CN114588170A - 负载华蟾素的pda纳米药物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载华蟾素的PDA纳米药物的制备方法，包括如下步骤：(1)合成PDA纳米药物：配制氨水或Tris‑HCl的醇水溶液，醇水溶液中乙醇和水的体积比为1：1‑1：10；在氨水或Tris‑HCl的醇水溶液中加入华蟾素和盐酸多巴胺，华蟾素与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1‑1：20，氨水或Tris‑HCI与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1‑1：50，搅拌，用离心法收集PDA纳米药物，洗涤，干燥；(2)靶向分子的修饰：将PDA纳米药物分散于PBS缓冲液中，用EDC/NHS通过氨基和羧基的耦合反应，结合带羧基的靶向分子叶酸，EDC/NHS与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1‑1：10，叶酸与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1‑1：50，离心收集靶向分子修饰的纳米药物，洗涤，干燥，制得负载华蟾素的PDA纳米药物。本发明还公开了负载华蟾素的PDA纳米药物在制备抗肺癌药物中的应用。

Description

负载华蟾素的PDA纳米药物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗癌纳米药物的制备及应用，特别涉及一种负载中药单体华蟾素，具有靶向给药及智能响应的聚多巴胺纳米药物及其制备和用途。
背景技术
恶性肿瘤具有生长速度快、转移能力强、复发率高等特点，已经成为当前威胁人类健康的主要杀手，其发病率和死亡率还在不断攀升。目前，临床使用的许多化疗药物虽然可以在一定程度上抑制肿瘤的生长，但其存在毒副作用大，药物利用率低，累计给药量大等缺点。然而，通过纳米材料负载小分子抗癌药物构建的纳米平台具有可靶向输送药物、病灶部位药物释放量高等优点，从而可以减少正常组织损伤，提高治疗效果。
光热治疗技术作为一种新型的肿瘤治疗策略，具有光热转化能力的有机光敏分子或者无机纳米材料，在近红外光照射下能够转化为热量发挥多种抗肿瘤作用，包括热消融作用、克服化疗耐药作用和抑制肿瘤转移等作用。目前可用于肿瘤光热制剂多为一些有机光敏分子(吲哚菁绿、亚甲基蓝等)或一些无机材料(贵金属纳米粒子、金属硫族化合物纳米材料、碳基纳米材料以及量子点等)，但都存在一定的缺点，比如有机光敏分子具有很短的血液半衰期以及不能选择性富集在瘤区，无机材料也存在生物相容性不佳等缺点，这些缺点制约了现有光热制剂的应用。在众多新兴的光热转换剂中，聚多巴胺(PDA)作为一种新型光热材料引起了极大的关注。多巴胺是天然生物色素－黑色素的主要成分，所以具有优良的生物相容性。多巴胺碱性条件下自氧化聚合能够粘附在固体表面，其化学结构也含有儿茶酚和氨基，也便于后续的表面修饰。另外，还可以对负载的抗癌药物在低的pH值下进行可控释放。由于PDA纳米粒子具有良好的稳定性、生物可降解性，靶向修饰及智能释放，可作为光热转换制剂用于癌症光热治疗(PTT)，在疾病的早期诊断和靶向药物输送上显示出特有的优势。
纳米药物由于其小尺寸效应，可以包埋化疗药物或基因药物(siRNA或Crispr-cas9质粒)，还可以修饰靶向分子及智能化响应基团等，因此具有EPR(enhancedpermeability and retention effect)效应、延长药物的消除半衰期、靶向递送、可控释放及透过机体屏障(血脑屏障)等优势，在癌症治疗方面取得了长足的发展。FDA已经批准上市了多种抗癌纳米药物，如白蛋白紫杉醇(Abraxane)、脂质体阿霉素(Doxil)和脂质体伊立替康(Onivyde) 等。虽然纳米药物在抗肿瘤治疗方面取得了一些成效，但纳米载体的毒性和安全性还有待评估，在临床治疗中的效果还有待提高。近期研究发现，传统的EPR模型过于简单，药物难以富集并渗透到肿瘤组织内部。所以，在纳米药物表面修饰上靶向分子，是纳米药物富集在肿瘤部位的关键所在。常见的靶向分子有小分子(叶酸、凝集素等)、多肽、多糖、抗体及核酸适配体等。申请人在设计纳米药物的靶向递送方面具有丰富的经验，曾使用过靶向分子RGD多肽，cetuximab单抗和EGFR适配体等，均对肿瘤组织具有良好的靶向识别作用。叶酸受体在肿瘤细胞的高表达使得叶酸(FA)成为较为常见的靶向分子。
新一代的纳米药物不仅具有靶向给药的优势，还能够根据肿瘤微环境的刺激响应可控释放抗癌药物。科研人员已经探索了许多智能响应型纳米药物，像外部刺激(光、磁场、超声等)和内部刺激(pH、温度、酶、氧化还原电位等)响应。申请人在纳米药物的智能化响应方面也做了大量的探索，刺激剂包括氧化还原、DNAzyme、核酸酶、冠醚、可见- 紫外光及自噬溶酶体等。大量研究表明，肿瘤组织pH的水平(6.5～6.9)一般低于同一组织来源的正常对照(7.2～7.4)，这主要是因为肿瘤组织无氧代谢(Warburg效应)旺盛，产生大量酸性代谢产物(乳酸等)。基于肿瘤微环境低的pH值，可以设计基于pH智能响应的纳米药物。尽管已有一些基于pH智能响应纳米药物的报道，关于可生物降解纳米药物(PLGA、环糊精、壳聚糖、多巴胺等)的研究却很少，关于联合光热治疗的报道更少，这严重制约了纳米药物的发展前景。
华蟾素(蟾皮)提取物来源于中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥表皮，主要含有吲哚类生物碱，具有清热解毒、止痛、利水消肿、化瘀溃坚等作用。《本草纲目》记载，蟾蜍气味辛凉，微毒，具有退热、祛湿、虚热、杀虫之功效，是治疗疳病、痈疽、诸疮之要药。华蟾素也是目前我国临床上应用广泛的一种中药抗肿瘤药物，单独用药或者与一些化疗药物联合应用，对于各种中、晚期恶性肿瘤尤其是原发性肺癌、肝癌、胰腺癌的治疗均有良好的疗效。但是，由于华蟾素的水溶性差、循环半衰期短、生物利用度低等，如何提高华蟾素的抗癌疗效是临床上需要解决的科学问题。
在本发明中，申请人构建了具有靶向递送和智能响应的PDA纳米药物(图1)，该纳米药物，在FA的靶向作用下，胞吞进入肿瘤细胞，溶酶体逃逸后，在肿瘤微环境低的pH 值条件下刺激释放抗癌药物华蟾素，联合PDA的光热治疗，从而达到高效抑制肺癌发生发展的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载华蟾素的PDA纳米药物的制备方法及其在抑制肿瘤中的应用，填补了之前PDA纳米载体没有负载过中药单体的空缺。
根据实施例，本发明提供的一种负载华蟾素的PDA纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成PDA纳米药物：配制氨水或Tris-HCl的醇水溶液，醇水溶液中乙醇和水的体积比为1：1-1：10；在氨水或Tris-HCl的醇水溶液中加入中药单体华蟾素和盐酸多巴胺，华蟾素与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：20，氨水或Tris-HCI与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：50，搅拌，用离心法收集PDA纳米药物，洗涤，干燥；
(2)靶向分子的修饰：将PDA纳米药物分散于PBS缓冲液中，用EDC/NHS通过氨基和羧基的耦合反应，结合带羧基的靶向分子叶酸，EDC/NHS与盐酸多巴胺的摩尔比为1： 1-1：10，叶酸与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：50，离心收集靶向分子修饰的纳米药物，洗涤，干燥，制得负载华蟾素的PDA纳米药物。
根据后续实施例和试验例，本发明前述制备方法中之步骤(1)(2)中，耦合反应的温度优选为10～40℃，反应时间优选为1-48小时。
根据后续实施例和试验例，本发明前述制备方法中之步骤(1)(2)中，离心转速优选为3000rpm～15000rpm，离心时间优选为2～30分钟。
根据实施例，本发明制得的负载华蟾素的PDA纳米药物，主要应用在肺癌的治疗上。
相对于现有技术，本发明采用较简单的工艺制备合成负载中药单体华蟾素的PDA纳米药物，产率高，生物相容性好，具有产业化实施的前景；本发明制备的负载华蟾素的PDA纳米药物，分布均匀，具有良好的胶体稳定性及生物相容性，具有显著的抗肿瘤效果，联合光热治疗，体现增强的化疗效果，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为华蟾素负载的FA修饰的PDA纳米药物合成及应用示意图，华蟾素(Cino)、聚多巴胺(PDA)、聚乙二醇(PEG)、叶酸(FA)、叶酸受体(FR)、近红外(NIR)；
图2为PDA纳米粒子的(A)TEM图(标尺200nm)和(B)使用动态光散射(DLS) 的粒径分布图；
图3为PDA纳米粒子及华蟾素纳米药物的Zeta电位图；
图4为空白PDA纳米载体对(A)正常肺上皮细胞Beas2B，(B)肺癌细胞A549和(C)LLC的生物相容性；
图5为FA修饰的阿霉素(DOX)负载的PDA纳米药物的靶向效果，(A)荧光显微镜分析正常肺上皮细胞Beas2B，肺癌细胞A549及LLC中DOX的荧光强度，(B)流式分析 DOX的荧光值，标尺25μm；
图6为PDA纳米药物的pH智能响应，以及PDA纳米材料的光热响应现象，(A)DOX 负载的PDA纳米药物在pH 5.0以及808激光照射下的可控释放，(B)PBS，PDA纳米载体及华蟾素负载的纳米药物在2W及5W 808激光器下的光热响应现象，(C)热成像温度图；
图7为华蟾素负载的FA修饰的PDA纳米药物联合光热治疗比的单独华蟾素对(A)肺癌细胞A549及(B)LLC具有更显著的抑制效果；
图8显示给药过程中小鼠体重的变化；
图9为华蟾素负载的FA修饰的PDA纳米药物联合光热治疗在体内抗LLC肿瘤的作用，(A)肿瘤体积，(B)光热响应，(C)肿瘤照片和(D)肿瘤重量；
图10为免疫组化染色，(A)Cleaved caspase-3免疫组化染色，(B)统计分析图；
图11显示小鼠肝肾功能指标的变化，(A)AST(天冬氨酸氨基转移酶)，(B)ALT(丙氨酸氨基转移酶)，(C)Cre(肌酐)；
图12显示小鼠活体成像观察纳米药物在心肝脾肺肾瘤等脏器的分布。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1--负载华蟾素的PDA纳米药物的氨水制备法
(1)首先用氨水的醇水溶液合成空白PDA纳米载体或华蟾素负载的PDA纳米药物。先将290mL超纯水、110mL乙醇和1.5mL NH4OH在室温下搅拌30分钟。然后将50mg 的华蟾素或50mg的阿霉素(空白纳米载体不加)加入到10ml的乙醇中。在10mL超纯水中加入0.5g盐酸多巴胺，搅拌过夜。最后用离心法收集纳米药物，以10000rmp离心 10分钟，取出未载药物，室温离心用超纯水洗涤2次，在冻干机上干燥过夜。
(2)然后用EDC\NHS把FA修饰在纳米粒子的表面。首先将上述纳米药物(100mg) 分散于10ml PBS缓冲液(10mM，pH＝6.0)中。随后，在1ml超纯水中加入50mg FA-PEG-COOH。然后加入50mg的EDC和50mg的NHS，在搅拌条件下反应2小时。最后收集FA修饰的纳米药物，5000rmp离心10分钟，室温离心用超纯水洗涤2次，干燥过夜。
实施例2--负载华蟾素的PDA纳米药物的Tris-HCl制备法
先将72mL乙醇加入到400ml的Tris-HCl(10mM，pH＝8.5)缓冲溶液中，在37℃下搅拌均匀。然后将50mg的华蟾素或50mg的阿霉素(空白纳米载体不加)加入到10ml 的乙醇中。在10mL超纯水中加入0.5g盐酸多巴胺，搅拌过夜。在反应过程中，混合溶液迅速从无色变为黑色，表明PDA纳米载体的形成。最后用离心法收集纳米药物，以10000 rmp离心10分钟，弃掉上清，移除未载药物，室温离心用超纯水洗涤2次，在冻干机上干燥过夜。
对于靶向分子FA的修饰，首先将上述纳米药物(100mg)分散于10ml PBS缓冲液(10mM，pH＝6.0)中。随后，在1ml超纯水中加入50mg FA-PEG-COOH。然后加入50mg的 EDC和50mg的NHS，在搅拌条件下反应2小时。最后收集FA修饰的纳米药物，5000rmp 离心10分钟，室温离心用超纯水洗涤2次，干燥过夜。
本发明以下试验例1-8使用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)及Zeta电势等手段表征制备的PDA纳米载体，然后利用CCK-8法评价纳米载体及光热治疗的细胞毒性。再通过体外实验验证纳米药物相对于单独华蟾素更能抑制肿瘤细胞的增殖。最后建立裸鼠皮下肿瘤模型进行抗肿瘤实验。
试验例1--靶向修饰PDA纳米药物联合光热疗法来治疗肺癌。
为了提高抗肿瘤药物华蟾素的治疗效果和增强其溶解度，开发了具有刺激响应性和靶向分子修饰的有机纳米药物。在PDA纳米药物的制备方面，采用经典的Stober方法(盐酸多巴胺在碱性醇水溶液中还原为PDA)，合成了可生物降解的PDA纳米药物。随后，在 EDC和NHS存在下，通过氨基和羧基的共价偶联反应，将靶向分子FA修饰在PDA纳米药物表面。如图1所示，纳米药物的递送过程可以描述如下。首先，FA修饰的纳米药物被叶酸受体高表达的肿瘤细胞识别。纳米药物通过FA及其受体介导的内吞作用经核内体进入细胞质。溶酶体逃逸后，纳米药物被送到细胞质中。肿瘤细胞有氧糖酵解产生的酸性代谢物(乳酸等)在细胞内低pH条件下积累，从而刺激PDA纳米药物，释放抗肿瘤药物华蟾素抑制癌细胞增殖。最后，PDA纳米药物联合其光热治疗，具有更好的治疗效果。
试验例2--PDA纳米载体的表征。
利用透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)对其进行了表征。先将少量的PDA纳米载体悬浮液滴在湿润的培养皿中的封口膜上，将囊泡放置在碳涂层网格(300目)上3分钟，然后使用透射电镜(JEM-1230，JEOL)对网格进行分析。在DLS研究中，使用Malvern ZetaSizer纳米ZS90粒度分析仪分析了纳米颗粒的粒度分布和Zeta电位。
如图2A所示，TEM图像表明，PDA纳米载体具有球形且均匀的形貌。如图2B所示，DLS图像与TEM结果较为一致，大多数纳米粒子的尺寸约为330nm。
此外，利用动态光散射(Malvern ZetaSizer Nano ZS90)测量了PDA纳米载体和负载华蟾素纳米药物的zeta电位。如图3所示，PDA纳米载体和载华蟾素纳米药物的zeta电位分别为-42mV和-31mV，表明华蟾素已成功嵌入到PDA纳米药物中。这种负电荷可能是由FA在纳米药物表面的修饰引起的。
华蟾素在PDA纳米药物中的包封效率和装载量。采用乙腈稀释PDA纳米药物，测定其中华蟾素的含量。随后，通过配备Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱的WatersAcquity UPLC仪测定样品中华蟾素的浓度。流动相为乙腈(A)和0.1％甲酸(B)，梯度洗脱程序为：0-19分钟，10％-95％(A)；19-20分钟，95％-100％(A)；20-21分钟，100％-10％(A)；21-25分钟，10％-10％(A)；流速0.4mL/min；温度40℃；样品体积2监测波长范围450-650nm。根据标准曲线(吸光度与浓度)，在257nm处测定PDA纳米药物中华蟾素的含量。华蟾素包封效率为21.3％，计算方法为纳米药物中华蟾素包封量与加入华蟾素总量之比。 PDA纳米药物中华蟾素的装载量为9.1％，以纳米药物包封的华蟾素量与含华蟾素的纳米药物总量之比计算。
试验例3--PDA纳米载体的生物相容性。
本发明选择天然黑色素PDA作为基本组成，以保证纳米载体具有优良的生物相容性。理论上，PDA纳米载体由于其可降解成高香草酸和二羟基杏仁酸，而具有良好的生物相容性。将Beas2B、A549和LLC细胞置于96孔板中，每孔2×103个细胞，4个复孔，培养过夜。不同试剂孵育48小时后，根据厂家说明书对细胞进行CCK-8检测。如图4所示，PDA 纳米载体对正常肺上皮Beas2B细胞和肺癌A549以及LLC细胞均无明显的细胞毒性，说明PDA纳米载体具有良好的生物相容性。另外，该专利也探讨了808激光对细胞生长的影响。如图4的最后一列所示，2W·cm-2的808激光5分钟对Beas2B、A549和LLC细胞的增殖影响不大。
试验例4--FA修饰的靶向给药作用。
为了分析FA的靶向作用，首先将肺正常上皮细胞Beas2B、肺癌细胞A549和LLC分别接种于共聚焦培养皿，每孔2×105个细胞，培养24小时。然后，将上述细胞与0.5mg/ml 负载DOX的FA修饰的PDA纳米药物孵育4小时。再用PBS洗涤，4％多聚甲醛固定30 分钟，PBS洗涤后用0.5g/ml Hoechst 33258染色5分钟。最后，超纯水冲洗干燥后，在红色通道处用荧光显微镜(Leica)观察FA的靶向作用。或者收集细胞，在PE(红色)通道用流式细胞仪(BD)分析FA的靶向作用。
为了提高纳米药物的疗效和减少毒副作用，将FA-PEG作为靶向分子修饰在PDA纳米药物表面。PEG不仅增加了纳米药物的水溶性和消除半衰期，而且降低了纳米药物的免疫原性。为验证FA的靶向作用，利用DOX的光信号，将DOX加载的FA修饰的PDA纳米药物与人正常上皮Beas2B细胞、肺癌A549和LLC细胞孵育。如图5A所示，荧光显微镜观察显示肺正常Beas2B细胞周围有少量PDA纳米药物。Beas2B细胞周围的红色可能是 PDA纳米药物的非特异性吸附造成的，如流式细胞分析中16HBE细胞右移(红色，图5B)。相比之下，纳米药物在肺癌A549和LLC细胞周围有大量的靶向吸附，说明FA在肿瘤细胞中具有良好的靶向给药作用。如图5B所示，流式细胞分析结果与荧光显微镜结果一致。这些数据表明，将FA作为靶向分子可以特异性地将抗癌药物递送到肿瘤细胞。
试验例5—DOX负载PDA纳米药物的智能响应。
利用阿霉素(DOX)的光学信号，探索DOX纳米药物的智能化响应现象，其制备方法与华蟾素一致。首先，将2.5mg DOX负载的PDA纳米药物溶解于5ml的1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中，分成5份，每份1ml，作为对照组(pH＝7.4)。同时，将5mg DOX负载的PDA纳米药物溶解于10ml 1×PBS缓冲液(pH＝5.0)中，分成10份，每份1ml。其中5个作为pH(pH＝5.0)释放组，另外5个作为pH(pH＝5.0)释放加激光照射(808nm， 2W·cm-2，5分钟)组。然后在预定的时间间隔沉淀不同组的三个样品，在480nm处用紫外分光光度计测定上清中DOX的吸光值，根据标注曲线计算出DOX的含量。
大量研究表明，肿瘤组织的pH水平(6.5～6.9)普遍低于正常组织，这主要是由于肿瘤组织的有氧糖酵解(Warburg效应)和产生大量的酸性代谢物(乳酸等)。研究了在低pH水平(pH＝5.0)下，在近红外激光照射和无近红外激光照射下，PDA纳米药物的pH释放和光热响应。如图6A所示，释放曲线显示，对照组(pH＝7.4的PBS缓冲液)的DOX释放量仅为17％。少量的DOX泄漏是由于PDA纳米载体在正常情况下的相对稳定性造成的。而用pH＝5.0的PBS缓冲液和pH＝5.0的PBS缓冲液在近红外激光处理12小时内，DOX 的释放量分别达到48％和63％。这种依赖pH的方式可能是由于PDA纳米载体的pH敏感性。在pH＝5.0条件下，经808激光处理(2W·cm-2，5分钟)后，PDA纳米药物的温度逐渐升高，导致DOX累积释放量显著增加。这种光热释放可能是由于PDA纳米载体的渗透率增加所致。此外，大多数抗癌剂在最初6小时内从PDA纳米药物中释放出来。这些结果证实了PDA纳米药物可以对低pH水平产生响应，并相应地触发药物的按需释放。同时， 808激光治疗可加速PDA纳米药物中抗癌药物的释放。
然后，对PDA纳米药物的光热响应进行了研究。808激光处理后PBS缓冲液、PDA 纳米载体和负载华蟾素的PDA纳米药物的曲线图及温度图(图6B和6C)所示。用808 激光处理后，PBS缓冲液的温度没有变化。而PDA纳米载体和负载华蟾素的PDA纳米药物的温度随时间增加而达到饱和状态。另外，功率越大，温度上升越快。此外，PDA纳米载体和负载华蟾素的PDA纳米药物的温度曲线也有相似的趋势。总之，负载华蟾素的PDA 纳米药物具有利用光热疗法治疗肺癌的能力。
试验例6--华蟾素负载的PDA纳米药物对肺癌细胞的体外抑制作用。
将人肺上皮Beas2B细胞、肺癌A549和LLC细胞分别接种于96孔板，每孔2×103个细胞，4个复孔，培养过夜。在不同浓度的单独华蟾素、负载华蟾素的PDA纳米药物以及联合光热治疗48小时后，根据制造商的说明书对细胞进行CCK-8实验。
如图7A所示，A549细胞中单独华蟾素的一半最大抑制浓度(IC50)为61nM。而负载华蟾素的纳米药物的IC50只有32nM，几乎降低了一半。重要的是，联合光热治疗的负载华蟾素纳米药物的IC50更低，只有21nM。结果表明，PDA纳米药物具有较好的抑癌能力。此外，采用808激光照射的PDA纳米药物具有光热治疗的潜力。同时，研究了PDA 纳米药物对肺癌LLC细胞的抑制作用。如图7B所示，单独华蟾素的IC50为74nM，PDA 纳米药物的IC50为39nM。而使用808激光的纳米药物的IC50下降到31nM，说明使用 808激光的PDA纳米药物不仅有化疗作用，而且联合光热治疗能显著抑制LLC细胞的增殖。PDA纳米药物具有较好的抑制作用，这可能与这些药物的细胞摄取方式不同有关。例如，单独华蟾素通过扩散进入细胞，而PDA纳米药物通过内吞作用进入细胞。在这方面，内吞作用携带大量华蟾素比通过细胞膜的简单扩散更有效。重要的是，PDA纳米药物对叶酸受体高表达和低pH水平的肺癌细胞具有比正常细胞更高的选择性细胞毒性。另外，808 激光对肺癌细胞的抑制作用主要是由于热消融所致。结果表明，在808激光器的作用下，靶向递送和可控释药的PDA纳米药物具有最好的治疗效果。
试验例7--华蟾素负载的PDA纳米药物的体内抗肿瘤作用。
购自中国上海Sippr-BK实验动物有限公司的6周龄雄性裸鼠(约20g)，随机分为5组(每组n＝6)，在每只小鼠左侧腋窝皮下注射2×105的LLC细胞。当肿瘤体积达到大约50mm3，每隔一天小鼠腹腔注射生理盐水，PDA纳米载体(～5mg/kg)，单独华蟾素 (1mg/kg)，华蟾素纳米药物(含有华蟾素1mg/kg)，华蟾素纳米药物(含有华蟾素1mg/kg) 联合808激光治疗(2W·cm-2，5分钟)，当最大肿瘤体积达到约800mm3时，处死所有小鼠，测量肿瘤体积和重量。另外，在处死小鼠前获得的眼眶血主要用于肝肾功能的检测。用福尔马林固定肿瘤组织进行免疫组化分析。
如图8所示，治疗期间各组均未观察到小鼠死亡或体重显著下降，说明治疗对荷瘤小鼠没有产生严重的毒副作用。如图9A所示，PDA纳米载体组与对照组有相似的趋势，说明PDA纳米载体具有良好的生物相容性。单独华蟾素能有效抑制肿瘤的生长。相比之下， PDA纳米药物的治疗效果优于单独华蟾素。重要的是，带808激光的PDA纳米药物几乎抑制了皮下肿瘤的生长。肿瘤照片(图9C)和肿瘤重量(图9D)与肿瘤体积的结果一致，清楚地表明单独华蟾素及联合光热治疗能有效地抑制肿瘤的生长，抑制率分别为29％，48％和67％。图9B也记录了近红外激光照射时肿瘤区域的温度升高情况。生理盐水组和单独华蟾素组在照射5分钟(2W·cm-2)后温度仅升高至35.2℃和34.9℃，并且可以观测到很高的背景信号。PDA纳米载体组、PDA纳米药物组以及联合光热治疗组的温度分别为41.7 ℃、42.3℃和42.7℃。这些结果表明，近红外激光照射的PDA纳米药物对肿瘤的抑制能力最强，这是由于PDA纳米药物在肿瘤微环境中的靶向递送和低pH水平刺激释放所致。此外，激光辐照的热消融也提高了PDA纳米药物的治疗效果。
免疫组化分析，各组肿瘤用5ml福尔马林固定过夜，乙醇脱水，石蜡包埋，切片(5μm)。载玻片在二甲苯和乙醇中脱蜡，再在水中水化。然后在PBS缓冲液(pH＝6.0)中微波加热30分钟进行抗原提取。再将载玻片在3％过氧化氢中猝灭，以阻断内源性过氧化物酶活性，用TBST缓冲液洗涤。最后，一抗4℃孵育过夜，按照SuperPictureTM聚合物检测试剂盒(LifeTechnologies)说明书进行，使用cleaved caspase 3(Abcam)抗体。如图10A和10B所示，与对照组相比，PDA纳米载体中凋亡因子(cleaved-caspase-3)的阳染与对照组相似。而单独华蟾素对cleaved-caspase-3的阳染明显增加。此外，负载华蟾素的纳米药物对 cleaved-caspase-3的阳染比单独华蟾素的阳染更明显。值得注意的是，与华蟾素@nano治疗组相比，华蟾素@nano加近红外照射组肿瘤组织表现出典型的热损伤特征，且凋亡细胞数量最多。所以，在近红外激光照射下，华蟾素@nano纳米药物的抗肿瘤活性最为显著。
进一步检测PDA纳米药物的肝肾毒性，如小鼠血清ALT(谷丙转氨酶)、AST(天门冬氨酸转氨酶)和Cre(肌酐)水平。从图11可以看出，单独华蟾素的ALT、AST和Cre 水平最高，而未经或经过近红外激光的PDA纳米药物对小鼠肝功能的影响小于单独华蟾素，PDA纳米载体对小鼠肝功能的影响不显著。这些结果表明，PAD具有生物可降解性， PDA纳米药物在肿瘤微环境下具有靶向给药和智能响应的特性，同时PDA纳米药物在光热治疗下具有低肝肾毒性。联合近红外激光的PDA纳米药物具有良好的治疗效果和低肝肾毒性。
试验例8
利用吲哚菁绿(ICG)的近红外(NIR)荧光信号，通过体内成像系统监测单独ICG，ICG负载的PDA纳米药物，以及叶酸修饰的ICG负载的PDA纳米药物的体内生物分布。如图12所示，在注射24小时后，单独ICG组在肿瘤内只能看到微弱的ICG荧光。相比之下，未经FA修饰的PDA纳米药物在肿瘤组织中的荧光强度仍然很强。但在肝脏中可观察到较强的ICG荧光，说明不经FA修饰的PDA纳米药物可以通过EPR效应在体内长循环。重要的是，经FA修饰的PDA纳米药物在肿瘤部位的ICG荧光明显强于未经FA修饰的PDA 纳米药物，且在肝脏中ICG荧光较弱，显示出良好的肿瘤靶向能力。这些结果表明，靶向修饰的PDA纳米药物可以提高治疗效果，减少毒副作用。

Claims (5)

1.一种负载华蟾素的PDA纳米药物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)合成PDA纳米药物：配制氨水或Tris-HCl的醇水溶液，醇水溶液中乙醇和水的体积比为1：1-1：10；在氨水或Tris-HCl的醇水溶液中加入华蟾素和盐酸多巴胺，华蟾素与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：20，氨水或Tris-HCI与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：50，搅拌，用离心法收集PDA纳米药物，洗涤，干燥；
(2)靶向分子的修饰：将PDA纳米药物分散于PBS缓冲液中，用EDC/NHS通过氨基和羧基的耦合反应，结合带羧基的靶向分子叶酸，EDC/NHS与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：10，叶酸与盐酸多巴胺的摩尔比为1：1-1：50，离心收集靶向分子修饰的纳米药物，洗涤，干燥，制得负载华蟾素的PDA纳米药物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，耦合反应的温度为10～40℃，反应时间为1-48小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，离心转速为3000rpm～15000rpm，离心时间为2～30分钟。
4.权利要求1-3中任何一项制备方法获得的负载华蟾素的PDA纳米药物。
5.权利要求4所述的负载华蟾素的PDA纳米药物在制备抗肺癌药物中的应用。
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