CN113740525A - 一种检测肾损伤标志物胱抑素c的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测肾损伤标志物胱抑素C的方法。该方法首先加入免疫磁珠与待测溶液混合，特异性捕获肾损伤标志物胱抑素C，再加入免疫脂质体孵育一段时间后形成免疫磁珠‑胱抑素C‑免疫脂质体夹层三明治结构复合物，之后进行磁性分离并加入TritonX‑100对免疫脂质体进行破膜，利用免疫脂质体释放出的精氨酸促使纳米金聚集显色而实现胱抑素C的高灵敏、快速、可视化检测。本发明利用免疫脂质体扩增反应和纳米金显色相结合，能实现肾损伤标志物胱抑素C的高灵敏度检测，并且具有检测时间短，可视化检测，成本低，特异性高等优点。

Description

一种检测肾损伤标志物胱抑素C的方法

技术领域

本发明涉及属于纳米生物检测技术领域，尤其涉及一种免疫脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

脂质体免疫传感器是指将脂质体应用于免疫检测的一种新型生物传感器，免疫传感器由于只对抗原与抗体的特异性吸附进行检测，避免了非特异性吸附的干扰，从而提高了传感器的准确性和专一性。而脂质体是由磷脂和胆固醇组成的，具有磷脂双分子层的球形纳米级囊泡，由于其结构的特殊性能够包埋或吸附大量信号物质或其他生物识别分子，从而能够达到信号放大增强检测信号的目的。因此，脂质体免疫传感器不仅有传统免疫传感器的特异性和高效性，而且还在此基础上放大了信号，极大提高了传感器的灵敏度。

比色传感器是以颜色变化为分析基础，通过裸眼观察或分光光度计，直接或间接实现对颜色变化的靶标进行定性、定量检测。其具有肉眼直接观察，易操作，成本低，检测速度快，实时高效，且不需要实验室仪器等优点。纳米金颗粒会因为纳米颗粒之间的距离的改变，导致相邻颗粒之间的表面等离子耦合，使得等离子体共振光谱发生移位从而导致溶液颜色的改变，由于其低成本、易合成、距离变化后颜色改变明显等特点，使其在比色传感检测中具有很好的竞争力。

急性肾损伤是由多种病因引起的高致死率的一种临床综合征，在临床上是一个严重并长期存在的问题，在过去10多年的时间里，急性肾损伤在住院患者中发病率约为3.2％～9.6％，在老年患者中为14.8％。而在重症患者中高达22％。而且由于缺乏有效的治疗方法，接近半数的急性肾损伤患者会变为慢性肾病。因此，通过关键指标对急性肾损伤的发生进行早期诊断、早期干预、及时治疗对降低急性肾损伤的发病率和死亡率具有积极意义。

胱抑素C即半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种低分子量蛋白，分子量为13.3KDa，由122 个氨基酸残基组成，在所有组织的有核细胞中持续恒定的转录和表达，且没有组织特异性，体液中的浓度不会受到年龄、性别、代谢水平和营养状况等因素所影响。正常机体状态下，在人体的血清胱抑素C由肾小球滤过后，在近端小管全部重吸收及分解，不会重新回到血液循环中。一些研究表明血清胱抑素C的浓度与肾功能的损伤程度高度相关，且能比传统的肾损伤标志物血肌酐、尿素氮能更早地反映肾功能的下降，能够更加及时准确的反映人体肾小球滤过率的改变，从而能够更早地诊断肾损伤。但是，目前的检测胱抑素C的方法大多操作复杂、价格昂贵、需要实验室仪器，因此开发一种高灵敏、操作简便、快速高效的检测血液中胱抑素 C的新方法，对肾损伤的早期诊断具有重要意义。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种免疫脂质体的制备方法，所述制备方法以DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、胆固醇、DPPE(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)为原料，利用薄膜分散法制备脂质体；用制备得到的脂质体包封精氨酸，获得免疫脂质体。

进一步的，所述免疫脂质体的制备方法包括如下步骤：

a)称取DPPC、胆固醇、DPPE放置于离心管中，加入氯仿和甲醇溶液，超声溶解；

b)将步骤a)超声后的溶液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，在烧瓶的内壁形成脂质膜；

c)将精氨酸预先溶解在PBS中，充分溶解，加入步骤b)中内壁形成脂质膜的烧瓶中，同时水浴摇晃烧瓶，使内壁上的脂质膜溶解脱落，获得包封精氨酸的多层脂质体；

d)将步骤c)获得的包封精氨酸的多层脂质体放入超声破碎仪中同时进行冰水浴和超声；

e)将步骤d)超声后的溶液离心，除去未分散、较大的脂质体；吸取上清液使用截留分子量为8000的半透膜透析，除去未被包埋的精氨酸，获得所述的精氨酸脂质体；

f)将步骤e)获得的精氨酸脂质体加入2.5％(w/v)戊二醛溶液，所述精氨酸脂质体与戊二醛溶液的体积比为2:3，，轻轻摇匀后，在25℃下孵育1h；将获得的溶液在PBS中，4℃下透析24h除去过量的戊二醛；加入胱抑素C抗体2于精氨酸脂质体中，所述胱抑素C抗体2与精氨酸脂质体的用量比为1μg:10μL，混匀后在旋转仪上孵育，25℃下孵育1h；未结合的胱抑素C抗体2用100KD的超滤管4℃12000rpm 20min重复超滤3次；将超滤获得的液体加入PBS(1％BSA)中，所述超滤获得的液体与PBS(1％BSA)的体积比为1：2，在25℃下孵育1h，以达到封闭醛基的目的，获得所述的免疫脂质体。

进一步的，将步骤f)获得的免疫脂质体4℃保存。

进一步的，所述步骤a)中，DPPC、胆固醇、DPPE的质量比为(55～65)：(35～35)：(5～10)，氯仿和甲醇的体积比为(3～6)：(1～2)，所述DPPC、胆固醇、DPPE混合物在氯仿和甲醇溶液中的浓度为15mg/ml。

进一步的，所述步骤c)中，精氨酸与脂质膜的质量比为(4～10)：(2～3)。

本发明的第二个目的是提供采用前述制备方法制备得到的免疫脂质体。

进一步的，所述免疫脂质体直径为140±40nm。

本发明的第三个目的是提供前述的免疫脂质体在制备检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者试剂盒中的应用。

进一步的，所述检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者工具对胱抑素C的最低检测值为 15μg/L。

进一步的，所述应用包括如下步骤：

1)采用前述的制备方法制备免疫脂质体；

2)免疫磁珠-胱抑素C复合物的形成：将待测血清加入混匀的免疫磁珠，所述免疫磁珠为经胱抑素C的抗体1标记的免疫磁珠，37℃孵育20～40min后，得到免疫磁珠-胱抑素C复合物；

3)免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物的形成：向步骤2)中形成的免疫磁珠-胱抑素C 复合物中加入免疫脂质体，混匀后37℃放置20～40min，形成免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物；优选的，所述加入的免疫脂质体浓度为0.8×10⁸个/mL～9.6×10⁸个Lipid/mL。

4)磁性分离：对免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物进行磁吸附，所述磁吸附时间为 1～5min，弃去未被吸附的液体，得到吸附产物；

5)人工破膜：向步骤4)得到的吸附产物中加入含10mM TritonX-100的PBS，脂质体破膜后释放出包裹的精氨酸；优选的，所述破膜剂为TritonX-100破膜剂；优选的，所述含10mM TritonX-100的PBS体积为200μL。

6)显色检测：取步骤5)破膜后的液体，加入到纳米金溶液中，所述破膜后的液体与纳米金溶液的体积比为1：20，通过颜色变化以及紫外吸收强度分析精氨酸的量来确定样本中胱抑素C的含量。

进一步的，步骤2)所述抗体1标记的免疫磁珠制备方法如下：

磁珠活化：取200μL市售羧基磁珠于ep管中加入800μL乙醇(20％)，于涡旋仪中混匀，用磁力架固定磁珠在EP管上，弃去上清，加入适量活化缓冲液MEST，固定弃去上清，重复两次。精密称取5mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)与5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别溶于1mL MES中，各取200μL与2mg市售羧基磁珠混合，涡旋后置于37℃放置30min，磁固定，吸取上清，加入500μL MEST洗涤3次，弃上清。

抗体偶联：加入125μg胱抑素C抗体1到500μL偶联缓冲液MES中，与磁珠孵育，涡旋后旋转仪上孵育，37℃孵育6h，6小时后磁固定，弃上清。

封闭与保存：加入1mL PBST(1％BSA)涡旋后旋转仪上孵育室温孵育30min，磁固定，吸取上清，1mL PBST(1％BSA)洗涤4次后，加入200μL PBST(0.5％BSA)4℃保存。

本发明基于如下原理设计了肾损伤标志物胱抑素C的检测方法：免疫脂质体包封精氨酸为报告分子，用胱抑素C的抗体1标记磁珠制备免疫磁珠，用胱抑素C的抗体2标记包封精氨酸的免疫脂质体，在待测样品中先后加入免疫磁珠和免疫脂质体，样品中的胱抑素C会先后和免疫磁珠以及免疫脂质体形成免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物，接着进行磁分离，加入破膜剂破坏脂质体，脂质体中包封的精氨酸被释放出来，取适量的破膜后的液体加入到纳米金溶液中，反应一定的时间后，观察纳米金颜色变化，以及分光光度计中A650/A520的比值变化；脂质体释放的精氨酸的浓度与胱抑素C的浓度呈正比，精氨酸与纳米金溶液颜色变化以及分光光度计中A650/A520成正比，也就是纳米金溶液颜色变化以及分光光度计中 A650/A520与样品中胱抑素C的含量成正比，因此可以通过颜色变化进行定性检测以及分光光度计进行定量检测来确定样品中胱抑素C的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明基于纳米金显色、免疫脂质体扩增技术构建脂质体包裹精氨酸报告分子的免疫脂质体传感器，可以高灵敏、快速、可视化检测样品中的胱抑素C含量。相比与传统的ELISA试剂盒的方法，该方法检测快速，抗原抗体结合反应只需50min，脂质体破乳只需几秒，纳米金显色只需10min，显色完成后结果可直接裸眼观察，整个检测流程只需1h以内。而且灵敏度高，能检测出的最低值可达μg/L，比ELISA方法要低一个数量级。

附图说明

图1为本发明肾损伤标志物胱抑素C检测原理图

图2为实施例2中免疫脂质体粒径大小

图3为实施例4中免疫脂质体浓度于信号响应标曲

图4为实施例5中检测胱抑素C的线性标曲

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但所描述的实例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为本发明的限制。

以下实例中，

MES：10mM，pH 6.0，精密称量213.25mg MES粉末(一水吗啉乙磺酸)，加入去离子水100mL，用1M NaOH调节。

MEST：含0.05％Tween20，Tween20 25μL加入到50mL MES中

PBST(1％BSA):500mg BSA、Tween20 25μL加到50mL PBS中

PBST(0.5％BSA):250mg BSA、Tween20 25μL加到50mL PBS中

PBS(1％BSA)：500mg BSA加到50mL PBS中

实施例1：免疫磁珠的制备

磁珠活化：取200μL市售羧基磁珠于ep管中加入800μL乙醇(20％)，于涡旋仪中混匀，用磁力架固定磁珠在EP管上，弃去上清，加入适量活化缓冲液MEST，固定弃去上清，重复两次。精密称取5mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)与5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别溶于1mL MES中，各取200μL与2mg市售羧基磁珠混合，涡旋后置于37℃放置30min，磁固定，吸取上清，加入500μL MEST洗涤3次，弃上清。

抗体偶联：加入125μg胱抑素C抗体1到500μL偶联缓冲液MES中，与磁珠孵育，涡旋后旋转仪上孵育，37℃孵育6h，6小时后磁固定，弃上清。

封闭与保存：加入1mL PBST(1％BSA)涡旋后旋转仪上孵育室温孵育30min，磁固定，吸取上清，1mL PBST(1％BSA)洗涤4次后，加入200μL PBST(0.5％BSA)4℃保存。

实施例2：免疫脂质体的制备

免疫脂质体的制备：精密称取DPPC、DPPE、胆固醇(18.5mg、1.75mg、9.75mg，总量为30mg)，置于2mL离心管中，加入2mL氯仿：甲醇(体积比3：2)，超声溶解；超声后的溶液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，在烧瓶的内壁形成脂质膜；将预先溶解在PBS的精氨酸加入烧瓶中，同时在水浴中，摇晃烧瓶，使内壁上的脂质膜溶解脱落，获得包封精氨酸的多层脂质体；多层脂质体放入超声破碎仪中同时进行冰水浴和超声；超声后的溶液离心，除去未分散、较大的脂质体；吸取上清液使用截留分子量为8000的半透膜透析，去除未包埋的精氨酸，获得精氨酸脂质体。

免疫脂质体的制备：将2mL精氨酸脂质体加入到3mL 2.5％戊二醛溶液中，25℃下孵育1 h；将获得的溶液在PBS中，4℃下透析24h除去过量的戊二醛；加入50μg胱抑素C抗体2于500μL精氨酸脂质体中，25℃下孵育1h，未结合的胱抑素C抗体2用100KD的超滤管4℃12000rpm 20min重复超滤3次；弃去上清，将超滤获得的液体加入体积比为1：2的PBS (1％BSA)中25℃下孵育1h封闭未结合的醛基，获得所述的免疫脂质体，4℃保存。取上清测马尔文粒度仪，检测粒径大小，图2为马尔文粒度仪结果，说明制备的脂质体大小在140±40 nm。

实施例3：基于纳米金显色、免疫脂质体扩增检测胱抑素C的具体步骤

免疫磁珠-胱抑素C复合物的形成：将待测血清置于离心管中，加入实施例1中制备得到的经胱抑素C抗体1标记的免疫磁珠，37℃孵育20min后，得到免疫磁珠-胱抑素C复合物；

免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物的形成：向步骤2)中形成的免疫磁珠-胱抑素C复合物中加入浓度为4.8×10⁸个Lipid/mL的免疫脂质体，混匀后37℃放置30min，形成免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物；

磁性分离：将离心管放置在磁力架上5min，对上述步骤形成的免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物进行磁吸附，用移液器吸走管内液体，弃去，得到吸附产物；

人工破膜：向离心管得到的吸附产物中加入含10mM TritonX-100的200μL PBS，脂质体破坏后释放出包裹的精氨酸；

显色检测：取10μL上一步骤破膜后的液体，加入到200μL的纳米金溶液中，通过颜色变化以及紫外吸收强度分析精氨酸的量来确定样本中胱抑素C的含量。

实施例4

本实施例为免疫脂质体的使用浓度优化，将浓度分别为0.8×10⁸个Lipid/mL～20×10⁸个 Lipid/mL的免疫脂质体分别加入到200μL的纳米金溶液中，然后加入10μL 10mM的PBST，反应10min后，在紫外分光光度计中测量A650/A520的比值。

由图3的结果可知，当免疫脂质体的使用浓度为0.8×10⁸个/mL～9.6×10⁸个Lipid/mL时，与A650/A520成线性关系，且R²＝0.9913，线性关系良好。

由上述实验结果可知，在本发明所述的检测肾损伤标志物胱抑素C的方法中，免疫脂质体的较佳使用浓度为0.8×10⁸个Lipid/mL～9.6×10⁸个Lipid/mL。

实施例5

本实施例为基于生物素化脂质体对胱抑素C的检测灵敏度实验，其步骤与实施例3相同。图4给出了胱抑素C浓度与A650/A520的标准曲线，由图3可知，胱抑素C在20μg/L～100μg/L 范围内符合线性方程Y＝0.0015X+0.2169，其中Y为A650/A520比值，X为胱抑素C的浓度。胱抑素C的浓度与A650/A520比值成线性相关(R²＝0.9359),以空白平均值的3倍SD 值除以斜率的方法计算，最低检测限为15.17μg/L，可于胱抑素C的测定。

实施例6

本实施例为检测胱抑素C蛋白的特异性及加样回收率，其步骤与实施例3相同，在PBS 中分别加入浓度的为20μg/L、60μg/L、100μg/L的胱抑素C蛋白，将检测值与加入标准量进行对比。表1给出实施例6所述的对于样品中胱抑素C加样回收率的结果，结果可知回收率在90～110％之间，变异系数小于10％，结果表明，本发明中检测体系具有良好的精密度和回收率。

表1样品中的加样回收实验结果

Claims (10)

1.一种免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法以DPPC、胆固醇、DPPE为原料，利用薄膜分散法制备脂质体；用制备得到的脂质体包封精氨酸，获得免疫脂质体。

2.根据权利要求1所述的免疫脂质体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

a)称取DPPC、胆固醇、DPPE放置于离心管中，加入氯仿和甲醇溶液，超声溶解；

b)将步骤a)超声后的溶液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，在烧瓶的内壁形成脂质膜；

c)将精氨酸预先溶解在PBS中，充分溶解后，加入步骤b)中内壁形成脂质膜的烧瓶中，同时水浴摇晃烧瓶，使内壁上的脂质膜溶解脱落，获得包封精氨酸的多层脂质体；

d)将步骤c)获得的包封精氨酸的多层脂质体放入超声破碎仪中同时进行冰水浴和超声；

e)将步骤d)超声后的溶液离心，吸取上清液使用截留分子量为8000的半透膜透析，除去未被包埋的精氨酸，获得所述的精氨酸脂质体。

f)将步骤e)获得的精氨酸脂质体加入2.5％(w/v)戊二醛溶液，所述精氨酸脂质体与戊二醛溶液的体积比为2:3，，轻轻摇匀后，在25℃下孵育1h；将获得的溶液在PBS中，4℃下透析24h除去过量的戊二醛；加入胱抑素C抗体2于精氨酸脂质体中，所述胱抑素C抗体2与精氨酸脂质体的用量比为1μg:10μL，混匀后在旋转仪上孵育，25℃下孵育1h；未结合的胱抑素C抗体2用100KD的超滤管4℃12000rpm 20min重复超滤3次；将超滤获得的液体加入PBS(1％BSA)中，所述超滤获得的液体与PBS(1％BSA)的体积比为1：2，在25℃下孵育1h，以达到封闭醛基的目的，获得所述的免疫脂质体。

3.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，还包括将步骤f)获得的免疫脂质体4℃保存。

4.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，DPPC、胆固醇、DPPE的质量比为(55～65)：(35～35)：(5～10)，氯仿和甲醇的体积比为(3～6)：(1～2)，所述DPPC、胆固醇、DPPE混合物在氯仿和甲醇溶液中的浓度为15mg/ml。

5.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，精氨酸与脂质膜的质量比为(4～10)：(2～3)。

6.采用权利要求1至5任一项权利要求所述的制备方法制备得到的免疫脂质体。

7.根据权利要求6所述的免疫脂质体，其特征在于，所述免疫脂质体直径为140±40nm。

8.权利要求6所述的免疫脂质体在制备检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者工具对胱抑素C的最低检测值为15μg/L。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：

1)采用权利要求1至5任一项权利要求所述的制备方法制备免疫脂质体；

2)免疫磁珠-胱抑素C复合物的形成：将待测血清加入混匀的免疫磁珠，所述免疫磁珠为经胱抑素C抗体1标记的免疫磁珠，37℃孵育20～40min后，得到免疫磁珠-胱抑素C复合物；

3)免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物的形成：向步骤2)中形成的免疫磁珠-胱抑素C复合物中加入免疫脂质体，混匀后37℃放置20～40min，形成免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物；优选的，所述加入的免疫脂质体浓度为0.8×10⁸个/mL～9.6×10⁸个Lipid/mL；

4)磁性分离：对免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物进行磁吸附，所述磁吸附时间为1～5min，弃去未被吸附的液体，得到吸附产物；

5)人工破膜：向步骤4)得到的吸附产物中加入含10mM TritonX-100的PBS，脂质体破膜后释放出包裹的精氨酸；优选的，所述破膜剂为TritonX-100破膜剂；优选的，所述含10mMTritonX-100的PBS体积为200μL；

6)显色检测：取步骤5)破膜后的液体，加入到纳米金溶液中，所述破膜后的液体与纳米金溶液的体积比为1：20，通过颜色变化以及紫外吸收强度分析精氨酸的量来确定样本中胱抑素C的含量。

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