进行纯化，冷冻干燥即得新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统(ADH-1-HA-MSN)。所述的靶向材料ADH-1-HA与氨基化的介孔二氧化硅的质量比为1:2～1:1。
本发明的有益效果为：本发明提供一种能够高效靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的新型双重靶向药物载体。利用介孔二氧化硅作为药物载体，一方面保证了较大的药物包载量，另一方面为功能团的修饰提供了可修饰点；通过靶向材料ADH-1-HA的修饰，可以增加介孔二氧化硅纳米给药系统的肿瘤细胞靶向性及对发生EMT肿瘤细胞N-cadherin的靶向抑制，提高对肿瘤细胞迁移与侵袭的抑制率。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有广阔的应用前景，同时也为相应给药系统的设计和发展打下基础。
附图说明
图1为透明质酸(HA)的核磁共振氢谱图；
图2为靶向材料环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)的核磁共振氢谱图；
图3(a)为用扫描电镜观察到的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的形态图；
图3(b)为采用动态光散射仪分析得到的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统(ADH-1-HA-MSN)的粒径分布图；
图4(a)为未经TGF-β1诱导的人非小细胞肺癌A549细胞形态图；
图4(b)为TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞形态图；
图5为用蛋白免疫印迹分析得到的未用TGF-β1诱导(Control)和TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞(TGF-β1)相关蛋白的表达情况；
图6为TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞对包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统的摄取图，其中细胞核用DAPI 进行染色。
图7为TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞对包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统的摄取图，其中细胞核用DAPI进行染色。
图8为TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞对包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的摄取图，其中细胞核用DAPI进行染色。
图9为CCK-8法测定的包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN/DOX)、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(HA-MSN/DOX)、包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统(ADH-1-HA-MSN/DOX)和游离阿霉素(Free DOX) 对TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞的细胞毒作用。
图10(a)用未经基质胶覆盖的侵袭小室测定的无血清培养基(A549/EMT)、游离ADH-1(ADH-1)、包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN/DOX)、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(HA-MSN/DOX)和包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统(ADH-1-HA-MSN/DOX)对TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞的迁移抑制情况；
图10(b)用基质胶覆盖的侵袭小室测定的无血清培养基(A549/EMT)、游离ADH-1(ADH-1)、包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN/DOX)、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统(HA-MSN/DOX)和包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统(ADH-1-HA-MSN/DOX)对TGF-β1诱导发生 EMT的人非小细胞肺癌A549细胞的侵袭抑制情况；
图11为用蛋白免疫印迹法分析得到的各处理组对TGF-β1诱导发生EMT的人非小细胞肺癌A549细胞内的N-cadherin蛋白表达量的影响情况。其中各处理组分别为：1.完全培养基；2.游离ADH-1；3.包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统；4.包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统；5.预先用N-cadherin抗体孵育1h后，再加入包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1
第一步，合成靶向材料环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
精密称取31mg透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，溶胀24h，然后将23.4mgEDC和14.1mg NHS依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化1.5h，随后将5mg环五肽ADH-1加到上述溶液中，室温、搅拌条件下反应48h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为3500的透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析24h，进行纯化；将透析袋中的溶液冷冻干燥后，得到产物ADH-1-HA。
将所得样品用核磁共振氢谱进行表征，图2为ADH-1-HA的核磁共振氢谱图：与图1中HA的核磁共振氢谱图相比，ADH-1-HA的核磁共振氢谱图中出现了三个新峰，分别为2.81ppm来自于ADH-1十七杂环上的三个叔氢，7.25ppm 和8.58ppm来自于ADH-1五元杂环上的两个叔氢，证明靶向材料ADH-1-HA的成功合成。
第二步，合成新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统
精密称取6mg靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，水化24h，然后将3.90mg EDC与2.35mg NHS依次滴加到溶液中，活化1.5h，将12mg氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室温条件下搅拌2h。反应液以 12000g/min的转速离心并用去离子水洗涤三次，进行纯化，冷冻干燥即得到新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统 (ADH-1-HA-MSN)。
将新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统滴加到硅片上，待自然晾干后，用扫描电子显微镜进行观察，如图3(a)所示，其为圆形颗粒，大小较为均一。
将新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统用动态光散射仪进行粒径分析，图3(b)为其粒径分布，可以看出它的粒径主要分布在100nm。
肿瘤EMT细胞模型的建立及表征
细胞模型的建立方法：待A549细胞的覆盖率达到30％～40％时，用无血清的培养基饥饿处理24h，然后用含5ng/ml TGF-β1的完全培养基，再培养48h。图4(a)、(b)为A549细胞未诱导和诱导的细胞形态图。可以看出与未诱导的细胞相比，诱导之后细胞的形态大多为纺锤状。
将A549细胞接种于六孔板中，饥饿处理24h，然后用含5ng/ml TGF-β1的完全培养基，再培养48h。去除培养基，用磷酸盐缓冲液洗一遍，然后每孔中加入150μL细胞裂解液，用枪吹打数下，使裂解液与细胞充分接触，在冰上裂解 40分钟后，12000g/min离心4min，取上清，然后进行免疫印迹分析。图5分别为未用TGF-β1诱导和诱导后相关蛋白的表达情况，与未用TGF-β1诱导的细胞相比，诱导之后细胞的上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达量下降，间质细胞标志物：N-钙粘蛋白(N-cadherin)，Snail和波形蛋白(Vimentin) 的表达量增多，表明诱导之后的A549细胞发生了上皮间质转化。
TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞对新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的摄取
将TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞接种于放置盖破片的24孔板中，培养过夜，使细胞爬片。移除培养基，分别用包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统和包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统处理细胞4h，其中各组阿霉素的浓度均为10ng/ml。用激光共聚焦显微镜观察各处理组中介孔二氧化硅纳米给药系统在诱导TGF-β1发生 EMT的A549细胞内的摄取情况。从图6和图7显示的结果可以看出：经过HA 修饰后的介孔二氧化硅纳米给药系统在TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞内的摄取量明显高于未经HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统的摄取量，说明 HA的修饰增加了介孔二氧化硅纳米给药系统对TGF-β1诱导发生EMT的A549 细胞的靶向性。但是，ADH-1-HA修饰的该新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统对TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的靶向能力与只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统相比有所下降。这是由于HA上的羧基被ADH-1取代，羧基数目的减少会削弱HA的靶向性。图6，图7，图8的比例尺为75.0μm。
新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的细胞毒性测定
新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的细胞毒性测定采用CCK-8法。将TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞(5×103/ 孔)接种于96孔培养板，培养过夜。分别加入含有一系列浓度的包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的完全培养基，以游离阿霉素、包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统和包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统处理组作为对照。CO2培养箱37℃培养48h，然后每孔中加入10μLCCK-8溶液，继续培养1h后，在酶标仪上，于450nm测定A值。按以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100％
图9中的结果表明：与未经HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统相比， HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统显著增加了对TGF-β1诱导发生EMT的 A549细胞的细胞毒性。表明HA的修饰增加了介孔二氧化硅纳米给药系统对 TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的靶向性，提高了药物在细胞内的蓄积量，增加了药物对TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的毒性。更重要的是，新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的细胞摄取量虽然低于只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统，但是它的细胞毒性要显著高于只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统，这表明该新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统表现出了协同的抗肿瘤效果：ADH-1阻断了N-cadherin的功能，阿霉素导致DNA损伤。图9中每个数值为平均值±SD(n＝3)。
新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统抑制肿瘤细胞迁移与侵袭能力的测定
TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞消化、离心、用无血清培养基重悬后接种于未铺基质胶的侵袭小室的上室，下室中加入600μL完全培养基作为趋化剂。然后在上室中加入包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统液，以无血清培养基、包载阿霉素的未经HA和ADH-1 修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统和游离ADH-1作为对照。培养24h后移除上、下室液体，用磷酸盐缓冲液洗一遍，用棉签擦去上室中未迁移的细胞，用磷酸盐缓冲液洗三遍，下室加入600μL甲醇固定20min，移除甲醇，用磷酸盐缓冲液洗三遍，下室加入500μL，0.1％的结晶紫溶液，将细胞染色30min，用磷酸盐缓冲液洗涤小室，待膜完全干燥后，用显微镜观察上室底侧的细胞，10倍目镜拍照，取九个视野计数，统计细胞迁移数目。细胞侵袭实验与上述的细胞迁移实验类似，只是侵袭小室的上室要基质胶包被基底膜。
从图10(a)显示的结果可以看出，与未经HA修饰的相比，HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统显著抑制了TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的迁移，表明HA的修饰增加了介孔二氧化硅纳米给药系统对细胞的靶向性，提高了对细胞迁移的抑制能力。而且新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统抑制TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的迁移能力要显著高于只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统，表明ADH-1的修饰阻断了N-cadherin的功能，因此抑制了肿瘤细胞的迁移。这一结论，会进一步用蛋白免疫印迹进行验证。细胞侵袭实验的结果与细胞迁移实验的结果一致(图10 (b))，与其它给药系统相比，新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统抑制TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞的侵袭的能力最强。
新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统抑制肿瘤细胞迁移与侵袭机制的探究
越来越多的研究表明，N-cadherin的下调抑制了肿瘤细胞的迁移与侵袭。因此，我们用蛋白免疫印迹的方法测定了N-cadherin的表达量，用于探究新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统抑制TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞侵袭的机制。TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞用包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统进行处理，以完全培养基、游离ADH-1、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统和预先用N-cadherin抗体孵育1h后，再用包载阿霉素的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的处理组作为对照。如图11所示，用新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统处理的实验组，与用只有HA修饰的介孔二氧化硅纳米给药系统处理的对照组和预先用N-cadherin抗体孵育1h后，再用其处理的对照组相比，降低了N-cadherin的表达量；与用游离ADH-1处理的对照组结果一致。上述结果表明，新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统是通过下调N-cadherin的表达量实现对肿瘤细胞迁移与侵袭的抑制。
实施例2
将第一步的ADH-1肽和HA的质量5mg和31mg改为9.1mg和31mg；将第二步的ADH-1-HA和氨基修饰介孔二氧化硅的质量6mg和12mg改为6mg和 6mg；其它制备条件不变，制备新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统。
实施例3
将第一步的ADH-1肽和HA的质量5mg和31mg改为5.7mg和31mg，将第二步的ADH-1-HA和氨基修饰介孔二氧化硅的质量6mg和12mg改为6mg和 9mg，其它制备条件不变，制备新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统。
实施例4
第一步，合成靶向材料—环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
精密称取31mg透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，溶胀12h，然后将15.6mgEDC和9.4mgNHS依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化2h，随后将9.1mg环五肽ADH-1加到上述溶液中，室温、搅拌条件下反应24h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为3500的透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析36h，进行纯化；将透析袋中的溶液冷冻干燥后，得到产物ADH-1-HA。
第二步，合成新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统
精密称取6mg靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，溶胀12h，然后将2.6mg EDC与1.6mg NHS依次滴加到溶液中，活化2h，将6mg氨基修饰的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室温条件下搅拌4h。反应液12000g/min 离心并用去离子水洗涤三次，进行纯化，冷冻干燥即得到新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统ADH-1-HA-MSN。
实施例5
第一步，合成靶向材料—环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
精密称取31mg透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，溶胀18h，然后将19.5mgEDC和11.7mg NHS依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化2h，随后将5.7mg环五肽ADH-1加到上述溶液中，室温、搅拌条件下反应36h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为3500的透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析36h，进行纯化；将透析袋中的溶液冷冻干燥后，得到产物ADH-1-HA。
第二步，合成新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统
精密称取6mg靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，溶胀36h，然后将3.3mg EDC与2.0mg NHS依次滴加到溶液中，活化2h，将9mg氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室温条件下搅拌3h。反应液12000g/min离心并用去离子水洗涤三次，进行纯化，冷冻干燥即得到新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统ADH-1-HA-MSN。
上述实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统，其特征在于，该介孔二氧化硅纳米给药系统中的环五肽-透明质酸ADH-1-HA作为靶向材料、阿霉素作为模型药物、介孔二氧化硅作为药物载体；该介孔二氧化硅纳米给药系统对发生EMT的肿瘤细胞具有主动靶向结合与靶向抑制能力，能够有效地抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭；
靶向材料中的环五肽ADH-1作为发生EMT的肿瘤细胞表面N-cadherin的靶向抑制剂；靶向材料中的透明质酸(HA)作为主动靶向递送的靶头分子，利用其与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合，实现对肿瘤细胞的靶向识别，同时HA还作为ADH-1与介孔二氧化硅之间的偶联分子。
2.权利要求1所述的新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统的制备方法，其特征在于以下步骤：
第一步，合成靶向材料环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
1.1)将透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下溶胀12～24h，得到透明质酸钠水溶液；所述的透明质酸钠水溶液的浓度为15～31mg/ml；
1.2)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依次滴加到透明质酸钠水溶液中，活化透明质酸钠中的羧基1-1.5h，得到混合溶液；所述的EDC与NHS的摩尔比为1:1～0.5，透明质酸钠中的羧基与EDC的摩尔比为1:1～1.5；
1.3)将环五肽ADH-1加到上述混合溶液中，室温、搅拌条件下反应24～48h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，两端夹紧，去离子水进行透析纯化后，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到产物ADH-1-HA；所述的透明质酸钠中的羧基与环五肽ADH-1的摩尔比为10:1～5:1；
第二步，合成新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统
2.1)将靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下溶胀12-24h；
2.2)将EDC与NHS依次滴加到步骤2.1)得到的溶液中，活化1.5-2h后，将氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室温条件下搅拌2-4h得到反应液；所述的EDC/NHS的摩尔比为1:1～0.5，靶向材料ADH-1-HA上的羧基与EDC的摩尔比为1:1～1.5；
2.3)反应液离心并用去离子水洗涤后进行纯化，冷冻干燥即得新型双重靶向抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的介孔二氧化硅纳米给药系统。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的靶向材料ADH-1-HA的浓度为16～32mg/ml。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸钠的分子量为37KDa。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤1.3)所述的透析纯化时间为24～48h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1.3)所述的透析纯化时间为24～48h。
7.根据权利要求2或3或6所述的制备方法，其特征在于，所述的透析袋的截留分子量为3500～37500。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的透析袋的截留分子量为3500～37500。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的透析袋的截留分子量为3500～37500。
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