CN112816694A - 一种异常凝血酶原检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异常凝血酶原检测试剂盒，包括：链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA‑II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA‑II抗体、校准品和质控品，制备过程为：制备生物素标记的PIVKA‑II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA‑II抗体和校准品，并将链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA‑II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA‑II抗体、校准品和质控品分装到同一容器中，得检测试剂盒。该试剂盒提高了检测的灵敏度和检测效率，利于医学上大规模推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，更具体地说是涉及一种异常凝血酶原检测试剂盒及制备方法。
背景技术
PIVKA-II是维生素K缺乏或拮抗剂-II诱导的蛋白质(Protein Induced byVitamin KAbsence orAntagonist-II)，又称异常凝血酶原(Des-gamma-carboxyprothrombin,DCP)，正常肝脏在维生素K作用下会产生凝血酶原，但在维生素K缺乏或者肝细胞癌患者中产生异常凝血酶原，其血清水平在维生素K缺乏的患者、使用华法林治疗的患者或肝细胞肝癌(HCC)患者的血清中会升高，可用于HCC的诊断。PIVKA-II血清半衰期约40～72小时，比AFP短3～5天，能更及时反映HCC的疗效，被推荐用于肝细胞癌高危人群的筛查及原发性肝癌的辅助诊断，可与AFP互为补充。
但是，现有技术中，检测PIVKA-II的试剂盒主要用于对已确诊的肝癌患者进行动态监测以及辅助判定疾病进展或治疗效果，不能作为恶性肿瘤早期诊断或确诊的依据，不宜用于普通人群的肿瘤筛查；而且，目前的检测PIVKA-II的试剂盒通常为磁微粒PIVKA-II校准品、包被PIVKA-II抗体的磁微粒混悬液、磁微粒PIVKA-II酶结合物，以形成抗体-抗原-抗体-酶复合物；或者，还有一部分检测PIVKA-II的试剂盒包括检测试纸卡，试纸卡包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫，结合垫上标记有抗PIVKA-II的抗体，后者试剂盒检测灵敏度较低，由于只有一次吸附，容易出现抗体与抗原非特异性位点结合的情况，造成假阳性的产生；前者，灵敏度较高，但是检测成本高，反应时间长，不利于大规模推广及应用。
因此，如何提供一种检测灵敏度高、检测快的PIVKA-II检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种异常凝血酶原检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒提高了检测的灵敏度和检测效率，利于医学上大规模推广和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种异常凝血酶原检测试剂盒，包括：链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品和质控品；其中，质控品浓度包括50mAu/mL和10000mAu/mL；链霉亲和素磁微粒的浓度为1mg/ml。
以上技术方案达到的技术效果是：生物素标记的PIVKA-II抗体是一抗，碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体是二抗。链霉亲和素磁微粒与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。由于链霉亲和素不含糖基且等电点接近于中性，因此链霉亲和素在检测应用中具有更低的非特异性结合水平，因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
作为本发明优选的技术方案，所述校准品和所述质控品均包括：待检PIVKA-II抗原。
作为本发明优选的技术方案，所述生物素标记的PIVKA-II抗体和碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体均为单克隆抗体，且PIVKA-II抗体的分子量为1500000D，生物素分子量为587D。
作为本发明优选的技术方案，所述生物素包括：NHS-DPEG-4-Biotin。
一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，过程为：制备生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体和校准品，并将链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品和质控品分装到同一容器中，得检测试剂盒。
作为本发明优选的技术方案，所述制备生物素标记的PIVKA-II抗体的过程为：
1)量取1mgPIVKA-II抗体；
2)按照抗体与生物素1:20的摩尔比称量生物素，并用DMSO进行溶解至终浓度为5mg/ml，得生物素溶液；
3)在PIVKA-II抗体中加入所述生物素溶液，充分混匀后室温反应2h，得反应产物；
4)用透析袋透析所述反应产物15-18h，并以抗试剂缓冲液将透析产物稀释至0.5μg/ml，得生物素标记的PIVKA-II抗体。
作为本发明优选的技术方案，所述透析袋的截留分子量为500Da，透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液。
作为本发明优选的技术方案，所述制备碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体过程包括：
1)将PIVKA-II抗体进行透析，然后对透析产物进行活化；
2)将碱性磷酸酶用SMCC进行活化；
3)将活化后的抗体和碱性磷酸酶按照1：1的摩尔比进行混合，在2-8℃反应18h，得反应物；
4)将反应物用superdex 200层析柱进行纯化，收集I峰和II峰进行混合，并用抗试剂缓冲液将抗体-碱性磷酸酶稀释至0.1μg/ml，得到碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体。
作为本发明优选的技术方案，制备碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体时，透析袋的截留分子量为1000Da，以0.1M PBS缓冲液对PIVKA-II抗体进行透析15-20h，以2IT对透析产物进行活化。
作为本发明优选的技术方案，所述制备校准品的过程包括：
1)在0.05M的PH＝7.4的TRIS缓冲液中加入牛血清白蛋白，防腐剂，至牛血清蛋白的终浓度为0.5％，防腐剂的终浓度为0.2％，得校准品缓冲液；
2)将PIVKA-II纯品用校准品缓冲液进行不同浓度稀释，得到浓度分别为0.5mAu/mL、5mAu/mL、50mAu/mL、500mAu/mL、10000mAu/mL和30000mAu/mL的校准品。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种异常凝血酶原检测试剂盒，该试剂盒提高了检测的灵敏度，缩短了检测时间，提高了检测效率，而且，该试剂盒在检测时，PIVKA-II抗原与生物素或者碱性磷酸酶间接地连接，解决了开发此项目的关键问题即偶联问题，可以方便地建立异常凝血酶原的磁微粒酶促化学发光体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例2提供的体系1的曲线拟合图；
图2附图为本发明实施例2提供的体系2的曲线拟合图；
图3附图为本发明实施例2提供的体系1的血清测试相关性的曲线图；
图4附图为本发明实施例2提供的体系2的血清测试相关性的曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种异常凝血酶原检测试剂盒，包括：链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品和质控品，其中，校准品和所述质控品均包括：待检PIVKA-II抗原；生物素标记的PIVKA-II抗体和碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体均为单克隆抗体，生物素标记的PIVKA-II抗体是一抗，碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体是二抗；且PIVKA-II抗体的分子量为1500000D，生物素分子量为587D。
试剂盒的检测原理为：链霉亲和素磁珠标记的PIVKA II抗体与样本、校准品或质控品中的PIVKA II特异性抗原结合形成复合物，在外加磁场的作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物。随后加入碱性磷酸酶(AP)标记的PIVKAII配对抗体结合形成“三明治”复合物。在外加磁场的作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，发光强度与样本中的PIVKA II的含量成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中PIVKA II浓度。
实施例2
上述试剂盒的制备方法为：
生物素标记的PIVKA-II抗体制备步骤如下：
1)量取1mgPIVKA-II抗体；
2)通过抗体分子量(1500000)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素；
3)称取0.4mg左右的生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为5mg/ml；
4)在抗体中加入DMSO溶解的生物素，充分混匀后室温反应2h；
5)用截留分子量为500Da的透析袋透析步骤4)中的反应产物15-18h，透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液；
6)用抗试剂缓冲液将混合物稀释至0.5μg/ml，得到生物素标记的PIVKA-II抗体；
碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体制备步骤如下：
1)将PIVKA-II抗体用0.1M PBS进行透析15-20h，然后用2IT进行活化；
2)将碱性磷酸酶用SMCC进行活化；
3)将活化后的PIVKA-II抗体和碱性磷酸酶按照1:1的摩尔比进行混合，2-8℃反应18h，得反应物；
4)将反应物用superdex 200层析柱进行纯化，收集I峰和II峰进行混合后，用抗试剂缓冲液将抗体-碱磷酶稀释至0.1μg/ml，得到碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体；其中，抗试剂缓冲液包括0.15M pH7.5磷酸盐缓冲液、1％牛血清白蛋白和0.1％ProClin300；
校准品制备步骤如下：
1)配制PIVKA-II校准品缓冲液：将0.05M的PH＝7.4的TRIS缓冲液中加入牛血清白蛋白，防腐剂，至牛血清白蛋白的浓度为0.5％，防腐剂的浓度为0.2％；
2)将PIVKA-II抗原纯品用校准品缓冲液进行稀释，校准品浓度分别为mAu/mL、5mAu/mL、50mAu/mL、500mAu/mL、10000mAu/mL和30000mAu/mL的异常凝血酶原溶液，校准品形态为液态且具有良好的稳定性。
将上述制备的生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品及事先准备的质控品、链霉亲和素磁微粒装入试剂盒中。
检测过程如下：
1)待测样本30μl+生物素标记的PIVKA-II抗体30μl+碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体30μl，孵育15min，得体系I；
2)向检测体系中加入链霉亲和素磁微粒30μl，孵育5min，得体系II；然后再磁分离2min，去上清，去除杂质、链霉亲和素磁微粒与生物素标记的PIVKA-II抗体结合形成的物质，得沉淀；
3)对沉淀洗涤3次，每次加入300μl洗涤液；得待检底物，每次吸取待检底物200μl，用全自动仪测值；
我们同时用生物素化的异常凝血酶原单克隆抗体-链霉亲和素磁珠(现有的检测体系，体系1)，异常凝血酶原单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒(本发明的检测体系，体系2)，分别用两个体系对在医院收集的异常凝血酶原样品做检测，同时测试同一组样本，并与给值进行比对，数据如表1所示，体系1和体系2的曲线拟合分别如图1和图2所示；测试血清相关性分别如图3和图4所示；由结果可以看出，不同体系测值与给值相关性都在0.9以上，说明相关性良好，且不同体系之间测值相关性大于0.9，说明体系2较体系1准确度更高一些。
表1.不同体系下测值与给值对比以及测值之间对比
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种异常凝血酶原检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品和质控品；其中，质控品浓度包括50mAu/mL和10000mAu/mL；链霉亲和素磁微粒的浓度为1mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒，其特征在于，所述校准品和所述质控品均包括：待检PIVKA-II抗原。
3.根据权利要求1所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的PIVKA-II抗体和碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体均为单克隆抗体，且PIVKA-II抗体的分子量为1500000D，生物素分子量为587D。
4.根据权利要求1所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒，其特征在于，所述生物素为：NHS-DPEG-4-Biotin。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，过程为：制备生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体和校准品，并将链霉亲和素磁微粒、生物素标记的PIVKA-II抗体、碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体、校准品和质控品分装到同一容器中，得检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备生物素标记的PIVKA-II抗体的过程为：
1)量取1mgPIVKA-II抗体；
2)按照PIVKA-II抗体与生物素1:20的摩尔比称量生物素，并用DMSO进行溶解至终浓度为5mg/ml，得生物素溶液；
3)在PIVKA-II抗体中加入所述生物素溶液，充分混匀后室温反应2h，得反应产物；
4)用透析袋透析所述反应产物15-18h，并以抗试剂缓冲液将透析产物稀释至0.5μg/ml，得生物素标记的PIVKA-II抗体。
7.根据权利要求6所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为500Da，抗试剂缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液。
8.根据权利要求5所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体过程包括：
1)用透析袋对PIVKA-II抗体进行透析，然后对透析产物进行活化；
2)将碱性磷酸酶用SMCC进行活化；
3)将活化后的PIVKA-II抗体和碱性磷酸酶按照1：1的摩尔比进行混合，在2-8℃反应18h，得反应物；
4)将反应物用superdex 200层析柱进行纯化，收集I峰和II峰进行混合，并用抗试剂缓冲液将PIVKA-II抗体-碱性磷酸酶稀释至0.1μg/ml，得到碱性磷酸酶标记的PIVKA-II抗体。
9.根据权利要求8所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，透析袋的截留分子量为1000Da，以0.1M PBS缓冲液对PIVKA-II抗体进行透析15-20h，以2IT对透析产物进行活化。
10.根据权利要求5所述的一种异常凝血酶原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备校准品的过程包括：
1)在0.05M的PH＝7.4的TRIS缓冲液中加入的牛血清白蛋白，防腐剂，至牛血清蛋白的终浓度为0.5％，防腐剂的终浓度为0.2％，得校准品缓冲液；
2)将PIVKA-II抗原纯品用校准品缓冲液进行不同浓度稀释，得到浓度分别为0.5mAu/mL、5mAu/mL、50mAu/mL、500mAu/mL、10000mAu/mL和30000mAu/mL的校准品。
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