CN113933521A - 磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例涉及一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用,涉及检测领域,包括Anti‑FITC羊多抗包被的磁珠、ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体、FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体、含有ProGRP重组抗原的标准品;其中,所述第一、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体为识别ProGRP抗原分子不同表位的单克隆抗体。本发明为磁微粒化学发光免疫法,采用ALP酶促发光,引用了FITC和Anti‑FITC对,并对制备方法及稀释液进行了改进,极大的提高产品的灵敏度、特异性和稳定性,降低了成本,解决了现有试剂盒准确度差、线性范围差等性能问题,解决了手动操作带来的人为误差,实现全自动反应,操作简单,整个反应周期短。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域,特别涉及一种磁微粒化学发光检测试剂盒、磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法及应用。
背景技术
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胃泌素释放肽(GRP)最早是1978年从猪胃细胞分离出来的一种胃肠激素,它由27个氨基酸组成,具有促胃泌素分泌作用,ProGRP是GRP的前体结构,普遍存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺的神经内分泌细胞中。ProGRP因部分氨基酸残基的不同分为3种分子亚型(ProGRP31-125、ProGRP31-118、ProGRP31-115),但它们C-末端均有共同片段ProGRP31-98。研究发现,SCLC患者的肿瘤细胞能合成和释放GRP,并通过自分泌或细胞间的相互作用参与肿瘤的生长、转移过程。目前ProGRP作为SCLC(小细胞肺癌)的早期诊断、疗效判断及预后分析的指标。相比NSE,ProGRP有更高的敏感性和特异性。ProGRP与其它肿瘤标志物尤其是NSE联合运用能提高诊断率,并有助于判断治疗效果和预后,ProGRP另外可用于SCLC(小细胞肺癌)和NSCLC(非小细胞型肺癌)的鉴别。
目前对于ProGRP的体外诊断有放射免疫法(RIA)、酶免疫法(主要为ELISA)、化学发光法(CLIA)等,由于放射免疫法的物质放射性和酶免法灵敏度低等各种缺陷,将会逐渐被淘汰,化学发光法将成为主流。RIA因存在着放射性辐射和标记物放射衰变的问题,污染问题严重,试剂有效期短,操作复杂,极大地影响了其临床使用。ELISA因其传统的固相载体多为酶标板,固/液相反应接触面积小,反应不彻底,测量结果变异较大,空白限也较高,所以在目前对定量检测要求越来越高的情况下,其使用逐渐受到限制。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种磁微粒化学发光检测试剂盒、磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法及应用,本发明将化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合,采用FITC和ALP分别标记抗体,以直径3μm的偶联有抗FITC抗体的超顺磁性微粒作为分离试剂。ALP催化底物发光后,通过仪器测量发光强度。该技术继承了以ELISA为代表的传统免疫检测技术、无放射性污染、操作简便等优点,同时由于采用了磁微粒作为分离载体,用ALP作为标记酶,选用低空白限发光底物。试剂盒在空白限、线性范围、检测重复性等性能方面有了全面的提高。
解决方案
为实现本发明目的,本发明实施例提供了一种磁微粒化学发光检测试剂盒,包括Anti-FITC羊多抗包被的磁珠、ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体、FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体、含有ProGRP重组抗原的标准品;
其中,所述第一、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体为识别ProGRP抗原分子不同表位的单克隆抗体。
本发明的Anti-FITC羊多抗是指Anti-FITC抗原羊多克隆抗体。
进一步地,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体中,ALP通过SMCC桥联到第一胃泌素释放肽前体抗体上;可选地,每1重量份的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.9重量份的ALP标记;可选地,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体中,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体先进行活化再加入ALP和SMCC桥连,可选地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体采用Traut’s Reagent溶液和甘氨酸溶液活化。
进一步地,还含有稀释液,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体通过稀释液稀释后的浓度为0.1μg/mL。
进一步地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体的活化方法为:取第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中加入缓冲液,离心浓缩至2.5~3.5mg/mL,取至EP管中,加入活化剂Traut’s Reagent溶液,室温静置反应,加入的甘氨酸溶液,室温静置反应;除去未反应的活化剂,收集活化后的抗体,浓度调整为3mg/mL。可选地,通过PD10柱纯化去除未反应的活化剂。
进一步地,Traut’s Reagent溶液的浓度为5mg/mL;可选地,甘氨酸溶液的浓度为0.1moL/L;可选地,每1mg第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述Traut’s Reagent溶液的加入量为18~25μL;可选地,每1mg第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述甘氨酸溶液的加入量为45~60μL。
可选地,加入活化剂后室温静置反应的时间为20min;可选地,加入甘氨酸溶液后室温静置反应的时间为5min;可选地,缓冲液为pH9.0的0.2M NaHCO3。
进一步地,桥连方法为:将ALP溶液与SMCC溶液室温静置反应,去除多余的SMCC,收集活化后的ALP,与活化后的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体在2-8℃条件下静置反应获得偶联物,浓缩再稀释,作为试剂2号试剂;可选地,室温静置反应时间为25~35min,可选地为30min,可选地,2-8℃条件下静置反应时间为18~22h,可选地为20h,可选地,SMCC溶液的浓度为10mg/mL;可选地,稀释液为校准品稀释液;试剂2号试剂的浓度为0.1~0.8μg/mL,可选地为0.1μg/mL。
进一步地,偶联物溶液通过Supperdex200凝胶纯化。
进一步地,FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体中,每1重量份的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.075重量份的FITC标记。
可选地,FITC标记第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体的方法为:将FITC、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体分别加入缓冲液制得溶液,将两种溶液混合反应,浓缩再稀释,作为试剂1号试剂;可选地缓冲液采用pH9.0的0.2M NaHCO3;可选地,FITC溶液浓度为0.5mg/mL,可选地,第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液的浓度为3mg/mL;可选地,稀释液为校准品稀释液;可选地,通过PD10柱纯化去除未反应的FITC。试剂1号试剂的浓度为0.1~1.0μg/mL,可选地为0.5μg/mL。
进一步地,Anti-FITC羊多抗包被的磁珠中,每100重量份的裸磁珠用1重量份Anti-FITC抗体包被;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被;可选地,裸磁珠的质量百分数为0.5%,磁珠的粒径为3μm;可选地,Anti-FITC抗体包被磁珠的浓度为0.5mg/mL。
进一步地,Anti-FITC羊多抗包被的磁珠的制备方法为:
(1)取裸磁珠100重量份,清洗,然后用缓冲液定至10mg/mL磁珠悬液,加入EDC室温活化,再加入1重量份Anti-FITC抗体进行包被反应,磁分离去除上清,封闭得包被浓缩液;
可选地,清洗方法为:用0.1M pH 5.0MES缓冲液清洗,共清洗3次;可选地,10mg/mL磁珠悬液用0.1M pH 5.0MES缓冲液制得;可选地,EDC活化30min;可选地,包被反应37℃、3h;
(2)将(1)中的连接物浓缩液用稀释液稀释到0.5mg/mL,即为试剂3号试剂;可选地,稀释液为校准品稀释液。
进一步地,所述标准品包括通过标准品稀释液稀释ProGRP重组抗原的六个浓度的溶液,ProGRP重组抗原的浓度分别为:0、20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL;可选地,所述标准品稀释液为pH8.0的Tris缓冲液,还包含如下成分:1m%BSA、0.05m%新生牛血清、0.1v%吐温20和0.1v%proclin300。
另一方面,提供一种磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,用于制备上述的磁微粒化学发光检测试剂盒,包括如下步骤:
1)每1重量份的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.9重量份的ALP标记制得ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体;
可选地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体采用Traut’s Reagent溶液和甘氨酸溶液活化,可选地活化方法为:取胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中加入缓冲液,离心浓缩至2.5~3.5mg/mL,取至EP管中,加入活化剂Traut’s Reagent溶液,室温静置反应,加入的甘氨酸溶液,室温静置反应;除去未反应的活化剂,收集活化后的抗体,浓度调整为3mg/mL;
2)每1重量份的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.075重量份的FITC标记制得FITC标记第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体;
3)每100重量份的裸磁珠用1重量份Anti-FITC抗体包被;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被制得Anti-FITC羊多抗包被的磁珠;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被;
4)制备含有ProGRP重组抗原的不同浓度的标准品。
本发明的试剂盒的具体组分可以为:
(1)Anti-FITC包被的磁珠:为Anti-FITC羊多抗包被的磁性磁珠,其中磁珠的质量百分数为0.5%,磁珠的粒径为3μm,稀释液为含一定量蛋白稳定剂、防腐剂的Tris缓冲液。具体的制备方法为:裸磁珠为羧基磁珠,取裸磁珠先用MES缓冲液清洗3次,然后用EDC室温活化30min,后加入抗体进行反应37℃、3h,最后用1%BSA封闭。其中抗体与磁珠的质量比为1:100,整个反应缓冲液为0.1M MES pH5.0。
(2)ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体:为ALP标记的ProGRP小鼠单克隆抗体,其中稀释液为含一定量蛋白稳定剂、防腐剂的Tris缓冲液。具体的制备方法为:采用SMCC桥联ALP和第一胃泌素释放肽前体抗体方法,首先ALP用SMCC活化和胃泌素释放肽前体抗体用2-IT活化,两活化物进行反应得到ALP标记的第一胃泌素释放肽前体抗体。其中胃泌素释放肽前体抗体与ALP的质量比为1:0.9。
(3)FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体:为FITC标记ProGRP小鼠单克隆抗体,其中稀释液为含一定量蛋白稳定剂、防腐剂的Tris缓冲液。具体的制备方法为:FITC与第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体在0.2M NaHCO3pH9.0室温反应19h,然后纯化得到标记物。其中第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体与FITC的质量比为1:0.075。
(4)校准品:为含有ProGRP重组抗原的6的浓度点,分别为0、20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL,其中稀释液为含一定量蛋白稳定剂、防腐剂的Tris缓冲液。
进一步地,所述校准品稀释液还用于稀释Anti-FITC羊多抗包被的磁珠、ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体和/或FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体。
进一步地,FITC标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备方法可以为:
(1)取FITC用0.2M NaHCO3pH9.0缓冲液溶解10min,FITC浓度为0.4~0.6mg/mL;
(2)取第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中,加入0.2MNaHCO3pH9.0缓冲液,然后离心浓缩至2.5~3.5mg/mL;
(3)步骤(2)中的浓缩液与步骤(1)中的溶液按比例混合,室温反应19h;可选地,混合比例按照每1mg第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体与0.15mL步骤(1)中溶液混合;
(4)把步骤(3)中反应物移至离心浓缩管中,加入0.2M NaHCO3pH9.0缓冲液,然后离心去除游离的FITC,获得FITC抗体标记物;
(5)用稀释液把FITC抗体标记物稀释到0.5μg/mL,即为试剂1号试剂。
进一步地,ALP标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备方法如下:
(1)取第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中加入0.2M NaHCO3pH9.0缓冲液,离心浓缩至2.5~3.5mg/mL,取至EP管中,加入5mg/mL的活化剂Traut’s Reagent溶液,室温静置反应20min,加入0.1moL/L的甘氨酸溶液,室温静置反应5min;用PD10柱除去未反应的活化剂,收集活化后抗体,浓度调整为3mg/mL;可选地,每1mg胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述Traut’s Reagent溶液的加入量为18~25μL;可选地,每1mg胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述甘氨酸溶液的加入量为45~60μL;
(2)ALP溶液中加入10mg/mL的SMCC溶液,室温静置30min,用PD10柱除去未反应的SMCC,收集活化后ALP,浓度调整为3mg/mL;可选地,每0.9mg质量的ALP中加入5μL SMCC溶液;
(3)将上述(1)和(2)活化物混合,2-8℃条件下静置20h,用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物,获得连接物浓溶液,2-8℃保存备用,可选地,每1mg胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应0.9mg ALP;
(4)将(3)中的连接物浓缩液用稀释液稀释到0.1μg/mL,即为试剂2号试剂。
进一步地,Anti-FITC羊多抗包被的磁珠的制备方法如下:
(1)取裸磁珠100重量份,用0.1M pH 5.0MES缓冲液清洗,共清洗3次,最后用0.1MpH 5.0MES缓冲液定至10mg/mL磁珠悬液,加入EDC室温活化30min,后加入1重量份Anti-FITC抗体进行反应37℃、3h,磁分离去除上清,最后加入1%BSA封闭,即为包被浓缩液
(2)将(1)中的连接物浓缩液用稀释液稀释到0.5mg/mL,即为试剂3号试剂。
另一方面,提供一种磁微粒化学发光检测试剂盒在制备诊断SCLC和/或NSCLC产品中的应用,其特征在于,包括权利要求1至8任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒或权利要求9所述的制备方法制备的磁微粒化学发光检测试剂盒;
可选地,磁微粒化学发光检测试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
S1、加20体积份的的校准品、质控品或待测标本至检测管中;
S2、加50体积份的ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液和FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液至检测管中;
S3、混匀后,37±0.5℃温育20分钟;
S4、加50体积份的Anti-FITC羊多抗包被的磁珠至检测管中;
S5、混匀后,37±0.5℃温育5分钟;
S6、磁分离去上清;
S7、加300体积份的清洗液至检测管中,混匀;
S8、磁分离去上清;
S9、重复步骤S7、S8,至少两遍;
S10、加入200体积份学发光底物至检测管中,混匀;
S11、后检测发光强度。
有益效果
(1)本发明为磁微粒化学发光免疫法,采用碱性磷酸酶(ALP)酶促发光,引用了异硫氰酸荧光素(FITC)和Anti-FITC羊多抗对,并对制备方法及稀释液进行了改进,极大的提高产品的灵敏度、特异性和稳定性,降低了成本,解决了现有试剂盒准确度差、线性范围差等性能问题,配合全自动化学发光设备,解决了手动操作带来的人为误差,实现全自动反应,操作简单,整个反应周期短。
(2)本发明为双抗体夹心化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的一种检测方法。检测原理是:将待测样本,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体和FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体混合温育,其中的异硫氰酸荧光素(FITC)和碱性磷酸酶(ALP)标记的第一、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体,为分别结合ProGRP抗原不同表位的一对ProGRP单克隆抗体,被标记的第一、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体与样本中ProGRP抗原分子结合,形成免疫复合物。然后加入包被FITC抗体的磁分离试剂并且温育,免疫复合物被偶联在磁微粒表面的FITC抗体吸附。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入化学发光底物,ALP催化底物发光,测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与ProGRP抗原浓度呈正比,通过RLU可以从标准曲线上计算出待测样本的ProGRP含量。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明相关性试验例的实施例1的试剂盒和商品化的试剂盒(罗氏的ProGRP电化学发光法检测试剂盒)相关系数图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外,为了更好的说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在一些实施例中,对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
实施例1
1、校准品的制备
用校准品稀释液和ProGRP重组抗原配制6个校准点,浓度分别为0、20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL。校准品稀释液成分包含1%BSA(质量百分百)、新生牛血清0.05%(体积百分比)、0.1%吐温20(体积百分比)、0.1%proclin300(体积百分比)和pH8.0的Tris缓冲液。
2、试剂1号的制备
(1)取5mg FITC用10mL 0.2M NaHCO3pH9.0缓冲液溶解10min,浓度为0.5mg/mL;
(2)取1mg第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中,加入4mL 0.2MNaHCO3pH9.0缓冲液,然后离心浓缩至3mg/mL;
(3)取(1)中0.15mL FITC与(2)中第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体于1.5mL EP管中室温反应19h;
(4)把(3)中反应物移至离心浓缩管中,加入4mL 0.2M NaHCO3pH9.0缓冲液,然后离心浓缩至1mL,即为FITC抗体标记物;
(5)用试剂1号稀释液把FITC抗体标记物稀释到0.5μg/mL,即为试剂1号试剂。
(6)试剂1号稀释液同为校准品稀释液。
3、试剂2号的制备
(1)取1mg第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中,加入4mL 0.2MNaHCO3pH9.0缓冲液,离心浓缩至3mg/mL,取至1.5mLEP管中,加入5mg/mL的活化剂Traut’sReagent溶液20μL,室温静置反应20min,加入0.1moL/L的甘氨酸溶液50μL,室温静置5min。用PD10柱除去未反应的活化剂,收集活化后抗体,浓度调整为3mg/mL,2-8℃保存备用;
(2)取含有0.9mgALP的溶液,加入10mg/mL的SMCC溶液5μL,室温静置30min,用PD10柱除去未反应的SMCC,收集活化后ALP,浓度调整为3mg/mL,2-8℃保存备用;
(3)将上述(1)和(2)活化物混合,2-8℃条件下静置20h,用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物,获得连接物浓溶液,2-8℃保存备用。
(4)将(3)中的连接物浓缩液用试剂2号稀释液稀释到0.1μg/mL,即为试剂2的制备。
(5)试剂2号稀释液同为校准品稀释液。
4、试剂3号的制备
(1)取裸磁珠100mg,加入10mL 0.1M pH 5.0MES缓冲液清洗,共清洗3次,然后加入10mL 0.1M pH 5.0MES缓冲液,加入10mg/mL EDC 1mL室温活化30min,后加入1mg Anti-FITC羊多抗进行反应37℃、3h,磁分离去除上清,最后加入10mL 1%BSA封闭,即为包被浓缩液;
(2)将(1)中的连接物浓缩液用试剂3号稀释液稀释到0.5mg/mL,即为试剂3的制备。
(3)试剂3号稀释液同为校准品稀释液。
检测实施例2
具体的检测流程如下:
1、加20μL校准品、质控品或待测标本至检测管中;
2、加50μL试剂1号、试剂2号至检测管中;
3、混匀后,37±0.5℃温育20分钟;
4、加50μL试剂3号至检测管中;
5、混匀后,37±0.5℃温育5分钟;
6、磁分离去上清;
7、加300μL清洗液至检测管中,混匀;
8、磁分离去上清;
9、重复步骤7、8,两遍;
10、加200μL学发光底物至检测管中,混匀;
11、检测发光强度。
对比例1
与实施例1的区别在于,试剂2号的制备不同:ALP采用戊二醛法偶联到第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体上,具体地:将0.9mg ALP用0.2M NaHCO3调整为浓度为2~4mg/mL,加入20μL 25%的戊二醛室温反应3h,然后用PD10柱去除未反应的戊二醛,用0.2M NaHCO3定容至300μL,活化完成,与上述实施例1步骤(2)中的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体(对应加入量为1mg,浓度2~4mg/mL)的溶液混合,过夜反应18h,然后用AKTA纯化仪根据分子量大小纯化偶联物。
对比例2
与实施例1的区别在于,试剂2号的制备不同:ALP采用过碘酸钠法偶联到第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体上,具体的:1)将10mg/mL ALP溶液和12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液按体积比1:1混合均匀,4℃避光反应30min;再加入与混合溶液等体积的20μL/mL的乙二醇水溶液,混合,常温避光反应30min,活化完成,与上述实施例1步骤(2)中的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体(加入量与ALP质量对等,浓度2~4mg/mL)的溶液混合,反应24h,然后加入2mg/mL的NaBH4(1mg ALP对应80μL NaBH4),反应2h,然后用AKTA纯化仪根据分子量大小纯化偶联物。
对比例3
与实施例1的区别在于,试剂2号的制备不同:ALP采用传统SMCC方法偶联到第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体上,具体的:取2-5mg/ml碱性磷酸酶(ALP)溶液,加入5mg/mlLC-SMCC溶液(每毫升ALP加入50-100μL LC-SMCC),室温反应15-30min;然后在终止缓冲液(包括0.1mol/L磷酸盐,0.5mol/L羟胺和25mM EDTA,PH值7.4)中室温透析2-4h,中间更换缓冲液1-2次,获得活化ALP;与上述实施例1步骤(2)中的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体(ALP与抗体的质量比为0.9mg:1mg)的活化溶液混合,过夜反应18h,然后用AKTA纯化仪根据分子量大小纯化偶联物。
对实施例1的试剂2号、及对比例1~3的试剂2号的的标记物产率进行检测,结果如表1。
表1不同标记方法的酶标记物产率
由表1可知,本发明采用具有异型双功能基团的SMCC试剂进行偶联,对偶联工艺进行了优化,采用PD10柱进行中间过程纯化,相比透析用时短、纯化效果好的优势。本发明的SMCC偶联方法具有操作简单,耗时短,并且酶标记物产率高的优点。
对比试验例
为了研究FITC和anti-FITC羊多抗对的使用对试剂盒检测效果的影响,通过设置对比组和实验组:
实验组:参照实施例1试剂3号的方法制备anti-FITC羊多抗包被的磁珠,并与试剂1、2号配合检测发光值;
对比组:与实验组的区别在于,无试剂1号,并将实施例1试剂3号中的1mg Anti-FITC羊多抗更换为1mg第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体,即对照组的试剂中不含有FITC和anti-FITC羊多抗对,对照组试剂3号为第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体包被磁珠(磁珠浓度0.5mg/mL,对应的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体浓度约为5μg/mL),并与实施例1的试剂2号配合检测发光值。
将实验组、对比组分别检测校准品进行抗体用量的测定,在同样的双抗体夹心法测试血清中的ProGRP,如果不采用FITC和anti-FITC对(对比组),要想达到相近的曲线发光值,就需要大大增加第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体(ProGRP抗体)的量,结果如表1,实验组中试剂1号中第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体(ProGRP抗体)的使用量为0.5μg/mL,而对照组试剂3号中第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体(ProGRP抗体)的使用量为5μg/mL,结果将有9倍抗体量的差异,因此,本发明实施例1采用FITC和anti-FITC对(其成本远远小于ProGRP抗体的成本),可以大大降低ProGRP抗体的使用量,降低成本。
表1实验组、对比组在曲线发光值相接近时的抗体使用量
为了进一步研究实验组、对比组对空白限的影响,使用上述的实验组和对比组进行空白限检测,结果如表2、表3。
空白限的检测方法:用零浓度校准品作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD所对应的RLU值,根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为空白限。
表2实验组检测的空白限
表3对照组检测的空白限
为了进一步对进行特异性对比,采用实验组、对照组随机测试20例正常人血清(均为阴性血清)的ProGRP,结果如表4所示,结果显示,对照组出现两例假阳性(参考范围为0-63pg/mL)。
表4实验组、对照组检测20例正常人血清的ProGRP结果
相关性试验例
本发明还进一步研究了血清相关性,采用实施例1的试剂盒和商品化的试剂盒(罗氏的ProGRP电化学发光法检测试剂盒)进行了200例临床比对试验,结果如图1所示,证明该产品与对比产品在统计学上无显著差异,两种试剂检出结果的一致性较好,相关系数为0.98。
在同样的双抗体夹心法测试血清中的ProGRP,如果不采用FITC和anti-FITC,是将ProGRP抗体一个抗体用于标记碱性磷酸酶,另一个ProGRP抗体直接包被于磁珠上,这样将会大大增加包被于磁珠上的ProGRP抗体的量,另外试验结果显示,本发明引入FITC和anti-FITC抗原抗体对,不仅极大的降低了原料的用量,节省了成本,也在空白限、特异性等方面也有不错的表现。
本发明进一步的试剂盒的效能评价如下:
1)准确度评价
将浓度约为5000pg/mL的胃泌素释放肽前体样品(A)加入到以血清为基质的样品B中,得到样本C,重复测定两次,浓度结果取均值,所加入A的体积与样本B之间的体积比例为1∶9,根据公式(1)计算回收率R,结果如表5所示,应符合2.3的要求。
式中:
R—回收率;
V—样品A液的体积;
V0—样本B液的体积;
c—样本B液加入A液后的检测浓度;
c0—测量B液的浓度;
cs—样本A液的浓度。
表5准确度评价—添加回收实验数据
2)线性范围评价
将接近线性范围上限(5000pg/mL)的高值样本和低值样本按一定比例混合为至少5种浓度的样本,其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。按检验流程进行操作,对每一浓度的样本均重复检测2次,计算其平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数r,数据参见表6。
表6线性范围评价
4)重复性评价
用浓度为(100±20)pg/mL和浓度为(2500±500)pg/mL作为样本各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M×100%得出变异系数CV,结果如表7。
表7重复性评价
5)批间差评价
将实施例的试剂盒取三批,每批试剂盒均测定浓度在(100±20)pg/mL和浓度为(2500±500)pg/mL范围内的样本,每批重复测定10次,计算30次测定结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式(3)计算变异系数(CV),本数据参见表8。
表8批间差评价
测定血清浓度(pg/mL) | 测定次数 | 分析间CV(%) |
100 | 30 | 4.01% |
2500 | 30 | 2.23% |
6)特异性评价
用试剂盒缓冲体系,配制浓度为100ng/ml的胃泌素释放肽(GRP)特异性样本,样本平行测定3次,其测定结果应不高于1.0ng/mL。数据参见表9。
表9特异性实验
测试交叉反应物 | 浓度(ng/mL) | 测定结果(ng/mL) |
GRP | 100 | ≤1 |
GRP | 100 | ≤1 |
GRP | 100 | ≤1 |
7)相关性评价
用实施例的试剂盒和商品化的试剂盒进行了200例临床比对试验,证明该产品与对比产品在统计学上无显著差异,两种试剂检出结果的一致性较好,相关系数为0.98。
8)稳定性评价
对试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的加速稳定性实验,结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确度等指标均在正常范围之内,试剂盒有效期可达12个月。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,包括Anti-FITC羊多抗包被的磁珠、ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体、FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体、含有ProGRP重组抗原的标准品;
其中,所述第一、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体为识别ProGRP抗原分子不同表位的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体中,
ALP通过SMCC桥联到第一胃泌素释放肽前体抗体上;
可选地,每1重量份的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.9重量份的ALP标记;
可选地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体先进行活化再加入ALP和SMCC桥连;
可选地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体采用Traut’s Reagent溶液和甘氨酸溶液活化;
可选地,还含有稀释液,ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体通过稀释液稀释后的浓度为0.1μg/mL。
3.根据权利要求2所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体的活化方法为:取第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中加入缓冲液,离心浓缩至2.5~3.5mg/mL,取至EP管中,加入活化剂Traut’s Reagent溶液,室温静置反应,加入的甘氨酸溶液,室温静置反应;除去未反应的活化剂,收集活化后的抗体,浓度调整为3mg/mL;可选地,通过PD10柱纯化去除未反应的活化剂;
可选地,Traut’s Reagent溶液的浓度为5mg/mL;可选地,甘氨酸溶液的浓度为0.1moL/L;可选地,每1mg第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述Traut’s Reagent溶液的加入量为18~25μL;可选地,每1mg第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体对应的所述甘氨酸溶液的加入量为45~60μL;
可选地,加入活化剂后室温静置反应的时间为20min;可选地,加入甘氨酸溶液后室温静置反应的时间为5min;可选地,缓冲液为pH9.0的0.2M NaHCO3。
4.根据权利要求2或3所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,桥连方法为:将ALP溶液与SMCC溶液室温静置反应,去除多余的SMCC,收集活化后的ALP,与活化后的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体在2-8℃条件下静置反应获得偶联物,浓缩再稀释,作为试剂2号试剂;可选地,室温静置反应时间为25~35min,可选地为30min,可选地,2-8℃条件下静置反应时间为18~22h,可选地为20h,可选地,SMCC溶液的浓度为10mg/mL;可选地,稀释液为校准品稀释液;可选地,试剂2号试剂的浓度为0.1~0.8μg/mL,可选地为0.1μg/mL;可选地,偶联物溶液通过Supperdex200凝胶纯化。
5.根据权利要求1至4任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体中,每1重量份的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.075重量份的FITC标记;
可选地,FITC标记第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体的方法为:将FITC、第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体分别加入缓冲液制得溶液,将两种溶液混合反应,浓缩再稀释,作为试剂1号试剂;可选地缓冲液采用pH9.0的0.2M NaHCO3;可选地,FITC溶液浓度为0.5mg/mL,可选地,第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液的浓度为3mg/mL;可选地,稀释液为校准品稀释液;可选地,通过PD10柱纯化去除未反应的FITC;试剂1号试剂的浓度为0.1~1.0μg/mL,可选地为0.5μg/mL。
6.根据权利要求1至5任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,Anti-FITC羊多抗包被的磁珠中,每100重量份的裸磁珠用1重量份Anti-FITC抗体包被;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被;可选地,裸磁珠的质量百分数为0.5%,磁珠的粒径为3μm;可选地,Anti-FITC抗体包被磁珠的浓度为0.5mg/mL。
7.根据权利要求1至6任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,Anti-FITC羊多抗包被的磁珠的制备方法为:
(1)取裸磁珠100重量份,清洗,然后用缓冲液定至10mg/mL磁珠悬液,加入EDC室温活化,再加入1重量份Anti-FITC抗体进行包被反应,磁分离去除上清,封闭得包被浓缩液;
可选地,清洗方法为:用0.1M pH 5.0MES缓冲液清洗,共清洗3次;可选地,10mg/mL磁珠悬液用0.1M pH 5.0MES缓冲液制得;可选地,EDC活化30min;可选地,包被反应37℃、3h;
(2)将(1)中的连接物浓缩液用稀释液稀释到0.5mg/mL,即为试剂3号试剂;可选地,稀释液为校准品稀释液。
8.根据权利要求1至7任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述标准品包括通过标准品稀释液稀释ProGRP重组抗原的六个浓度的溶液,ProGRP重组抗原的浓度分别为:0、20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL和5000pg/mL;可选地,所述标准品稀释液为pH8.0的Tris缓冲液,还包含如下成分:1m%BSA、0.05m%新生牛血清、0.1v%吐温20和0.1v%proclin300。
9.一种磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)每1重量份的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.9重量份的ALP标记制得ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体;
可选地,所述第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体采用Traut’s Reagent溶液和甘氨酸溶液活化,可选地活化方法为:取第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体至离心浓缩管中加入缓冲液,离心浓缩至2.5~3.5mg/mL,取至EP管中,加入活化剂Traut’s Reagent溶液,室温静置反应,加入的甘氨酸溶液,室温静置反应;除去未反应的活化剂,收集活化后的抗体,浓度调整为3mg/mL;
2)每1重量份的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体用0.075重量份的FITC标记制得FITC标记第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体;
3)每100重量份的裸磁珠用1重量份Anti-FITC抗体包被;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被制得Anti-FITC羊多抗包被的磁珠;可选地,所述裸磁珠先用EDC室温活化再加入Anti-FITC抗体包被;
4)制备含有ProGRP重组抗原的不同浓度的标准品。
10.一种磁微粒化学发光检测试剂盒在制备诊断SCLC和/或NSCLC产品中的应用,其特征在于,包括权利要求1至8任一所述的磁微粒化学发光检测试剂盒或权利要求9所述的制备方法制备的磁微粒化学发光检测试剂盒;
可选地,磁微粒化学发光检测试剂盒的检测方法包括如下步骤:
S1、加20体积份的的校准品、质控品或待测标本至检测管中;
S2、加50体积份的ALP标记的第一胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液和FITC标记的第二胃泌素释放肽前体单克隆抗体溶液至检测管中;
S3、混匀后,37±0.5℃温育20分钟;
S4、加50体积份的Anti-FITC羊多抗包被的磁珠至检测管中;
S5、混匀后,37±0.5℃温育5分钟;
S6、磁分离去上清;
S7、加300体积份的清洗液至检测管中,混匀;
S8、磁分离去上清;
S9、重复步骤S7、S8,至少两遍;
S10、加入200体积份学发光底物至检测管中,混匀;
S11、后检测发光强度。
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