CN113533734A - 一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法 - Google Patents

一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法。属于免疫分析技术领域。试剂盒包括：链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液、校准品、洗液和底物溶液。本发明避免组织学检测需取得病理标本，对未取得癌组织病理的患者就无法判断其GP73状态，也难以多次检测的问题。利用血清学检测具有方便、可重复测量、定量、客观以及可以实时检测等特点。反应时间短，避免了放射性污染，简化了实验操作流程，生物素与链霉亲和素之间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。

Description

一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备 方法
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，更具体的说是涉及一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法。
背景技术
肝细胞癌是一种恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强的恶性肿瘤。甲胎蛋白(AFP)是诊断肝细胞癌的重要指标，但30％左右的肝细胞癌患者AFP检测结果为阴性。
高尔基体蛋白73(GP73)是新近发现的一种肝细胞癌相关蛋白，日益增多的研究表明，其在肝癌的诊断和鉴别诊断中具有重要的应用价值，是一种潜在的肿瘤标志物。
高尔基体蛋白73(GP73)，又称为Ⅱ性高尔基体跨膜蛋白(GOLPH2)或高尔基体膜蛋白Ⅰ(GOLM1)，分子量73KD，恒定表达于正常肝脏的胆管上皮细胞，肝实质细胞很少或不表达。用于已经组织学确诊的肝癌患者的病情监测及疗效评价，不能作为恶性肿瘤早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。
因此，如何检测高尔基体蛋白73是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒，包括：链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液、校准品、洗液和的底物溶液。
进一步的：底物溶液包括200～2000mg/L((4氯苯基)硫代)(10甲基吖啶9(10H)亚基)甲基磷酸二钠、2～200mg/L光泽精、200～2000mg/L亚硫酸钠、0.1％～0.5％ProClin300和0.1～0.5mol/L Tris缓冲液。
优选的：生物素化标记GP73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
1)量取GP73抗体和生物素-NHS备用；
2)将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，加入GP73抗体充分混匀；
3)将步骤2)的反应产物透析，得混合物，并用抗试剂缓冲液稀释得生物素化标记GP73抗体溶液。
优选的：GP73抗体为单克隆抗体；GP73抗体和生物素-NHS的摩尔比为0.8～1.2：20；生物素-NHS用DMSO溶解后的终浓度为5mg/ml；反应的时间为2h；透析的透析袋规格为分子量500；透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液，抗试剂缓冲液为0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin300；稀释的程度至混合物为0.5μg/ml。
有益效果在于：生物素与链霉素-亲和素体系结合亲和力高，反应高度专一，提高灵敏度，利用透析去除杂质，从而不增加非特异性结合。
优选的：碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
1)将高尔基体蛋白73抗体用0.1M PBS进行透析，用2-亚氨基硫烷盐酸盐，活化；
2)将碱性磷酸酶用(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯活化；
3)将活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶进行混合，2～8℃反应15～20h，得反应物；
4)将反应物纯化，得碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体；
5)用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体稀释，得碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液。
有益效果在于：利用反应进行标记偶联，从而提升试剂盒碱性磷酸酶与抗体的有效结合和牢固程度。
进一步的：透析所用透析袋的规格为分子量500。
优选的：步骤1)高尔基体蛋白73抗体和2-亚氨基硫烷盐酸盐质量比为20:7，室温活化25～30min；步骤2)碱性磷酸酶和(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的质量比为2:1，室温活化25～30min；步骤3)活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶的质量比为1:1；步骤4)纯化条件为用superdex 200层析柱，在0.15M磷酸盐缓冲液下2mL/S，20～30min后收集Ⅰ峰，30～40min后收集Ⅱ峰，将Ⅰ峰和Ⅱ峰进行混合后，测试波长280的OD值；步骤5)抗试剂缓冲液包括0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin 300；稀释至碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体浓度0.1μg/ml。
有益效果在于：利用纯化步骤，将结合物与游离物分离，从而提升试剂盒灵敏度与特异性。利用抗试剂缓冲液进行稀释，可提升特异性、灵敏度及延长有效期。
优选的：校准品的制备方法包括以下步骤：
1)配制校准品缓冲液：0.05M的pH7.4的TRIS缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白，0.2％防腐剂；
2)将GP73纯品用校准品缓冲液进行稀释，校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的高尔基体蛋白73溶液。
有益效果在于：利用反应进行校准品配制，利用不同浓度校准品测值定制曲线，利用校准品缓冲液配制可以降低测试本底值及延长有效期。
优选的：洗液的制备方法包括以下步骤：
1)纯化水700mL，搅拌条件下依次加入氯化钠20g、磷酸二氢钾2g、十二水磷酸氢二钠29g、氯化钾2g、叠氮钠2g、吐温205mL充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至8.6±0.05；
2)用纯化水定重至1000g，室温搅拌混匀，经0.22μm滤膜过滤，即得洗液。
有益效果在于：利用滤膜过滤，去除杂质避免杂质引起的非特异性结合。
本发明还提供了一种非诊断治疗目的利用磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的方法，包括以下步骤：
1)取样本30μl、生物素标记GP73抗体溶液30μl、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液30μl，37℃孵育15min；
2)加入链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清，洗涤3次，每次300μl洗液；
4)加入底物溶液200μl，检测波长在400～600nm之间的发光值。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法，取得的技术效果为本发明利用血清检测法，由于组织学检测需取得病理标本，对未取得癌组织病理的患者就无法判断其GP73状态，并且也难以多次检测。血清学检测具有方便、可重复测量、定量、客观以及可以实时检测等特点，不失为组织学检测的一种补充。整个反应体系反应时间短，避免了放射性污染，简化了实验操作流程，采样方式降低了病人的痛苦，实现了便捷。生物素与链霉亲和素之间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的体系1曲线拟合示意图。
图2附图为本发明提供的体系2曲线拟合示意图。
图3附图为本发明提供的体系1测试血清相关性示意图，其中给值为北京热景生物技术有限公司的GP73的测值，测值为体系1的测值。
图4附图为本发明提供的体系2测试血清相关性示意图，其中给值为北京热景生物技术有限公司的GP73的测值，测值为体系2的测值。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒及制备方法。
实施例中，所需原料为市售渠道获得，所需设备为实验常规设备，例如，实施例、对照组自万渤生物技术有限公司采购GP73抗体，货号ABGP73010；高尔基体蛋白73抗体，货号ABGP73020；实施例、对照组自北京泽诚生物技术有限公司采购链霉亲和素包被的磁微粒和异硫氰酸荧光素免疫磁微粒。
实施例1
生物素化标记GP73抗体溶液，制备步骤如下：
1)量取1mg GP73抗体(货号ABGP73010单克隆抗体，来源为鼠抗)；
2)通过抗体分子量(150000)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素-NHS；
3)称取0.4mg的生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为5mg/ml；
4)在GP73抗体中加入DMSO溶解的生物素-NHS，充分混匀后室温反应2h；
5)用截留分子量为500(道尔顿)的透析袋透析步骤4)中的反应产物，透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液；
6)用抗试剂缓冲液将混合物稀释至0.5μg/ml作为生物素化标记GP73抗体溶液。
碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体(货号ABGP73020)溶液，制备步骤如下：
1)将2mg高尔基体蛋白73抗体用0.1M PBS进行透析，然后用0.7mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(西格玛)室温条件下活化25～30min；
2)将2mg碱性磷酸酶用1mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(西格玛)室温条件下活化25～30min；
3)将活化后的2mg抗体和2mg碱性磷酸酶进行混合，2～8℃反应15～20h；
4)将反应物用superdex 200层析柱(美国通用)在0.15M磷酸盐缓冲液下2mL/S进行纯化，20～30min后收集Ⅰ峰，30～40min后收集Ⅱ峰，将Ⅰ峰和Ⅱ峰进行混合后使用紫外分光光度计测试波长280的OD值；
5)用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体稀释至0.1μg/ml，其中，抗试剂缓冲液包括0.15M pH7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白(罗氏)，0.1％ProClin300(西格玛)作为碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液。
校准品制备步骤如下：
1)配制GP73校准品缓冲液：0.05M的pH＝7.4的TRIS缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白，0.2％防腐剂；
2)将高尔基体蛋白73纯品用校准品缓冲液进行稀释，校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的高尔基体蛋白73溶液，校准品形态为液态且具有良好的稳定性。
洗液制备步骤如下：
1)选择一个干净的玻璃烧杯，称量其重量并记录，加入纯化水700mL，开启搅拌器；2)依次加入氯化钠(NaCl)20g、磷酸二氢钾(KH2PO4)2g、十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)29g、氯化钾(KCL)2g、叠氮钠(NaN3)2g、吐温20(Tween 20)5mL充分搅拌直至完全溶解；检测并调节pH值至8.6±0.05；
3)用纯水定重至1000g，室温搅拌混匀；
4)使用0.22μm滤膜过滤，室温放置。
将上述成分制备一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒，包括：链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液、校准品、洗液和底物溶液。
对比实验
对照组异硫氰酸荧光素标记GP73抗体(货号ABGP73010)溶液，制备步骤如下：
1)量取1mg GP73抗体；
2)按照GP73抗体与异硫氰酸荧光素的摩尔比为1：30称量异硫氰酸荧光素；
3)称取5mg异硫氰酸荧光素，用0.05M pH 9.0碳酸钠缓冲液溶解至终浓度为5mg/ml；
4)在步骤(1)量取的GP73抗体中加入15.6μl步骤(3)溶解的异硫氰酸荧光素，充分混匀后，室温反应15～18h；
5)用截留分子量为1000(道尔顿)的透析袋透析步骤(4)获得的反应产物，获得混合物；所用透析缓冲液为pH 7.5的0.15M PBS缓冲液；
6)用抗试剂缓冲液将步骤(5)获得的混合物稀释至1μg/ml作为工作液使用；抗试剂缓冲液包括0.15M pH7.5磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProCin300。
体系1(实施例组)：
1)样本30μl+生物素标记GP73抗体30μl+碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体30μl，37℃孵育15min；
2)加入(北京泽诚)链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300μl洗液；
5)加入底物200μl，(使用光子计数器)检测波长在400～600nm之间的发光值。
体系2(对照组)：
1)样本30μl+异硫氰酸荧光素标记GP73抗体30μl+碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体30μl，37℃孵育15min
2)加入(北京泽诚)异硫氰酸荧光素免疫磁微粒30μl，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清；
4)洗涤3次，每次300μl洗液；底物200μl，使用光子计数器检测波长在400～600nm之间的发光值。
同时用生物素标记高尔基体蛋白73抗体-链霉亲和素磁珠(体系1)，异硫氰酸荧光素标记GP73抗体-异硫氰酸荧光素免疫磁微粒(体系2)，分别用两个体系对0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的高尔基体蛋白73样品做检测，同时测试同一组样本，并与北京热景生物技术有限公司的GP73的测值进行比对，数据如下表所示：
表1.不同体系下测值与给值对比以及测值之间对比
Figure BDA0003175933370000081
Figure BDA0003175933370000091
体系1中各浓度点对应的发光值拟合的曲线相关系数R2为0.999，体系2中各浓度点对应的发光值拟合的曲线相关系数R2为0.9868，且体系1中各浓度点的发光值也比体系2中各浓度点的发光值高(参见图1、图2)。
进一步的，对不同体系测试血清相关性，对检测结果进行对比研究，体系1和体系2测值与热景生物测值相关性都在0.9以上，说明相关性良好，但依据相关性回归曲线Y＝aX+b，体系1中a值为1.0187，而体系2中a值为0.5978。因此，本发明的技术方案更可行(参见图3、图4)。
结果表明：生物素与链霉亲和素之间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。
实施例制备的试剂盒，制备方法简单方便，检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被的磁微粒悬浮溶液，生物素化标记GP73抗体溶液、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液、校准品、洗液和底物溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化标记GP73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
1)量取GP73抗体和生物素-NHS备用；
2)将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，加入GP73抗体充分混匀；
3)将步骤2)的反应产物透析，得混合物，并用抗试剂缓冲液稀释得生物素化标记GP73抗体溶液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述GP73抗体为单克隆抗体；所述GP73抗体和生物素-NHS的摩尔比为0.8～1.2：20；所述生物素-NHS用DMSO溶解后的终浓度为5mg/ml；所述反应的时间为2h；所述透析的透析袋规格为分子量500；透析缓冲液为PH＝7.5的0.15M PBS缓冲液，所述抗试剂缓冲液为0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin300；所述稀释的程度至所述混合物为0.5μg/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
1)将高尔基体蛋白73抗体用0.1M PBS进行透析，用2-亚氨基硫烷盐酸盐，活化；
2)将碱性磷酸酶用(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯活化；
3)将活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶进行混合，2～8℃反应15～20h，得反应物；
4)将反应物纯化，得碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体；
5)用抗试剂缓冲液将所述碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体稀释，得碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)所述高尔基体蛋白73抗体和所述2-亚氨基硫烷盐酸盐质量比为20:7，室温活化25～30min；步骤2)所述碱性磷酸酶和(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的质量比为2:1，室温活化25～30min；步骤3)所述活化后的高尔基体蛋白73抗体和碱性磷酸酶的质量比为1:1；步骤4)所述纯化条件为用superdex 200层析柱，在0.15M磷酸盐缓冲液下2mL/S，20～30min后收集Ⅰ峰，30～40min后收集Ⅱ峰，将Ⅰ峰和Ⅱ峰进行混合后，测试波长280的OD值；步骤5)所述抗试剂缓冲液包括0.15M pH 7.3磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，0.1％ProClin 300；所述稀释至所述碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73抗体浓度0.1μg/ml。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品的制备方法包括以下步骤：
1)配制校准品缓冲液：0.05M的pH7.4的TRIS缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白，0.2％防腐剂；
2)将GP73纯品用校准品缓冲液进行稀释，校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL和500ng/mL的高尔基体蛋白73溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗液的制备方法包括以下步骤：
1)纯化水700mL，搅拌条件下依次加入氯化钠20g、磷酸二氢钾2g、十二水磷酸氢二钠29g、氯化钾2g、叠氮钠2g、吐温20 5mL充分搅拌直至完全溶解，调节pH值至8.6±0.05；
2)用纯化水定重至1000g，室温搅拌混匀，经0.22μm滤膜过滤，即得洗液。
8.一种非诊断治疗目的利用磁微粒化学发光法检测高尔基体蛋白73的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取样本30μl、生物素标记GP73抗体溶液30μl、碱性磷酸酶标记高尔基体蛋白73抗体溶液30μl，37℃孵育15min；
2)加入链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；
3)磁分离2min，去上清，洗涤3次，每次300μl洗液；
4)加入底物溶液200μl，检测波长在400～600nm之间的发光值。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114152740A (zh) * 2021-11-16 2022-03-08 珠海科域生物工程股份有限公司 一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法
CN114563570A (zh) * 2022-01-29 2022-05-31 北京美联泰科生物技术有限公司 一种信号放大技术在pgp9.5检测试剂盒中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104198721A (zh) * 2014-07-28 2014-12-10 北京润诺思医疗科技有限公司 一种高尔基体蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用
CN105954267A (zh) * 2016-04-20 2016-09-21 北京中航赛维生物科技有限公司 一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法
CN107941790A (zh) * 2017-11-28 2018-04-20 泰州泽成生物技术有限公司 磁微粒化学发光法测定肾素的试剂盒及其检测方法
WO2018133038A1 (zh) * 2017-01-20 2018-07-26 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测系统
CN112816694A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 泰州泽成生物技术有限公司 一种异常凝血酶原检测试剂盒及制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104198721A (zh) * 2014-07-28 2014-12-10 北京润诺思医疗科技有限公司 一种高尔基体蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用
CN105954267A (zh) * 2016-04-20 2016-09-21 北京中航赛维生物科技有限公司 一种抗组蛋白抗体IgG的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法
WO2018133038A1 (zh) * 2017-01-20 2018-07-26 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测系统
CN107941790A (zh) * 2017-11-28 2018-04-20 泰州泽成生物技术有限公司 磁微粒化学发光法测定肾素的试剂盒及其检测方法
CN112816694A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 泰州泽成生物技术有限公司 一种异常凝血酶原检测试剂盒及制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114152740A (zh) * 2021-11-16 2022-03-08 珠海科域生物工程股份有限公司 一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法
CN114563570A (zh) * 2022-01-29 2022-05-31 北京美联泰科生物技术有限公司 一种信号放大技术在pgp9.5检测试剂盒中的应用
CN114563570B (zh) * 2022-01-29 2023-01-17 北京美联泰科生物技术有限公司 一种信号放大技术在pgp9.5检测试剂盒中的应用

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