CN105106958B - 具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，通过控制蛋白浓度、铜盐浓度、反应溶液pH、反应时间和反应温度，诱导无机铜基纳米复合物的生长，合成出以人血白蛋白为骨架、包裹硫化铜或硒化铜纳米复合物的铜基纳米结构，该具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物具有分散性好、光稳定性好、光热转换效率高以及体内肿瘤靶向性良好等特性，可用于光热治疗，实现肿瘤高效热消除。

Description

具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备 方法和应用

技术领域

本发明涉及一种铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用。

背景技术

光热治疗(photothermal therapy，PTT)是近年来迅速发展的一种微创肿瘤治疗技术。靶向肿瘤部位的光吸收剂在入射光激发下，利用其光热转换效应产生热，可使肿瘤局部温度升高并达到一定温度(42℃以上)，从而实现杀伤肿瘤细胞的作用。通过光热转换物质的肿瘤靶向传输以及对肿瘤部位选择性的照射，使得全身系统毒性极大降低，因此光热治疗被认为是一种极具潜力替代手术的治疗肿瘤技术。

近年来，纳米材料因其物理、化学、生物学方面等独特性质和应用而逐渐成为研究的热点，特别是在光热治疗方面的应用受到广泛关注。多种具有良好近红外吸收特性的纳米材料在肿瘤光热治疗方面已经取得一定的成功，如金纳米复合物、碳纳米材料、高分子材料、载近红外荧光染料胶束等。但是不同的材料均存在一定的不足，以碳菁类染料为例，其具有一定的光漂白性，细胞摄取难，靶向性差，体内代谢快等缺点，所以研究的重心正向新型多功能生物材料转移。

最近研究发现，血清白蛋白作为药物的载体显示出良好的生物相容性，这一点与其独特的蛋白类结构息息相关。以人血清白蛋白为例，人血清白蛋白(Human SerumAlbumin，HSA)是临床常用的一种天然血液制品，含584个氨基酸，平均分子量69,000道尔顿，易溶于水，在中性介质中带负电，具有安全无毒，无免疫原性，可生物降解，生物相容性好等优点。此外，白蛋白含有59个赖氨酸，有利于其作为载体的靶向头基修饰，可进行主动靶向纳米复合物的研究。2005年FDA批准由美国生命科学(American Bioscience)公司开发的以白蛋白为载体的紫杉醇蛋白纳米复合物注射液上市，临床研究显示，该紫杉醇蛋白纳米复合物比其聚氧乙烯蓖麻油制剂有更高的治疗指数和安全性，并且避免了使用皮质类固醇的术前给药，表面人血清白蛋白作为静脉应用载体的广阔前景。因此，以蛋白纳米复合物为载体的纳米给药系统的研究具有临床实用价值。

同时，2009年研究人员首次发现血清白蛋白可在较为温和的条件下将一些金属离子进行还原，如金离子，并诱导其生长为金纳米簇，形成一种以血清白蛋白为支架，包裹金簇的蛋白纳米复合物(J Am Chem Soc 2009,131,888–889.)。该重大发现掀开了无机纳米复合物制备方法的新篇章。越来越多的研究小组通过模拟生物矿化过程的方法制备具有更加良好生物相容性的无机纳米材料，一定程度上解决了困扰无机纳米复合物的问题。该方法使用方便，条件温和，高效。更为重要的一点是，血清白蛋白表面功能基团多，为进一步的功能化提供了前提。多种由蛋白稳定的纳米材料也成为研究的热点，如Au、Ag、ZnS/Mn等纳米结构(Anal Chem 2011,83,2883–2889；Chem Eur J.2013,19,7473–7479.)，而且人血清蛋白作为紫杉醇药物载体也已经被FDA批准可用于临床使用(Int JNanomedicine 2009,4,99-105；J Food Prot.2008,71,590-594)。因此，人血清白蛋白一定程度上拥有更佳的使用前景。

在无机光热材料中，除了金纳米材料和碳纳米管材料，硫化铜普遍被认为是一种具有发展前景的光热材料，具有以下几个优点：低耗、低毒、近红外吸收强等。最近已有研究表明硫化铜在体内外水平上可作为一种新型光热材料(Nanomedicine 2010,5,1161；J AmChem Soc,2010,132,15351)。该结果显示出硫化铜在体内光热治疗具有一定的应用前景。但是，与其他光热纳米材料相比，硫化铜具有一个明显的缺点，就是其较低的光热转换效率，据报道其光热转换效率在25％左右(Nano Lett,2011,11,2560–2566；Acs Nano,2011,5(12):9761-71)，在前面提到了两个研究中，使用的激光器功率分别为16W/cm²和24W/cm²，这远远高于临床上批准人体耐受的激光强度(0.33W/cm²)，因此，合成具有强近红外吸收及高光热转换效率的硫化铜纳米材料是重要的发展方向。

在硫化铜纳米复合物的合成方面，首先发现的是一种高温油相的制备方法(AcsNano,2011,5,9761-71；Nano Lett,2011,11,2560–2566)，该法制备出的纳米复合物非水溶性，需要进一步进行水化后才能转入水相，所以这种制备方法存在明显不足，即生物相容性较差。而随着技术的进步，水溶性的硫化铜制备技术也随之发展起来。尽管这种方法一定程度上解决了生物相容性不好的问题，但所制备的纳米复合物的粒径偏大，明显限制了其在生物方面的应用。有报道使用牛血清蛋白生物矿化合成硫化铜纳米粒(DaltonTrans.2015,44,13112–13118)，硫化铜纳米粒溶液(1.3mg/mL)在高能量密度为3W的808nm激光在10分钟内最高可以升温17.1℃，动物抑瘤效果有限，表明该纳米粒的光热升温能力弱，光热转换效率不高，且牛血清白蛋白在人体内可能带来免疫副反应，不能用于临床使用。因此，开发生物相容性好、靶向性好、光热转换效率高的硫化铜蛋白纳米复合物是铜基纳米复合物研究的重点方向。

有鉴于上述的内容，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种生物相容性好，光热转换效率高，能在近红外光激发下产生光热效应抑制肿瘤细胞生长的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用。

本发明提出的一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物，其特征在于：包括硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，所述复合物均以蛋白为骨架，包裹硫化铜和硒化铜纳米复合物的铜基纳米结构，所述复合物的直径为5～30nm。

对850-1000nm波长范围内的近红外光具有显著吸收，铜基蛋白纳米复合物光稳定性良好，0.72W/cm²激光照射(980nm)下在30分钟内光吸收变化小于10％。

作为本发明的进一步改进，所述蛋白为人血清白蛋白，所述铜基纳米结构的铜源是乙酸铜、硝酸铜。

作为本发明的进一步改进，所述复合物中铜元素含量为0.01-0.5mmol/L。

铜元素含量在0.01-0.5mmol/L范围时，在0.72W/cm²激光照射(980nm)下，5分钟内温度可增加40-80℃，光热转换效率>40％。

本发明提出的一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)配置浓度为10～100mg/mL的蛋白溶液和浓度为1～50mmol/L的铜源溶液，将蛋白溶液和铜源溶液按体积比5:1混合，搅拌均匀，得到混合溶液；

(2)用PH调节溶液调节步骤(1)中的混合溶液的PH值至8.0～13.0；

(3)往混合溶液中加入硫源或硒源溶液进行反应，混合溶液中铜元素与硫或者硒元素之间的比值为1:2～1:8；反应温度为37℃～55℃，反应时间为2～12h，水浴搅拌至反应结束；

(4)取出反应后的溶液，用5000～100000截留分子量透析袋透析24-48h，得到透析后的纳米复合物；

(5)使用截留分子量为10-200kD的超滤管对透析后的纳米复合物进行超滤纯化，得到铜基蛋白纳米复合物。

作为本发明方法的进一步改进，步骤(2)中的PH调节溶液为2mol/L的NaOH溶液。

作为本发明方法的进一步改进，步骤(3)中的硫源是Na₂S·9H₂O，硒源是K₂SeO₃，所述硫源和硒源溶液的浓度为0.1mol/L。

作为本发明方法的进一步改进，步骤(5)中透析以去离子水为接受介质，透析液更换次数为6-8次。

作为本发明方法的进一步改进，步骤(5)中超滤转速为2000～5000r/min，超滤次数至少10次。

本发明提出的一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物作为肿瘤靶向光热治疗药物的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明的铜基蛋白纳米复合物尺寸均一，其直径为5～30nm，具有很低的细胞毒性和良好的血液相容性，且在体内具有良好的肿瘤靶向性；

2、本发明的铜基蛋白纳米复合物可采用980nm激光器激发产生显著光热效应，980nm激发时，激光对机体组织渗透渗透比808nm激光深；980nm激光的安全光密度是808nm激光的2倍以上。

3、铜基蛋白纳米复合物有较高的光热转换效率，在近红外激光照射下能有效的将光能转换为热能，光照稳定性良好，无光漂白现象；

4、铜基蛋白纳米复合物表面的蛋白拥有较多的功能基团，为进一步化学修饰提供了可能；

5、铜基蛋白纳米复合物对肿瘤具有良好的靶向性，并能在近红外光激发下高效发挥肿瘤光热治疗效果，在静脉注射(30.0mmol/L)后24h进行光热治疗(980nm，0.72W/cm2，5min)，可完全消融肿瘤，无复发现象。

与其他材料相比，本发明提供的一种铜基蛋白纳米复合物，其显著的优势在于生物相容性良好、光热转换效率高、光稳定性好、体内肿瘤靶向性优异，为高效的肿瘤光热治疗奠定基础。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1a：本发明硫化铜蛋白纳米复合物透射电镜图；

图1b：本发明硒化铜蛋白纳米复合物透射电镜图；

图2：本发明实施例一中铜基蛋白纳米复合物紫外全谱扫描图；

图3a：本发明实施例七中硫化铜蛋白纳米复合物升温曲线图；

图3b：本发明实施例七中硒化铜蛋白纳米复合物升温曲线图；

图4：本发明实施例八中铜基蛋白纳米复合物的光热转换效率图；

图5：本发明实施例九中铜基蛋白纳米复合物的光照稳定性图；

图6：本发明实施例十中铜基蛋白纳米复合物的细胞毒性试验图；

图7：本发明实施例十一中铜基蛋白纳米复合物的组织分布结果图；

图8：本发明实施例十二中铜基蛋白纳米复合物的抑瘤曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一：

铜基蛋白纳米复合物的制备：取人血清白蛋白配置成15mg/mL的溶液，待用。配制50mmol/L硝酸铜溶液，以及2mol/L NaOH的溶液以调节pH。分别取20mL人血清白蛋白溶液放置于两个离心管中，分别向其中加入4mL的乙酸铜溶液，用2mol/L NaOH溶液调节溶液pH至8.5左右，常温搅拌2min后按铜元素与硫或者硒元素1:2加入0.1mol/L Na₂S·9H₂O或者K₂SeO₃，放置于55℃水浴磁力搅拌2h，取出溶液后先用8000～14000截留分子量透析袋透析24h，以去离子水为接受介质，每4h换水一次。随后用100kD超滤离心管进行超滤，以4000rpm超滤10次以上，最后取出两个样品分别为硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物。

用激光粒度仪(Nano ZS90，英国马尔文公司)25℃测得该法制备的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物的粒径分别为10.9nm和11.2nm，铜元素含量为0.5mmol/L的水溶液在980nm激光下(0.72W/cm²)照射300s后分别升温至75℃和58℃。

实施例二：

将实施例一中铜基蛋白纳米复合物的制备过程中人血清白蛋白浓度增加至50、100mg/mL，乙酸铜溶液改为5、25mmol/L，其他步骤同实施例一。随着反应物中人血清白蛋白与铜离子比例的降低，即人血清白蛋白投入量增多时可制备出物理化学稳定性更佳的同基蛋白纳米复合物。

实施例三：

将实施例一中铜基蛋白纳米复合物的制备过程中反应体系的pH值调节至10、12.5，其他步骤同实施例一。随着反应体系中水相pH的增加，可调节铜基蛋白纳米复合物在800～1200nm近红外区域吸收的强弱。

实施例四：

将实施例一中铜基蛋白纳米复合物的制备过程中铜元素与硫或者硒的比例调节至1:4、1:8，其他条件与同实施例一，从而得到铜与配体不同比例的铜基蛋白纳米复合物。

实施例五：

将实施例一中铜基蛋白纳米复合物的制备过程中反应温度调整至37、46℃，从而制备出近红外吸收强弱不同的铜基蛋白纳米复合物，随着温度的升高，复合纳米粒在近红外区域吸收也随之升高，相应的光热效应也越强。

实施例六：

将实施例一中铜基蛋白纳米复合物的制备过程中反应时间从2h增加至4、6、8、12h。随着反应时间的增加，制备出来的铜基蛋白纳米复合物也伴随有更大的尺寸，直至反应时间为12h时，用激光粒度仪25℃测得该法制备的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物的粒径分别为30.1nm和29.5nm，铜元素含量为0.5mmol/L的水溶液在980nm激光下(0.72W/cm²)照射300s后分别升温至67℃和61℃。

实施例七：

参照实施例一对制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对其体外升温效应进行考察，按铜离子计，分别制备0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5mmol/L的溶液，利用980nm激光器(0.72W/cm²)照射5min，每隔30s记录溶液的温度。两种蛋白纳米复合物的光热效应都显示出一定的浓度依赖性，且相同浓度下硫化铜蛋白纳米复合物能产生比硒化铜蛋白纳米复合物更高的升温效果。

实施例八：

参照实施例一对制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对其光热转换效率进行考察，选取含铜离子浓度0.1mmol/L的水溶液(0.5mL)对其进行激光照射(980nm，0.72W/cm²)600s后水溶液温度趋于平稳，撤去激光器使其自然冷却至室温，期间每30s对温度进行记录，根据文献(Nanoscale,2014,6,3274)提供的公式对光热转换效率进行计算，结果发现硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物的光热转换效率分别为50％和48％，远高于文献报道，表明我们制备出高光热转换效率的铜基蛋白纳米复合物。

实施例九：

参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对其体外光照稳定性进行考察，取0.1mmol/L的硫化铜和硒化铜蛋白纳米复合物，分别放置于7个2mL的EP管中，对这7个样品进行980nm(0.72W/cm²)照射0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0和15.0min，对其紫外吸收的变化进行扫描。铜基蛋白纳米复合物在不同时间的光照下其紫外吸收均未发生明显的变化，具有明显的光稳定特性，为后期的光热治疗奠定基础。

实施例十：

参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对细胞毒性进行考察。取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为6×10³/mL，每孔100μl，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用PBS洗1-2次，加入用培养基配好的铜基白蛋白溶液，每孔100μl，以铜元素浓度给药，浓度梯度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mmol/L，每个浓度4个复孔。放入培养箱培养24小时后，更换培养液，光照组每孔分别在1.5W/cm²条件下，光照3分钟，放回培养箱中继续培养24小时，加10μl 5mg/mL的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm处测定吸光度值。在光照条件下，铜基蛋白纳米复合物可对细胞产生有效的杀伤作用，其IC₅₀分别为20μM和35μM。

实施例十一：

参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对体内组织分布考察：步骤如下：

(1)肿瘤模型的建立：培养4T1肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在小鼠腹部第二对乳头上侧种瘤，每只小鼠皮下注射100μl，每天观察肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积＝(长×宽²)/2。

(2)尾静脉注射两种铜基蛋白纳米复合物(30.0mmol/kg)至荷瘤小鼠体内，在注射后24h取出小鼠的心，肝，脾，肺，肾和肿瘤，匀浆，并用2mL的硝酸对组织进行硝解，待组织硝解完全之后取出100μL稀释至10.0mL过膜之后用ICP-AES对各组织中的铜元素进行定量。ICP定量结果可知，在24h后两种蛋白纳米复合物只要在肿瘤部位富集，为后期的光热治疗提供了指引。

实施例十二：

参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对体内抑瘤效果考察。采用实施例十一中步骤(1)建立肿瘤模型的方法构建小白鼠荷瘤模型，待肿瘤体积至60mm³时，按照以下设计给药：铜基蛋白纳米复合物单剂量注射浓度30.0mmol/kg，生理盐水组，分别光照和非光照组，共6组，每组5只，第0天给药，第2天进行激光治疗(980nm，0.72W/cm²，5分钟)。分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天测量小鼠的体重和肿瘤体积。注射生理盐水组，光热以及未光照条件下均对肿瘤的生长无影响，说明单独光照不能对肿瘤产生抑制效果。而注射高剂量铜基蛋白纳米复合物未光照条件下发现未能影响肿瘤的生长，说明单独的铜基蛋白纳米复合物不能抑制肿瘤的生长，而注射高剂量铜基蛋白纳米复合物光照后肿瘤部位能迅速产生热损伤效果，且在观察时间内未出现复发现象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)配置浓度为10～100mg/mL的蛋白溶液和浓度为1～50mmol/L的铜源溶液，将蛋白溶液和铜源溶液按体积比5:1混合，搅拌均匀，得到混合溶液；

(2)用PH调节溶液调节步骤(1)中的混合溶液的PH值至8.0～13.0；

(3)往混合溶液中加入硫源或硒源溶液进行反应，混合溶液中铜元素与硫或者硒元素之间的比值为1:2～1:8；反应温度为37℃～55℃，反应时间为2～12h，水浴搅拌至反应结束；

(4)取出反应后的溶液，用5000～100000截留分子量透析袋透析24-48h，得到透析后的纳米复合物；

(5)使用截留分子量为10-200kD的超滤管对透析后的纳米复合物进行超滤纯化，得到铜基蛋白纳米复合物；

该方法制备的具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物，包括硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，所述复合物均以蛋白为骨架，包裹硫化铜和硒化铜纳米复合物的铜基纳米结构，所述复合物的直径为5～30nm。

2.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白为人血清白蛋白，所述铜基纳米结构的铜源是乙酸铜、硝酸铜。

3.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：所述复合物中铜元素含量为0.01-0.5mmol/L。

4.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的PH调节溶液为2mol/L的NaOH溶液。

5.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的硫源是Na₂S·9H₂O，硒源是K₂SeO₃，所述硫源和硒源溶液的浓度为0.1mol/L。

6.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(5)中透析以去离子水为接受介质，透析液更换次数为6-8次。

7.根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于：步骤(5)中超滤转速为2000～5000r/min，超滤次数至少10次。

8.根据权利要求1所述的具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物在制备肿瘤靶向光热治疗药物的应用。