CN105562705B - 一种基于蛋白质合成铜量子点的方法及其应用 - Google Patents

一种基于蛋白质合成铜量子点的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白质合成铜量子点的方法。首先，采用液相还原法，以无水硫酸铜作为氧化剂，水合肼作为还原剂，外加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为分散剂，在80～100℃水浴条件下，发生氧化还原反应生成紫红色的纳米铜溶胶，此铜溶胶在特定波长的紫外激发下发微弱的蓝色荧光；然后，当与聚丙烯酰胺凝胶固定的蛋白质相互作用后，其荧光强度明显增强，且发生荧光颜色的变化，例如与人血清白蛋白作用后发蓝紫色荧光，与过氧化氢酶作用后发粉黄色荧光，与溶菌酶作用后发橙红色荧光。该方法简单、快速，成本低，无生物毒性，可用于生物传感器，为荧光检测生物大分子提供新的途径。

Description

一种基于蛋白质合成铜量子点的方法及其应用
技术领域
本发明属于纳米材料领域，尤其涉及一种基于蛋白质合成铜量子点的方法及应用。
背景技术
纳米材料具有与宏观物质显著不同的体积效应、表面效应、量子尺寸效应及介电限域效应，从而具有特殊的磁、光、声、热、电及超导性质，被有效地应用于生物传感、环境科学、化学成分检测等诸多领域。目前纳米铜材料因其独特的物理化学性质，被广泛地应用于导电材料、催化剂、润滑、微电子器件、医药等领域。
目前以不同的修饰剂保护合成了多种铜量子点，例如以十二烷基硫酸钠等微乳剂作为保护剂，合成了最大发射波长小于400nm的铜量子点；以较高浓度的牛血清白蛋白包裹合成的铜量子点，其最大发射波长在410nm左右；以双链或者单链DNA介导合成的铜量子点，其最大发射波长在600nm左右，且其性质与碱基的顺序组成及链长有关。合成的这些铜量子点的最大发射波长均小于400nm或者在600nm左右，很少有合成荧光发射在400～600nm附近的纳米铜材料。
发明内容
发明目的：目的在于提供一种基于蛋白质合成铜量子点的方法，所合成的铜量子点的最大发射波长在550nm左右，并且实现了对蛋白质或者纳米铜溶胶的灵敏检测。
技术手段：为实现上述技术目的，本发明提出了一种基于蛋白质合成铜量子点的方法，包括如下步骤：
(1)合成聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米铜溶胶：配制硫酸铜水溶液，在磁力搅拌下加入聚乙烯吡咯烷酮，水浴加热至80～100℃，45～50min后，缓慢滴入(优选地，滴速为50滴/min)水合肼，充分反应，45～50min后，得到聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米铜溶胶；
(2)用聚丙烯酰胺凝胶分别固定不同的蛋白质，加入步骤(1)得到的纳米铜溶胶中浸泡3h；
(3)将步骤(2)得到的固定有蛋白质和纳米铜溶胶的聚丙烯酰胺凝胶，于310±10nm的紫外波长下照射，即可得到不同荧光性质的铜量子点。
具体地，配制硫酸铜水溶液的摩尔浓度为2.5±0.1mM/L，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为0.01125±0.001g/mL，加入的水合肼的终体积浓度为5.0±0.1％。
步骤(2)中，用聚丙烯酰胺凝胶分别固定不同的蛋白质的方法为：将丙烯酰胺凝胶储备液：过硫酸铵溶液：TEMED：蛋白质溶液按照体积比为4:0.15:0.015:12进行混合制备得到，其中，所述的丙烯酰胺凝胶储备液的浓度为30.0±0.1mg/mL，过硫酸铵溶液的质量体积浓度为10.0±0.1g/mL，所述的蛋白质溶液的质量体积浓度为2.0±0.1mg/mL。
优选地，所述的蛋白质为人血清白蛋白、溶菌酶和过氧化氢酶中的任意一种。
通过上述方法得到的铜量子点同样在本发明的保护范围之内。
本发明进一步提出了上述制备得到的铜量子点在制备生物传感器中的应用。
本发明还提出了上述制备得到的铜量子点在荧光检测生物法分子中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)制备的铜量子点粒径均匀，利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛作用，使得粒径较均匀的铜纳米粒子渗透到凝胶孔径中去，进而与蛋白质发生相互作用，合成铜量子点；
(2)最大发射波长在550nm左右，蛋白质的种类不一样，最终合成的铜量子点的最大发射波长也不一样；
(3)可以实现纳米铜溶胶和蛋白质的定量检测。
附图说明
图1为纳米铜溶胶的光谱图，其中，右上角所示为其在日光灯(左)和紫外灯(下)右的图片；
图2为纳米铜溶胶的透射电镜图；
图3为纳米铜溶胶的粒径分布图，粒径大小为2.45±0.56nm；
图4为聚丙烯酰胺凝胶固定三种不同的蛋白质，纳米铜溶胶浸泡处理后的荧光图，其中，A：人血清白蛋白，B:过氧化氢酶，C:溶菌酶，上层为荧光强度图，下层为荧光颜色图；
图5为纳米铜溶胶的定量检测图，以溶菌酶为例，纳米铜溶胶的浓度分别为0.06、0.12、0.19、0.31、0.62、1.24、2.50、5.00mM，检测限是0.06mM，线性检测范围是0.06～0.62mM；
图6为蛋白质溶液的定量检测图，以溶菌酶为例，其浓度分别为1.40、6.94、17.4、34.7、52.1、69.4、104.2、138.9、347.2μM，检测限是1.40μM，线性检测范围是1.40～69.4μM。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的试剂、耗材，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)均购于华美生物工程公司；过硫酸铵购于国药化学试剂公司；过氧化氢酶购于Sigma，人血清白蛋白、溶菌酶、无水硫酸铜(CuSO4)、聚乙烯吡咯烷酮(poly(N-vinyl-2-pyrrolidone)，PVP)、硫酸钴、硫酸镍、水合肼均购于北京欣科中晶生物有限公司。
下述实施例中所用的荧光成像仪器为凝胶生物成像系统(Vilber Fusion SL4型，中国北京五洲东方科技发展有限公司)，紫外可见分光光度计(TU-1901型，中国北京普析通用有限公司)，荧光光谱仪(LS-55型，美国珀金埃尔默仪器有限公司)。
文中所述二次水(电导率为18.2MΩ)即为超纯水。
下面通过具体的实施例详细说明本发明。
实施例1纳米铜溶胶的合成及表征。
(1)以无水硫酸铜为原料，称取0.0080g，加入5mL去离子水中，配成硫酸铜水溶液；在磁力搅拌下，加入聚乙烯吡咯烷酮0.2250g，水浴加热至80～100℃，45～50min后，缓慢滴入水合肼，所加入的水合肼的体积浓度(终浓度)为5.0±0.1％，反应，45～50min后，得到紫红色的纳米铜溶胶；
(2)将上述合成的纳米铜溶胶放入比色皿中，使用荧光光谱仪进行荧光表征(光谱图如图1所示)，并拍摄其放在日光灯和紫外灯下的图片(如图1右上角所示)；
(3)将上述合成的纳米铜溶胶稀释102倍，透射电镜下观察其粒径大小并进行粒径分布的统计分析，结果如图2和图3所示。该铜溶胶粒径在2nm左右，包裹表面活性剂-聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，为水溶性，粒径大小为2.45±0.56nm。实施例2聚丙烯酰胺凝胶固定不同蛋白质的制备。
(1)各组分溶液的配制：
30％的丙烯酰胺凝胶储备液的配制：29.2g丙烯酰胺和0.80g Bis，加去离子水80mL溶解，超声，定容至100mL，过滤，4℃储存备用；
10％的过硫酸铵溶液(m/v)的配制：0.10g过硫酸铵，加去离子水1mL溶解，现用现配；
蛋白质溶液的配制：分别称取上述三种蛋白质12.0mg，分别溶于去离子水中，混匀，4℃储存备用，最终得到上述三种蛋白质溶液的浓度均为2.0mg/mL。(2)烯酰胺凝胶固定不同蛋白质的制备：
将30％的丙烯酰胺凝胶储备液：10％的过硫酸铵溶液：TEMED：蛋白质溶液的体积比为4:0.15:0.015:12进行混合，制备得到分别固定有上述三种蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶。
(3)烯酰胺凝胶固定三种不同的蛋白质后荧光强度数据的采集
将步骤2中得到的凝胶放在凝胶成像系统的暗箱中，紫外光源下(312±10nm)进行激发，选择曝光时间为5s，进行数据采集，结果如表1所示。
表1
实施例3基于蛋白质合成铜量子点。
使用实施例1中合成的纳米铜溶胶，对实施例2中制备的固定有不同蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶进行浸泡，纳米铜溶胶与凝胶的体积比是3:4～1:1，3小时后，采集荧光强度数据，结果如表1所示，其荧光强度图(上层)和荧光颜色图(下层)如图4所示，其中A为人血清白蛋白，B为过氧化氢酶，C为溶菌酶。
实施例4纳米铜溶胶的定量检测。
保持蛋白质溶液的浓度不变，配制一系列不同浓度的纳米铜溶胶(浓度分别为0.06、0.12、0.19、0.31、0.62、1.24、2.50、5.00mM)，采集其对同一蛋白质(聚丙烯酰胺凝胶固定的)的荧光响应值，最终实现对纳米铜溶胶的定量检测，以溶菌酶与铜溶胶为例，如图5a和5b所示，对纳米铜溶胶的检测限为0.06mM，线性检测范围为0.06～0.62mM，y＝5.81531+30.19092x,R＝0.99259。这种检测方法简单、快速，成本低，无生物毒性，是基于荧光强度和荧光颜色的双读出检测，具有选择性和可视性。
实施例5蛋白质浓度的定量检测。
保持纳米铜溶胶的浓度不变，配制一系列不同浓度的蛋白质溶液(浓度分别为1.40、6.94、17.4、34.7、52.1、69.4、104.2、138.9、347.2μM)，按照实施例2制备固定有不同浓度蛋白质的凝胶，采集其对同一浓度纳米铜溶胶的荧光响应值，以溶菌酶与铜溶胶为例，结果如图6a和6b所示，对溶菌酶的检测限为1.40μM，线性检测范围为1.40～69.4μM，y＝2.31849+0.7054x,R＝0.98134。这种检测是基于荧光强度和荧光颜色的双读出检测，具有选择性和可视性，且其相比起传统的荧光探针标记方法，没有背景干扰。
综上所述，本发明首先采用液相还原法，以无水硫酸铜作为氧化剂，水合肼作为还原剂，外加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为分散剂，在80～100℃水浴条件下，发生氧化还原反应生成紫红色的纳米铜溶胶，此铜溶胶在特定波长的紫外激发下发微弱的蓝色荧光；然后，当与聚丙烯酰胺凝胶固定的蛋白质相互作用后，其荧光强度明显增强，且发生荧光颜色的变化，例如与人血清白蛋白作用后发蓝紫色荧光，与过氧化氢酶作用后发粉黄色荧光，与溶菌酶作用后发橙红色荧光。该方法简单、快速，成本低，无生物毒性，可用于生物传感器，为荧光检测生物大分子提供新的途径。

Claims (4)

1.一种基于蛋白质合成铜量子点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米铜溶胶：配制硫酸铜水溶液，在磁力搅拌下加入聚乙烯吡咯烷酮，水浴加热至80～100℃，45～50min后，缓慢滴入水合肼，充分反应，45～50min后，得到聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米铜溶胶；
(2)用聚丙烯酰胺凝胶分别固定不同的蛋白质，固定不同的蛋白质的方法为：将丙烯酰胺凝胶储备液：过硫酸铵溶液：TEMED：蛋白质溶液按照体积比为4:0.15:0.015:12进行混合从而固定对应的蛋白质，其中，所述的丙烯酰胺凝胶储备液的浓度为30.0±0.1mg/ml，过硫酸铵溶液的质量体积浓度为10.0±0.1g/ml，所述的蛋白质溶液的质量体积浓度为2.0±0.1mg/mL，蛋白质为人血清白蛋白、溶菌酶和过氧化氢酶中的任意一种；丙烯酰胺凝胶储备液通过如下方法配制：29.2g丙烯酰胺和0.80g Bis，加去离子水80mL溶解，超声，定容至100mL，过滤，4℃储存备用；加入步骤(1)得到的纳米铜溶胶中浸泡3～4h，其中，纳米铜溶胶与聚丙烯酰胺凝胶的体积比是0.75～1：1；
(3)将步骤(2)得到的固定有蛋白质和纳米铜溶胶的聚丙烯酰胺凝胶，于310±10nm的紫外波长下照射，即可得到荧光性质不同的铜量子点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制硫酸铜水溶液的摩尔浓度为2.5±0.1mM/L，聚乙烯吡咯烷酮的质量浓度为0.01125±0.001g/mL，加入的水合肼的终体积浓度为5.0±0.1％。
3.根据权利要求1～2任一项所述的方法制备得到的铜量子点。
4.权利要求3所述的铜量子点在蛋白质浓度定量检测中的应用。
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Denomination of invention: Synthesis of copper quantum dots based on protein and its application

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