CN111830251A - 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
一种生物样品检测方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111830251A CN111830251A CN202010592579.0A CN202010592579A CN111830251A CN 111830251 A CN111830251 A CN 111830251A CN 202010592579 A CN202010592579 A CN 202010592579A CN 111830251 A CN111830251 A CN 111830251A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- binding
- label
- magnetic
- difference
- analyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 71
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 21
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 12
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 4
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 claims 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000007785 strong electrolyte Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 54
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 41
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 41
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 description 23
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 21
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 21
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 102100026893 Troponin T, cardiac muscle Human genes 0.000 description 14
- 101710165323 Troponin T, cardiac muscle Proteins 0.000 description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 10
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 10
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 10
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052701 rubidium Inorganic materials 0.000 description 1
- IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N rubidium atom Chemical compound [Rb] IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4737—C-reactive protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
- G01N2333/585—Calcitonins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生物样品检测方法及检测试剂盒，该方法通过免疫特异性结合磁珠的方式，形成三元复合物(磁珠‑抗原‑标记物)，在磁场作用下收集三元复合物。在特定化学试剂下，将三元免疫复合物中的标记物洗脱下来，在磁场作用下将标记物和磁珠分离，收集包含标记物的洗脱液并用强电解质重新分散。检测标记物的洗脱液进而通过纳米颗粒计数器从而实现绝对定量。本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种生物样品的定量检测方法。
背景技术
疾病的发生、发展与蛋白质的异常表达或特定蛋白表达密切相关。准确测定疾病相关蛋白的含量在传染病防控、癌症筛查和精准诊断等方面具有重要意义。
几种常用的免疫学技术，酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BAS－ELISA。间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。目前通用的夹心法需要一端连接可以直接或者间接发光的基团，会受到溶液环境和检测器灵敏度的限制。
最近，Quanterix开发了一种可同时检测数千个单个蛋白质分子的方法。使用与常规ELISA相同的试剂，该方法已用于以飞摩尔(fg/mL)浓度测量各种不同基质(血清，血浆，脑脊髓液，尿液，细胞提取物等)中的蛋白质，从而将灵敏度大约提高了1000倍。这种方法利用了飞升大小的反应室阵列，这些阵列称为单分子阵列(SimoaTM)，可以隔离和检测单个酶分子。因为阵列体积比常规ELISA小约20亿倍，所以如果存在标记的蛋白质，则会快速生成荧光产物。随着扩散的消除，可以容易地观察到这种高的局部产物浓度。只需一个分子即可达到检测极限。该方法也被定义为数字ELISA。但是，Simoa方法还是依赖于计算每个反应室的光学信号强度通过柏松公式推算浓度，还不能实现完全的绝对定量。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物样品的定量检测方法。
本发明的另一个目的是提供一种生物样品的定量检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种生物样品检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将修饰有第一结合物的磁珠与含有待分析物的样品、及修饰有第二结合物的标记物混合，得混合液；
(2)除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物；
(3)将混合液中的标记物与磁珠分离；
(4)去除样品中的磁珠，通过对标记物进行计数和/或电荷、粒径测量得出样品中待分析物的含量以及种类；
其中，第一结合物和第二结合物分别与所述样品中的待分析物的第一结合位点、第二结合位点特异性结合。
作为优选的：步骤(2)的方法为：在磁场的控制下，吸附住混合物中的磁珠，除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物。其中，磁场的强度不低于0.0001T，优选为0.0001T-0.1T；
作为优选的：步骤(3)中，标记物和磁珠的分离可以是断开磁珠与第一结合物的连接，或者断开第一结合物与待分析物的结合，或者断开第二结合物与待分析物的结合，或者断开第二结合物与标记物的连接；
具体的方法可以为：
1)利用解离剂，解离磁珠与第一结合物的连接或第二结合物与标记物的连接，所述解离剂可以是柠檬酸缓冲液、强酸性缓冲液、强碱性缓冲液，或者是其他的化学解离剂；
或者2)使用第一结合物的竞争分子、待分析物的竞争分子、或第二结合物的竞争分子使得标记物被从磁珠上替换下来；
或者3)特异性分解酶分解第一结合物、待分析物、第二结合物；
或者4)采用以上方法的组合。
作为优选的：步骤(4)使用磁场吸附，去除样品中的磁珠；
作为优选的，步骤(4)中标记物的计数采用纳米孔计数法、或者NTA检测法、或者纳米流式计数法、或者数字荧光计数法检测。
作为优选的：所述标记物为直径在10nm～1000nm的颗粒。
进一步优选的：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
作为优选的：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
作为优选的：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
作为优选的：所述6C或12C有机分子链可以是六烷基链或者十二烷基链。
本发明的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量。
作为优选的：每种标记物的直径差异5％以上，或者表面电位差异10％以上。
作为优选的：本技术方案通过不同孔径的纳米孔检测样品中标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和浓度。
本发明的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
在步骤(3)之前，通过磁场梯度、磁场偏转或者离心的方法，将不同尺寸或者不同磁感应强度的磁珠分组；
在不同分组中根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量，从而更大限度实现不同待测物的同时检测。
作为优选的：每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上；
作为优选的：每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异10％以上。
一种生物样品检测试剂盒，其包括：
a.修饰有第一结合物的磁珠，第一结合物能够与待分析物的第一结合位点特异性结合；
b.修饰有第二结合物的标记物，第二结合物能够与待分析物的第二结合位点特异性结合。
作为优选的：所述标记物为直径在10nm～1um的颗粒。
进一步优选的：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
作为优选的：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
作为优选的：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
作为优选的：所述6C或12C有机分子链可以是六烷基链或者十二烷基链。
本发明试剂盒的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的：每种标记物的直径差异5％以上，或者表面电位差异10％以上。
本发明试剂盒的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的：每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上。
作为优选的：每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
进一步优选的：所述试剂盒还包括缓冲液、解离剂以及小型磁铁装置，或者用于产生磁场的线圈装置。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过免疫特异性结合磁珠的方式，形成三元复合物(磁珠-抗原-标记物)，如图1所示，在磁场作用下收集三元复合物。在特定化学试剂下，将三元免疫复合物中的标记物洗脱下来，在磁场作用下将标记物和磁珠分离，收集包含标记物的洗脱液并用强电解质重新分散检测标记物的洗脱液进而通过纳米颗粒计数器从而实现绝对定量，如图2所示。
2、本发明方法中，第一结合物与磁珠连接的优势在于：磁珠可以均匀分散在混合液中，能够使第一结合物充分结合待测样品中的待测物，提高捕获率，提高检测下限；同时带磁珠的三元复合物能够在磁场的作用下进行富集，便于后续步骤使用检测计数；此外“磁珠-抗原-标记物”三元复合物在磁场中的分组，可以更进一步增加同时检测的待分析物的种类数。
3、标记物与磁珠的多种解离方式的组合运用的优势在于：可以最大限度地提高解离率。
4、本发明通过使用不同的标记物结合不同的待测物的方法，可以检测多个不同待测物的种类和含量，实现多靶标的同时检测。
5、本发明方法使用纳米颗粒计数法，不使用光学读取的方法，可以极大的提高检出下限。计数颗粒可以在有利于提高纳米孔计数信噪比的溶液中稳定读取，该方法可以在抗原抗体不稳定的环境中进行计数。
6、本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。
附图说明
图1为本发明“磁珠-抗原-标记物”三元复合物结构示意图。
图2为本发明检测方法的检测原理示意图：1为修饰有第一结合物的磁珠与含有待分析物的样品混合，2为修饰有第一结合物的磁珠与待分析物的第一结合位点特异性结合，3为加入修饰有第二结合物的标记物与待分析物的第二结合位点特异性结合，在磁场下去除未结合的修饰有第二结合物的标记物4为标记物与磁珠分离，收集上清中洗脱下来的标记物。
图3为不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数曲线图：其中数据圆点(o)为标准浓度样本计数值，实测样本的计数值(x)可在标准曲线上对应相应浓度。
图4为实施例2肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测示意图：不同标记物1和2与磁珠分离，收集上清中洗脱下来的标不同标记物1和2。标记物2较标记物1有较大的尺寸，对应较大的脉冲信号，以此来区分标记物1和2。
图5为实施例2肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测计数结果：标记物1和2混合物的脉冲数据，单个脉冲对应单个标记物颗粒。标记物2较标记物1有较大的尺寸，对应较大的脉冲信号，通过脉冲值可以区分标记物1和2，从而实现标记物1和2的计数。
图6为不同磁珠的磁场分离示意图：磁场方向和流体初始方向正交。三元复合物在磁场作用下发生偏转，小磁珠的三元复合物从第一个出口流出，大磁珠的三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例以肌钙蛋白cTnI的检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清白蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
l mg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，直径200纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3、肌钙蛋白cTnI检测方法
(1)将不同浓度的肌钙蛋白cTnI待检测样本(10fg/ml，100fg/ml,1pg/ml)与抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在铷磁铁的磁场(磁场强度为0.0001T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)向免疫三元复合物中先后加入解离液柠檬酸缓冲液(pH＝3)和NaOH溶液(pH＝13)洗脱纳米颗粒；
(6)磁场下吸取上清液重新分散在1M KCl缓冲液中。
(7)利用基于库尔特原理(U.S.Patent 2,656,508.1953)的纳米孔单颗粒计数装置(型号：qNano,Izon science Ltd.)对步骤(6)分散于KCl缓冲液中的纳米颗粒进行计数。
本实施例中，不同浓度的肌钙蛋白cTnI待检测样本(10fg/ml，100fg/ml，1000fg/ml)可以洗脱得到相应浓度的纳米颗粒上清液。将该上清液用上述方法进行计数。在图3中有10fg/ml，100fg/ml，1000fg/ml不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数数据(表1)，通过计数可以得到浓度和计数数目的标准曲线。其中数据圆点(o)为标准浓度样本计数值，实测样本的计数值(x)可在标准曲线上对应相应浓度为500fg/ml。
表1不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数数据
| 肌钙蛋白cTnI浓度 | 计数数目 |
| 10fg/ml | 4 |
| 100fg/ml | 43 |
| 1000pg/ml | 425 |
浓度计算公式：单位时间计数(N)＝浓度常数(A)*浓度(C)。这里浓度常数A由标准曲线得到，为0.42±0.02ml/pg。
进一步以浓度为500fg/ml的肌钙蛋白cTnI进行验证。经检测，计数数目为212，经计算公式换算后浓度为498fg/ml，准确率达99％以上。
实施例2
本实施例以肌钙蛋白cTnI和肌钙蛋白cTnT同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)和捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清白蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(二氧化硅微球，100纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3、肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测方法
洗脱方法在实施例1中一样的步骤之前，还通过添加肌钙蛋白分解酶的方法进行洗脱，得到两种标记物纳米颗粒的混合上清液，用于纳米孔计数。检测原理如图4所示，计数结果如图5所示，不同颗粒大小得到不同幅值的脉冲。检测结果如表2所示。
表2不同初始浓度肌钙蛋白的检测数据
| 蛋白 | 初始浓度 | 标记物计数数目 | 换算浓度 | 准确率 |
| cTnI | 75fg/ml | 31 | 72fg/ml | 98％ |
| cTnT | 500fg/ml | 210 | 485fg/ml | 97％ |
实施例3
本实施例以肌钙蛋白cTnI，肌钙蛋白cTnT，C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获CRP抗体1(K1016，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获PCT抗体1(K3b8，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，1000纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnI抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，1000纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入CRP抗体2(K1017，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(纳米金，10纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnT抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(纳米金，10纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入PCT抗体2(K58w3，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3.四种蛋白的同时检测
(1)将四种蛋白样本与四种抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在磁场(磁场强度0.0001T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入四种抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)磁场作用下的分离：上述混合物经过如图6所示的分叉管路，从左边管口进入，从右侧和上侧的三个管口流出。在管路路径上有由通上恒定电流的绕线线圈产生的大小为0.0001T的恒定磁场，磁场方向向上。在磁珠组成的三元复合物在磁场作用下发生偏转，150纳米磁珠的三元复合物从第一个出口流出，800纳米的磁珠三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。从而实现了根据磁珠尺寸实现分组。
(6)分离后进行解离。解离的标记物纳米颗粒进行计数，根据粒径大小的测量用于不同标记物的统计。
检测结果如表3所示。
表3不同初始浓度待检蛋白的检测数据
| 蛋白 | 初始浓度 | 标记物计数数目 | 换算浓度 | 准确率 |
| cTnI | 75fg/ml | 31 | 72fg/ml | 98％ |
| cTnT | 500fg/ml | 210 | 485fg/ml | 97％ |
| CRP | 100fg/ml | 42 | 98fg/ml | 98％ |
| PCT | 50fg/ml | 22 | 52fg/ml | 99％ |
实施例4
本实施例以肌钙蛋白cTnI，肌钙蛋白cTnT，C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获CRP抗体1(K1016，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获PCT抗体1(K3b8，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-50mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnI抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-20mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入CRP抗体2(K1017，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-50mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnT抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-20mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入PCT抗体2(K58w3，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3.四种蛋白的同时检测
(1)将四种蛋白样本与四种抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在磁场(磁场强度0.1T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入四种抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)磁场作用下的分离
上述混合经过如下图所示的分叉管路，从左边管口进入，从右侧和上侧的三个管口流出。在管路路径上有由通上恒定电流的绕线线圈产生的大小为0.001T的恒定磁场，磁场方向向上。在磁珠组成的三元复合物在磁场作用下发生偏转，150纳米磁珠的三元复合物从第一个出口流出，800纳米的磁珠三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。从而实现了根据磁珠尺寸实现分组。
分离后进行解离。解离的标记物纳米颗粒进行计数，根据电荷的测量用于不同标记物的统计。具体方式为用单粒子表面电位仪进行单粒子电位测量(型号：qNano,Izonscience Ltd.)。
表4不同初始浓度待检蛋白的检测数据
| 蛋白 | 初始浓度 | 标记物计数数目 | 换算浓度 | 准确率 |
| cTnI | 15fg/ml | 7 | 18fg/ml | 96％ |
| cTnT | 50fg/ml | 23 | 54fg/ml | 97％ |
| CRP | 10fg/ml | 5 | 12fg/ml | 96％ |
| PCT | 50fg/ml | 22 | 52fg/ml | 98％ |
由以上实施例可以看出：本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。本发明通过使用不同的标记物结合不同的待测物的方法，可以检测多个不同待测物的种类和含量，实现多靶标的同时检测。
本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，对这些实施例所进行的同等效果的修改和替换，均落入本发明权利要求的保护范围。
Claims (20)
1.一种生物样品检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将修饰有第一结合物的磁珠与含有待分析物的样品、修饰有第二结合物的标记物混合，得混合液；
(2)除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物；
(3)将步骤(2)处理后的混合液中的标记物与磁珠分离；
(4)去除样品中的磁珠，通过对标记物进行计数和/或电荷、粒径测量得出样品中待分析物的含量以及种类；
其中，第一结合物和第二结合物分别依次与所述待分析物的第一结合位点、第二结合位点特异性结合。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于：步骤(2)的方法为：在磁场的控制下，吸附混合物中的磁珠，除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物，磁场的强度不低于0.0001T。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，标记物和磁珠的分离方法为：
1)利用解离剂，解离磁珠与第一结合物的连接或第二结合物与标记物的连接；
或者2)使用第一结合物的竞争分子、待分析物的竞争分子、或第二结合物的竞争分子使得标记物被从磁珠上替换下来；
或者3)特异性分解酶分解第一结合物、待分析物或第二结合物；
或者4)采用以上方法的组合。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)是通过磁场吸附，去除样品中的磁珠；标记物的计数采用纳米孔计数法、或者NTA检测法、或者纳米流式计数法、或者数字荧光计数法检测。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述标记物为直径在10nm～1000nm的颗粒。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
11.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸或者表面电位上有可测量的差异；
在步骤(3)之前，通过磁场梯度、磁场偏转或者离心的方法，将不同尺寸或者不同磁感应强度的磁珠分组；
在不同分组中根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量，更大限度实现不同待测物的同时检测。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上；每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
13.一种生物样品检测试剂盒，其包括：
a.修饰有第一结合物的磁珠，第一结合物能够与待分析物的第一结合位点特异性结合；
b.修饰有第二结合物的标记物，第二结合物能够与待分析物的第二结合位点特异性结合。
14.根据权利要求13所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：所述标记物为直径在10nm～1000nm的颗粒。
15.根据权利要求14所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
16.根据权利要求13的生物样品检测试剂盒，其特征在于：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
17.根据权利要求16所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
18.根据权利要求13-17任一项所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的，每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
19.根据权利要求13-17任一项所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的，每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上；
作为优选的：每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
20.根据权利要求13-17任一项所述的生物样品检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括缓冲液、解离剂以及小型磁铁装置，或者用于产生磁场的线圈装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010592579.0A CN111830251A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
| PCT/CN2020/128738 WO2021258618A1 (zh) | 2020-06-24 | 2020-11-13 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010592579.0A CN111830251A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111830251A true CN111830251A (zh) | 2020-10-27 |
Family
ID=72899359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010592579.0A Pending CN111830251A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111830251A (zh) |
| WO (1) | WO2021258618A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021120943A1 (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种检测样品体系中微量蛋白的方法 |
| CN113552364A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-26 | 中南大学 | 用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法 |
| WO2021258618A1 (zh) * | 2020-06-24 | 2021-12-30 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
| CN113866427A (zh) * | 2021-10-09 | 2021-12-31 | 河南沃迈生物科技有限公司 | 一种新型快速超敏c-反应蛋白试剂盒及应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117825685A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-04-05 | 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 | 一种赭曲霉毒素a胶体金标记物及其制备方法和应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104949943A (zh) * | 2014-03-25 | 2015-09-30 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种生物样品快速检测方法 |
| CN105734043A (zh) * | 2014-12-27 | 2016-07-06 | 美天施生物科技有限责任公司 | 多分选细胞分离方法 |
| US20160266105A1 (en) * | 2013-07-19 | 2016-09-15 | California Institute Of Technology | Digital assay for quantifying and concentrating analytes |
| CN106645700A (zh) * | 2016-12-22 | 2017-05-10 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法 |
| CN106999929A (zh) * | 2014-09-11 | 2017-08-01 | 克忧公司 | 用于检测和量化分析物的系统和方法 |
| CN107690582A (zh) * | 2015-04-03 | 2018-02-13 | 雅培制药有限公司 | 用于样品分析的装置和方法 |
| CN109490528A (zh) * | 2017-10-05 | 2019-03-19 | 香港科技大学 | 外泌体分析及癌症诊断方法 |
| CN109541215A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-29 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种肿瘤检测物及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130065780A1 (en) * | 2010-02-15 | 2013-03-14 | North Carolina State University Office Of Technology Transfer | Label-Free Multiplexing Bioassays Using Fluorescent Conjugated Polymers and Barcoded Nanoparticles |
| CN111122398A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-05-08 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种微纳颗粒的检测装置及方法 |
| CN111830251A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-27 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
-
2020
- 2020-06-24 CN CN202010592579.0A patent/CN111830251A/zh active Pending
- 2020-11-13 WO PCT/CN2020/128738 patent/WO2021258618A1/zh active Application Filing
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160266105A1 (en) * | 2013-07-19 | 2016-09-15 | California Institute Of Technology | Digital assay for quantifying and concentrating analytes |
| CN104949943A (zh) * | 2014-03-25 | 2015-09-30 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种生物样品快速检测方法 |
| CN106999929A (zh) * | 2014-09-11 | 2017-08-01 | 克忧公司 | 用于检测和量化分析物的系统和方法 |
| CN105734043A (zh) * | 2014-12-27 | 2016-07-06 | 美天施生物科技有限责任公司 | 多分选细胞分离方法 |
| CN107690582A (zh) * | 2015-04-03 | 2018-02-13 | 雅培制药有限公司 | 用于样品分析的装置和方法 |
| CN106645700A (zh) * | 2016-12-22 | 2017-05-10 | 广州华弘生物科技有限公司 | 一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法 |
| CN109490528A (zh) * | 2017-10-05 | 2019-03-19 | 香港科技大学 | 外泌体分析及癌症诊断方法 |
| CN109541215A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-29 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种肿瘤检测物及其制备方法与应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021120943A1 (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种检测样品体系中微量蛋白的方法 |
| WO2021258618A1 (zh) * | 2020-06-24 | 2021-12-30 | 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 |
| CN113552364A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-26 | 中南大学 | 用于检测心梗标志物的高频压电石英晶体传感系统及其检测方法 |
| CN113866427A (zh) * | 2021-10-09 | 2021-12-31 | 河南沃迈生物科技有限公司 | 一种新型快速超敏c-反应蛋白试剂盒及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021258618A1 (zh) | 2021-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111830251A (zh) | 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 | |
| CN111679086B (zh) | 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法 | |
| US7704730B2 (en) | Multiplexed assay methods | |
| US8956823B2 (en) | Anti-antibody reagent | |
| JPH03504276A (ja) | 分析方法 | |
| US20130011827A1 (en) | Methods and kits for decreasing interferences in plasma or serum containing assay samples of specific binding assays | |
| JP4274944B2 (ja) | ダイナミックレンジが拡張された粒子利用リガンドアッセイ | |
| US20210405033A1 (en) | Analyte detection and methods therefor | |
| US20170138937A1 (en) | Detection of analytes | |
| JP2005510706A5 (zh) | ||
| CN112505322A (zh) | 阿尔茨海默病标志物p-Tau217检测试剂盒及其制造方法 | |
| EP4051102A1 (en) | Analyte detection and quantification by discrete enumeration of particle complexes | |
| US20020137097A1 (en) | Standard diluent for multiplex assays | |
| US20050191677A1 (en) | Mass spectrometric concentration measurement of proteins | |
| KR20200141277A (ko) | 면역진단 키트 및 이를 이용한 면역진단 방법 | |
| JP2005514622A (ja) | 生体サンプルのマルチパラメトリック定量に適用される単独較正システムを得る方法、この目的のために調製された免疫学的試薬、および定量方法 | |
| Li et al. | Preparation and characterization of a homogeneous immunoassay for point-of-care testing (POCT) of procalcitonin (PCT) | |
| CN114563578A (zh) | 人膜性肾病诊断试剂盒 | |
| CN118033119A (zh) | 一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法 | |
| US20120258882A1 (en) | Method for quantitatively detecting biomolecules | |
| US20210063387A1 (en) | Means and method for detecting analytes by means of macroscopic granulate particles | |
| JP2024523356A (ja) | 構造が切り替わる結合剤を使用して被検物質を検出するための方法 | |
| CN117630154A (zh) | 一种单颗粒电感耦合等离子体质谱的差量计数分析方法 | |
| CN117890575A (zh) | 一种用于检测神经因子的无微球均相化学发光检测方法 | |
| CN118033117A (zh) | 一种用于在现场进行多重检测的免洗涤生物传感方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201027 |