CN104345053A - 一种检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测血清肌酐的金纳米粒子（AuNPs）生物传感器及其制备方法，包括：（1）制备AuNPs溶液；（2）加入GSH溶液作为抗聚集剂，混合均匀，对AuNPs进行表面保护；（3）分别加入不同浓度的标准血清肌酐溶液，利用荧光分光光度计进行比色和定量检测，得出血清肌酐浓度与共振光散射(RLS)强度的关系曲线，即得到所述金纳米粒子生物传感器。GSH能在AuNPs的表面形成保护层，降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度，在合适的GSH浓度下，加入不同浓度的血清肌酐溶液，AuNPs溶液体系呈现颜色渐变的现象；同时利用AuNPs分散状态或聚集程度与RLS强度的关系，可实现对血清肌酐的定量检测。本发明的可视化测定和RLS强度检测血清肌酐的方法具有简单快速、实用性强等优点。

Description

一种检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及分析化学与纳米材料光谱分析领域，具体涉及一种检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器及其制备方法。

背景技术

近年来，金纳米粒子（AuNPs）作为一种生物化学纳米传感探针，凭借着简单快速、容易合成、高比表面积和独特的光学性质等优点，越来越受到研究者的关注。同时，金纳米粒子的分散状态（酒红色）或聚集状态（蓝色）又能作为比色分析的重要依据。比色分析法是开始于十九世纪三、四十年代的一种定量分析的方法，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

共振光散射（RLS）技术是在1993年由Pasternack等提出的、在普通荧光分光光度计上进行的检测技术，最早应用于生化分析中，因其具有简便、快速、灵敏度高等一系列的优点，也被应用于其它领域，如：药物分析、纳米材料等。共振光散射技术是一种利用光散射现象建立的测试方法。光散射指的是当光束通过某种介质时，从入射光方向以外所观察得到的现象，该现象广泛地存在于光与粒子的作用当中。当介质中的电子受到光电磁波的电场振动时，形成偶极振子，偶极振子从而向各个方向发射电磁波，即为光散射波。显然，散射波会随着介质粒径大小而产生不同。当粒径（r）远大于入射光波长（λ₀）时，产生的散射可看作是反射和折射；如果粒径与入射光波长接近，便产生丁达尔（Tyndall） 散射；如果粒径很小，且20r ≤λ₀ 时，则产生以瑞利散射为主的分子散射。在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器后所得的同步光谱(△λ=0nm)即为散射粒子的共振光散射光谱(RLS)。共振光散射光谱法只需要普通荧光分光光度计，调节激发光波长和发射光波长相等，即可获得待测组分所引起的共振光散射强度。大量数据实验表明，共振光散射强度与共振光散射粒子的浓度在一定范围内有线性关系，据此可直接进行定量分析。

肌酐是一种含氮的有机非蛋白类化合物，是肌酸分解代谢的最终产物，包括血清肌酐和尿肌酐。人体血清肌酐的含量直接反映肾功能的健康程度。在临床医学检验中，血清肌酐的含量是检验肾功能的其中一个特异性指标。当肾脏机能受损时，血清肌酐的正常排泄受到阻碍，使血清肌酐含量增加，即血清中肌酐含量升高意味着肾功能受到损害，故血清肌酐的测定在临床诊断中有非常重要的意义。人类血清肌酐的合理生理浓度为40~150 μmol/L，当血清肌酐浓度超过150 μmol/L，说明血清肌酐浓度过高，表明此时肾脏已经受到一定程度的损害；当血清肌酐浓度超过250 μmol/L，就需要进行肾透析。目前为止，血清肌酐的浓度在临床上仍然是一个决定是否需要进行肾脏透析的重要参考指标。

目前测定血清肌酐的主要方法有化学测定法（碱性苦味酸法）、非酶电化学生物传感法、电化学分析法、拉曼散射法、毛细管电泳法、同位素稀释质谱法、基于纳米安培电流生物传感法及高效液相层析法等。这些方法在血清肌酐的检测上虽然都显示出一定的灵敏度和选择性，但是仍然存在着许多缺陷，如：实验操作和样品前处理复杂、耗时，特异性差，需要昂贵的仪器等。因此，开发快速简单、低成本且具有良好性能和较宽线性范围的传感器是必要的，其对肾病患者会起到积极的作用，且对于血清肌酐分析方法的发展及其在生物化学、药学和临床上的应用都具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器的制备方法的制备方法。

 具体地，该制备方法包括以下步骤：

（1）制备金纳米粒子溶液；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液作为抗聚集剂，混合均匀，对金纳米粒子进行表面保护；

（3）分别加入不同浓度的标准血清肌酐溶液，利用荧光分光光度计进行定量检测，得出血清肌酐浓度与共振光散射强度的关系曲线图，即得到所述的金纳米粒子生物传感器。

金纳米粒子（AuNPs）在水溶液中的状态与共振光散射（RLS）强度存在一定的关系，分散状态下的AuNPs其体系RLS强度较低，而处于聚集状态下的AuNPs其体系的RLS强度则明显增加。本发明人发现血清肌酐能使AuNPs发生聚集，当金纳米颗粒聚集到一定的程度，金纳米粒子的粒径就会改变，导致RLS强度增加，AuNPs溶液的颜色也会发生明显变化，该性质是本发明进行比色分析的依据。但是，本发明人同时发现微量的血清肌酐即可引起缺少表面保护的AuNPs发生剧烈聚集，意味着此时缺少保护的AuNPs溶液，其RLS强度及颜色变化对肌酐浓度的改变缺乏辨析度，也就是说，即使肌酐的浓度继续加大，其RLS强度的增加值和AuNPs溶液颜色依然与加入微量肌酐所得到的结果一样。

谷胱甘肽是一种低分子量的硫醇，可分为氧化型（GSSG）和还原型（GSH），来源于大多数哺乳动物的组织。在本制备方法中，利用的是还原型谷胱甘肽。当具有硫醇基的GSH加入到AuNPs溶液中时，其很容易附着到金纳米粒子的表面，能在金纳米粒子表面形成一个保护层，可以降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度，即在本制备方法中GSH作为金纳米粒子的抗聚集剂和保护剂。由此，本发明人发现在合适的GSH浓度下，不同浓度的血清肌酐能使AuNPs体系发生不同程度的聚集，由此呈现从红色到蓝色，有明显梯度的颜色变化。与此同时，因为共振光散射信号强度是由样品的聚集程度决定的，因此，GSH的加入使得RLS的增加值与血清肌酐浓度呈正比，据此实现对血清肌酐的定量检测。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，其中所述金纳米粒子的粒径范围为16.5 ± 2.5 nm。如前所述，共振光散射与介质的粒径大小直接相关，散射波会随着介质粒径大小而产生不同。在本发明的制备方法中，金纳米粒子的粒径范围在16.5 ± 2.5 nm时， AuNPs溶液颜色改变对血清肌酐浓度的变化最为灵敏和稳定，所测得的RLS的强度增加值与血清肌酐浓度间存在良好的线性关系。如果金纳米粒子的粒径大于19nm或小于14nm，RLS的增加值和AuNPs溶液颜色改变对血清肌酐浓度的变化不够灵敏。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，其中所述金纳米粒子与所述还原型谷胱甘肽的含量关系为每0.5ml浓度为0.5×金纳米粒子溶液中加入0.2ml浓度为1μM的还原性谷胱甘肽溶液。0.5mL的AuNPs能在最大程度上满足本发明对实现血清肌酐梯度颜色变化检测的要求，因此，本发明优选AuNPs的含量为0.5ml。同时，本发明人经过条件优化实验发现，若AuNPs为0.5ml，当GSH（1μM）的含量低于0.2ml时（例如，0.15mL），AuNPs表面的GSH浓度较低，不能提供有效的保护，导致AuNPs聚集程度较大，不能显示出良好的梯度变化和定量分析范围；当GSH（1μM）的含量高于0.2mL（例如，0.3mL）时，AuNPs表面的GSH浓度较高，导致AuNPs的抗聚集效果明显，不能满足肌酐的比色和RLS定量分析要求，因此，0.2mL的GSH（1μM）被选为0.5ml AuNPs的最佳抗聚集剂含量。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，其中所述金纳米粒子溶液的制备方法如下：

（1）将氯金酸溶液煮沸；

（2）加入柠檬酸三钠溶液，继续搅拌煮沸约10 min；

（3）停止加热，搅拌约20 min至溶液冷却至室温，即得到金纳米粒子溶液。

制备得到的金纳米粒子溶液的浓度可依靠紫外可见分光光度计于521 nm处的吸光度来实现定量，当金纳米粒子在521 nm 处的吸光度为1.000 时，其浓度记作1×。通过TEM图像可以推测AuNPs的平均粒径，如前所述，金纳米粒子的最佳粒径范围为16.5 ± 2.5 nm。

本发明的另一个目的在于提供一种由本发明方法制备成的检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器，以克服现有血清肌酐检测技术中设备昂贵、特异性不强以及操作过程繁琐的缺陷。

本发明的再一个目的在于提供一种本发明制备的检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器在检测血清肌酐含量的应用方法，包括以下步骤：

（1）将pH为7.05的Britton-Robinson 缓冲液和金纳米粒子溶液均匀混合；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液，均匀混合；

（3）加入待测血清肌酐溶液，室温下培育25 min；

（4）若溶液为酒红色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度范围为0～40 μM；若溶液为紫色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度范围为40～250 μM；若溶液为蓝色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度大于250 μM。

在本应用方法中，由于GSH对AuNPs的表面保护，因此，不同浓度的血清肌酐能使AuNPs体系发生不同程度的聚集，由此呈现从红色到蓝色，有明显梯度的颜色变化。因此，可以通过体系从酒红色到紫色，再到蓝色的颜色变化来用肉眼鉴别出血清肌酐的病理临界值及其大致浓度范围，具有明显的简单快速和实用性强等优点。

本发明的再一个目的在于提供一种本发明制备的检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器在检测血清肌酐含量的应用方法，包括以下步骤：

（1）将pH为7.05的Britton-Robinson 缓冲液和金纳米粒子溶液均匀混合；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液，均匀混合；

（3）加入待测血清肌酐溶液，室温下培育25 min；

（4）将溶液置于荧光分光光度计上，以相同激发和发射波长，在200～700 nm的范围内进行同步扫描，得到所述待测血清肌酐溶液的共振光散射强度；

（5）由所述血清肌酐浓度与共振光散射强度的标准曲线图，即可得出所述待测血清肌酐的浓度。 

 基于相同的原理，前一种应用方法实现的是血清肌酐的简单快速、可视化检测，得到的是血清肌酐的大致浓度范围；后一种应用方法利用共振光散射技术实现的是血清肌酐的定量检测，该定量检测血清肌酐的方法灵敏度高、线性范围较宽且成本低、操作简单。

与现有技术相比，本发明方法制备的检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器具有如下优点：1）具有较好的稳定性、重现性，对血清肌酐具有很高的特异性，不易受到检测样品中其他物质的干扰；2）利用GSH作为金纳米粒子的抗聚集剂和保护剂，使得RLS的增加值和AuNPs溶液颜色的改变对血清肌酐浓度的变化极为敏感，能有效地扩展比色检测的范围，增加体系的颜色区分度，使肉眼检测血清肌酐成为了可能；3）操作简单方便，极为快速，既能可视化检测，也可精确定量检测，满足实际应用中对于血清肌酐检测的不同需求。因此，本发明制备的金纳米粒子生物传感器在检测血清肌酐含量方面体现出良好的发展前景。

附图说明

图1为本发明制备方法的实验原理图。

图2为检测不同浓度血清肌酐溶液的共振光散射强度信号关系图。

图3为制备的金纳米粒子的透射电镜图。

图4为比色检测血清肌酐的颜色变化图。

图5为不同抗聚集剂对金纳米粒子保护性能对比效果图。

图6为共振光散射强度差值与血清肌酐浓度的分段标准曲线图。

图7为比色检测血清肌酐的紫外可见吸收光谱曲线关系图。

图8为本发明实施例制备的传感器条件优化对比效果图。

图9为还原型谷胱甘肽与其它氨基酸的详细对比实验图。

图10为本发明实施例制备的金纳米粒子生物传感器检测血清肌酐的抗干扰性能测试图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当理解，本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明巧妙利用了金纳米粒子、还原型谷胱甘肽和血清肌酐各物质之间的相互作用关系，设计出一种能够用于检测血清肌酐含量的金纳米粒子生物传感器，其检测血清肌酐含量的原理如图1所示。如图1所示，当缺少GSH保护时，微量的血清肌酐分子即可使金纳米粒子发生完全聚集，导致RLS的增加值和AuNPs溶液颜色的改变对血清肌酐浓度的变化不敏感，即RLS的增加值与血清肌酐含量之间并不存在线性关系，并且不能通过肉眼来进行肌酐含量的判断；当加入GSH时，GSH附着到金纳米粒子的表面，在金纳米粒子表面形成一个保护层，降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度。在合适的GSH浓度下，不同浓度的血清肌酐能使AuNPs体系发生不同程度的聚集，由此呈现从红色到蓝色，有明显梯度的颜色变化。与此同时，因为共振光散射信号强度是由样品的聚集程度决定的，因此，GSH的加入使得RLS的增加值与血清肌酐浓度之间存在良好的线性关系，据此实现对血清肌酐的定量检测。

实施例1  

1.制备特定粒径范围的金纳米粒子胶体溶液

取2.9 mL，10 mmol/L的氯金酸（HAuCl₄·4H₂O），以去离子水在100 mL容量瓶中稀释到刻度线，煮沸，然后加入3.5 mL，1%（wt%）柠檬酸三钠溶液，继续搅拌煮沸，10 min后，停止加热，搅拌约20 min至溶液自然冷却至室温。将制备得到的AuNPs溶液保存在4℃的环境中。利用紫外可见分光光度计于521 nm处检测最后得到的金纳米粒子溶液的吸光度，从而定量确定金纳米粒子的浓度。当金纳米粒子在521 nm 处的吸光度为1.000 时，其浓度记作1×，金纳米粒子的浓度约为15nM（紫外分光光度计测量计算所得）。通过图3的TEM图像可以推测出所制备的AuNPs的粒径范围为16.5 ± 2.5 nm。

2.制备金纳米粒子生物传感器

在1.5mL离心管中，将0.1 mL，pH 为7.05 的Britton-Robin缓冲液（伯瑞坦-罗比森缓冲溶液，在100ml三酸混合液（磷酸、乙酸、硼酸，浓度均为0.04mol/L）中，加入NaOH调节pH为7.05即可制备得到）和0.5 mL 的AuNPs溶液均匀混合，然后加入0.2 ml，10^-6 mol/L的GSH溶液，均匀混合和培育5 min；之后在各个离心管中分别加入0.2 mL，一系列不同浓度的标准血清肌酐溶液，使各个离心管中体系总体积为1.0 mL，室温下培育25 min；最后将各个离心管中的溶液置于1×1cm的荧光石英比色皿中，对其进行同步荧光（即激发波长=发射波长）扫描，扫描范围：200～700 nm，激发光狭缝宽度：2.5 nm，发射光狭缝宽度：2.5 nm，扫描速率：1200 nm/min，光电倍增管电压：600 V，得到不同浓度（0～1000μmol/L）标准血清肌酐的共振光散射光谱。

图2显示了不同扫描波长下，不同浓度的标准血清肌酐的共振光散射强度，由图2可以看出，金纳米粒子在561nm处的光散射峰可以被定义为共振光散射峰，并可以此作为定量分析的依据。本发明人测得金纳米粒子和由GSH保护的金纳米粒子溶液都呈现一较弱的RLS信号，而当肌酐加入体系中时，RLS的强度明显增加。另外，RLS的强度随着肌酐浓度的增大而增强，同时其光谱图的形状大致相同，上述的特征都说明在GSH保护的金纳米粒子和肌酐之间存在聚集反应，即GSH保护的金纳米粒子和肌酐的结合增加了散射体的数量，从而令RLS信号增强。

图6显示了血清肌酐浓度与共振光散射强度差值的分段标准曲线，由图6可以看出，在0～1000μM的范围内，本实验所使用的金纳米粒子传感器的RLS信号分别与10～250μM和250～1000μM两个肌酐浓度范围形成线性关系，两校准曲线方程如图所示。值得一提的是，肌酐浓度250μM对应着比色法测定的颜色临界点，与图4A所示的结果一致。因此，利用上述两种线性范围，本实验所提出的金纳米粒子生物传感器非常具有实际的临床应用意义。血清肌酐的检出限为1.21 μmol/L。

而且，在实验过程中，随着血清肌酐浓度的增加，用肉眼可以明显看出AuNPs溶液呈现从酒红色到紫色，再到蓝色的梯度颜色变化，实验结果如图4所示。如图4A所示，当肌酐浓度在0～10μM时，AuNPs溶液呈现酒红色，当肌酐浓度在10～250μM时，AuNPs溶液呈现紫红色，当肌酐浓度大于250μM时，AuNPs溶液呈现蓝色。图4B中1代表GSH（0.2 μM）；2～12分别代表氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，缬氨酸，组氨酸，浓度均为1μM，由图4B可以看出，除了GSH，其他氨基酸（2～12）的加入对AuNPs溶液的颜色并无明显影响。

我们利用紫外-可见光光谱分析来对该金纳米粒子传感器作进一步的性质探讨。如图7所示，当血清肌酐处于较低浓度（0和1μM）时，只有位于521nm处出现一吸收峰，而当逐渐增加血清肌酐的浓度时，在640-663nm处吸收峰强度逐渐增加，并且其在521nm处的吸收强度不断减少，从侧面证明了在GSH保护的金纳米粒子之间随着血清肌酐浓度的增加，存在着一个粒子间的聚集过程。

实施例2

1. 不同抗聚集剂对金纳米粒子的保护

  为了对金纳米粒子进行保护，使得RLS的增加值和AuNPs溶液颜色的改变对血清肌酐浓度的变化更为更具梯度变化，以便于扩展肌酐比色检测和定量分析范围，本发明人试验了各种氨基酸和GSH对金纳米粒子的保护效果，试验结果如图5和图9所示。图5中横坐标1代表GSH（0.2 μM）；横坐标2～12分别代表氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，缬氨酸，组氨酸，浓度均为1μM，由图5可以看出固定血清肌酐的浓度为100μM，可以观察到，在加入GSH和各种氨基酸后，只有加入GSH的反应体系出现一个明显的ΔI_RLS 信号（ΔI_RLS信号为加入血清肌酐后和前的，有GSH或氨基酸提供保护的金纳米粒子的RLS强度差值），意味着GSH能为金纳米粒子提供有效的保护作用，而其余各种氨基酸并不能。

图9是更加详细的对比效果图。图9中横坐标中1代表谷胱甘肽，2～12代表：氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，色氨酸，苏氨酸，缬氨酸，组氨酸。条形图上的a分别代表：1：AuNPs + 血清肌酐 (100 μM)；其余2～12：AuNPs + 各种氨基酸 (1 μM) + 血清肌酐 (100 μM)；条形图上的b分别代表：1：AuNPs + GSH (0.20μM) +血清肌酐 (100 μM)；其余2～12：AuNPs + GSH(0.20 μM) + 各种氨基酸 (1 μM) + 血清肌酐 (100 μM)。通过图9的对比，可以发现1中，加入GSH前后对比强烈，可知GSH的引入的确可以令AuNPs的RLS强度降低；另外，由2～12的氨基酸对比可知，其他各种氨基酸不起保护作用，而且GSH加入到氨基酸中，再次证明GSH的保护效果。

 2. 金纳米粒子生物传感器的条件优化

我们对GSH的用量（浓度均为1μM）进行了优化，如图8A所示。由吸收关系图可知，AuNPs体系为0.5ml，当采用0.3mL或0.15mL的GSH时（图中曲线1和3），AuNPs体系呈现红色或蓝色，因为GSH提供了过多和过少的保护效果，而采用0.2mLGSH时，体系的颜色变化符合理想预期，可以提供更明显的颜色对比效果，因此，选择0.2mL，1μM的GSH 作为抗聚集剂。

我们对体系pH值进行了优化，如图8B所示。明显地，当pH=7.05，此时AuNPs体系的ΔI_RLS达到最大值，因此我们选择pH=7.05为反应的最佳pH值。此时体系其余的反应条件为 [GSH]: 0.20 μM, [血清肌酐]: 100 μM, [AuNPs]: 0.5×。

图8C试验了不同AuNPs浓度下的体系ΔI_RLS值。可知，当AuNPs的浓度为0.5×时，AuNPs体系呈现最高的ΔI_RLS值，因此我们选择0.5×的AuNPs作为体系最优的AuNPs的浓度条件。此时体系其余的反应条件为[GSH]: 0.20μM, [血清肌酐]: 100 μM, pH7.05.

我们还对体系培育时间进行了优化，由图8D所示，最终选择25min作为体系的最优培育时间。此时体系其余的反应条件为[GSH]: 0.20 μM, [血清肌酐]: 100, 250, 500, 800, 1000 μM, [AuNPs]: 0.5×, pH7.05。

 3.抗干扰性测试

为探究本发明检测血清肌酐的金纳米粒子传感器对其他潜在物质的抗干扰性能，我们分别选取了可能与血清肌酐共存的不同的金属离子（钙离子、钠离子、锌离子、镁离子（均为50μM）；尿素（1μM）以及抗坏血酸（1μM））进行抗干扰实验。如图10所示，在GSH（0.2μM）存在的情况下，肌酐与各种金属离子、金属离子混合溶液、尿素、抗坏血酸共存时所呈现的RLS信号值都与单独加入肌酐的RLS信号值几乎一样。由此可以得出，即使体系中存在类似干扰物，其RLS信号也是可靠的。其余反应条件为：[AuNPs]: 0.5×, pH7.05。说明本发明制备的传感器具有良好的血清肌酐检测特异性。

 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备金纳米粒子溶液；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液作为抗聚集剂，混合均匀，对金纳米粒子进行表面保护；

（3）分别加入不同浓度的标准血清肌酐溶液，利用荧光分光光度计进行定量检测，得出血清肌酐浓度与共振光散射强度的关系曲线图，即得到所述的金纳米粒子生物传感器。

2.如权利要求1所述的金纳米粒子生物传感器的制备方法，其中所述金纳米粒子的粒径范围为16.5 ± 2.5 nm。

3. 如权利要求1所述的金纳米粒子生物传感器的制备方法，其中所述金纳米粒子与所述还原型谷胱甘肽的含量关系为每0.5ml浓度为0.5×金纳米粒子溶液中加入0.2ml浓度为1μM的还原性谷胱甘肽溶液。

4. 如权利要求2所述的金纳米粒子生物传感器的制备方法，其中所述

金纳米粒子溶液的制备方法如下：

（1）将氯金酸溶液煮沸；

（2）加入柠檬酸三钠溶液，继续搅拌煮沸约10 min；

（3）停止加热，搅拌约20 min至溶液冷却至室温，即得到金纳米粒子溶液。

5. 一种如权利要求1～4任一所述方法制备成的检测血清肌酐的金纳米粒子生物传感器。

6.一种如权利要求5所述的金纳米粒子生物传感器的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将pH为7.05的Britton-Robinson 缓冲液和金纳米粒子溶液均匀混合；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液，均匀混合；

（3）加入待测血清肌酐溶液，室温下培育25 min；

（4）若溶液为酒红色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度范围为0～40 μM；若溶液为紫色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度范围为40～250 μM；若溶液为蓝色，则初步判断待测血清肌酐溶液的浓度大于250 μM。

7. 一种如权利要求5所述的金纳米粒子生物传感器的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将pH为7.05的Britton-Robinson 缓冲液和金纳米粒子溶液均匀混合；

（2）加入还原型谷胱甘肽溶液，均匀混合；

（3）加入待测血清肌酐溶液，室温下培育25 min；

（4）将溶液置于荧光分光光度计上，以相同激发和发射波长，在200～700 nm的范围内进行同步扫描，得到所述待测血清肌酐溶液的共振光散射强度；

    （5）由所述血清肌酐浓度与共振光散射强度的标准曲线图，即可得出所述待测血清肌酐的浓度。