CN111679086B - 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝素结合蛋白的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法，以及其在肝素结合蛋白免疫学检测中的应用。所述磁微粒化学发光检测试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液、生物素标记的肝素结合蛋白捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液、发光标记物偶联的肝素结合蛋白检测抗体溶液以及肝素结合蛋白系列校准品和质控品。本发明中的试剂盒利用磁微粒化学发光检测法的优势，在使用全自动化学发光免疫分析仪检测标本中肝素结合蛋白时，具有操作简便，特异性强，灵敏度高，线性范围宽等特性。

Description

一种HBP的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于医学免疫诊断试剂领域，特别涉及基于化学发光法的肝素结合蛋白检测。

背景技术

肝素结合蛋白(Heparin Binding Protein-简称HBP)是一种中性粒细胞分泌的颗粒蛋白，具有杀菌作用，同时也参与炎症反应和凝血过程的调节。1984年，Shafer等人首次发现并分离出这种蛋白，根据其正电性的特征和杀菌的功能命名为CAP37(CationicAntimicrobial Protein,分子量37kDa)。后来又陆续有人从多形核白细胞中的嗜苯胺蓝颗粒中分离出天青杀素(Azurocidin)，以及与肝素有很强结合能力的肝素结合蛋白(HBP-Heparin Binding Protein)。进一步的蛋白质结构和基因测序的研究表明，这三种蛋白实际上是同一种蛋白，在本发明中统一用肝素结合蛋白来代表。肝素结合蛋白是一种多功能的蛋白，可以通过结合血管上皮细胞，改变血管通透性，诱导血浆渗漏和炎症反应。肝素结合蛋白还能够趋化和激活单核白细胞和巨噬细胞，应对细菌感染，参与调节免疫反应。最近的一些研究工作表明，血浆中的肝素结合蛋白的浓度与脓毒症以及脓毒症休克有很强的相关性。脓毒症是全身性的感染炎症反应，会引起体温改变、心率加快、呼吸急促等症状，导致全身凝血功能紊乱和免疫炎症反应失衡，诱发器官功能衰竭，严重时会发生脓毒症休克甚至死亡。医学界对脓毒症的病原机理还不是十分清楚，及早地预测脓毒症的发生能有效地防止脓毒症引起的器官衰竭以及死亡。Linder等人(Adam Linder et al,Critical CareMedicine,2015,43:2378-2386)的研究表明作为参与炎症反应的肝素结合蛋白，能够有效地预测脓毒症以及脓毒症休克的发生，是一个很好的临床诊断指标。

检测肝素结合蛋白(HBP)的代表产品是英国Axis-Shield公司的酶联免疫分析试剂盒(国械注进20162400300)。酶联免疫分析法是在96孔板上包覆捕捉抗体，当含有抗原的样品在孔中培养时，包覆在孔内的抗体通过抗体抗原反应捕捉样品中的抗原，然后用酶标记的检测抗体与抗原结合，形成抗体-抗原-抗体的三明治结构。标记好的的酶可以与相应的底物定量地发生反应，产生颜色变化。通过测量特定波长下的吸光度变化，可以定量检出样品中的抗原浓度。酶联免疫分析法可以准确地检测样品中的肝素结合蛋白浓度，但是实际操作中酶联免疫分析(ELISA)实验耗时比较长，一般需要4至5小时才能得到检测结果，作为预测脓毒症及炎症反应的重要指标，不能够很好地满足门诊或者急诊的快速检测的需求。同时96孔板只能是每8孔进行拆卸，不能够做到单人份测试，且检测范围只能覆盖5.9-200.0ng/mL，由于临床上报道的HBP值高于检测范围上限的例子较多，该试剂盒的使用上存在局限性。其他报道的检测方法还有CN204882574U公开的胶体金法和CN204882575U公开的免疫荧光层析的方法。胶体金法和免疫荧光层析法虽然可以快速检测，但是只能进行定性或者半定量的检测，准确度低，无法提供精确的临床判断依据。同时受限于方法本身，由于使用的是非均相反应体系，检测的精密度差，且无法从操作程序上清除干扰物，使得测试的准确性不能得到保障。

发明内容

为了解决上述现有各种方法的不足，本发明的目的是提供灵敏度高、特异性好、线性范围宽、能够快速准确的检测血液样本中的肝素结合蛋白(HBP)浓度的化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法。

根据本发明的一方面，提供了一种肝素结合蛋白化学发光检测试剂盒，所述肝素结合蛋白检测试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液、生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液、发光标记物偶联的HBP检测抗体溶液、与发光标记物相适用的底物和激发液以及HBP系列校准品和质控品。

根据本发明的一方面，所述链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液中，磁微粒悬浮溶液的浓度为1-2mg/mL。

根据本发明的一方面，所述的生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液，其中生物素标记的HBP捕获抗体与生物素标记的牛血清白蛋白按质量比10：1至10：4混合，生物素标记的抗体和蛋白总浓度为1-3μg/mL。采用生物素标记抗体链接到链霉亲和素包被的磁微粒的方法在化学发光免疫检测中经常使用，最早由HOECHSTJAPAN公司发明，专利号JP19790121912。因为链霉亲和素与生物素的结合比例为1:4，区别于抗体通过偶联剂直接标记到磁珠表面的方法，其包被效率提升了4倍。捕获抗体包被效率提升后，捕获抗原的成功率会提升，因此检测灵敏度提升。但是在提升磁珠上捕获抗体的捕获抗原能力的同时，也会由于抗体使用量变大，捕获抗体在磁珠表面排布过密，导致无效抗体量变多，试剂成本增加很多。同时由于抗体排布密集，抗体之间的空间位阻效应放大，在有些时候反而会降低检测时的灵敏度和特异性。本发明中采用生物素标记的捕获抗体与生物素标记的牛血清白蛋白共同结合磁珠上的链霉亲和素，不仅可以有效降低捕获抗体在磁珠表面排布过密所引起的空间位阻效应，同时牛血清白蛋白作为常用抗体封闭剂和保护剂，可以起到保护磁珠上捕获抗体的作用，也能有效降低非特异性吸附带来的测试干扰。

根据本发明的一方面，所述HBP捕获抗体为单克隆抗体。

根据本发明的一方面，所述的发光标记物偶联的HBP检测抗体溶液中，HBP检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，抗体浓度为1-3μg/mL，优选的抗体种类为多克隆抗体。

根据本发明的一方面，所述的发光标记物偶联的HBP检测抗体溶液中，发光标记物为碱性磷酸酶或吖啶酯中的一种。

根据本发明的一方面，所述的肝素结合蛋白检测试剂盒中，有与发光标记物相适用的底物和激发液。

根据本发明的一方面，所述校准品和质控品的制备方法是将重组或天然的肝素结合蛋白溶解于下述稀释液，配制成浓度分别为0、5、50、100、200、300ng/mL的校准品，以及浓度分别为8和40ng/mL的质控品。

根据本发明的一方面，所述试剂盒中全部试剂组份的稀释液由非离子型缓冲溶液、非离子型表面活性剂、无机盐、二糖稳定剂、蛋白保护剂和防腐剂组成。所述非离子型缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液和2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液的其中任一种，缓冲液浓度范围为10-100mmol/L，缓冲液pH范围为5.5-7.5；所述非离子型表面活性剂为0.1％-1％的月桂醇聚氧乙烯醚或tween-20；所述无机盐为10-100mmol/L的氯化钠或氯化钾；所述二糖稳定剂为0.5-4％的蔗糖或海藻糖；所述蛋白保护剂为0.5-8％的甘氨酸和精氨酸；防腐剂为0.1-0.4％Proclin-300。

本发明提供的试剂盒是供化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay-CLIA)使用，该方法是利用吸附在磁微粒上的HBP抗体捕捉测试样品中的肝素结合蛋白(HBP)，利用吖啶酯或碱性磷酸酶标记的HBP抗体检测测试样品中的肝素结合蛋白(HBP)，形成抗体-抗原-抗体的复合物。当发光标记物是吖啶酯时，碱性环境中加入H₂O₂后自身发光；当发光标记物是碱性磷酸酶时，加入(金刚烷)-1，2-二氧环乙烷，失去磷酸根，发出光信号，由仪器检测溶液的发光值(RLU)，根据标准曲线定量地计算出测试样品中肝素结合蛋白的浓度。本发明和酶联免疫试剂盒相比，由于采用化学发光免疫分析法，本发明的试剂盒在使用中具有操作简便，特异性强，灵敏度高，线性范围宽，精密度高等优点。

本发明的有益效果包括：

1.节约成本，同时可有效提升检测灵敏度和特异性。生物素与链霉亲和素的结合比例是4：1，在生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白与链霉亲和素包被的磁珠混合时，生物素标记的牛血清白蛋白与生物素标记的HBP捕获抗体按比例结合链霉亲和素包被的磁珠上的4个生物素结合位点，不仅减少了HBP捕获抗体密集排布在磁珠表面所导致的空间位阻效应，同时牛血清白蛋白还可以降低抗体与抗原结合时的其他生物大分子引起的非特异性反应。所以采用生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液，相对于只有生物素标记的HBP捕获抗体溶液进行反应时，可得到更高的灵敏度，同时也有更好的特异性。抗体是试剂材料成本占比最高的成分，可以高达试剂材料成本的90％。在生物素标记的HBP捕获抗体中加入一定比例的生物素标记的牛血清白蛋白，还可降低HBP捕获抗体的用量，从而节约了使用成本。

2.检测快速，本发明方法在全自动化学发光免疫分析仪上1小时可以完成120-200个检测，在半自动生化分析仪上15分钟可以完成检测。而现有的ELISA方法需要4到5小时完成检测。

3.试剂量程宽，线性范围广，可以不用稀释直接测量浓度高达300ng/mL的样品,同时抗原浓度高达700ng/mL也不会出现钩状(Hook)效应。

4.试剂适用性好。本发明所提供的化学发光法检测试剂盒既可以在全自动化学发光免疫分析仪上使用，也可以在半自动化学发光免疫分析仪上使用。可以同时满足大型医院检验科、小型医院门诊、以及急诊科室的检测需要。

附图说明

图1为实施例1的标准曲线；

图2为实施例1的线性范围；

图3为实施例1的钩状效应曲线；

图4为实施例1的相关性分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

实施例1

(1)生物素标记的HBP捕获抗体溶液的制备

预先将生物素用二甲基亚砜溶解至1mg/ml，将生物素-二甲基亚砜溶液与HBP捕获抗体按质量比1:10进行混合，控制体积在100ul以内，加入碳酸盐缓冲溶液将体积补足至150ul，37℃条件下孵育1h，反应完后将溶液使用50kDa超滤管超滤换液，期间更换3次超滤液。最终所得抗体浓缩液收集在50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300中，生物素标记的HBP捕获抗体的终浓度为2μg/mL。

(2)生物素标记的牛血清白蛋白溶液的制备

预先将生物素用二甲基亚砜溶解至1mg/ml，将生物素-二甲基亚砜溶液与牛血清白蛋白按质量比1:10进行混合，控制体积在100ul以内，加入碳酸盐缓冲溶液将体积补足至150ul，37℃条件下孵育1h，反应完后将溶液使用30kDa超滤管超滤换液，期间更换3次超滤液。最终所得抗体浓缩液收集在50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300中，生物素标记的牛血清白蛋白的终浓度为2μg/mL。

(3)生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液实施例1(1)中的生物素标记的HBP捕获抗体和实施例1(2)中的生物素标记的牛血清白蛋白按体积比10：2混合，由于二者的浓度都为2μg/mL，所以混合后的生物素标记的抗体和蛋白总浓度为2μg/mL。

(4)生物素标记的抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液包被的磁微粒悬浮溶液的制备

本产品使用市售的链霉亲和素磁珠(采购于挪威Dynal公司的

M-270链霉亲和素)，将磁珠溶液摇晃均匀，移取100ul磁珠溶液于离心管中，放置于磁力架上吸附2min，进行磁性分离，弃去上清液，在离心管中加入等体积稀释液，将磁珠重新悬浮，并混合均匀。按上述清洗方法将磁珠再清洗一次，用稀释液将磁珠稀释至1mg/ml即可使用。所述磁珠稀释液为50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300。

取用清洗后的磁珠1mg于离心管中，置于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液，将10ug生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液加入磁珠中，使磁珠重新悬浮，将反应溶液放置于37℃，摇床中200r/min震荡反应2h。反应完成后用磁珠清洗液将磁珠清洗2次后，用5ml磁珠贮存液进行重悬，并放置于4℃进行保存。所用磁珠包被液和清洗液为50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300。

(5)生物素标记的HBP捕获抗体包被的磁微粒悬浮溶液的制备取用实施例4中清洗后的磁珠1mg于离心管中，置于磁力架上进行磁性分离，弃去上清液，将10ug生物素标记的HBP捕获抗体加入磁珠中，使磁珠重新悬浮，将反应溶液放置于37℃，摇床中200r/min震荡反应2h。反应完成后用磁珠清洗液将磁珠清洗2次后，用5ml磁珠贮存液进行重悬，并放置于4℃进行保存。所用磁珠包被液和清洗液为50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300。

(6)吖啶酯标记的HBP检测抗体的制备

预先将吖啶酯用二甲基亚砜溶解至4mg/ml，将吖啶酯-二甲基亚砜溶液与HBP检测抗体按质量比1:10进行混合，控制体积在100ul以内，加入碳酸盐缓冲溶液将体积补足至150ul，37℃条件下孵育1h，反应完后将溶液使用50kDa超滤管超滤换液，期间更换3次超滤液。最终所得抗体浓缩液收集在50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300中，吖啶酯标记的HBP检测抗体的终浓度为2μg/mL。

(7)校准品和质控品的制备

将市售的HBP抗原用校准品稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0ng/mL,5ng/mL，50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,300ng/mL，校准品稀释液的组成是50mM pH7.3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化钾、2％蔗糖、4％精氨酸、0.2％Proclin-300。

将高浓度的HBP样品(80ng/mL)用校准品稀释液稀释成8ng/mL和40ng/mL，分别作为低值质控品和高值质控品。

(8)HBP标准曲线的建立

将50ul生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液包被的磁微粒悬浮溶液，50ul HBP校准品，100ul HBP检测抗体溶液加入反应杯中，37℃孵育12min，用磁珠清洗液清洗3次，用半自动化学发光免疫分析仪进行测试，记录发光值(RLU)，具体数据见表1。根据浓度和发光值可以建立标准曲线。图1是实施例1中建立的标准曲线。

表1.实施例1中HBP标准曲线测试发光值结果

校准品浓度(ng/mL)	0	5	50	100	200	300
							发光值(RLU)	1569	35689	201358	325846	502148	658245

实施例2

试剂的分析灵敏度(空白限)

使用实施例1(4)和(5)中的试剂，选用生理盐水作为空白样本测试，重复测试20次，用半自动化学发光免疫分析仪进行测试，记录发光值(RLU)，具体数据见表2。计算20次测试结果的平均值(X)和标准差(SD)，将X±2SD的计算值带入实施例1中建立的标准曲线计算浓度值，所得浓度值作为试剂的分析灵敏度(空白限)。测试结果如表2所示，(4)中的试剂的分析灵敏度(空白限)空白限为0.34ng/mL，(5)中的试剂的分析灵敏度(空白限)为2.11ng/mL，(4)中的试剂的分析灵敏度要远低于(5)中的试剂的分析灵敏度，因此选择(4)中的试剂完成后续的性能分析，同时印证了说明书中有益效果的第一条。肝素结合蛋白(HBP)的检测临床参考值在12ng/mL左右，本发明试剂的分析灵敏度比参考值要小一个数量级，完全符合使用的需要。

表2.实施例1的HBP试剂分析灵敏度测试结果

实施例3试剂的特异性

使用实施例1(4)和(5)中的试剂，向低值质控品(8ng/mL)和高值质控品(40ng/mL)中分别添加校准品稀释液(空白组)和校准品稀释液溶解的不同浓度的特异性干扰物胆红素(D实验组)、甘油三酯(G实验组)、总蛋白(Z实验组)和类风湿因子(L实验组)，稀释后各组中低值质控品和高值质控品的理论值降低为6.4和32ng/mL。通过对空白组和实验组检测结果的比较，5次测试的平均值与理论值相对偏差越小的测试组，特异性越好。

表3实施例1(4)的特异性检测结果

表4实施例1(5)的特异性检测结果

实施例1(4)相对实施例1(5)的5次检测结果的相对偏差低很多，因此实施例1(4)的生物素标记的捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白的混合蛋白溶液包被的磁珠相对于只有生物素标记的捕获抗体包被的磁珠，特异性更好。

实施例4

试剂的线性范围

用零值HBP校准品稀释浓度300ng/mL的高浓度HBP校准品，分别制成300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、0ng/mL共6个不同的稀释浓度样本。使用实施例1中制备的试剂对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。测量结果见表5。以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)。线性相关曲线见图2。

表5.实施例1的HBP试剂线性范围测量结果

理论浓度(ng/mL)	300	200	100	50	5	0
							RLU1	653564	483651	312058	195623	31568	1456
RLU2	685114	496320	345682	215205	35246	1652
							RLU3	623584	523148	302584	220549	35921	1756
RLU均值	654087	501040	320108	210459	34245	1621
							浓度值(ng/mL)	281.02	188.18	93.98	49.33	4.31	0.24

实施例5

试剂的重复性用实施例1中制备的试剂测试HBP浓度为8ng/mL左右的正常值水平的控制物质和HBP浓度为40ng/mL左右的异常值水平的控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值(X)和标准差(SD)。按式(1)计算变异系数(CV)。测试结果见表6。根据测量结果，计算出变异系数CV＝4.69％和1.63％，符合试剂CV合试剂的技术要求。

CV＝SD/X…………(1)

式中：

CV——变异系数；

SD——标准差；

X——测量值的平均值。

表6.实施例1的HBP试剂重复性测量结果

实施例6

试剂的钩状(Hook)效应

将市售的HBP抗原用校准品稀释液配制成一系列浓度的抗原溶液，浓度分别为300ng/mL，400ng/mL,500ng/mL,600ng/mL,700ng/mL,800ng/mL,900ng/mL,1000ng/mL。图3是实施例1中发光值(RLU)随抗原浓度的变化关系。本发明提供的化学发光检测试剂盒在700ng/mL时不出现Hook效应。图3为实施例1的钩状效应曲线。

实施例7

与进口ELISA试剂盒的相关性分析

在本实施例中，我们收集了264个临床血浆样本，采用实施例1中的试剂进行检测，检测结果与市场上的进口试剂盒的检测结果进行了相关性分析。分析结果如图4所示。相关性直线拟合的结果显示拟合方程为y＝0.9857x+0.7755，其中Y轴截距为0.7755，斜率为0.9836，相关系数R＝0.9765。这个结果表明本发明中的试剂盒和进口上市试剂盒相关性高，准确性非常一致。

实施例8

与市场上其他试剂盒的性能参数对比

本发明试剂与市场上其他HBP试剂盒的性能参数对比情况如表7所列。从表中可以看出，本发明的盒试剂主要在检测需要的试剂数量和种类、试剂的线性范围、试剂的检测速度和精密度方面明显优于市场上的对比试剂盒。

表7.HBP试剂盒性能参数对比

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述肝素结合蛋白检测试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液、生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液、发光标记物偶联的HBP检测抗体溶液、与发光标记物相适用的底物和激发液以及HBP系列校准品和质控品。

2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中全部试剂组份的稀释液由非离子型缓冲溶液、非离子型表面活性剂、无机盐、二糖稳定剂、蛋白保护剂和防腐剂组成，所述非离子型缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸缓冲液和2-吗啉乙磺酸缓冲液的其中任一种，缓冲液浓度范围为10-100mmol/L，缓冲液pH范围为5.5-7.5；所述非离子型表面活性剂为0.1％-1％的月桂醇聚氧乙烯醚或tween-20；所述无机盐为10-100mmol/L的氯化钠或氯化钾；所述二糖稳定剂为0.5％-4％的蔗糖或海藻糖；所述蛋白保护剂为0.5％-8％的甘氨酸和精氨酸；防腐剂为0.1％-0.4％Proclin-300。

3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，浓度为1-2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的生物素标记的HBP捕获抗体和生物素标记的牛血清白蛋白混合溶液，其中生物素标记的HBP捕获抗体与生物素标记的牛血清白蛋白按质量比10：1至10：4混合，生物素标记的抗体和蛋白总浓度为1-3μg/mL；所述HBP捕获抗体为单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的发光标记物偶联的HBP检测抗体溶液中，发光标记物为碱性磷酸酶或吖啶酯中的一种；所述HBP检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种，抗体浓度为1-3μg/mL。

6.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的HBP系列校准品和质控品的制备方法是将重组或天然的肝素结合蛋白溶解于权利要求2中的稀释液，配制成浓度分别为0、5、50、100、200、300ng/mL的校准品，以及浓度分别为8ng/mL和40ng/mL的质控品。

Images