CN113945712A - 一种区别细菌、病毒感染的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种区别细菌、病毒感染的检测方法及检测试剂盒。目前细菌、病毒感染临床鉴别的检测主要以C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)的检测为主,上述标志物检测的准确性较低,并且检测周期较长。本发明目的在于提供一种检测结果更加准确并且易于操作的检测方法,具体的,本发明提供了一种TRAIL,IP‑10,CRP的联合检测方法,并对检测体系所使用的缓冲试剂进行了优化,优化后的检测方法实现了更好的稳定性,应用于试剂盒的制备有效提高了试剂盒产品的准确性。
Description
技术领域
本发明属于标志物检测技术领域,涉及一种区别细菌、病毒感染的检测方法以及检测试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
C-反应蛋白(CRP)是目前在临床广泛应用的细菌感染生物标志物。作为敏感的炎症标志物,CRP检测快速、便捷,其升高幅度与感染或炎症严重程度呈正相关;CRP检测还可辅助区分细菌感染和病毒感染。
目前临床上应用最广的是C-反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)来鉴定细菌和病毒感染,目前临床上应用最广的检测试剂盒为乳胶增强法和化学发光法。但是仅用CRP和PCT检测不能完全排除细菌感染,因此不能完全解决抗生素滥用的问题。
北京市心肺血管疾病研究所具有公开专利“检测肺栓塞的血清标志物及其应用(CN 107843732 A)”,该专利指出TRAIL用于区分肺栓塞患者和正常人的血清诊断标志物,并公开了一种TRAIL诊断试剂盒。该试剂盒为ELISA方法,需要大量手工操作,该方法稳定性较差,并且有交叉污染的风险。
为了减少抗生素的滥用,提高区分细菌和病毒性感染的准确度。近年来,研究发现肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)可以作为区分病毒和细菌感染的有效生物标志物。新研究表明,TRAIL可以作为慢性肾脏疾病、冠状动脉疾病、自身免疫性疾病和移植术后的炎症标志物。血浆的表达水平可能与炎症性疾病的严重程度、临床预后密切相关。TRAIL作为凋亡信号通路的关键分子和免疫系统调节因子,在2型糖尿病肾病中随着肾间质病变程度加重表达水平逐渐升高。动物实验证实,TRAIL在脓毒症病理生理过程中具有重要调节作用,其参与了脓毒症免疫抑制的形成。在脓毒症患者中血浆表达明显降低,其表达的水平可能反映患者免疫状态的变化。TRAIL的检测可以预测脓毒症患者的免疫功能状态及预后。在脓毒症不同免疫状态下干预及其受体可能是脓毒症治疗的潜在靶点。
趋化因子在细胞免疫聚集反应中有着关键作用,其中IP-10属于Cx3C趋化因子亚家族,主要由脂多糖或IFN-γ诱导产生,趋化淋巴细胞能力极强。正常生理状态情况下,仅有少量T细胞分泌IP-10,当机体出现结核分枝杆菌感染后,结核性肉芽肿形成,IP-10大量分泌并结合支气管组织细胞Cx3C,使局部组织炎性反应加剧,以CD4+为主的淋巴细胞大量聚集,IFN-γ表达增强。
发明内容
基于上述技术背景,本发明目的在于提供一种准确区分细菌及病毒感染的检测方法,所述方法对TRAIL,IP-10,CRP三种标志物进行联合检测,该检测方法克服了现有方法检测周期长、准确性不足的缺陷。
为了实现上述技术目标,本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面,提供一种区别细菌、病毒感染的检测方法,所述检测方法以TRAIL、IP-10、CRP作为检测标志物,向待测血清中加入包被抗体及标记抗体构建包被抗体-标志物-标记抗体复合物,通过磁珠分离所述复合物通过化学发光检测。
本发明首先对检测标志物进行了优化,经验证,采用TRAIL,IP-10,CRP联合作为诊断标志物具有更好的准确性,两种或两种以上标志物为阳性时判断为病毒感染,两种或两种以上标志物为阴性则判断为细菌感染,上述判断方式准确性显著超过现有诊断标志物。
为了实现针对上述标志物的快速、灵敏检测,本发明分别设计包被抗体和标记抗体与待检物质形成双抗夹心物。利用磁微粒化学发光免疫分析方法对样本中TRAIL,IP-10,CRP含量进行定量测定。反应的技术原理为:吖啶酯标记的标记抗体同校准品、质控品或者样本中的TRAIL,IP-10,CRP和标记生物素的包被抗体三者,形成抗体-抗原-抗体复合物,最后加入链霉亲和素磁珠,通过生物素和链霉亲和素特异性的结合连接在磁珠上,在外加磁场中直接沉淀,将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物,加入化学发光底物液A和B。吖啶酯在碱性条件下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时便发出光子,形成发光反应,即可使用发光仪检测反应的发光强度。发光强度与样本中TRAIL,IP-10,CRP的含量呈正比,使用四参数Logistic方程拟合可计算出样本中TRAIL,IP-10,CRP的浓度。
本发明第二方面,提供检测TRAIL,IP-10,CRP的试剂盒,所述试剂盒中分别包括TRAIL、IP-10、CRP的包被抗体、磁珠、标记抗体、发光底物、校准品及质控品,所述试剂盒的特征在于,所述包被抗体及标记抗体的缓冲液中还具有蛋白保护剂及糖类。
以上一个或多个技术方案的有益效果是:
1.提供了一种区分细菌和病毒感染的TRAIL,IP-10,CRP标志物联检方法,提高非细菌感染诊断的特异性和灵敏度。
2.本发明利用磁微粒与化学发光技术相结合,提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好的定量检测方法,并适用于全自动化学发光仪,操作简单,适合临床大量检测血清的需求。
3.本发明采用独特的缓冲体系,加入蛋白保护剂及糖类提高检测的稳定性和重复性。
4.磁微粒试剂作为一种试剂盒通用试剂,较大地减少了因连接差异而产生的批间差,提高了试剂盒的精密度及稳定性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为TRAIL区分病毒感染所绘制ROC曲线线下面积;
图2为IP-10区分病毒感染所绘制ROC曲线线下面积;
图3为CRP区分病毒感染所绘制ROC曲线线下面积。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,目前临床区分细菌和病毒感染的血清标志物为C反应蛋白和降钙素原,但是即使血清检测C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)阴性的患者,也不能完全排除细菌感染,造成临床上抗生素滥用。因此,针对上述技术问题,进行多项标志物联检并发明更灵敏更可靠的检测试剂盒,对于区分细菌和病毒感染,并指导抗生素的使用,有着重要的应用价值和意义。
本发明第一方面,提供一种区别细菌、病毒感染的检测方法,所述检测方法以TRAIL、IP-10、CRP作为检测标志物,向待测血清中加入包被抗体及标记抗体构建包被抗体-标志物-标记抗体复合物,通过磁珠分离所述复合物并进行化学发光检测。
优选的,所述检测方法中,将TRAIL、IP-10、CRP中一种或几种的组合作为检测标志物;进一步的方案中,所述检测方法以三种标志物的组合结果对细菌、病毒感染进行判断,判断方式如下:以两种或两种以上标志物为阳性时判断为病毒感染,两种或两种以上标志物为阴性则判断为细菌感染。
更进一步的,所述TRAIL的临界值(cut-off)为78.5 pg/mL,所述IP-10临界值(cut-off)为 454 pg/mL,所述CRP临界值(cut-off)为 41.5 mg/L;CRP≤41.5 mg/L即CRP标志物为阳性, TRAIL≥78.5 pg/mL即TRAIL标志物为阳性,IP-10≥454 pg/mL即IP-10标志物为阳性,反之则为阴性。
优选的,所述检测方法具体步骤如下:将待测血清与生物素标记的包被抗体、混合孵育,加入标记抗体后获得包被抗体-标志物-标记抗体复合物,最后加入链霉亲和素磁珠将复合物连接在磁珠上,在外加磁场中沉淀磁珠并将复合物移出加入发光底物后对光强度进行检测。
进一步的,所述血清与包被抗体、标记抗体在35~39℃孵育8~12min。
进一步的,所述加入磁珠后孵育35~39℃孵育8~12min。
上述优选技术方案的一种实施方式中,所述化学发光检测可通过磁微粒化学发光仪进行分析,将血清中上述待测物的发光值与质控品进行对照,从而计算TRAIL,IP-10,CRP的浓度。
本发明第二方面,提供一种用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,所述试剂盒中包括TRAIL、IP-10、CRP的包被抗体、磁珠、标记抗体、发光底物、校准品及质控品,所述试剂盒的特征在于,所述包被抗体及标记抗体的缓冲液中还具有蛋白保护剂及糖类。
优选的,所述包被抗体为TRAIL小鼠单克隆抗体、IP-10小鼠单克隆抗体、CRP小鼠单克隆抗体,所述包被抗体具有生物素标记。
进一步的,所述包被抗体和生物素以摩尔比1:10-1:40进行混匀,室温反应0.5-4h,反应产物采用0.01-0.5M Tris-HCl(0.1-2%NaCl)缓冲液换相,并加入等体积的甘油。
更进一步的,所述包被抗体用PBS换相稀释成1-5mg/mL,生物素用DMSO溶解为2-20mg/mL。
优选的,所述标记抗体为TRAIL小鼠单克隆抗体、IP-10小鼠单克隆抗体、CRP小鼠单克隆抗体,所述标记抗体具有吖啶酯标记。
进一步的,所述标记抗体的制备方法如下:
将标记抗体与吖啶酯按照摩尔比1:10-1:40的比例进行混匀,并在室温下反应0.5-4h,加入赖氨酸室温下混匀0.5-1h。
更进一步的,所述标记抗体浓度为1-5mg/mL,所述吖啶酯采用DMSO溶解为2-20mg/ml,所述赖氨酸的浓度为200-500mg/mL,所述赖氨酸的加入质量为抗体质量的20-40倍。
优选的,所述磁珠具有链霉亲和素修饰。
优选的,所述发光底物包括A液及B液,所述A液为H2O2,发光底物B为NaOH。
优选的,所述校准品为含有TRAIL蛋白、IP-10蛋白、CRP蛋白的复合校准品,设置线性范围内低、中、高三个浓度水平。
优选的,所述质控品为含有TRAIL蛋白、IP-10蛋白、CRP蛋白的复合质控品,设置线性范围内低、高两个浓度水平。
优选的,所述包被抗体及标记抗体的缓冲液中还具有氯化钠、表面活性剂、蛋白保护剂及糖类。
进一步的,所述表面活性剂为包括但不限于曲拉通、吐温20(Tween-20)、吐温80(Tween-80)中的一种。
进一步的,所述蛋白保护剂为包括但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白、赖氨酸、甘氨酸、牛IgG中的一种。
进一步的,所述糖类为包括但不限于海藻糖、蔗糖中的一种。
进一步的,所述缓冲液包括0.1-2%NaCl、0.05-0.5%表面活性剂,0.5%-5%蛋白保护剂,0.5%-5%的糖类,0.5-1%的防腐剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中,以137例从第三方医学检验实验室收集的样本对TRAIL,IP-10,CRP三个标志物的联合检测效果进行说明。
上述137例样本中,其中108例确诊为病毒感染,29例确诊为细菌感染,统计各标志物进行ROC分析,得出区分细菌和病毒感染的相关参数如下:
表1
对于单独检测,认为CRP≤41.5 mg/L、TRAIL≥78.5 pg/mL、IP-10≥454 pg/mL分别判定为病毒感染可能性大,反之判定为细菌感染可能性大;对于联合检测,其中两个或以上的标志物同为阳性(CRP≤41.5 mg/L即CRP标志物为阳性,TRAIL≥78.5 pg/mL即TRAIL标志物为阳性,IP-10≥454 pg/mL即IP-10标志物为阳性),则判断为病毒感染;两个或两个以上标志物同为阴性(CRP>41.5 mg/L即CRP标志物为阴性,TRAIL<78.5 pg/mL即TRAIL标志物为阴性,IP-10<454 pg/mL即IP-10标志物为阴性)则判断为细菌感染;对单独检测和联合检测灵敏度和特异性进行统计如下表所示:
表2 不同检测方法灵敏度和特异性
从上述灵敏度数据可以看出,本发明采用联合检测手段显著提高了检测灵敏度和特异性。
实施例2
本实施例中,提供一种TRAIL、IP-10、CRP的联合检测试剂盒。
本发明所述的TRAIL、IP-10、CRP含量的试剂盒组成包括缓冲液、试剂A(吖啶酯标记的标记抗体溶液),试剂B(生物素标记的包被抗体溶液),磁分离试剂(链霉亲和素磁珠溶液),校准品(系列浓度的TRAIL,IP-10,CRP,用于建立标准曲线),质控品(含有一定浓度的TRAIL,IP-10,CRP),底物液(催化底物发光)。
1、缓冲试剂的配制:在含蛋白(试剂A和试剂B)的PBS缓冲体系中,添加0.9%NaCl,调节pH在8.0-8.5之间,加入0.25%Tween-20,0.5%甘氨酸,0.5%的海藻糖,0.1%的防腐剂Proclin-300,充分混均至完全溶解,加入适量纯化水定量,搅拌混匀1.5h,验证pH是否在5.5-6.5之间。使用过滤装置将其过滤,2-8℃下保存备用。
此缓冲液较常见抗试剂缓冲体系相比,加入了蛋白保护剂(甘氨酸)及糖类(海藻糖),使整个反应体系更稳定,可得到平行性好且准确的检测结果,从而提高了试剂盒稳定性。
2、试剂A的制备:标记抗体与吖啶酯采用以下步骤偶联:
(1)将标记抗体换相浓缩使其浓度为3mg/mL;吖啶酯事先用DMSO溶解为10mg/mL的溶液;赖氨酸用水溶解为300mg/mL。
(2)按照标记抗体和吖啶酯摩尔比为1:20的比例将两者进行混匀,室温下混匀反应2.5h。
(3)向反应物中加入30倍的抗体量的赖氨酸作为终止液,室温下混均反应45min。
(4)将标记后试剂用缓冲试剂在蛋白纯化仪或透析袋中进行换相,稀释成0.8μg/mL,制备成试剂A。
3、试剂B的制备:生物素与包被抗体采用以下步骤偶联:
(1)将包被抗体用PBS换相稀释成3mg/mL,生物素用DMSO溶解为10mg/mL。
(2)按照包被抗体和生物素摩尔比为1:25将两者进行混匀,室温下混匀反应2.5h。
(3)将反应物用0.05M Tris-HCl(0.9%NaCl)缓冲液换相。
(4)在其中加入等体积的甘油混匀置于-20℃下保存备用。
(5)标记了生物素的包被抗体用缓冲试剂稀释成0.25μg/mL,制备成试剂B。
4、链霉亲和素磁珠混悬液的制备
向0.05M Tris缓冲液中加入0.9%NaCl、0.5%BSA、0.3%Tween-20配制pH8.0-pH8.5的稀释液,将外购链霉亲和素磁珠原液稀释至1.5mg/mL,2-8℃保存备用。
5、校准品缓冲液的制备
在0.05M的Tris缓冲体系中,添加0.9% NaCl、3%海藻糖,充分混匀1h后,调节pH至8.0-8.5之间,加入3%酪蛋白、0.1%的Proclin-300充分混匀1h后,验证pH在8.0-8.5之间,用过滤装置将其过滤,2-8℃保存。
6、校准品的配制
校准品是由外购的TRAIL,IP-10,CRP抗原,用校准品缓冲液稀释而成。
7、发光底物A为H2O2,发光底物B为NaOH。
8、所述的检测TRAIL,IP-10,CRP含量的试剂盒的使用方法:
全自动磁微粒化学发光仪取试剂A 80μL至孵育杯中,然后加入30μL校准品、质控品或者样本,80μL试剂B,37℃下孵育10min,孵育过后,加入30μL磁微粒混悬液,37℃下孵育10min,采用300μL的清洗液清洗3次,最后加入化学发光底物A和B各100μL,检测发光值,根据校准品曲线,计算TRAIL,IP-10,CRP的浓度。
本实施例中,还对本实施例试剂盒与市售试剂盒的性能进行了比对,具体对其进行重复性、检出限和线性范围性能指标检测。
检测方法如下:
最低检测限:用零浓度校准品作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的相对发光值(RLU)或OD值,计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-信号值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的信号值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限。
线性范围:参考各厂家说明书。
表3 TRAIL 试剂盒性能比较
表4 IP-10 试剂盒性能比较
表5 CRP 试剂盒性能比较
实施例2所述检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。上述标记用的吖啶酯为深州市美凯特科技有限公司生产;标记用的生物素为Sigma公司生产;TRAIL、IP-10、CRP抗体为R&D公司生产;链霉亲和素磁珠为百迈格生物科技有限公司生产;发光底物、清洗浓缩液为仪器配套用试剂。
为了验证实施例2中缓冲液体系能够提高检测的准确性和重复性,本实施例通过37℃加速试验对缓冲液体系提高检测稳定性和准确性的效果进行验证:
该检测中,分别使用了4种配方(对照组为:A配方不含蛋白保护剂亦不含糖类;B配方不含蛋白保护剂含有糖类;C配方含蛋白保护剂不含糖类;实验组为实施例2中“1、缓冲试剂的配制”配方)在37℃放置7天后对CRP试剂盒指标包括线性、最低检测限、准确度、重复性进行检测,数据如下:
表64种配方具体成分
表737℃加速试验结果
上述表7中样本1、样本2分别为低浓度和高浓度的质控品。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种区别细菌、病毒感染的检测方法,其特征在于,所述检测方法以TRAIL、IP-10、CRP作为检测标志物,向待测血清中加入包被抗体及标记抗体构建包被抗体-标志物-标记抗体复合物,通过磁珠分离所述复合物并进行化学发光检测。
2.如权利要求1所述区别细菌、病毒感染的检测方法,其特征在于,所述检测方法中,将TRAIL、IP-10、CRP中任意两种或三种标志物的组合结果对细菌、病毒感染进行判断,CRP≤41.5 mg/L即CRP标志物为阳性, TRAIL≥78.5 pg/mL即TRAIL标志物为阳性,IP-10≥454pg/mL即IP-10标志物为阳性,反之则为阴性;两种或两种以上标志物为阳性时判断为病毒感染,两种或两种以上标志物为阴性则判断为细菌感染。
3.如权利要求1所述区别细菌、病毒感染的检测方法,其特征在于,所述检测方法具体步骤如下:将待测血清与生物素标记的包被抗体、混合孵育,加入标记抗体后获得包被抗体-标志物-标记抗体复合物,最后加入链霉亲和素磁珠将所述复合物连接在磁珠上,在外加磁场中沉淀磁珠并将所述复合物移出加入发光底物后对光强度进行检测。
4.如权利要求3所述区别细菌、病毒感染的检测方法,其特征在于,所述血清与包被抗体、标记抗体在35~39℃孵育8~12min;所述加入磁珠后35~39℃孵育8~12min。
5.一种用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括TRAIL、IP-10、CRP的包被抗体、磁珠、标记抗体、发光底物、校准品及质控品;所述包被抗体及标记抗体的缓冲液中还具有蛋白保护剂及糖类。
6.如权利要求5所述用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,其特征在于,所述包被抗体为TRAIL小鼠单克隆抗体、IP-10小鼠单克隆抗体、CRP小鼠单克隆抗体,所述包被抗体具有生物素标记;
所述包被抗体和生物素以摩尔比1:10-1:40进行混匀,室温反应0.5-4h,反应产物采用0.01-0.5M Tris-HCl缓冲液换相,并加入等体积的甘油;所述包被抗体用PBS换相稀释成1-5mg/mL,生物素用DMSO溶解为2-20mg/mL。
7.如权利要求5所述用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,其特征在于,所述标记抗体为TRAIL小鼠单克隆抗体、IP-10小鼠单克隆抗体、CRP小鼠单克隆抗体,所述标记抗体具有吖啶酯标记;所述标记抗体的制备方法如下:将标记抗体与吖啶酯按照摩尔比1:10-1:40的比例进行混匀,并在室温下反应0.5-4h,加入赖氨酸室温下混匀0.5-1h;所述标记抗体浓度为1-5mg/mL,所述吖啶酯采用DMSO溶解为2-20mg/ml,所述赖氨酸的浓度为200-500mg/mL,所述赖氨酸的加入质量为抗体质量的20-40倍。
8.如权利要求5所述用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,其特征在于,所述包被抗体及标记抗体的缓冲液中还具有氯化钠和表面活性剂。
9.如权利要求8所述用于判断细菌、病毒感染的试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂为曲拉通、吐温20、吐温80中的一种;所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、赖氨酸、牛IgG、甘氨酸中的一种;所述糖类为海藻糖、蔗糖中的一种。
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- 2021-12-21 CN CN202111567047.2A patent/CN113945712A/zh active Pending
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