CN113433318A - 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供及一种检测甲胎蛋白异质体AFP‑L3含量的试剂盒及其检测方法和应用，属于生物检测技术领域。所述试剂盒包括试剂A、试剂B、磁分离试剂和底物液；其中，试剂A包含吖啶酯标记的小扁豆凝集素溶液；试剂B包含生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液；磁分离试剂包含链霉亲和素磁珠溶液。本发明利用磁微粒与化学发光技术相结合，提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好的定量检测试剂盒及其检测方法，并适用于全自动化学发光仪，操作简单，适合临床大量检测血清的需求，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒及其检测方法 和应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)含量的试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肝癌可分为原发性和继发性两大类，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。发病率和致死率高，近年来呈逐年上升的趋势。肝癌具有早期不易发现、进展期迅速、复发率高，对化疗药物不敏感的特点，因此预后不佳。目前肝癌诊断仍主要依赖于影像学检查、肝组织病理活检。但超声、CT、MRI等影像学检查难以鉴别早期肝细胞癌和肝硬化不典型增生结节，对于较小的肝癌结节(<1cm)检出率还很低。病理学检查是诊断肝癌的金标准，但由于穿刺活检存在着种植转移的风险，以及取样影响结果等，增加了对肝癌普查和早期诊断的难度。因此，肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌病死率具有重要意义。因而，急需通过简捷的血清学检测来辅助早期诊断。

甲胎蛋白(AFP)被认为是原发性肝癌(HCC)诊断和预后判断的首选血清标志物，但长期的临床实践表明，40％的HCC患者血清AFP水平可能处于正常范围，而在慢性肝炎或肝硬化患者中却可能出现假性增高的现象，其临床应用价值存在一定的局限性。虽然大部分肝癌患者血清AFP含量升高，但仍有约30％的患者呈阴性或低水平状态，故单纯依靠AFP诊断肝癌易导致漏诊。国内外研究表明，AFP-L3是肝癌细胞所特有的一种物质，相比较影像技术，AFP-L3可以提前9-12个月被检测出，AFP-L3占总AFP超过10％，提示肝癌的发生率大于95％，这大大提高了肝癌的检查率，对于肝癌的早发现早治疗有着重要的意义。

HCC患者的血清中AFP和异常凝血酶原(PIVKA-II)均可用于监测治疗效果及预测肿瘤的复发风险。PIVKA-II阳性患者肝内转移、门静脉侵袭和肝静脉血栓形成以及包膜浸润的发生率较高。目前，国内外多个肝病协会均已将AFP、AFP-L3％和PIVKA-II列为HCC诊断的重要指标。

对于AFP-L3的测定，国内最早主要采用离心管分离方法，该方法采用琼脂糖偶联LCA，通过离心方法分离出AFP-L3，然后再用其他AFP检测试剂进行检测，但该方法操作程序复杂，耗时长，且不能实现自动化和批量测定。

热景生物公开了一种用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒，专利号CN108627653 A。该试剂盒包含分离试剂和检测试剂，其中分离试剂包括偶联凝集素的磁性颗粒、清洗液和洗脱液，该试剂用于待检样品中AFP-L3的分离；检测试剂包含包被甲胎蛋白抗体的磁性颗粒，标记酶的抗甲胎蛋白抗体，该试剂主要用于AFP和AFP-L3的检测。但是上述检测方法的弊端是可能造成特异性吸附，且系统操作程序相对较多，分离磁珠容易沉降，不易混匀，重复性不好，容易引起检测结果的偏差。

广州华弘生物公开了一种甲胎蛋白异质体定量检测试剂盒，专利号CN104965088A。该试剂盒包含甲胎蛋白单克隆抗体包被的酶标板、凝集素/对照不含有凝集素、HRP标记的AFP单克隆抗体，根据OD值测定甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的含量。但该方法操作复杂，用时较长，且不能自动化。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)含量的试剂盒及其检测方法和应用。本发明利用磁微粒与化学发光技术相结合，提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好的定量检测试剂盒及其检测方法，并适用于全自动化学发光仪，操作简单，适合临床大量检测血清的需求，因此具有良好的实际应用价值。

本发明的第一个方面，提供一种检测甲胎蛋白异质体含量的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、磁分离试剂和底物液；

其中，试剂A包含吖啶酯标记的小扁豆凝集素溶液；

试剂B包含生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液；

磁分离试剂包含链霉亲和素磁珠溶液；

底物液用于催化底物发光；

所述试剂盒还包括校准品和质控品。

本发明的第二个方面，提供上述试剂盒的制备方法，所述制备方法至少包括：

抗试剂缓冲液的配制；

试剂A的制备；

试剂B的制备。

所述试剂盒的制备方法还包括链霉亲和素磁珠混悬液的制备和校准品的配制。

本发明的第三个方面，提供上述试剂盒在AFP-L3检测中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种AFP-L3检测的方法，所述方法包括采用上述试剂盒对AFP-L3进行检测。

具体的，可采用一步延时法、一步法或两步法进行检测。当反应模式为上述一步延时法时，该试剂盒的灵敏度和线性最好，因此优选为一步延时法。

本发明的第五个方面，提供上述试剂盒和/或检测方法在肝癌早期诊断中的应用。

本发明的第六个方面，提供一种用于肝癌早期诊断的系统，所述系统包括检测模块、数据处理模块和结果显示模块；

所述检测模块，其用于检测待测样本中AFP-L3、AFP和PIVKA-II的含量；

其中，检测AFP-L3含量可使用上述试剂盒；

所述数据处理模块，其基于上述检测模块的检测结果结合算法，用于计算待测患者患有肝癌概率情况；

所述结果显示模块，用于输出计算结果。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1.上述技术方案利用磁微粒与化学发光技术相结合，提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好的定量检测方法，并适用于全自动化学发光仪，操作简单，适合临床大量检测血清的需求；

2.上述技术方案将吖啶酯直接标记在小扁豆凝集素上，实现了甲胎蛋白异质体的分离和检测同时进行，最终使得甲胎蛋白异质体的检测操作简单，用时短，可自动化。

3.上述技术方案采用生物素和链霉亲和素高亲和力和多级放大效应，赋予该分析方法更高的检测敏感度、特异性、稳定性。

4.上述技术方案采用独特的缓冲体系提高检测的稳定性和重复性。

5.上述技术方案中使用的磁微粒试剂作为一种试剂盒通用试剂，较大地减少了因连接差异而产生的批间差，提高了试剂盒的精密度及稳定性，因此具有良好的实际应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中不同吖啶酯标记量获得的工作液信号值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，目前针对甲胎蛋白异质体的检测往往存在整个检测流程较为复杂、检测时间长、灵敏度低、精密度差等缺点。

有鉴于此，本发明提供一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法，其工作原理为：小扁豆凝集素和甲胎蛋白单克隆抗体形成类似双抗夹心的方法。利用磁微粒化学发光免疫分析方法对样本中甲胎蛋白异质体含量进行定量测定。反应的技术原理为：吖啶酯标记的小扁豆凝集素同校准品、质控品或者样本中的甲胎蛋白异质体和标记生物素的甲胎蛋白单克隆抗体三者，形成抗体-抗原-凝集素复合物，最后加入链霉亲和素磁珠，通过生物素和链霉亲和素特异性的结合连接在磁颗粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入化学发光底物液A和B。吖啶酯在碱性条件下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。发光强度与样本中甲胎蛋白异质体的含量呈正比，使用四参数Logistic方程拟合可计算出样本中甲胎蛋白异质体的浓度。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种检测甲胎蛋白异质体含量的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、磁分离试剂和底物液；

其中，试剂A包含吖啶酯标记的小扁豆凝集素溶液；本发明中将吖啶酯直接标记在小扁豆凝集素上，作为检测试剂盒的一个组分，既能够和甲胎蛋白异质体特异性结合又能形成信号值，是将分离甲胎蛋白异质体和检测甲胎蛋白异质体同时进行，应用在甲胎蛋白异质体的临床检测。

试剂B包含生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液；

磁分离试剂包含链霉亲和素磁珠溶液；

底物液用于催化底物发光。在本发明的一个具体实施方式中，底物液包含发光底物A和发光底物B，其中，发光底物A可以为H₂O₂，发光底物B可以为NaOH。

所述试剂盒还包含抗试剂缓冲液，所述抗试剂缓冲液是通过向MES缓冲体系中添加NaCl、表面活性剂、蛋白类保护剂、酪蛋白、糖类和防腐剂制成，pH控制为4.5-6.5。通过采用上述抗试剂缓冲液，能够有效提高检测的稳定性和重复性。

其中，表面活性剂可以为吐温20。

更具体的，所述抗试剂缓冲液的成分包括：0.05-0.5M的MES缓冲体系中，0.1-2％NaCl，0.05-0.5％表面活性剂，0.5％-5％蛋白类保护剂，0.05-0.5％酪蛋白，0.5％-5％的糖类，0.5-1‰的防腐剂，pH为4.5-6.5。

本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒还包括校准品和质控品。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述试剂盒的制备方法，所述制备方法至少包括：

抗试剂缓冲液的配制；

试剂A的制备；

试剂B的制备。

其中，所述抗试剂缓冲液的配制方法包括：在0.05-0.5M的MES缓冲体系中，添加0.1-2％NaCl，调节pH在4.5-6.5之间，加入0.05-0.5％表面活性剂，0.5％-5％蛋白类保护剂，0.05-0.5％酪蛋白，0.5％-5％的糖类，0.5-1‰的防腐剂，充分混均至完全溶解，加入纯化水定量，搅拌混匀0.5-2h，维持pH在4.5-6.5之间。使用过滤装置将其过滤，2-8℃下保存备用。

更优选的，所述抗试剂缓冲液的成分包括：pH6.0的MES缓冲体系中，0.75％的NaCl，0.3％吐温20，3％蛋白类保护剂(如BSA)，0.05％酪蛋白，3％的糖类(如海藻糖)，1‰的防腐剂(如叠氮钠)。

经试验证明，本发明中的抗试剂缓冲液通过加入了蛋白保护剂及糖类等，从而使整个反应体系更稳定，提高检测的准确性和可重复性。

所述试剂A的制备方法包括：

将小扁豆凝集素与吖啶酯混合反应，加入赖氨酸终止反应后，透析后即得。

其中，小扁豆凝集素与吖啶酯的摩尔比控制为1:10～50，如1:10、1:20、1:30、1:40或1:50；当小扁豆凝集素和吖啶酯摩尔比为1:30时，即可达到满意的工作液信号值，因此选择小扁豆凝集素和吖啶酯摩尔比为1:30。

试剂A使用时，采用上述抗试剂缓冲液进行稀释(如稀释成0.1-2μg/mL)进行使用。

所述试剂B的制备方法包括：

将AFP单克隆抗体与生物素混匀反应，经透析后即得。

其中，AFP单克隆抗体与生物素的摩尔比为1:10～40，如1:10、1:20、1:30或1:40。

试剂B使用时，采用上述抗试剂缓冲液进行稀释(稀释成0.5-5μg/mL)进行使用。

本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒的制备方法还包括链霉亲和素磁珠混悬液的制备和校准品的配制；

其中，链霉亲和素磁珠混悬液的制备包括：用0.05-0.5M Tris缓冲液，0.1-2％NaCl，0.5-5％BSA，0.05-0.5％吐温20配置的pH7.0-8.5的稀释液，将链霉亲和素磁珠原液稀释至0.2-3mg/mL。

所述校准品的配制包括：将甲胎蛋白抗原采用校准品缓冲液稀释后即得。

其中，所述校准品缓冲液其成分包括：0.05-0.5M的TRIS缓冲体系中，0.1-2％NaCl，1-10％糖类(如蔗糖)，1-10％蛋白类保护剂(如BSA)，0.5-1‰的防腐剂(如叠氮钠)，pH 7.0-8.5。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述试剂盒在AFP-L3检测中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种AFP-L3检测的方法，所述方法包括采用上述试剂盒对AFP-L3进行检测。

具体的，可采用一步延时法、一步法或两步法进行检测。当反应模式为上述一步延时法时，该试剂盒的灵敏度和线性最好，因此优选为一步延时法。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述试剂盒和/或检测方法在肝癌早期诊断中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于肝癌早期诊断的系统，所述系统包括检测模块、数据处理模块和结果显示模块；

所述检测模块，其用于检测待测样本中AFP-L3、AFP和PIVKA-II的含量；

其中，检测AFP-L3含量可使用上述试剂盒；

所述数据处理模块，其基于上述检测模块的检测结果结合算法，用于计算待测患者患有肝癌概率情况；

所述结果显示模块，用于输出计算结果。

其中，所述待测样本优选为血清样本；

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例所用标记用的吖啶酯为深州市美凯特科技有限公司生产，货号：202414；标记用的生物素为Sigma公司生产，货号：B3295-50MG；AFP抗体山东康瑞健医疗技术有限公司为生产，货号：AB006-1；小扁豆凝集素为阿拉丁公司生产，货号：L140096-10mg；链霉亲和素磁珠为百迈格生物科技有限公司生产，货号为：BMSA10002M-100mL；甲胎蛋白异质体抗原为山东康瑞健医疗技术有限公司生产，货号为：AG006-1；发光底物、清洗浓缩液均来自深圳君和生物集团有限公司成品试剂。

实施例

一种检测甲胎蛋白异质体含量的试剂盒组成包括试剂A(含有一定浓度的吖啶酯标记的小扁豆凝集素溶液)，试剂B(含有一定浓度的生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液)，磁分离试剂(含有一定浓度的链霉亲和素磁珠溶液)，校准品(含有一系列浓度的甲胎蛋白异质体，用于建立标准曲线)，质控品(含有一定浓度的甲胎蛋白异质体)，底物液(催化底物发光)。

步骤一：抗试剂缓冲液的配制：

在0.5M的MES缓冲体系中，添加0.1％NaCl，调节pH在4.5-6.5之间，加入0.05-0.5％表面活性剂，0.5％-5％蛋白类保护剂，0.1％酪蛋白，0.5％-5％的糖类，1‰的叠氮钠，充分混均至完全溶解，加入适量纯化水定量，搅拌混匀1h，验证pH是否在4.5-6.5之间。使用过滤装置将其过滤，2-8℃下保存备用。

本实施例通过优化抗试剂缓冲体系使整个反应体系更稳定，检测结果具有可重复性。

pH筛选，pH从4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，不同pH值的抗试剂缓冲液配置的试剂A，观察半年后，试剂A的稳定性。如表1所示：pH为6.0时，试剂放置半年的稳定性最好。

表1：不同pH值的抗试剂缓冲液配置的试剂A的稳定性

pH	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5
						信号值降幅	32.65％	25.62％	10.62％	5.72％	15.32％

表面活性剂浓度筛选：吐温20，浓度从0.05％，0.1％，0.3％和0.5％。不同吐温20浓度的抗试剂缓冲液配置的试剂A，根据试剂的精密度确定吐温20的浓度。如表2所示：吐温20浓度为0.3％，试剂的精密度最好。

表2：不同浓度的吐温20的抗试剂缓冲液配置的试剂A的精密度

吐温20浓度	0.05％	0.1％	0.3％	0.5％
					精密度	8.0％	5.6％	2.3％	4.0％

蛋白类保护剂选择BSA，BSA浓度的筛选：0.5％，1％，3％和5％。不同BSA浓度的抗试剂缓冲液配置的试剂A，观察半年后，试剂A的稳定性。如表3所示：BSA为3％和5％时，试剂放置半年的稳定性相差不大，因此择BSA为3％。

表3：不同浓度的BSA的抗试剂缓冲液配置的试剂A的稳定性

蛋白类保护剂	0.5％	1％	3％	5％
					信号值降幅	20.65％	10.62％	4.62％	3.42％

海藻糖浓度的筛选：0.5％，1％，3％和5％。不同海藻糖浓度的抗试剂缓冲液配置的试剂A，观察半年后，试剂A的稳定性。如表4所示：海藻糖浓度为3％时，试剂放置半年的稳定性最好。

表4：不同浓度的海藻糖的抗试剂缓冲液配置的试剂A的稳定性

蛋白类保护剂	0.5％	1％	3％	5％
					信号值降幅	22.65％	15.26％	3.62％	4.32％

此缓冲液较常见抗试剂缓冲体系相比，加入了蛋白保护剂及糖类，使整个反应体系更稳定，最终确定该抗试剂缓冲液的成分为pH6.0的MES缓冲体系中，0.75％的NaCl，0.3％吐温20，3％蛋白类保护剂BSA，0.1％酪蛋白，3％的海藻糖，1‰的叠氮钠，可得到平行性好且准确的检测结果，从而提高了试剂盒精密度及准确度。

步骤二：试剂A的制备：

凝集素与吖啶酯采用以下步骤偶联：

1.称取3mg小扁豆凝集素，溶于CB缓冲液(0.03M Na₂CO₃，0.07M NaHCO₃，pH9.4)，配置成3mg/mL的小扁豆凝集素溶液。吖啶酯事先用DMSO溶解为15mg/mL的溶液。赖氨酸用水溶解为500mg/mL。

2.吖啶酯标记量的选择

按照小扁豆凝集素和吖啶酯不同摩尔比1：10，1：20，1：30，1：40和1：50的比例将两者进行混匀，室温下混匀反应2h。

3.向反应物中加入20倍的抗体量的赖氨酸作为终止液，室温下混匀反应30min。

4.最终，将反应物置于透析袋中放置于PBS缓冲液进行透析，每2h更换一次透析液，此操作重复三次。

5.将透析后的物质回收至EP管中，于2-8℃下保存备用

6.标记了吖啶酯的小扁豆凝集素用抗试剂缓冲液稀释成0.5μg/mL，制备成试剂A备用。

本实施例通过调节吖啶酯标记量，以吖啶酯标记状态是否饱和作为验证指标，选择最优的吖啶酯标记量，最优条件下小扁豆凝集素和吖啶酯摩尔比为1：30。如图1所示：横坐标为小扁豆凝集素和吖啶酯摩尔比，纵坐标为偶联获得的工作液信号值。

步骤三、试剂B的制备

生物素与AFP单克隆抗体采用以下步骤偶联：

1.将AFP单克隆抗体置于透析袋中放置于PBS缓冲液中进行透析，每2h更换一次透析液，此操作重复3次。透析过的AFP抗体用PBS稀释成1mg/mL。

2.生物素用DMSO溶解为10mg/mL，按照AFP抗体和生物素摩尔比为1:30量将两者进行混匀，室温下混匀反应2h。

3.最后将反应物用透析袋置于用0.05M Tris-HCl(0.1％NaCl)缓冲液中进行透析，每两个小时换一次透析液，反复3次。

4.透析所得溶液加入等体积的甘油混匀置于-20℃下保存备用。

5.标记了生物素的AFP抗体用抗试剂缓冲液稀释成1μg/mL，制备成试剂B备用。

步骤四：链霉亲和素磁珠混悬液的制备

用0.05M Tris缓冲液，0.1％NaCl，1％BSA，0.3％吐温20配置的pH7.0的稀释液，将外购链霉亲和素磁珠原液稀释至0.2mg/mL，2-8℃保存备用。

步骤五：校准品缓冲液的制备

在0.05M的TRIS缓冲体系中，添加0.1％NaCl，5％蔗糖，充分混匀1h后，调节pH至7.2，加入1％BSA，1‰的叠氮钠充分混匀1h后，验证pH在7.2左右，用过滤装置将其过滤，2-8℃保存。

步骤六：校准品的配制

校准品是外购的甲胎蛋白抗原，用校准品缓冲液稀释，浓度分别为0μg/L,10μg/L,50μg/L,200μg/L,1000μg/L和2000μg/L的甲胎蛋白的溶液。

步骤七：发光底物A为H₂O₂，发光底物B为NaOH；

步骤八：所述的检测甲胎蛋白异质体含量的试剂盒的使用方法：

不同反应模式对试剂灵敏度和线性的影响。

1.一步延时法：全自动磁微粒化学发光仪取30μL磁微粒混悬液至样本杯中，然后加入30μL校准品、质控品或者样本，60μL生物素标记的AFP抗体，37℃条件下孵育10min，然后加入吖啶酯标记的小扁豆凝集素工作液60μL至样本杯中，37℃条件下孵育10min，使用500μL的清洗液清洗3次，最后加入化学发光底物A和B各100μL，检测发光值，根据校准品曲线，回算AFP-L3的浓度。

2.一步法：全自动磁微粒化学发光仪取吖啶酯标记的小扁豆凝集素工作液60μL至样本杯中，然后加入30μL校准品、质控品或者样本，60μL生物素标记的AFP抗体，加入30μL磁微粒混悬液，37℃条件下孵育10min，使用500μL的清洗液清洗3次，最后加入化学发光底物A和B各100μL，检测发光值，根据校准品曲线，回算AFP-L3的浓度。

3.两步法：全自动磁微粒化学发光仪取30μl磁微粒混悬液，加入30μL校准品、质控品或者样本μ，然后加入60μL生物素标记的AFP抗体，37℃下孵育10min，使用500μL的清洗液清洗3次，然后加入吖啶酯标记的小扁豆凝集素工作液60μL至样本杯中37℃条件下孵育10min，使用500μL的清洗液清洗3次，最后加入化学发光底物A和B各100μL，检测发光值，根据校准品曲线，回算AFP-L3的浓度。

本实施例通过筛选不同的反应模式，根据线性和灵敏度指标选择最优的反应模式。如表5所示，当反应模式为上述一步延时法时，该试剂盒的灵敏度和线性最好。

表5：不同反应模式下该试剂的灵敏度和线性相关系数

比较例

依据热景(廊坊)生物技术有限公司的专利CN108627653A公开记载，该专利公开了用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒，其中甲胎蛋白异质体检测流程为：1.分离步骤：分离磁珠和样本，37℃孵育20min，清洗液清洗一次，洗脱液洗脱一次，然后进行磁分离；2.检测步骤：分离后的AFP-L3和包被抗体、标记抗体，震荡混均后，于37℃下孵育10min，然后清洗加底物液，进行检测。整个反应流程包含孵育30min清洗洗脱10min共用时40min左右，用时较长，试剂组分包含分离磁珠、分离清洗液、分离洗脱液、检测磁珠、包被抗体和标记抗体，试剂组分繁多，且反应流程复杂。

依据本实施例专利步骤八的记载，总反应时间孵育20min清洗5min共用时25min左右，用时较短，试剂组分只有三个，相对简单，且反应流程简单。

步骤九：应用本实施例技术制备的AFP-L3含量检测试剂盒的质量检测

(1.)精密度：用三批试剂盒AFP-L3分别在20ng/mL±10％和1000ng/mL±10％水平样本，平行测定10次，计算测定结果，批间精密度CV＜10％。

表6：批间精密度结果

精密度	3批(20ng/mL)	3批(1000ng/mL)
			均值	19.87	1010.13
SD	1.13	43.43
			CV	5.69％	4.3％

从上表数据可知，三批试剂盒测定同一份样本精密度，批间精密度＜10％，表明不同批次的试剂盒之间的差异很小，测量结果具有重复性

(2.)线性范围：选择浓度范围为2000±200ng/mL的分离后的AFP-L3样本，稀释成为0.5ng/mL到1800ng/mL范围内的至少7个稀释浓度，按照本实施例试剂盒的说明书要求，在全自动化学发光仪器仪上检测，将每一浓度的样本重复检测三次，计算平均值，并计算线性相关系数≥0.99。

表7：线性范围测定实验结果

由表7中计算出剂量-反应曲线的线性来看，在0.5-1800ng/mL范围内相关系数为0.9998。因此将本试剂盒AFP-L3的线性范围规定为0.5-1800ng/mL。

(3.)最低检测限：以三批不同批次的检测试剂盒同时检测20次校准品稀释液或者零背景值样本，计算平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程Mean+2SD计算出RLU值，并计算浓度值。功能灵敏度：可选择低浓度样本进行倍比稀释，配制成一系列低浓度样本，测定并计算每个浓度样本的批间CV，CV最接近20％的样本所具有的分析物含量为功能灵敏度。

从下表8可以看出，该试剂盒的最低空白检出限不大于0.05ng/mL，能够准确检测出AFP-L3的浓度不大于0.5ng/mL。

表8灵敏度实验结果

(4.)本实施例试剂盒的临床验证

为了判断本实施例试剂盒检测肝癌与临床上肝癌患者检测的符合率，取来自医院血清肝癌样本302例，正常人血清412例，肝硬化血清203例，肝炎血清213例，分别用本实施例步骤七与对照热景试剂盒进行检测，检测结果见表8

验证结果表明，本实施例试剂盒对于原发性肝癌的符合率高达97.8％，对于健康人的特异性达到100％，对于肝癌高危人群肝炎和肝硬化特异性达到94.98％和89.12％，明显高于对照组热景试剂盒。说明本实施例试剂盒可以突出对肝癌的鉴别诊断，很好的区分良恶性肝病，具有较好的临床实用性。

表9临床样本测定结果

比较例

依据郑州安图生物工程股份有限公司的专利CN108226498A公开记载，该专利公开了一种检测甲胎蛋白异质体AFP-L3含量的试剂盒/试剂板，该试剂盒能够准确检测出AFP-L3的浓度不小于0.52ng/m，未记载线性范围和精密度情况。对于临床样本的检测：原发性肝癌的符合率为95％，肝硬化阳性率为32％，肝炎阳性率为10％。

依据热景(廊坊)生物技术有限公司的专利CN108627653A公开记载，该专利公开了用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒，该试剂盒的线性范围0.6-1200ng/mL，原发性肝癌的阳性检出率为93％，最低检出限不大于0.1ng/mL。

依据本实施例步骤九的记载，本实施例最低检出限，即空白限不大于0.042ng/mL，能够准确检测出AFP-L3的浓度不大于0.5ng/mL。对于临床样本的检测：原发性肝癌的符合率高达97.8％，对于健康人的特异性达到100％，对于肝癌高危人群肝炎和肝硬化特异性达到94.98％和89.12％，

由此可见，本实施例实现的AFP-L3的灵敏度和线性范围远高于对比专利记载的专利数据，达到的发明效果优于对比专利。

步骤十：本实施例还提供了一种用于肝癌早期诊断方法，包括检测模块、数据处理模块和结果显示模块，其中所述检测模块用于利用所述AFP-L3检测试剂盒联合AFP检测试剂盒和PIVKA-II检测试剂盒检测样本中的AFP-L3、AFP和PIVKA-II的含量，所述数据处理模块内置logistic regression回归算法，用于基于所述三种标志物的检测结果以及患者信息计算患者患有肝癌的概率及所述结果显示模块用于输出计算结果。AFP、PIVKA-II和AFP-L3联合检测能提高HCC早期诊断的灵敏度、特异性，为肝癌的临床诊断提供更加可靠的依据。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3)含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、磁分离试剂和底物液；

其中，试剂A包含吖啶酯标记的小扁豆凝集素溶液；

试剂B包含生物素标记的甲胎蛋白抗体溶液；

磁分离试剂包含链霉亲和素磁珠溶液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液用于催化底物发光；优选的，底物液包含发光底物A和发光底物B，其中，发光底物A为H₂O₂，发光底物B为NaOH。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含抗试剂缓冲液，所述抗试剂缓冲液是通过向MES缓冲体系中添加NaCl、表面活性剂、蛋白类保护剂、酪蛋白、糖类和防腐剂制成，pH控制为4.5-6.5；

优选的，所述表面活性剂为吐温20；

优选的，所述抗试剂缓冲液的成分包括：0.05-0.5M的MES缓冲体系中，0.1-2％NaCl，0.05-0.5％表面活性剂，0.5％-5％蛋白类保护剂，0.05-0.5％酪蛋白，0.5％-5％的糖类，0.5-1‰的防腐剂，pH为4.5-6.5；

优选的，所述试剂盒还包括校准品和质控品。

4.权利要求1-3任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括：

抗试剂缓冲液的配制；

试剂A的制备；

试剂B的制备。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗试剂缓冲液的配制方法包括：在0.05-0.5M的MES缓冲体系中，添加0.1-2％NaCl，调节pH在4.5-6.5之间，加入0.05-0.5％表面活性剂，0.5％-5％蛋白类保护剂，0.05-0.5％酪蛋白，0.5％-5％的糖类，0.5-1‰的防腐剂，充分混均至完全溶解，加入纯化水定量，搅拌混匀0.5-2h，维持pH在4.5-6.5之间；

优选的，所述抗试剂缓冲液的成分包括：pH6.0的MES缓冲体系中，0.75％的NaCl，0.3％吐温20，3％蛋白类保护剂，0.05％酪蛋白，3％的糖类，1‰的防腐剂；或，

所述试剂A的制备方法包括：

将小扁豆凝集素与吖啶酯混合反应，加入赖氨酸终止反应后，透析后即得；

其中，小扁豆凝集素与吖啶酯的摩尔比控制为1:10～50；

试剂A使用时，采用上述抗试剂缓冲液进行稀释进行使用；或，

所述试剂B的制备方法包括：

将AFP单克隆抗体与生物素混匀反应，经透析后即得；

其中，AFP单克隆抗体与生物素的摩尔比为1:10～40；

试剂B使用时，采用上述抗试剂缓冲液进行稀释进行使用。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述试剂盒的制备方法还包括链霉亲和素磁珠混悬液的制备和校准品的配制；

其中，链霉亲和素磁珠混悬液的制备包括：用0.05-0.5M Tris缓冲液，0.1-2％NaCl，0.5-5％BSA，0.05-0.5％吐温20配置的pH7.0-pH8.5的稀释液，将链霉亲和素磁珠原液稀释至0.2-3mg/mL；

所述校准品的配制包括：将甲胎蛋白抗原采用校准品缓冲液稀释后即得；

其中，所述校准品缓冲液其成分包括：0.05-0.5M的TRIS缓冲体系中，0.1-2％NaCl，1-10％糖类，1-10％蛋白类保护剂，0.5-1‰的防腐剂，pH 7.0-8.5。

7.权利要求1-3任一项所述试剂盒在甲胎蛋白异质体(AFP-L3)检测中的应用。

8.一种甲胎蛋白异质体检测的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-3任一项所述试剂盒对甲胎蛋白异质体AFP-L3进行检测；

优选的，采用一步延时法、一步法或两步法进行检测。

9.权利要求1-3任一项所述试剂盒和/或权利要求8所述检测方法在肝癌早期诊断中的应用。

10.一种用于肝癌早期诊断的系统，其特征在于，所述系统包括检测模块、数据处理模块和结果显示模块；

所述检测模块，其用于检测待测样本中AFP-L3、AFP和PIVKA-II的含量；

其中，检测AFP-L3含量可使用权利要求1-3任一项所述试剂盒；

所述数据处理模块，其基于上述检测模块的检测结果结合算法，用于计算待测患者患有肝癌概率情况；

所述结果显示模块，用于输出计算结果；

优选的，所述待测样本优选为血清样本；

优选的，所述算法包括logistic regression回归算法。

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