CN105038771B - 一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种谷胱甘肽‑金银合金纳米材料及其制备方法与应用，制备方法包括以下步骤：先制备银纳米粒子溶液；然后添加谷胱甘肽在65‑70°C下油浴反应40‑50h后加去离子水搅拌均匀；再加入氯金酸溶液搅拌、离心处理后上清液与过量的甲醇溶液混合反应，再次离心处理得到的沉淀物用PBS缓冲溶液重新溶解，即得到谷胱甘肽‑金银合金纳米材料溶液；可用于对组氨酸的定量检测和对人绒毛膜促性腺激素的免疫分析。本发明的制备方法简单方便，采用了谷胱甘肽作为还原剂和稳定剂，避免了毒性试剂的使用，具备环境友好性。本发明制备的谷胱甘肽‑金银合金纳米材料结构稳定均匀，分散性好和具有强烈的荧光特性，可用于各种生物样品的分析检测及其他相关功能材料检测。

Description

一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及无机纳米材料技术领域，尤其涉及一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

在近年的纳米材料研究中，贵金属纳米材料在对于DNA，蛋白质，金属离子，过氧化氢，有毒性的阴离子和硫醇类物质的检测中逐渐显示出它的优越性，也吸引研究者越来越多的兴趣。但同时，一系列的制备方法，如使用多元醇和微波协助都会在制备基于金或银的纳米材料中得到应用。然而，这些制备方法不仅需要高温反应，更因为需要使用微波发生器而产生诸多不便。与单金属组分的形式相比，多组分的纳米材料如金银纳米合金材料凭借着其微观纳米结构容易控制的优点，有潜力为生物生化提供一种具有明显优越性的分析方法。

此外，由于具有更大的比表面积和更易于进行表面修饰的优点，金银合金纳米材料相比其他材料在实际应用上具有更大的潜力。而与一些传统的有机染料相比，该材料具有优异的稳定性和明显的强荧光特性。但是目前制备出来的金银合金纳米簇稳定性和均匀性都很难控制，工艺复杂，而且大多数生产方法都采用有毒试剂，不利于人的身体健康，也不环保，不适合实际生产应用。因此，如何制备一种操作相对简单而且环境友好的，均匀稳定，并适合广泛应用的金银合金纳米材料是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备方法以解决现有制备方法稳定性和均匀性难控制，工艺复杂而且不环保的问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：

一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，制备银纳米粒子溶液。

步骤二，将谷胱甘肽加入步骤一所得银纳米粒子溶液中，然后在65-70°C下油浴反应40-50h后得到浅橙色的溶液，即用谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液（谷胱甘肽-银纳米粒子）；加去离子水搅拌均匀。油浴反应是一个内核蚀刻过程，反应的温度和时间对用谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液的稳定性和均匀性有很大影响。加去离子水可以更好的分散谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液，使其更容易与下一步加入的氯金酸溶液发生反应。

步骤三，再缓慢的逐滴滴加氯金酸溶液搅拌均匀。接着离心处理得到沉淀物AgCl和上清液。加氯金酸溶液是一个还原反应过程。

步骤四，将步骤三所得上清液与过量的甲醇溶液混合反应后在离心处理即得到用谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料沉淀物。上清液与过量的甲醇溶液混合反应的目的是用甲醇溶液将目标物用谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料析出。甲醇溶液的去离子水与甲醇的体积比为1:4时谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料析出效果最佳。

步骤五，将步骤四所得沉淀物用适量的PBS缓冲溶液重新溶解得到用谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料溶液（谷胱甘肽-金银合金纳米材料）。在2-4°C下保存。

进一步的，步骤一所述银纳米粒子溶液的制备方法包括以下步骤：首先将硝酸银溶液和柠檬酸三钠溶液加入去离子水中混合搅拌均匀；再加入新鲜配制的硼氢化钠溶液混合搅拌至反应完全，得到银纳米粒子溶液。

进一步的，所述谷胱甘肽、银纳米粒子和氯金酸物质的量之比为1:5.2:10-1:5.5:10。

进一步的，步骤五所述PBS缓冲溶液pH值为7.40，浓度为5-10 mM，含有0.6-0.9%NaCl。

进一步的，所述硝酸银溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液物质的量之比为1:1:1.2-1:1:1.5。

本发明的第二个目的在于提供一种用上述方法制备的谷胱甘肽-金银合金纳米材料。

本发明的第三个目的在于提供上述谷胱甘肽-金银合金纳米材料的应用，以促进谷胱甘肽-金银合金纳米材料的广泛应用。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料的应用，主要用于对组氨酸的定量检测和对人绒毛膜促性腺激素的免疫分析。

进一步的，所述对组氨酸的定量检测包括以下步骤：

步骤一，将用PBS缓冲液配制的谷胱甘肽-金银合金纳米材料与铜离子溶液充分混合；

步骤二，再加入不同体积的组氨酸溶液，室温下培育；

步骤三，最后进行荧光光谱表征测试，检测条件可以为：激发光波长为390 nm，扫描范围为500~700 nm，激发光和发射光狭缝宽度均为10 nm，扫描速率为1200 nm/min，光电倍增管电压为700 V。

基本原理就是借助铜离子与组氨酸特异性的高强度结合，将铜离子在原反应体系中争夺过来，从而实现对组氨酸的定量灵敏检测。

进一步的，所述对人绒毛膜促性腺激素的免疫分析包括以下步骤：

步骤一，分别对谷胱甘肽-金银合金纳米材料和磁性纳米粒子进行表面修饰；

步骤二，将表面修饰过的谷胱甘肽-金银合金纳米材料与不同标准浓度的人绒毛膜促性腺激素抗体溶液在25-37°C下培育到反应达到平衡；

步骤三，将表面修饰过的磁性纳米粒子与步骤二所得混合物进行培育；随后，一个“三明治”式的连接物形成，并带有磁性，最后对混合物进行测性分离，得到的上清液用于进行荧光分析检测；

步骤四，对步骤三所得混合物进行磁性分离，将得到的上清液进行荧光分析检测，检测条件为：激发光波长为390 nm，扫描范围为500~700 nm，激发光和发射光狭缝宽度均为10 nm，扫描速率为1200 nm/min，光电倍增管电压为700 V。

基本原理是利用抗原-抗体的特异性结合能力，以及磁性纳米粒子的强磁性，可以实现对目标检测物的特异性检测。

与现有技术相比，本发明的制备方法简单方便，采用了谷胱甘肽作为还原剂和稳定剂，避免了毒性试剂的使用，具备环境友好性。而且制备出来谷胱甘肽-金银合金纳米材料结构稳定均匀，分散性好和强烈的荧光特性，可实际应用于各种生物样品（如组氨酸和人绒毛膜促性腺激素等）的分析检测上，包括一些免疫检测，氨基酸检测及其他相关的功能材料检测应用领域。

附图说明

图1为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备过程示意图。

图2为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的三维荧光图谱。

图3为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的 TEM图。

图4为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的粒径分布图。

图5为氯金酸加入量对谷胱甘肽-金银合金纳米材料的荧光强度优化关系图。

图6为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的稳定性测试示意图。

图7为谷胱甘肽-金银合金纳米材料的EDS测试示意图。

图8为谷胱甘肽，谷胱甘肽-银纳米粒子和谷胱甘肽-金银合金纳米材料红外对比图；其中GSH为谷胱甘肽，GSH-AgNPs 为谷胱甘肽-银纳米粒子，GSH-AgAuNAs为谷胱甘肽-金银合金纳米材料。

图9为银纳米粒子，谷胱甘肽-银纳米粒子和谷胱甘肽-金银合金纳米材料紫外对比图；其中AgNPs为银纳米粒子，GSH-AgNPs 为谷胱甘肽-银纳米粒子，GSH-AgAuNAs为谷胱甘肽-金银合金纳米材料。

图10为AgCl的XRD图谱。

图11为AgCl的SEM图。

图12为谷胱甘肽-金银合金纳米材料检测不同浓度组氨酸的荧光光谱图，组氨酸的浓度从2μM到150μM。

图13为组氨酸的浓度与荧光强度变化图；组氨酸的浓度从2μM到150μM，插图为浓度为0-45μM的放大图。

图14为谷胱甘肽-金银合金纳米材料对HCG的免疫分析荧光光谱图，HCG的浓度从a-i分别为 0, 0.5, 1, 5, 10, 100, 200, 400 和 600 ng•mL^-1。

图15为HCG的浓度与荧光强度变化图；HCG的浓度从a-i分别为 0, 0.5, 1, 5,10, 100, 200, 400 和 600 ng•mL^-1。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备方法如图1所示，包括以下步骤：

步骤一，将 2.5mL，100mM 的硝酸银溶液和2.5mL，100mM的柠檬酸三钠溶液加入到39mL的去离子水中，均匀搅拌。

步骤二，将6mL，50mM新鲜配制的硼氢化钠溶液加入到步骤一中的混合溶液当中，不停搅拌14h后，得到银纳米粒子溶液。

步骤三，将307.3mg的谷胱甘肽粉末加入到步骤二所得银纳米粒子溶液当中，随后对混合物在70°C下，油浴反应50h，得到浅橙色的溶液，即用谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液。

步骤四，将4mL步骤三的谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液加入到10.8mL的去离子水中，均匀搅拌；然后在室温下缓慢逐滴加入1.2mL，10mM的氯金酸溶液（HAuCl₄•4H₂O），继续不停搅拌25min，然后在15000rpm下，离心25min，得到沉淀物（AgCl）和上清液。

步骤五，将步骤四所得上清液与过量的甲醇溶液进行彻底的混合反应，再在15000rpm下离心35min得到沉淀物。甲醇溶液中去离子水与甲醇的体积比为1:4。

步骤六，将步骤五所得沉淀物用适量的pH7.40，5mM并含有0.6%的NaCl的PBS缓冲溶液重新溶解，最后保存在2°C下，即可以得到谷胱甘肽-金银合金纳米材料溶液。

实施例2

谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备方法如图1所示，包括以下步骤：

步骤一， 2.64mL，100mM 的硝酸银溶液和2.64mL，100mM的柠檬酸三钠溶液加入到41.25mL的去离子水中，均匀搅拌。

步骤二，将7.93mL，50mM新鲜配制的硼氢化钠溶液加入到步骤一中的混合溶液当中，不停搅拌12h。搅拌过夜后，得到银纳米粒子溶液。

步骤三，307.3mg的谷胱甘肽粉末加入到步骤二所得银纳米粒子溶液当中，随后对混合物在65°C下，油浴反应40h，得到浅橙色的溶液，即用谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液。

步骤四，将4mL步骤三的谷胱甘肽稳定的银纳米粒子溶液加入到10.8mL的去离子水中，均匀搅拌；然后在室温下缓慢逐滴加入1.2mL，10mM的氯金酸溶液（HAuCl₄•4H₂O），继续不停搅拌20min，然后在14000rpm下，离心20min，得到沉淀物（AgCl）和上清液。

步骤五，将步骤四所得上清液与过量的甲醇溶液进行彻底的混合反应，再在14000rpm下离心25min得到沉淀物。甲醇溶液中去离子水与甲醇的体积比为1:4。

步骤六，将步骤五所得沉淀物用适量的pH7.40，10mM并含有0.9%的NaCl的PBS缓冲溶液重新溶解，最后保存在4°C下，即可以得到谷胱甘肽-金银合金纳米材料溶液。

实施例3

将按照实施例1和实施例2的方法制备得到的谷胱甘肽-金银合金纳米材料进行进行TEM，荧光，红外，紫外以及XRD和SEM的相关表征。

如图2所示的谷胱甘肽-金银合金纳米材料的三维荧光图谱。从图中可以看出，本发明制备的金银合金荧光纳米材料具有相对较强的荧光特性。

如图3和图4所示的谷胱甘肽-金银合金纳米材料的TEM图和粒径分布图，在谷胱甘肽作为稳定剂和表面保护剂的情况下，金银合金纳米材料均匀稳定的分布，并且粒径分布均匀，大小约为28.5nm。

如图5所示不同的加入量氯金酸（400μL、600μL、800μL、1000μL、1200μL、1400μL、1600μL、1800μL和2000μL）对谷胱甘肽-金银合金纳米材料的荧光强度优化关系图。从图中可以看出，选择1.2mL，10mM的氯金酸溶液是制备谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料的最佳用量。

如图6所示时间对谷胱甘肽-金银合金纳米材料的稳定性测试示意图。从图中可以看出，本发明的谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料具备相当的稳定性，能长时间放置而对其荧光特性没有太大的影响。

如图7所示谷胱甘肽-金银合金纳米材料的EDS测试示意图。从图中可以看出，金和银的含量相对较高。

图8为谷胱甘肽（GSH），谷胱甘肽-银纳米粒子（GSH-AgNPs）和谷胱甘肽-金银合金纳米材料（GSH-AgAuNAs）红外对比图。可以看出，在波数为2530cm^-1的峰位置，出现明显的对比，说明在GSH-AgAuNAs的制备过程中，GSH已经成功地覆盖在其表面。

图9为银纳米粒子（AgNPs），谷胱甘肽-银纳米粒子（GSH-AgNPs）和谷胱甘肽-金银合金纳米材料（GSH-AgAuNAs）紫外对比图。可以看出AgNPs在390nm处出现一明显的吸收特征峰，说明在制备过程中的确生成了AgNPs。

图10和图11分别为AgCl的XRD图谱和SEM图。XRD的图谱特征与文献报道的标准图谱一致，说明加入的氯金酸已经成功地用于谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料的制备中。

具体实施例4

将按照实施例1和实施例2的方法制备得到的谷胱甘肽-金银合金纳米材料进行组氨酸的检测， 包括以下步骤：

1）将100μL的用PBS缓冲液（pH7.40，10mM）配制的谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料（GSH-AgAuNAs）溶液与300 μL，10mM的铜离子溶液充分混合；

2）然后在加入不同体积的，1mM的组氨酸溶液，最终反应体积为1mL，室温下培育20-30 min；

3）最后在荧光分光光度计上进行扫描测试。激发光波长为390nm，扫描范围为500~700nm，激发光和发射光狭缝宽度均为10nm，扫描速率为1200nm/min，光电倍增管电压为700V。

检测结果如图12和图13所示，随着组氨酸的浓度从2μM到150μM依次增加，荧光强也对应变强。说明谷胱甘肽-金银合金纳米材料可以对组氨酸进行定量检测。

具体实施例5

将按照实施例1和实施例2的方法制备得到的谷胱甘肽-金银合金纳米材料与磁性纳米粒子进行对目标物人绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫分析。具体操作如下：

1）先分别对谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料（GSH-AgAuNAs）和磁性纳米粒子完成表面修饰后；

2）将1.5mL的已经功能化的谷胱甘肽稳定的金银合金纳米材料（GSH-AgAuNAs）与1mL加有不同标准浓度的HCG抗体溶液进行均匀混合反应，该混合物在25-37°C下培育1.5-2.5h，直至反应达到平衡；

3）然后，将0.5mL的已经修饰完成的磁性纳米粒子与上述的混合物进行培育反应25 -30min，随后，一个“三明治”式的连接物形成，并带有磁性；

4）最后对混合物进行磁性分离，得到的上清液用于进行荧光分析检测。该荧光分析参数设置为：激发光波长为390nm，扫描范围为500~700nm，激发光和发射光狭缝宽度均为10nm，扫描速率为1200nm/min，光电倍增管电压为700V。

检测结果如图14和15所示， 随着HCG的浓度a-i从0到 600ng•mL^-1依次增强，荧光强度也对应增强。说明谷胱甘肽-金银合金纳米材料可以对目标物人绒毛膜促性腺激素进行免疫分析。

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种谷胱甘肽-金银合金纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，制备银纳米粒子溶液；

步骤二，将谷胱甘肽加入步骤一所得银纳米粒子溶液中，然后在65-70°C下油浴反应40-50h后加去离子水搅拌均匀；

步骤三，再加氯金酸溶液搅拌均匀；接着离心处理，得到沉淀物AgCl和上清液；

步骤四，将步骤三所得上清液与过量的甲醇溶液混合反应后再次离心处理，得到的沉淀物；

步骤五，将步骤四所得沉淀物用适量的PBS缓冲溶液重新溶解。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一所述银纳米粒子溶液的制备方法包括以下步骤：首先将硝酸银溶液和柠檬酸三钠溶液加入去离子水中混合搅拌均匀；再加入新鲜配制的硼氢化钠溶液混合搅拌至反应完全。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽、银纳米粒子和氯金酸的物质的量之比为1:5.2:10-1:5.5:10。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤五所述PBS缓冲溶液pH值为7.40，浓度为5-10 mM，含有0.6-0.9%NaCl。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硝酸银溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液的物质的量之比为1:1:1.2-1:1:1.5。

6.一种根据权利要求1-5任一项所述制备方法制备的谷胱甘肽-金银合金纳米材料。

7.根据权利要求6所述谷胱甘肽-金银合金纳米材料的应用，其特征在于，用于对组氨酸的定量检测和对人绒毛膜促性腺激素的免疫分析。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述对组氨酸的定量检测包括以下步骤：

步骤一，将用PBS缓冲液配制的谷胱甘肽-金银合金纳米材料与铜离子溶液充分混合；

步骤二，再加入不同体积的组氨酸溶液，室温下培育；

步骤三，最后进行荧光光谱表征测试。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述对人绒毛膜促性腺激素的免疫分析包括以下步骤：

步骤一，分别对谷胱甘肽-金银合金纳米材料和磁性纳米粒子进行表面修饰；

步骤二，将表面修饰过的谷胱甘肽-金银合金纳米材料与不同浓度的人绒毛膜促性腺激素抗体溶液在25-37°C下培育；

步骤三，将表面修饰过的磁性纳米粒子与步骤二所得混合物进行培育；

步骤四，对步骤三所得混合物进行磁性分离，将得到的上清液进行荧光分析检测。