CN106645700A - 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106645700A
CN106645700A CN201611199507.XA CN201611199507A CN106645700A CN 106645700 A CN106645700 A CN 106645700A CN 201611199507 A CN201611199507 A CN 201611199507A CN 106645700 A CN106645700 A CN 106645700A
Authority
CN
China
Prior art keywords
particle
neuronspecific enolase
test kit
concentration
liposome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611199507.XA
Other languages
English (en)
Inventor
陈立国
邹伟权
张亚丽
李庆祥
母润红
王涛
苏焱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hua Hong Bio Tech Ltd Guangzhou
Original Assignee
Hua Hong Bio Tech Ltd Guangzhou
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hua Hong Bio Tech Ltd Guangzhou filed Critical Hua Hong Bio Tech Ltd Guangzhou
Priority to CN201611199507.XA priority Critical patent/CN106645700A/zh
Publication of CN106645700A publication Critical patent/CN106645700A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法，该试剂盒包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。本发明提供的试剂盒具有较高的检测的特异性和灵敏度，变异系数低，与干扰物质交叉反应小，具有较宽的检测线性范围，检测结果可靠。

Description

一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法。
背景技术
神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是一种肝糖分解酶，特异性存在于神经元、周围神经组织和神经内分泌组织内，其他脏器及脑脊液中的分布水平不及中枢神经系统的1％。当神经元或神经内分泌细胞发生缺血、缺氧、中毒或损伤时，细胞膜的完整性受到破坏，NSE从损伤的细胞内“漏出”，最先进入脑脊液中，通过破坏的血脑脊液屏障进入血液循环，导致NSE在外周血和脑脊液中的浓度明显升高，因此NSE是中枢神经系统损害的标志物，通过检测血清或脑脊液中NSE的变化，为证实颅脑损伤的发生、判断颅脑损伤的程度、预测患者的预后提供了依据。
此外，NSE在小细胞肺癌和神经母细胞瘤等内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性，许多研究者相继证明，NSE用于小细胞肺癌诊断，是一个具有高特异性和高灵敏性的肿瘤标记物，其特异性高达80～90％，诊断灵敏度达80％；当应用NSE作神经母细胞瘤鉴别诊断时，其阳性率可达96～100％。因此，通过检测血清中的NSE，对于小细胞肺癌和神经母细胞瘤的检测疗效和预报复发均具有重要的参考价值。监测患者血清中NSE含量的动态变化还可作为预测癌细胞是否有脑转移趋势的一个重要指标。因此，NSE是监测神经系统疾病和肿瘤的重要标志物，提供一种能准确、快速检测NSE的方法满足临床诊断和科研的需要，具有重要意义。
我国目前获准上市的NSE国产和进口检测试剂盒约7个品种，检测原理主要有酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLI)和时间分辨免疫荧光法(TRFIA)等。其中，传统的酶联免疫分析自动化程度不高，操作过程繁琐，受人为操作因素影响很大，不利于高通量的全自动检测，特异性和灵敏性有待提高，已逐渐被其他三种检测手段取代。新兴的化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析和时间分辨免疫荧光分析具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验的分析手段。但目前，具有自主知识产权的国产NSE检测试剂盒较少，且大部分均基于酶联免疫分析而设计的，涉及上述三种新兴检测手段的试剂盒更为少见，均依靠国外进口，价格昂贵，给患者带来很大经济负担，不利于基层普及。基于此，国内本领域的学者致力于NSE试剂盒的研发，如崔晓丙等人在“神经元特异性烯醇化酶(NSE)时间分辨免疫荧光免疫分析试剂盒的临床性能评价”(现代医学仪器与应用，2008,20(1),4-7)中披露采用自制的时间分辨免疫荧光免疫分析试剂盒检测血清中的NSE，与进口Roche电化学发光试剂盒检测比较，两者测定值接近，相关系数为0.973，达到国外进口的水平。又如贺安等人在“神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析法的建立”(现代免疫学，2011,31(1),44-47)中披露采用自制的光激化学发光免疫分析快速检测试剂盒检测血清中的NSE，与进口Roche电化学发光试剂盒检测比较，两者测定值接近，相关系数为0.979，达到国外进口的水平。
除了上述所述的几种检测手段外，国内学者也尝试将不同的技术手段结合，开发出使用更为简便，具有更高检测灵敏度和特异性地试剂盒，如公开号为CN 102914650 B的中国专利申请“神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用”以免疫磁珠微粒与化学发光技术相结合，可实现样本和试剂一次加入，大大简化了检测程序，缩短检测时间，并达到较佳的性能参数。又如公开号为CN 103175964 B的中国专利申请“神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法”以化学交联法将NSE单克隆体和多克隆抗体复合包被粒径为80-240nm的胶乳颗粒，保证检测试剂盒具有高灵敏度及较宽的检测线性范围，且操作简便、快速、特异性强、稳定性好。
电化学发光免疫法(ECLI)检测是在化学发光和电化学基础上发展而来的一种分析方法，其通过在电极上施加一定电压以引发电化学反应，电化学反应释放的能量再激发发光体，当激发态发光体返回基态时便产生光发射，从而可以根据光发射强度来实现对待测物的分析。目前基于电化学发光免疫分析原理的检测仪器已成功商品化，如罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)的Roche型电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒，采用钌联吡啶衍生物作为标记探针，磁珠为反应载体，并结合自动化的试剂传输系统，可快速检测多种疾病标志物。但基于电化学发光免疫技术用于检测NSE的国产试剂盒的研究相对较少，不能满足国内需求。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，采用该试剂盒进行NSE检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简单，操作流程短。
本发明另外一个目的在于提供一种所述快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒的使用方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。
所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。
所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。
本发明提供的试剂盒为夹心法电化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法，基本原理为：利用脂质体将发光物质(Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物)进行包裹，并进行脂质体表面抗体化结合，制备脂质体复合物；利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将生物素化的抗体与链霉亲和素包被的磁性微粒进行络和，制备磁性分离试剂；将脂质体复合物、待测物质(抗原)、磁性分离试剂混合，在室温下充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物的“三明治”结构，在外磁场的作用下，磁性微粒-抗原-脂质体复合物吸附于电极表面，加入反应缓冲液，使脂质体复合物释放出发光物质，所述的发光物质再次吸附于电极表面，开启电压后，发光底物及反应参与物在电极表面失去电子而被氧化。电子供体失去一个H+而成为强还原剂，将发光底物还原为激发态，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒中，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)按质量比为(4～10):1的比例分别取Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子，利用静电吸附作用，将带正电荷的Ru(bpy)3 2+吸附于带负电荷的纳米金粒子上，制得Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物；
(2)将Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶于Tris缓冲溶液中，制成质量浓度为2％的溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液含有10mM三羟甲基氨基甲烷和15mM氯化钠，pH为7.2；
(3)取二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体；
(4)取1mL内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体与1mL质量浓度为2％的1,5-戊二醛溶液混合，室温下反应2h，然后用10mM pH 7.2的PBS溶液进行透析12～24h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得。
其中，所述步骤(3)中二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为20:10:4。
本发明通过大量的试验发现，使用脂质体包裹发光物质Ru(bpy)3 2+体系的稳定性好，但检测灵敏度有待提高，通过大量的试验最终确定，将发光物质Ru(bpy)3 2+吸附于粒径为2～50nm的纳米金粒子上，形成Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，可显著增强发光强度，提高检测灵敏度。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒中，所述的生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体的制备包括以下步骤：取抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10～50mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0～2.0mg/mL的抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶液与25μL的浓度为10～50mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1～2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒中，所述的链霉亲和素包被的磁性微粒的制备包括以下步骤：取0.5mg金磁微粒，磁性分离弃上清，加入150～200μg链霉亲和素，加入0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl缓冲液0.5mL，置振荡器中室温条件下反应1～2h，去上清，用含1mmol/L EDTA且浓度为0.1mol/L、pH为7.4的Tris-HCl清洗液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒。
根据本发明的具体实施方案，本发明的快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒中，所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：取1mL生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁性微粒混合，在室温条件下，100r/min反应1～2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20、pH为7.2的PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂。
本发明将链霉亲和素包被的磁性微粒，并用生物素标记捕获抗体，利用生物素和链霉亲和素的相互作用，将生物素标记抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒免疫结合，延长抗体在磁性微粒上的臂展和正确定向，整体上提高了试剂盒的灵敏度，制得的磁性分离试剂稳定性良好，保存有效期延长。
进一步地，本发明所述的反应缓冲液的组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1％(v/v)吐温-20、1％(v/v)Triton X-100，pH为7.0～7.2。
所述的清洗液为含0.1％(v/v)吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
上述的反应缓冲液中磷酸二氢钾主要起缓冲作用，维持反应体系的pH值，添加吐温-20和Triton X-100可增强发光作用，提高发光效率，减少三丙胺的用量，提高试剂盒的使用安全性。
本发明还提供了神经元特异性烯醇化酶系列浓度的标准液，所述的神经元特异性烯醇化酶标准品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将神经元特异性烯醇化酶抗原配制成浓度分别为5，25，75，150，300，600ng/ml的标准液，即得。
作为优选，本发明试剂盒还可进一步包含质控品，所述质控品的配制同标准品，所述质控品中神经元特异性烯醇化酶抗原的浓度分别为75ng/ml和300ng/ml。
进一步地，本发明还提供了一种所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：
(1)使用含2％(w/v)BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；
(2)取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或神经元特异性烯醇化酶标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶出，溶出的联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物通过磁性再次吸附于电极表面，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；
(3)测定梯度浓度的神经元特异性烯醇化酶标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测标本中神经元特异性烯醇化酶的浓度。
本发明试剂盒中提及的各种缓冲溶液，除另有注明外，均为市售产品，未提及的试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，所用检测仪器设备，如电化学分析仪的使用按说明书操作进行。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)与常规的电化学发光免疫检测方法比较，本发明以夹心法电化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合，形成磁性微粒-抗原(待测物)-脂质体复合物的“三明治”结构，大大提高了检测的特异性和灵敏度，降低变异系数，与干扰物质交叉反应小，具有较宽的检测线性范围，检测结果可靠。
(2)分别采用本发明提供的试剂盒与Roche型电化学发光免疫分析试剂盒对经元特异性烯醇化酶进行检测，两者测定值接近，相关系数为0.984，达到国外进口的水平，但成本远低于进口试剂，适合大规模推广和应用。
(3)本发明将发光物质联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子进行复合，显著增强发光强度，提高检测灵敏度，并将形成的复合物包裹于脂质体内部，显著提高检测的稳定性。
(4)采用本发明提供的试剂盒对神经元特异性烯醇化酶进行检测，操作简单，耗时少，大大提高检测的效率。
(5)本发明提供的试剂盒中各试剂稳定性好，储存时间较长，且毒性低，对操作人员的健康影响小。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1本发明检测试剂盒的组成与制备
本发明所述的试剂盒包括以下组分：
试剂a：神经元特异性烯醇化酶标准品
试剂b：反应缓冲液
试剂c：脂质体复合物
试剂d：磁性分离试剂
试剂e：清洗液
作为优选，本发明试剂盒还可进一步包含质控品，所述质控品的配制同标准品。
所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，其中，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。
所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。
本发明试剂盒中各试剂的制备包括以下步骤：
(1)神经元特异性烯醇化酶标准品制备
原料 厂家
磷酸二氢钾 深圳卓越生物科技有限公司
氯化钠 深圳卓越生物科技有限公司
BSA Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
吐温-20 上海麦克林生化科技有限公司
神经元特异性烯醇化酶抗原 天健生物制药(天津)有限公司
制备方法：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将神经元特异性烯醇化酶抗原配制成浓度分别为5，25，75，150，300，600ng/ml的标准液，即得。
(2)反应缓冲液
原料 厂家
三丙胺 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
Triton X-100 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
其他试剂的来源见上表。
制备方法：以配制100ml反应缓冲液为例：
取1.43g三丙胺、1.36g磷酸二氢钾、0.58g氯化钠溶于100ml水中，加入0.1ml吐温-20、1ml Triton X-100，搅拌均匀，调节pH为7.2，即得反应缓冲液。
(3)清洗液
原料 厂家
磷酸二氢钠 深圳卓越生物科技有限公司
磷酸氢二钠 深圳卓越生物科技有限公司
其他试剂的来源见上表。
制备方法：以配制100ml清洗液为例：
①取0.599g磷酸二氢钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液，另取0.710g磷酸氢二钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液，分别取0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液72ml，混合，制得浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
②取0.58g氯化钠、0.1ml吐温-20，加入100ml浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀即得。
(4)脂质体复合物
原料 厂家
联吡啶钌 上海谱振生物科技有限公司
纳米金胶体 南京先丰纳米材料科技有限公司
二硬脂酰磷脂酰胆碱 Avanti polar lipids,lnc
胆固醇 Avanti polar lipids,lnc
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 Avanti polar lipids,lnc
神经元特异性烯醇化酶抗体 上海谷研科技有限公司
Tris-HCl缓冲溶液 南京森贝伽生物科技有限公司
1,5-戊二醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司
制备方法：
①按质量比为6:1的比例分别取Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子，利用静电吸附作用，将带正电荷的Ru(bpy)3 2+吸附于带负电荷的纳米金粒子上，制得Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物；
②将Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶于Tris缓冲溶液中，制成质量浓度为2％的溶液，所述的Tris缓冲溶液含有10mM三羟甲基氨基甲烷和15mM氯化钠，pH为7.2；
③按摩尔比为20:10:4分别称取二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90nm，得到内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体；
④取1mL内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体与1mL质量浓度为2％的1,5-戊二醛溶液混合，室温下反应2h，然后用10mM pH 7.2的PBS溶液进行透析12h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得。
(5)磁性分离试剂
原料 厂家
PBS缓冲液 南京森贝伽生物科技有限公司
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin 皮尔斯生物技术有限公司
金磁微粒 西安金磁纳米生物技术有限公司
链霉亲和素 德国默克公司
D-生物素 皮尔斯生物技术有限公司
制备方法：
①生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体的制备：取抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0mg/mL的抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶液与25μL的浓度为10mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体。
②链霉亲和素包被的磁性微粒的制备：取0.5mg金磁微粒，磁性分离弃上清，加入150μg链霉亲和素，加入0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl缓冲液0.5mL，置振荡器中室温条件下反应2h，去上清，用含1mmol/L EDTA且浓度为0.1mol/L、pH为7.4的Tris-HCl清洗液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒。
③磁性分离试剂的制备：取1mL生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁性微粒混合，在室温条件下，100r/min反应2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20、pH为7.2的PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂。
实施例2采用本发明检测试剂盒进行神经元特异性烯醇化酶检测
(1)待测样本的准备：样本的采集参照常规操作，具体为将采集的静脉血加入至试管或肝素抗凝管中，离心，取上清部分进行实验；
(2)使用含2％(w/v)BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；
(3)取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或神经元特异性烯醇化酶标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过工作电极下面的磁铁吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶出，溶出的联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物通过磁性再次吸附于电极表面，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；
(4)测定梯度浓度的神经元特异性烯醇化酶标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测标本中神经元特异性烯醇化酶的浓度。
对比例1检测试剂盒的组成与制备
对比例1检测试剂盒的组成和制备与实施例1检测试剂盒的组成和制备基本相同，区别在于，所述的脂质体复合物为内部不含粒径在2～50nm的类球形纳米金，仅包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体。
实施例3本发明检测试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造和检定规程对实施例1制得的检测试剂盒进行检定，结果如下：
①线性关系
以自制试剂盒中参考标准品浓度的对数为横坐标，信号值计数的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得NSE试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数为r＝0.9983，表明自制试剂盒在浓度为5-600ng/ml的范围内具有良好的剂量反应线性关系。
②最低检出限
重复测定零校准品(或样本稀释液)不少于10次，计算出反应量的均值(x)和标准差(s)，将(x+2s)的反应量代入剂量-反应曲线，计算出相应浓度值，即为最低检出限，所得自制试剂盒的最低检出限为0.01ng/ml。
③精密度
以自制试剂盒中3个不同浓度的参考标准品进行测定(高、中、低浓度分别为25ng/ml、150ng/ml、600ng/ml)，各设10个复孔。分别对同一批次和不同批次的自制试剂盒中3个不同浓度的参考标准品进行重复测定10次。结果自制试剂盒的批内变异系数(CV％)为1.4～2.8％，批间变异系数(CV％)为3.2～5.7％，符合试剂盒检定规程要求，精密度良好。
④特异性
以人非神经元烯醇化酶(NNE)1000ng/ml和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)500ng/ml作为待测样品，用自制的NSE试剂盒测定，检测结果分别为0.18ng/ml、0.06ng/ml，无明显的交叉反应，表明自制的试剂盒对检测NSE特异性高。
⑤稳定性
将自制的检测试剂盒置于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定NSE校准品，各时间点的试剂盒信号值变化不大，线性关系良好，表明本发明检测试剂盒具有良好的热稳定性。
实施例4本发明检测试剂盒与进口Roche型电化学发光免疫分析试剂盒测定结果比较
分别采用本发明自制的试剂盒和罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)的Roche型电化学发光免疫分析试剂盒同时对30份样本进行检测。用自制试剂盒检测血清中的NSE的分析灵敏度、精密度、稳定性和线性范围的结果，与国外Roche型电化学发光免疫分析试剂盒比较均无明显差异，结果见下表。并以自制试剂盒测定的结果为横坐标，Roche试剂盒测定的结果为纵坐标做回归分析，相关方程为：Y＝0.836X+0.492，相关系数r＝0.984。结果表明本发明自制试剂盒测定结果与Roche试剂盒测定结果具有高度相关性，两者的最低检测限相当，但本发明自制试剂盒的线性范围较宽，且批间、批内精密度较优。
实施例5对比例1试剂盒和本发明实施例1制得的试剂盒对神经元特异性烯醇化酶进行检测的结果比较
对比例1试剂盒的使用方法参考实施例2具体的步骤。
分别采用对比例1试剂盒和实施例1试剂盒同时对肺癌患者血清样本40份(NSE阳性率为100％)进行检测，结果见下表。
结果表明，对比例1制得的试剂盒对血清中NSE检测的灵敏度降低，检测的线性范围缩窄，批内和批间精密度降低，将发光物质Ru(bpy)3 2+吸附于粒径为2～50nm的纳米金粒子上，形成Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，可显著提高检测灵敏度和检测精密度，使检测具有较宽的线性范围。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。
2.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。
3.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。
4.根据权利要求1或2所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)按质量比为(4～10):1的比例分别取Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子，利用静电吸附作用，将带正电荷的Ru(bpy)3 2+吸附于带负电荷的纳米金粒子上，制得Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物；
(2)将Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶于Tris缓冲溶液中，制成质量浓度为2％的溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液含有10mM三羟甲基氨基甲烷和15mM氯化钠，pH为7.2；
(3)取二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mLRu(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体；
(4)取1mL内部包裹有Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物的脂质体与1mL质量浓度为2％的1,5-戊二醛溶液混合，室温下反应2h，然后用10mM pH 7.2的PBS溶液进行透析12～24h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得；
其中，所述步骤(3)中二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为20:10:4。
5.根据权利要求3所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体的制备包括以下步骤：取抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10～50mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0～2.0mg/mL的抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶液与25μL的浓度为10～50mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1～2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体。
6.根据权利要求3所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素包被的磁性微粒的制备包括以下步骤：取0.5mg金磁微粒，磁性分离弃上清，加入150～200μg链霉亲和素，加入0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl缓冲液0.5mL，置振荡器中室温条件下反应1～2h，去上清，用含1mmol/L EDTA且浓度为0.1mol/L、pH为7.4的Tris-HCl清洗液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒。
7.根据权利要求3、5、6任一所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：
取1mL生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁性微粒混合，在室温条件下，100r/min反应1～2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20、pH为7.2的PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂。
8.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液的组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1％(v/v)吐温-20、1％(v/v)Triton X-100，pH为7.0～7.2；
所述的清洗液为含0.1％(v/v)吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
9.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的神经元特异性烯醇化酶标准品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20的溶液将神经元特异性烯醇化酶抗原配制成浓度分别为5，25，75，150，300，600ng/ml的标准液，即得。
10.根据权利要求1-9任一所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用含2％(w/v)BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；
(2)取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或神经元特异性烯醇化酶标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物溶出，溶出的联吡啶钌Ru(bpy)3 2+和纳米金粒子复合物通过磁性再次吸附于电极表面，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；
(3)测定梯度浓度的神经元特异性烯醇化酶标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测标本中神经元特异性烯醇化酶的浓度。
CN201611199507.XA 2016-12-22 2016-12-22 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法 Pending CN106645700A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611199507.XA CN106645700A (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611199507.XA CN106645700A (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106645700A true CN106645700A (zh) 2017-05-10

Family

ID=58833554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611199507.XA Pending CN106645700A (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106645700A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109187971A (zh) * 2018-08-17 2019-01-11 迪瑞医疗科技股份有限公司 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110208346A (zh) * 2019-06-20 2019-09-06 重庆市人民医院 用于ccn1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用
CN111830251A (zh) * 2020-06-24 2020-10-27 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 一种生物样品检测方法及检测试剂盒
CN112462054A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN113740525A (zh) * 2020-05-29 2021-12-03 中国药科大学 一种检测肾损伤标志物胱抑素c的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009192235A (ja) * 2008-02-12 2009-08-27 Panasonic Corp アナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法
CN102350002A (zh) * 2011-10-14 2012-02-15 复旦大学附属华山医院 一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用
CN102680456A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 北京联众泰克科技有限公司 一种电化学发光免疫测定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009192235A (ja) * 2008-02-12 2009-08-27 Panasonic Corp アナライト分析用カプセル及びそれを用いたアナライト分析方法
CN102680456A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 北京联众泰克科技有限公司 一种电化学发光免疫测定方法
CN102350002A (zh) * 2011-10-14 2012-02-15 复旦大学附属华山医院 一种胶质瘤靶向分子磁共振对比剂及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI ZHAN,等: "《Electrogenerated Chemiluminescence. 83. Immunoassay of Human C-Reactive Protein by Using Ru(bpy)32+-Encapsulated Liposomes as Labels》", 《ANAL CHEM》 *
张志锋 等: "《链亲和素-磁性微粒的制备及其应用》", 《中国科学 B辑 化学》 *
李玲: "《联吡啶钌脂质体的合成及其在电化学发光免疫分析中的应用》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109187971A (zh) * 2018-08-17 2019-01-11 迪瑞医疗科技股份有限公司 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110208346A (zh) * 2019-06-20 2019-09-06 重庆市人民医院 用于ccn1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用
CN110208346B (zh) * 2019-06-20 2021-09-10 重庆市人民医院 用于ccn1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用
CN112462054A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN112462054B (zh) * 2019-09-06 2023-06-23 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN113740525A (zh) * 2020-05-29 2021-12-03 中国药科大学 一种检测肾损伤标志物胱抑素c的方法
CN111830251A (zh) * 2020-06-24 2020-10-27 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 一种生物样品检测方法及检测试剂盒
WO2021258618A1 (zh) * 2020-06-24 2021-12-30 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 一种生物样品检测方法及检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106645700A (zh) 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法
CN106771147B (zh) 一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶a2试剂盒及其使用方法
CN103278651B (zh) 一种肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN103389381B (zh) 附睾蛋白4化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN103063851B (zh) 一种游离三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
CN102507947A (zh) 一种基于免疫磁珠的cea时间分辨荧光免疫分析试剂盒
CN103278623B (zh) 一种肌酸激酶同功酶纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
Hasanzadeh et al. Ultrasensitive immunoassay of glycoprotein 125 (CA 125) in untreated human plasma samples using poly (CTAB‑chitosan) doped with silver nanoparticles
CN101639481A (zh) 游离甲状腺素的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒
CN101750502A (zh) 一种同步检测AFP和AFP-IgM的TRFIA及其试剂盒
CN103018445B (zh) 糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN103293323A (zh) 一种促黄体生成素纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN103048452A (zh) 一种肿瘤相关抗原ca125的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
CN101545912A (zh) 胰岛素微孔板式磁颗粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
Hu et al. Dual-quenching electrochemiluminescence resonance energy transfer system from CoPd nanoparticles enhanced porous g-C3N4 to FeMOFs-sCuO for neuron-specific enolase immunosensing
Chen et al. Sensitive electrochemical immunoassay of metallothionein-3 based on K 3 [Fe (CN) 6] as a redox-active signal and c-dots/nafion film for antibody immobilization
CN105606681B (zh) 一种基于金铜-多壁碳纳米管-二氧化锰构建的生物传感器的制备方法及应用
Jin et al. Magnetic particle-based chemiluminescence enzyme immunoassay for free thyroxine in human serum
Luo et al. A novel electrochemiluminescent immunosensor for the detection of NT-proBNP based on a Au/ZIF-67 nanocomposite
Lou et al. A signal amplifying fluorescent nanoprobe and lateral flow assay for ultrasensitive detection of cardiac biomarker troponin I
CN103267866B (zh) 一种促卵泡生成素纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN103344635B (zh) 一种克拉拉细胞蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN103048477A (zh) 一种三碘甲状腺原氨酸的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
CN101377498A (zh) 前列腺特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
CN102654501A (zh) 一种胃蛋白酶原ⅱ的光激发化学发光检测方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170510

RJ01 Rejection of invention patent application after publication