CN108578427A

CN108578427A - 叶酸修饰的金纳米颗粒及其制备方法与在制备放射增敏治疗药物中的应用

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Publication number: CN108578427A
Application number: CN201810172584.9A
Authority: CN
Inventors: 史海斌; 高明远; 程侠菊; 孙瑞
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-03-01
Also published as: CN108578427B

Abstract

本发明公开了一种叶酸修饰的金纳米颗粒及其制备方法与在制备放射增敏治疗药物中的应用；本发明的制备方法包括以下步骤：1）在纳米颗粒表面上修饰紫外光敏感性交联剂以及叶酸；2）紫外光触发的金纳米颗粒交联；和3）紫外光触发金纳米颗粒应用与放射增敏。该方法首次使用了体积较小的交联剂，避免了纳米颗粒的沉淀；修饰肿瘤靶向功能分子，有效增加纳米材料在肿瘤部位的富集量；利用紫外光照射实现纳米颗粒的可控交联，大大增加了纳米材料在肿瘤部位的滞留时间；通过本发明的制备方法获得光触发金纳米颗粒交联极大地增强了肿瘤CT成像和较好的肿瘤放射增敏治疗效果。适合于开发成一种基于放射增敏疗法的抗肿瘤药物，具有重要的科研及经济价值。

Description

叶酸修饰的金纳米颗粒及其制备方法与在制备放射增敏治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于纳米颗粒自组装技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向功能以及紫外光触发的纳米颗粒交联策略的制备方法，通过该方法制备的交联体，以及该交联策略在制备基于放射治疗（Radiotherapy，RT）的抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤一直是威胁人类健康的重大疾病之一，其多年来居高不下的发病率和高死亡率给人类生活及社会经济造成了沉重的负担。如何实现肿瘤的及时诊断与有效治疗，一直是医学界和科学家所关注的重大课题。

众所周知，纳米材料的小尺寸和高比表面积，使其可以通过肿瘤组织透过性增强及滞留效应（EPR效应，Enhanced Permeability and Retention effect）而被动地富集在肿瘤部位。除了这些被动靶向效应，纳米材料还可以通过表面修饰配体-受体系统靶向分子来达到材料的主动靶向肿瘤效果。金纳米材料具有独特的光、电、热、催化等物理与化学性质，生物相容性好，在生物材料领域有着广泛的应用。有研究报道，现有技术修饰的金纳米粒子，进入肿瘤后还会回流到血液中或是转移到周边组织，从而降低粒子的富集量。

迄今，大量的技术已经开发了用于金纳米材料发生交联，目前也存在着一些问题。例如，金纳米粒子可以很容易地在溶液中通过与多硫醇的分子混合来自组装，如二硫醇烷和季戊四醇四-3-巯基丙酸酯来实现，不幸的是，这种方法显然是不适合体内形成可控金纳米粒子集合体；金纳米粒子通过DNA触发自组装在所需部位用于体外诊断已被报道，但是，在技术上由于DNA昂贵、容易被血液中核酸酶分解以及可能诱导免疫应答，这个方法应用到体内也是具有挑战性的。最近，肿瘤微环境刺激响应性的肿瘤组织局部诱导金纳米粒子的聚集也已有报道。实体肿瘤局部的pH偏酸性可能刺激对pH敏感金纳米粒子，可以在肿瘤部位聚集并用于肿瘤光热治疗，然而，复杂的体内生物环境可能带来不想要的颗粒聚集。绕过这些障碍的一种方法就是利用光作为刺激。事实上，在体外利用光响应分子对金纳米粒子的光触发的自组装的研究已经报道了，如发色团的异构化或二聚体，螺吡喃，偶氮苯等；然而，在上述研究都未能在体内应用，而且所涉及的光响应分子的合成很复杂。

因此为了克服传统方法的缺点，寻找并开发一种具有肿瘤主动靶向功能并且能简单、快速、可控的金纳米颗粒交联新方法，应用于肿瘤放射增敏治疗中具有重大的研究及应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明利用光敏感交联反应开发出一种简单、快速、绿色、稳定、可控的纳米颗粒交联方法，得到的小分子交联金纳米材料可以与放射治疗结合，增加疗效，其具有低免疫原性、低毒副作用以及更加有利于在肿瘤组织中的滞留。

具体而言，本发明提供了一种叶酸修饰的金纳米颗粒交联策略并应用于肿瘤放射增敏治疗；采用如下技术方案：

叶酸修饰的金纳米颗粒在制备放射增敏治疗药物和/或CT成像剂中的应用；或者叶酸修饰的金纳米颗粒交联体在制备放射增敏治疗药物和/或CT成像剂中的应用。

叶酸修饰的金纳米颗粒或者叶酸修饰的金纳米颗粒交联体在制备与肿瘤有效交联的药物中的应用。

本发明中，叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

（1）以金纳米颗粒、甲氧基聚乙二醇硫醇和氨基聚乙二醇硫醇为原料，制备PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒；

（2）以PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒、紫外光敏感性交联剂和三乙胺为原料，制备紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒；

（3）以叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺、紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒为原料，制备叶酸修饰的金纳米颗粒。

本发明中，叶酸修饰的金纳米颗粒交联体的制备方法，包括如下步骤：

（3）以叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺、紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒为原料，制备叶酸修饰的金纳米颗粒；

（4）将叶酸修饰的金纳米颗粒加水重悬，置于紫外光下照射，得到叶酸修饰的金纳米颗粒交联体。

本发明中，步骤（1）中，金纳米颗粒、甲氧基聚乙二醇硫醇、氨基聚乙二醇硫醇的质量比为（1～2）∶20∶20；向金纳米颗粒溶液中加入甲氧基聚乙二醇硫醇和氨基聚乙二醇硫醇，于室温搅拌12～24小时，再经超滤离心，制备PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒。

本发明中，步骤（2）中，PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒、紫外光敏感性交联剂、三乙胺的质量比为1∶（2～15）∶（2～15）；将PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒、紫外光敏感性交联剂、三乙胺于室温搅拌2～5小时，再经超滤离心，制备紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒。

本发明中，步骤（3）中，叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶2∶2；首先将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺在DMSO溶剂中混合2～3小时，随后加入紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒，室温搅拌过夜，再经超滤离心，制备叶酸修饰的金纳米颗粒。

本发明中，步骤（4）中，紫外光的波长为365 nm或405 nm激光，照射强度为1~12 W/cm²，照射时间为3~30分钟。

本发明中，紫外光敏感性交联剂的化学名称为N-[3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酰氧基]琥珀酰亚胺，其化学结构式如下：

本发明还公开了具有放射增敏的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

（3）以叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺、紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒为原料，制备具有放射增敏的金纳米颗粒。

本发明还公开了具有放射增敏的金纳米颗粒交联体的制备方法，包括如下步骤：

（4）将叶酸修饰的金纳米颗粒加水重悬，置于紫外光下照射，得到具有放射增敏的金纳米颗粒交联体。

本发明还公开了一种肿瘤放射增敏药物，所述肿瘤放射增敏药物的制备方法包括如下步骤：

（4）将叶酸修饰的金纳米颗粒加水重悬，置于紫外光下照射，得到具有放射增敏的金纳米颗粒交联体；

（5）将具有放射增敏的金纳米颗粒交联体与分散介质混合，得到肿瘤放射增敏药物。

本发明还公开了上述肿瘤放射增敏药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，在上述制备方法中，步骤（1）中所述甲氧基聚乙二醇硫醇为两个末端分别由甲氧基和巯基修饰的聚乙二醇，其选自M-PEG₂₀₀₀-SH、M-PEG₅₀₀₀-SH、M-PEG₁₀₀₀₀-SH、M-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物；更优选的，所述甲氧基聚乙二醇硫醇为M-PEG₅₀₀₀-SH。甲氧基聚乙二醇硫醇发挥稳定化作用，防止纳米颗粒从原液中沉淀析出。

优选的，在上述制备方法中，步骤（1）中所述氨基聚乙二醇硫醇为两个末端分别由氨基和巯基修饰的聚乙二醇，其选自NH₂-PEG₂₀₀₀-SH、NH₂-PEG₅₀₀₀-SH、NH₂-PEG₁₀₀₀₀-SH、NH₂-PEG₂₀₀₀₀-SH中的任意一种或其任意比例的混合物；更优选的，所述氨基聚乙二醇硫醇为NH₂-PEG₅₀₀₀-SH。氨基聚乙二醇硫醇发挥功能化修饰作用。

优选的，在上述制备方法中，步骤（4）中所述紫外光由紫外光发射装置提供，所述紫外光发射装置为发射高能量紫外光的紫外激光器；更优选的，所述紫外光发射装置为紫外激光器。

优选的，在上述制备方法中，步骤（5）中所述分散介质为水。

本发明上述的制备方法可以得到叶酸修饰的金纳米颗粒、叶酸修饰的金纳米颗粒交联体，通过修饰小尺寸的金纳米粒子的表面，使其在肿瘤内发生可控交联，使颗粒尺寸变大延长在肿瘤部位滞留时间从而可以做到CT成像引导下的肿瘤放射增敏治疗。

修饰金纳米颗粒用于肿瘤治疗已经有所报道，但是大部分都是利用金的特性进行光热治疗，没有见到关于放射增敏治疗的报道；特别的，现有修饰金颗粒都着眼于细胞内吞然后杀死癌细胞，没有研究者考虑金颗粒与组织之间的联系，更没有这方面的报道；而且现有大部分报道都公开了体外细胞研究，极少涉及体内，更没有公开体内组织的效果研究，这恰恰是效果最不可预期的部分，体内外环境有别，这是常识，再加上肿瘤组织与肿瘤细胞是两回事，导致现有技术很多结果无法做参考。本发明首次使用了体积较小的紫外光敏感性交联剂N-[3-(3-甲基-3H-双吖丙啶-3-基)丙酰氧基]琥珀酰亚胺，成功避免了由于交联剂体积过大而导致的纳米颗粒沉淀；通过修饰肿瘤靶向功能分子，有效增加纳米材料在肿瘤部位的富集量，大大增加了纳米材料在肿瘤部位的滞留时间；极大地增强了肿瘤放射增敏治疗疗效。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明首次公开了一种叶酸靶向修饰的金纳米颗粒用于制备肿瘤放射增敏治疗药物的研究，其可以有效与肿瘤组织进行交联；通过体内实验证实，金纳米颗粒在肿瘤部位的滞留时间明显延长，经过X射线机照射后，肿瘤增长较其他组别被明显抑制，说明具有肿瘤靶向功能的的光响应的金纳米颗粒在动物水平有很好的放射增敏效果。

附图说明

图1为实施例纳米颗粒表面PEG末端的交联剂和叶酸修饰过程以及金纳米颗粒在肿瘤放射增敏治疗中作用的示意图；

图2为叶酸修饰的金纳米颗粒交联前后的紫外吸收和粒径变化情况图；

图3为叶酸修饰的金纳米颗粒交联前后的TEM图；

图4为暗场显微镜图像显示叶酸修饰的金纳米颗粒的细胞内吞情况；

图5为叶酸修饰的金纳米颗粒经紫外光诱导交联前后小动物CT图像；

图6为叶酸修饰的金纳米颗粒经紫外光诱导交联前后的细胞水平放射增敏研究；

图7为叶酸修饰的金纳米颗粒经紫外光诱导交联前后的动物水平放射增敏研究。

具体实施方式

下文将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释和说明本发明中的技术方案，而并非旨在限制本发明的范围。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得。

实施例一

向超纯水（100 mL）中加入1%的氯金酸溶液（0.6 mL），加热至100℃，剧烈搅拌至沸腾后加入1%的柠檬酸钠溶液（3 mL），待体系变成酒红色后，继续煮沸30 min，得到金纳米颗粒原液。

向金纳米颗粒原液（100 mL，内含金纳米颗粒1 mg）中依次加入M-PEG₅₀₀₀-SH（20mg）和NH₂-PEG₅₀₀₀-SH（20 mg），于室温搅拌24h。经超滤离心（5000 rpm × 10 min）5次，除掉多余的PEG。离心后用超纯水重悬，得到PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒母液。

向制得的经PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒母液（100 mL，内含经PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒1 mg）中紫外光敏感性交联剂（2.7 mg）和三乙胺（2.4 mg），于室温搅拌反应4 h。经超滤离心（5000 rpm × 10 min）3次后，得到紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒。通过测定反应前后溶液中紫外光敏感性交联剂的浓度，经计算可知，大约0.88 µmol的紫外光敏感性交联剂偶联于纳米颗粒表面。

所述紫外光敏感性交联剂的化学结构式如下：

在紫外光敏感的金纳米颗粒表面剩余PEG末端氨基上修饰肿瘤靶向叶酸分子：

首先，将叶酸：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）：N-N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）=1:2:2的摩尔比，在DMSO溶剂中活化2小时，随后将紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒水溶液（1 mL，1 mg/mL）加入，室温搅拌过夜。经超滤离心，得到叶酸修饰的金纳米颗粒。

实施例二

将实施例一制得的叶酸修饰的金纳米颗粒用超纯水重悬，置于紫外灯（405 nm，1 W/cm²）下照射10 min，便可诱导金纳米颗粒发生交联，得到叶酸修饰的金纳米颗粒交联体。

纳米颗粒表面PEG末端的交联剂以及叶酸修饰过程以及紫外光触发的纳米颗粒交联过程的示意图如图1所示。

实施例三金纳米颗粒交联前后的水合粒径分布和紫外吸收的变化以及TEM图像

将上述叶酸修饰的金纳米颗粒水溶液（母液）、叶酸修饰的金纳米颗粒交联体水溶液（母液）100 μL（2 mg/mL）分别用水稀释至2 mL，测试其粒径分布（DLS）和紫外吸收情况。

如图2a所示，叶酸修饰的金纳米颗粒的水合粒径分布较为均匀（约为60 nm），经紫外激光器（405 nm，25 min）照射的叶酸修饰的金纳米颗粒能发生交联聚集，水合粒径约为300 nm。

图2b是金纳米颗粒光触发交联聚集后的紫外吸收变化。未经过紫外光照射的叶酸修饰的金纳米颗粒的最大吸收在524 nm左右，经紫外激光（405 nm）照射后的叶酸修饰的金纳米颗粒交联体除了在536 nm左右有一个吸收峰以外，在700~800 nm区间吸收也有明显增强。

图3a-3b是紫外激光照射后叶酸修饰的金纳米颗粒的TEM图像，可以明显看到未经过紫外光照射的叶酸修饰的金纳米颗粒的粒径在20 nm左右（见图3a），经紫外激光（405nm）照射后的叶酸修饰的金纳米颗粒发生了明显的聚集现象（见图3b）。

实施例四经叶酸修饰的光响应的金纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向功能

将上述叶酸修饰的金纳米颗粒母液、叶酸修饰的金纳米颗粒交联体母液（2 mg/mL）用含10%血清培养基稀释至50 μg/mL，与小鼠乳腺癌细胞（4T1）孵育不同时间（2、6、10、24 h），然后用ICP-MS测细胞内的金元素含量，同时利用暗场显微镜直接观察金颗粒在细胞内的情况。

如图4a ICP-MS结果所示，随着金纳米颗粒与细胞的孵育时间延长，细胞内的金元素含量逐渐增多，并且未经叶酸修饰的金纳米颗粒的细胞内的金元素含量明显少于经叶酸修饰的金纳米颗粒。同时如图4b所示，在孵育24 h后，暗场显微镜结果也明显看到有叶酸修饰的金纳米颗粒明显多于未经叶酸修饰的金纳米颗粒。这证明经叶酸修饰后的金纳米颗粒可以通过配体-受体靶向系统更加有利于被肿瘤细胞内吞。

实施例五叶酸修饰的金纳米颗粒在肿瘤部位交联的CT显像以及TEM图像

将叶酸修饰的金纳米颗粒母液200 μL（5 mg/mL）尾静脉注射到BALB/C小鼠体内，然后用小动物CT成像系统不同时间点观察金纳米颗粒在肿瘤部位的CT成像。

如图5a所示，在小鼠尾静脉注射金纳米颗粒3 h之后，未经过和经过紫外光照射的小鼠肿瘤CT显像结果有差别，可以看到在48 h之后，经过紫外光照射的肿瘤部位CT增强明显，而未经过紫外光照射的肿瘤部位CT成像效果已经不明显了。同时如图5b所示，不同时间点的肿瘤部位CT值也能看出经过紫外光照射的金纳米颗粒交联在肿瘤部位CT值明显高于未经紫外光照射的，这说明经过紫外光交联之后的金纳米颗粒在肿瘤部位的滞留时间明显延长。

如图5c所示，分别将尾静脉注射后9、24、48 h的肿瘤做组织切片，可以看到经过紫外光照射的肿瘤部位内有金纳米颗粒交联聚集，而未经过紫外光照射的肿瘤部位内金纳米颗粒相对较少并且没有发生交联聚集。相对应的肿瘤组织内金元素含量用ICP-MS测定（见图5d），也可以得到一致结论。同时采用未经过紫外光照射的作为对比（其他制备方法一样），发现肿瘤组织内金元素含量较经过紫外光照射少大约35%。

实施例六叶酸修饰的金纳米颗粒在细胞水平的放射增敏

将叶酸修饰的金纳米颗粒母液100 μL，2 mg/mL用含10%血清培养基稀释至50 μg/mL，与小鼠乳腺癌细胞（4T1）孵育24 h之后。分为五组（Control组，λ_{405 nm}组，RT组，Au+RT组，Au+λ_{405 nm+RT}组，Au指加入叶酸修饰的金纳米颗粒；λ_{405 nm}指405 nm紫外激光照射（1 W/cm²，3min）；RT指X射线机照射（4 Gy）；细胞生长24 h后测live/dead染色以及DNA损伤，荧光显微镜拍照。

从图6a中可以看出，叶酸修饰的金纳米颗粒在细胞孵育下经过405 nm紫外光照射（1 W/cm²，3 min）后，金纳米颗粒在细胞内发生交联聚集，经过X射线机照射（4 Gy）后，死细胞（红色）较其他组别明显增多，活细胞（绿色）较其他组别明显减少，说明本发明的方法能够在细胞内实现金纳米颗粒的交联，并具有较好的放射增敏治疗效果，能够有效杀死肿瘤细胞。

从图6b中可以看出，叶酸修饰的金纳米颗粒在细胞孵育下经过405 nm紫外光照射（1 W/cm²，3 min）后，金纳米颗粒在细胞内发生交联聚集，经过X射线机照射（4 Gy）后，DNA损伤（红色的点）较其他组别明显增多，与live/dead结论一致，说明具有肿瘤靶向功能的的光响应的金纳米颗粒在细胞水平有很好的放射增敏效果。同时采用未经过紫外光照射的作为对比（其他制备方法一样），发现DNA损伤较经过紫外光照射少。

实施例10：具有肿瘤靶向功能的的光响应的金纳米颗粒在动物水平的放射增敏

将叶酸修饰的金纳米颗粒母液100 μL，2 mg/mL尾静脉注射到BALB/C小鼠体内，分为五组（Control组，λ_{405 nm}组，RT组，Au+RT组，Au+λ_{405 nm+RT}组，Au指加入叶酸修饰的金纳米颗粒；λ_{405 nm}指405 nm紫外激光照射（1 W/cm²，25 min）；RT指X射线机照射（4 Gy两次，第0天以及第二天照射）；然后隔天记录肿瘤大小。

如图7所示，叶酸修饰的金纳米颗粒在尾静脉注射小鼠体内之后经过405 nm紫外光照射后，金纳米颗粒在肿瘤内发生交联聚集，经过X射线机照射后，肿瘤增长较其他组别被明显抑制，说明具有肿瘤靶向功能的的光响应的金纳米颗粒在动物水平有很好的放射增敏效果。同时采用不加叶酸、未经过紫外光照射的作为对比（其他制备方法一样），发现肿瘤体积与RT组都差不多。

Claims

1.叶酸修饰的金纳米颗粒在制备放射增敏治疗药物和/或CT成像剂中的应用；或者叶酸修饰的金纳米颗粒交联体在制备放射增敏治疗药物和/或CT成像剂中的应用；

所述叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

所述叶酸修饰的金纳米颗粒交联体的制备方法，包括如下步骤：

2.叶酸修饰的金纳米颗粒或者叶酸修饰的金纳米颗粒交联体在制备与肿瘤有效交联的药物中的应用；

所述叶酸修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，金纳米颗粒、甲氧基聚乙二醇硫醇、氨基聚乙二醇硫醇的质量比为（1～2）∶20∶20；向金纳米颗粒溶液中加入甲氧基聚乙二醇硫醇和氨基聚乙二醇硫醇，于室温搅拌12～24小时，再经超滤离心，制备PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒。

4.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒、紫外光敏感性交联剂、三乙胺的质量比为1∶（2～15）∶（2～15）；将PEG修饰的氨基功能化金纳米颗粒、紫外光敏感性交联剂、三乙胺于室温搅拌2～5小时，再经超滤离心，制备紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒，所述紫外光敏感性交联剂的化学结构式如下：

。

5.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶2∶2，首先将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-N-羟基琥珀酰亚胺在DMSO溶剂中混合2～3小时，随后加入紫外光敏感性交联剂修饰的金纳米颗粒，室温搅拌过夜，再经超滤离心，制备叶酸修饰的金纳米颗粒。

6.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，紫外光的波长为365 nm或405 nm激光，照射强度为1～12 W/cm²，照射时间为3～30分钟。

7.具有放射增敏的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

8.具有放射增敏的金纳米颗粒交联体的制备方法，包括如下步骤：

9.一种肿瘤放射增敏药物，其特征在于，所述肿瘤放射增敏药物的制备方法包括如下步骤：

10.权利要求9所述肿瘤放射增敏药物在制备抗肿瘤药物中的应用。