CN104147608A

CN104147608A - 一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用

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Publication number: CN104147608A
Application number: CN201410337210.XA
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 吴一伦; 郭睿
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-07-16
Also published as: CN104147608B

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用，氨基化锂皂石为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷APMES修饰的锂皂石；聚乙二醇与叶酸的摩尔比为1∶0.4-1∶0.8；聚乙二醇-叶酸的质量分数在45-55％。制备：将叶酸溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，搅拌得到混合溶液，逐滴加入聚乙二醇溶液中，搅拌2-3d，透析，冷冻干燥，得到聚乙二醇-叶酸PEG-FA；向PEG-FA溶液中加入EDC，搅拌2-4h，再逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒的水溶液中，磁力搅拌2-3d，透析，即得。应用于药物负载。本发明制备方法简单，条件温和，应用范围广泛，具有良好的市场前景。

Description

一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明属于纳米载药材料及其制备和应用领域，特别涉及一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。

背景技术

癌症被认为是21世纪人类面临的重大挑战之一。在使用化学药物治疗肿瘤的过程中，抗癌药物存在水溶性差、在病灶部位保留时间短以及不能特异性识别肿瘤细胞等问题，这将对人体产生强烈的毒副作用，而无法有效实现药物对肿瘤的杀伤效果。因此，发展一种具有肿瘤靶向作用的载体材料实现药物的负载、可控释放与靶向治疗是目前纳米医学的研究热点。粘土类纳米颗粒，如锂皂石(Laponite，LAP)，不仅具有良好的生物相容性，还能够高效负载药物并实现药物的控制释放，在药物输送领域展现了独特的优势。但是负载药物之后，锂皂石纳米颗粒在水中的胶体稳定性下降，而且无法主动识别并富集到肿瘤细胞，因此，将靶向分子连接到其表面得到具有主动靶向效果的多功能锂皂石纳米颗粒，是改善抗肿瘤药物载体性能的有效途径。

聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，修饰到纳米材料表面能够显著提高其在水中的稳定性。叶酸(Folic Acid，FA)是一种小分子水溶性维生素，对维持肿瘤细胞过度活跃的新陈代谢作用有重要。叶酸受体在大部分肿瘤细胞表面均存在过量表达，而在正常细胞表面表达量很少。因此，如果将靶向分子FA链接到PEG末端得到PEG-FA，然后再修饰到锂皂石表面，不仅可以利用PEG分子链的修饰提高材料的稳定性，降低毒性，延长纳米颗粒在体内的循环时间，减少药物在到达肿瘤部位之前的代谢消耗，还能够通过FA分子与肿瘤细胞表面FA受体的特异性结合实现载体对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的靶向治疗。

查阅相关文献可以发现，合成聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒作为药物载体用于抗肿瘤药物输送与肿瘤靶向治疗的研究尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。所涉及的制备过程简单，条件温和。本发明的LM-PEG-FA/DOX能够有效控制DOX的释放，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有明显的靶向性和抑制效果，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

本发明的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，氨基化锂皂石为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷APMES修饰的锂皂石；聚乙二醇与叶酸的摩尔比为1∶0.4-1∶0.8；聚乙二醇-叶酸的质量分数在45-55％。本发明的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒用于抗肿瘤药物DOX的负载，聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA和阿霉素盐酸盐DOX的质量比为2∶1-4∶1，在此条件下DOX的负载效率为85-91％.

一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：

(1)将叶酸溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌4-6h，得到混合溶液，然后逐滴加入聚乙二醇的溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，得到聚乙二醇-叶酸；其中碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为13∶1-16∶1，投入的叶酸与聚乙二醇的摩尔比为1∶1-1∶2；

(2)向聚乙二醇-叶酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，搅拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH₂的水溶液中，搅拌反应2-4d，透析，得到聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA；其中投入的碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为10∶1-12∶1，投入的聚乙二醇-叶酸与氨基化锂皂石纳米颗粒的质量比为0.5∶1-0.6∶1。

所述步骤(1)中的溶剂为二甲基亚砜DMSO，步骤(1)中所述的聚乙二醇PEG的溶液溶剂和步骤(2)中聚乙二醇-叶酸的溶液溶剂为二甲基亚砜DMSO。

所述步骤(1)中的聚乙二醇PEG为NH₂-PEG-COOH，分子量大小为2000。

所述步骤(1)中的FA溶液浓度为5-8mg/mL。

所述步骤(1)中得到的PEG-FA中PEG和FA的摩尔比为1∶0.4-1∶0.8。

所述步骤(2)中的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH₂为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷APMES修饰的锂皂石LAP。

所述步骤(2)中的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH₂的水溶液浓度为6-8mg/mL。

所述步骤(2)中所得到的LM-PEG-FA中，PEG-FA的质量分数在45-55％。

所述步骤(1)和步骤(2)中的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min。

所述步骤(1)和步骤(2)中的透析为纯水透析，透析袋截留分子量大小为8000-14000，透析时间为2-4d。

所述步骤(1)和步骤(2)中的反应条件为避光反应。

本发明的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，将聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA水溶液加入阿霉素盐酸盐水溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素盐酸盐的聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA/DOX，其中LM-PEG-FA和DOX的质量比为2∶1-4∶1。

所述聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA水溶液的浓度为2-6mg/mL，阿霉素盐酸盐的水溶液浓度为1-2mg/mL。

所述搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min；离心的速率为8000-10000r/min，离心的时间为5min。

所得到的LM-PEG-FA/DOX中，LM-PEG-FA纳米颗粒对DOX的负载效率为85-91％。

锂皂石(Laponite，LAP)属于粘土类纳米颗粒，具有良好的生物相容性，并且被证实可以高效负载药物，是一种具有广泛应用前景的药物载体。LAP经过修饰可以得到表面氨基化的锂皂石纳米颗粒LM-NH₂，它继承了LAP作为药物载体的全部优良性质，并且便于进一步修饰。然而，LM-NH₂本身没有对肿瘤的主动靶向效果，因此，将靶向分子连接到LM-NH₂表面，得到具有主动靶向效果的多功能锂皂石纳米颗粒用于药物负载，是改善抗肿瘤药物载体LM-NH₂的有效途径。本发明将PEG-FA连接到LM-NH₂表面，得到的LM-PEG-FA不仅可以通过叶酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时引入的长链聚合物PEG可以延长载体在体内循环时间，降低材料毒性，提高材料稳定性，改善药物释放特性，并且还可以有效减少FA与FA受体结合时的空间位阻，提高LM-PEG-FA/DOX与高叶酸受体表达的肿瘤细胞的亲和力。本发明的LM-PEG-FA载体用于抗肿瘤药物负载，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有良好的靶向效果，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物、基因或诊断分子探针的负载与靶向输送。

本发明使用紫外-可见光分光光度计、¹H核磁分析、热重分析、Zeta电势测量、紫外-可见光谱测试等方法表征本发明制备的靶向修饰的锂皂石纳米颗粒，同时用刃天青还原法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验载药的锂皂石纳米颗粒对表面叶酸受体高表达的人卵巢癌细胞(SK-OV-3细胞)的毒性与靶向性。具体测试结果如下：

(1)表面电势和水合粒径测量

修饰前后粒子的粒径以及表面电势均通过动态光散射进行测定，结果如表1所示。经硅烷偶联剂修饰后，锂皂石的表面电势从-37.9mV变到-2.4mV，这是由于APMES带正电荷，修饰到LAP表面后可以屏蔽LAP表面的部分负电荷，导致了材料表面电势的变化。在表面进一步修饰了mPEG之后，所得到的LM-mPEG表面电势降低到-5.34±2.20mV。在修饰了PEG-FA之后，表面电势进一步降低到-7.74±0.73mV。因此，通过修饰前后的电势变化也可以证明氨基化锂皂石表面已成功修饰了mPEG和PEG-FA。另一方面，由于所修饰的mPEG和PEG-FA具有较大的空间位阻，得到的LM-mPEG和LM-PEG-FA的颗粒粒径分别为 153.8±4.6nm和242.8±10.2nm，较LM-NH₂(76.6±4.5nm)有了较大幅度的增长。颗粒粒径的变化也证明了mPEG和PEG-FA可以成功的修饰到氨基化锂皂石表面。另外，表面修饰后锂皂石的较小且具有较好的分散性，因此，仍是一种良好的载体材料。

表1 LAP、LM-NH₂、LM-mPEG、LM-PEG-FA的水合直径和表面电势

(2)核磁分析

在附图1所示的¹H核磁分析测试结果中，(a)，(b)，(c)和(d)分别代表LAP、LM-NH₂，LM-mPEG和LM-PEG-FA的结果。从图中可以看出，与(a)图相比，(b)图中2.6ppm处明显增强，并且在3.7ppm处出现了一个新的峰，这说明APMES已经成功的修饰到LAP表面。与(b)图相比，(c)图在3.8ppm处出现了强峰，这是PEG的特征峰，证明mPEG已经成功修饰到LM-NH₂表面。与(b)图相比，(d)图在3.8ppm出也出现了强峰，证明了PEG的存在，并且在6-9ppm之间连续出现三个强度相似的峰，对应FA分子结构中苯环及芳香杂环上的H，充分证明了PEG-FA已经成功修饰到了LM-NH₂表面。同时，通过积分可以算出，连接上的PEG与FA的比值为1∶0.76.

(3)热重分析

在附图2所示的热重测试结果中，分析图中从200℃到600℃重量损失可知，与LM-NH₂相比，LM-mPEG和LM-PEG-FA在升温过程中分别损失了总质量的34.73％和52.68％。这一结果证明mPEG和PEG-FA均已成功修饰在LM-NH₂表面。

(4)紫外-可见光谱测试

在附图3所示的紫外-可见光谱测试结果中，载药前，LAP、LM-NH₂和LM-mPEG在250到800nm波长范围内均没有明显的吸收峰。LM-PEG-FA的紫外光谱中在280nm处出现了一个较强的吸收峰，这是FA的紫外特征吸收峰。这一结果也证实FA已被成功修饰到锂皂石表面。在负载DOX之后，三种材料在480nm附近均显示出一个明显的吸收峰。根据文献报道，这个吸收峰为DOX的紫外特征吸收峰。因此，表面修饰的锂皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿瘤药物DOX。通过紫外定量分析，在投料比为LM-PEG-FA∶DOX＝3∶1的条件下，LM-PEG-FA的载药效率为89.6±1.6％.

(5)体外释放结果

附图4为LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX的体外累积释放曲线。在120小时中，DOX在pH＝5.0的弱酸性环境中从LM-PEG-FA/DOX中累计释放了93.25±12.57％，比在pH＝7.4的中性环境中累计释放量(12.83±0.45％)高。在相同时间范围内，DOX在弱酸性环境中从LM-mPEG/DOX中累计释放了91.15±2.52％，比在中性环境中累计释放量(23.95±0.20％)高。这说明基于锂皂石的载药体系均具有pH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低。其中靶向修饰的LM-PEG-FA/DOX载药体系的pH响应性释放效果更加显著，说明这一体系可以有效减少DOX在体内循环过程中在正常组织处的释放，将药物集中在肿瘤组织部位释放，减少了DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。

(6)刃天青实验

选择高叶酸受体表达的人源卵巢癌细胞SK-OV-3细胞作为模型，考察所制备的载药体系对该细胞增殖的抑制作用。具体做法是，将贴壁生长的SK-OV-3细胞与加入材料的培养基置于5％CO₂，37℃条件下共培养24小时，倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，加入含有0.1mg/mL刃天青的培养基置于相同条件下继续培养4小时后，吸出上层培养基测量其在激发波长λ＝530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量。附图5显示在给定范围内，与DOX、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX共培养的SK-OV-3细胞存活率均存在明显降低，证明载药材料LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。在药物浓度相同的条件下，经过LM-mPEG/DOX处理后的细胞的存活率比经过DOX处理后的细胞的存活率低，说明载药纳米颗粒对肿瘤细胞的抑制效果比裸药更好。这主要是由于与药物小分子相比，载药纳米颗粒更利于被肿瘤细胞吞噬。更重要的是，经过LM-PEG-FA/DOX处理后的细胞的存活率比经过DOX或LM-mPEG/DOX处理后的细胞的存活率低，说明靶向分子叶酸修饰的载药纳米颗粒对肿瘤细胞具有最佳的抑制效果。这主要是利用LM-PEG-FA/DOX表面修饰的叶酸分子与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体之间的特异性相互作用，增强了肿瘤细胞对载药粒子的吞噬。

(7)细胞吞噬实验

为了证实LM-PEG-FA/DOX的靶向作用，选择高叶酸受体表达的人源卵巢癌细胞SK-OV-3细胞作为模型，采用靶向刃天青实验考察细胞吞噬材料后存活率，并采用流式细胞术分析细胞吞噬材料后产生的荧光效果。

靶向刃天青试验的具体做法是，采用DOX浓度为25μg/mL的DOX，LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX的培养基分别与SK-OV-3细胞共培养4小时，弃掉培养基用PBS清洗3遍并换用不含DOX的培养基继续培养24小时或48小时，倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，加入含有0.1mg/mL刃天青的培养基置于相同条件下继续培养4小时后，吸出上层培养基测量其在激发波长λ＝530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量。附图6为靶向刃天青试验的结果。分析附图6结果可以看到，经过24小时的连续培养，LM-PEG-FA/DOX处理的SK-OV-3细胞的存活率为63.4±6.3％，低于LM-mPEG/DOX处理的细胞的存活率83.9±7.0％(p＜0.005)和DOX处理的细胞的存活率98.1±5.0％(p＜0.001)。经过48小时的连续培养可以得到相似的结果，LM-PEG-FA/DOX处理的SK-OV-3细胞的存活率为17.1±0.6％，低于LM-mPEG/DOX处理的细胞的存活率35.3±2.7％(p＜0.001)和DOX处理的细胞的存活率32.1±1.7％(p＜0.001)。实验结果证明LM-PEG-FA/DOX可以在较短时间内通过FA的靶向作用被肿瘤细胞大量吞噬，并且有效抑制肿瘤细胞的增殖。

利用流式细胞仪对SK-OV-3细胞吞噬药物后产生的荧光效果进行了检测。附图7为DOX浓度为20μg/mL，药物和细胞共培养2小时或4小时之后细胞由于吞噬药物产生荧光的结果。可以看出，经过2小时共培养，SK-OV-3细胞对于LM-PEG-FA/DOX的吞噬效果优于对DOX和LM-mPEG/DOX的吞噬效果(p＜0.05)，而经过4小时共培养，SK-OV-3细胞对于LM-PEG-FA/DOX的吞噬效果显示出强烈的增强，其平均荧光值是DOX或LM-mPEG/DOX组材料平均荧光值的3倍。实验结果证明本发明报道的LM-PEG-FA/DOX可以通过FA的靶向作用有效提高肿瘤细胞对DOX的吞噬，从而增强DOX的抗肿瘤活性。

(8)细胞内分布实验

为了更直观的观察药物在细胞内的分布，采用激光扫描共聚焦显微镜考察了细胞与药物共培养4小时之后细胞内荧光分布情况。附图8为DOX浓度20ppm条件下SK-OV-3细胞内荧光分布结果。可以看出本发明报道的LM-PEG-FA/DOX可以通过FA的靶向作用提高肿瘤细胞对DOX的吞噬作用。

综合以上实验结果可以认为，本发明所报道的LM-PEG-FA/DOX可以明显提高肿瘤细胞对DOX的摄取，减少DOX对正常组织细胞的毒副作用，改善了DOX的抗癌效果，具有良好的应用前景。

有益效果

(1)本发明的LM-PEG-FA/DOX载药纳米颗粒具有良好的药物缓释效果与pH响应性释放特性，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的靶向治疗；

(2)本发明制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。

附图说明

图1为(a)LAP，(b)LM-NH₂，(c)LM-mPEG和(d)LM-PEG-FA的¹H核磁共振结构分析；

图2为LM-NH₂，LM-mPEG和LM-PEG-FA的热重分析图谱；

图3为LAP，LM-NH₂，LM-mPEG，LM-PEG-FA，LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX的紫外吸收光谱图；

图4为在不同pH条件下DOX从LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX中释放的累积释放曲线；

图5为刃天青荧光比色法测试得到的不同细胞经PBS、DOX、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX处理24h后的细胞活力；

图6为刃天青荧光比色法测试得到的细胞经PBS、DOX、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX，处理4h，并换用无DOX的培养基继续培养24小时或48小时后的细胞活力(*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001)；

图7为流式细胞术测试得到经PBS、DOX、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX处理2h或4h后，SK-OV-3对DOX的吞噬情况(纵坐标为细胞内吞DOX后的平均荧光强度，与吞噬量成正比，*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001)；

图8为SK-OV-3细胞经PBS、DOX、LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX处理4h后细胞内荧光分布，其中材料中DOX浓度均为20μg/mL，细胞核用Hoechst33342染成蓝色。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

取2mg FA溶解于2mL DMSO，并加入4mg EDC，磁力搅拌4小时。缓慢加入含有2mg NH₂-PEG-COOH(MW＝2000)的DMSO溶液2mL，磁力搅拌反应3天。反应结束后将得到的PEG-FA溶液全部转移到截留分子量大小为8000-14000的透析袋中。将透析袋放入装有2L去离子水的烧杯中透析，透析持续3天，每天换水3-4次。透析结束后，将透析袋内产品转移到15mL离心管内冷冻干燥，即得到PEG-FA粉末。

将mPEG-COOH(MW＝2000)或PEG-FA粉末溶于DMSO，得到浓度为2mg/mL的溶液。向其中加入2.2mg EDC，磁力搅拌3小时。缓慢加入准备好的浓度为4mg/mL氨基化锂皂石LM-NH₂水溶液1mL，磁力搅拌反应3天。反应结束后将得到的LM-mPEG或LM-PEG-FA 溶液全部转移到截留分子量大小为8000-14000的透析袋中。将透析袋放入装有2L去离子水的烧杯中透析，透析持续3天，每天换水3-4次。透析结束后，将透析袋内产品转移到15mL离心管，4℃保存。

实施例2

取1mL浓度为3mg/mL的LM-mPEG和1mL浓度为3mg/mL的LM-PEG-FA水溶液，分别加入1mL浓度为1mg/mL的DOX水溶液，在避光的条件下磁力搅拌反应24小时，反应结束后，将溶液分别转移到15mL离心管中，在转速为8000rpm条件下离心(5min)，得到的沉淀用去离子水洗涤3次，即可得到载药纳米颗粒LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX。

实施例3

将LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX分别用pH＝7.4和pH＝5.4的缓冲液溶解成浓度为1mg/mL(LM-mPEG/DOX或LM-PEG-FA/DOX的浓度)的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。开始的12h内每隔2h取一次样，以后每隔24h取一次样。每次取透析袋外液体1mL，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1mL。测量取出的透析液在480nm处吸光度值，计算得到体外不同pH条件下DOX从LM-mPEG/DOX和LM-PEG-FA/DOX中释放的释放曲线。(图4)

实施例4

收集对数生长期SK-OV-3细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育24h。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL含LM-mPEG/DOX或LM-PEG-FA/DOX的PBS，或纯PBS(对照组)。将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24h。按照20μL每孔的浓度加入刃天青溶液(1mg/mL)，避光环境下37℃恒温培养、4h。按顺序每孔吸去上层培养液100μL于黑色96孔板中，在多功能荧光酶标仪上检测各孔在激发波长λ＝530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量。(图5)

实施例5

收集对数生长期SK-OV-3细胞，按照8000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育24h。弃掉培养基后，每孔更换180μL培养基，并添加20μL 含LM-mPEG/DOX或LM-PEG-FA/DOX的PBS，或纯PBS(对照组)。将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃孵育4h。弃掉培养基并用无菌PBS漂洗每孔3遍，并加入不含材料的培养基180μL，继续培养24h或48h。按照20μL每孔的浓度加入刃天青溶液(1mg/mL)，避光环境下37℃恒温培养4h。按顺序每孔吸去上层培养液100μL于黑色96孔板中，在多功能荧光酶标仪上检测各孔在激发波长λ＝530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量。(图6)

实施例6

收集对数期SK-OV-3细胞，按照200,000个细胞每孔的密度接种在24孔细胞培养板上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育24h。弃掉培养基后，每孔更换450μL培养基，并添加50μL含LM-mPEG/DOX(DOX的浓度为6ppm)、LM-PEG-FA/DOX(DOX的浓度为6μg/mL)或纯DOX(浓度为6μg/mL)的PBS或PBS(对照组)。继续置于5％CO₂，37℃条件下孵育4h。倒去培养基，用PBS洗涤3次，加入100μL胰酶消化约5min后，立即加入1mL左右PBS吹打并收集细胞，转移到10mL离心管中1000rpm离心5分钟，继续用1mL PBS重悬。以荧光分辨率作为参数，将滤网过滤重悬的细胞液作为样品加入到流式细胞仪中进行检测，得到细胞对药物的吞噬结果。(图7)

实施例7

将大小合适的处理过的圆形载玻片以每孔1片的密度放入24孔板中，每孔加入0.5mL培养基浸泡24小时。弃掉浸泡培养基后，收集对数生长期SK-OV-3细胞，按照20,000细胞每孔的密度接种在圆形载玻片上，置于5％CO₂，37℃条件下孵育24h。弃掉培养基后，每孔更换360μL培养基，并添加40μL含LM-mPEG/DOX(DOX的浓度为6μg/mL)、LM-PEG-FA/DOX(DOX的浓度为6μg/mL)或纯DOX(浓度为6μg/mL)的PBS或PBS(对照组)。继续置于5％CO₂，37℃条件下孵育4h。弃掉培养基，用无菌PBS洗1-2遍，每孔加2.5％戊二醛的PBS溶液0.5mL，静置于4℃条件下固定30min。弃掉戊二醛溶液，用无菌PBS洗1-2遍，加Hoescht33342(1μg/mL)，覆盖细胞即可，静置于37℃染色15min。将Hoescht33342液吸出，用无菌PBS洗3遍，在载玻片上滴加一滴荧光封闭剂，将盖玻片从24孔板中勾出，将有细胞的一面压到载玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞内荧光分布。(图8) 。

Claims

1.一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征在于：所述的氨基化锂皂石纳米颗粒为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石；聚乙二醇-叶酸的质量分数在45-55％，聚乙二醇与叶酸的摩尔比为1∶0.4-1∶0.8。

2.一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：

(2)向聚乙二醇-叶酸PEG-FA的溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，搅拌2-4h，得到混合溶液，然后逐滴加入氨基化锂皂石纳米颗粒LM-NH2的水溶液中，搅拌反应2-4d，透析，得到聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-PEG-FA；其中投入的碳二亚胺盐酸盐与叶酸的摩尔比为10∶1-12∶1，投入的聚乙二醇-叶酸与氨基化锂皂石纳米颗粒的质量比为0.5∶1-0.6∶1。

3.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的溶剂为二甲基亚砜DMSO，步骤(1)中所述的聚乙二醇的溶液和步骤(2)中聚乙二醇-叶酸的溶液溶剂为二甲基亚砜DMSO。

4.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中叶酸溶液浓度为5-8mg/mL。

5.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中氨基化锂皂石纳米颗粒的水溶液浓度为6-8mg/mL。

6.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min。

7.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的透析为纯水透析，透析袋截留分子量为8000-14000，透析时间为2-4d。

8.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的反应条件为避光反应。

9.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于：将聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液加入阿霉素盐酸盐水溶液，搅拌12-24h，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素盐酸盐的聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其中聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素盐酸盐的质量比为2∶1-4∶1。

10.根据权利要求9所示的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于：所述聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液的浓度为2-6mg/mL，阿霉素盐酸盐的水溶液浓度为1-2mg/mL。

11.根据权利要求9所示的一种聚乙二醇-叶酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于：所述搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min；离心的速率为8000-10000r/min，离心的时间为5min。