CN112379107A - 胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，属于试剂盒制备技术领域。该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体和偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体。该试剂盒使用链霉亲和素磁珠‑生物素标记抗体‑吖啶酯标记抗体体系，采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强，采用该试剂盒进行ProGRP的检测具有较高的灵敏度和特异性，获得检测结果的准确性更高、时间更短，操作更方便。

Description

胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂盒制备技术领域，具体涉及一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
胃泌素释放肽(GRP)是由McDonald等在1978年从猪的胃组织细胞中分离出一种具有促胃泌素分泌作用的胃肠道激素，由27个氨基酸组成，是有效的促分泌素或调节肽，广泛分布于哺乳动物的胃肠道、神经系统和肺呼吸道。GRP是正常人脑、胃的神经纤维以及胎儿肺的神经内分泌组织存在的激素。胎儿和新生儿支气管上皮内分泌细胞GRP含量丰富。而在成人，GRP仅存在于神经组织和小部分肺的神经内分泌细胞中，且水平较低。肺癌的癌细胞本身亦可产生并分泌GRP，以自分泌的方式调节自身的生长，并且也可以通过局部弥散的方式与周围的肿瘤细胞膜上相应的受体结合，刺激肿瘤的生长，许多小细胞肺癌细胞株和肿瘤组织分泌的GRP储存在细胞质中的高尔基体内，在适当条件下释放到组织中，与细胞膜上的GRP受体结合，使肿瘤细胞增殖和肿瘤无限生长，低水平GRP即可刺激SCLC细胞DNA合成，因而GRP被认为是SCLC的自主生长因子。但由于GRP很容易被肽链端解酶快速降解，活性部分在血中不稳定，从血浆中直接提取可靠的GRP较困难，因而难以在临床上应用。ProGRP是GRP的前体结构，普遍存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺的神经内分泌细胞中。ProGRP根据其部分氨基酸的变异可分为3种生物大分子，它们具有共同的C末端序列(31-98)，能够在血浆中稳定表达，ProGRP是GRP基因编码的产物，大量研究证实ProGRP31-98水平能够代表GRP水平和GRP基因表达，是一种新的肿瘤标志物。
胃泌素释放太前体和神经特异性烯醇化酶是与神经内分泌源组织和肿瘤有关的两种分子。胃泌素释放肽前体水平升高见于多种神经内分泌源肿瘤，包括小细胞肺癌、类癌、具有神经内分泌功能的未分化大细胞肺癌、甲状腺髓样癌、其他神经内分泌恶性肿瘤以及具有神经内分泌功能的不依赖雄性激素的前列腺癌亚组。
良性疾病中的胃泌素释放太前体：胃泌素释放太前体血清浓度在2-50pg/mL时为正常。但是肝脏疾病在内的良性疾病(除肾功能不全外)病人中2.5％血清水平高于50pg/mL但小于80pg/mL。
肺癌中的胃泌素释放太前体：胃泌素释放肽前体是SCLC的特异性肿瘤标志物，但其水平身高还可见于一小部分非小细胞癌(NSCLC)病人。这些病人的血清胃泌素释放肽前体浓度明显低于SCLC病人。胃泌素释放肽前体血清浓度与肿瘤浸润成都有关，胃泌素释放肽前体血清浓度＞150pg/mL时提示SCLC的可能性高达93％。
胃泌素释放肽前体对于SCLC灵敏度高，特异性好。不会因溶血出现假阳性结果，是SCLC早期标志物。目前测定胃泌素释放肽前体的方法有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、化学发光免疫法(CLEIA)等。然而，ELISA发尤其局限性，特异性差、灵敏度低、准确性不高等。放射性免疫方法虽然被认为是准确可靠的方法，但是放射性同位素的辐射影响，废物处理需要专门的实验室，成本高和半衰期短的弊端，已经使该方法逐渐遭到淘汰。
ProGRP化学发光免疫测试剂盒相比传统的检测方法，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应过程更简洁、反应迅速灵敏、线性范围更宽以及特异性更好；另一方面，ProGRP化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的ProGRP测定试剂盒存在操作时间长、准确度差、线性范围窄的问题，而提供一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
本发明首先提供一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，包括：
链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体和偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体。
优选的是，所述的链霉亲和素磁颗粒的质量分数是0.01％～1％。
优选的是，所述的链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。
优选的是，所述化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体中，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与化学发光标记物标记的摩尔比例是1:(3～20)。
优选的是，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。
优选的是，所述偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与偶联标记物标记的摩尔比例是1:(5～20)。
优选的是，所述偶联标记物为生物素。
优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括A液和B液，其中所述化学发光激发液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
优选的是，所述的试剂盒还包括胃泌素释放肽前体校准品，所述胃泌素释放肽前体校准品的浓度分别为0.00pg/mL、15.00pg/mL、50.00pg/mL、100.00pg/mL、500.00pg/mL、1000.00pg/mL、2000.00pg/mL和6000.00pg/mL的胃泌素释放肽前体溶液。
本发明还提供一种上述的胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
步骤二：化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
将ProGRP抗体放入离心管中离心，与溶解于DMF中的化学发光标记物进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2～6h，反应过程需要避光，标记反应结束后，经纯化、收集；
步骤三：胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
取ProGRP抗体，与溶解于DMF中的偶联标记物进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2～6h，反应过程需要避光，标记反应结束后，经纯化、收集。
本发明的有益效果
本发明提供一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒使用链霉亲和素磁珠-生物素标记抗体-吖啶酯标记抗体体系，采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强，选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。采用该试剂盒进行ProGRP的检测具有较高的灵敏度和特异性，获得检测结果的准确性更高、时间更短，操作更方便。
附图说明
图1为胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒ProGRP标准曲线图；
具体实施方式
为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同与描述的其他方式来实施。
本发明首先提供一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，包括：
链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体和偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体。
按照本发明，所述的链霉亲和素磁颗粒的质量分数优选是0.01％～1％，更优选为0.072％。
按照本发明，所述的链霉亲和素磁颗粒的粒径优选是0.05～3μm，更优选为3μm。
按照本发明，所述化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体中，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与化学发光标记物标记的摩尔比例优选是1:(3～20)，更优选为1：3。所述化学发光标记物优选为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。
按照本发明，所述偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与偶联标记物标记的摩尔比例优选是1:(5～20))，更优选为1：5。所述偶联标记物优选为生物素。
按照本发明，所述的试剂盒还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括A液和B液，其中所述化学发光激发液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
按照本发明，所述的试剂盒还包括胃泌素释放肽前体校准品，所述胃泌素释放肽前体校准品的浓度分别为0.00pg/mL、15.00pg/mL、50.00pg/mL、100.00pg/mL、500.00pg/mL、1000.00pg/mL、2000.00pg/mL和6000.00pg/mL的胃泌素释放肽前体溶液。
本发明还提供一种上述的胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50～100mg/ml；链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液的体积比优选为(0.5～1)：(5～10)；所述的混匀时间优选为10-15分钟，所述的缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH7.4；所述的固相试剂的浓度优选为0.01％～1％；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购.
步骤二：化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
将ProGRP抗体放入离心管中离心，优选在室温下离心10s～30s，保证抗体位于离心管底部位置，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，所述的离心温度优选为室温，离心时间优选为0.5min～3min；将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀，所述的混匀时间优选为2-6h，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，所述的封闭时间优选为1-2h，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为1～5mL/min，用PB缓冲液洗脱，分部收集，将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存，使用时将纯化后的胃泌素释放肽前体抗体浓溶液用100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0的缓冲液稀释，2℃～8℃保存。
所述的将ProGRP抗体的质量(μg)：化学发光标记物溶液的体积(μl)优选为500：5；所述的化学发光标记物溶液的浓度优选为2mg/mL；所述的封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为20％；所述的缓冲液为100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0；
步骤三：胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
将ProGRP抗体放入离心管中离心，优选在室温下离心10s～30s，保证抗体位于离心管底部位置，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入偶联标记物溶液离心，所述的离心温度优选为室温，离心时间优选为0.5min～3min；将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀，所述的混匀时间优选为2-6h，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，所述的封闭时间优选为1-2h，标记反应结束后，使用AKTA纯化仪(G25凝胶柱)纯化，流速为1～5mL/min，用PB缓冲液洗脱，分部收集，将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存，使用时将纯化后的胃泌素释放肽前体抗体浓溶液用100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0的缓冲液稀释，2℃～8℃保存。
所述的将ProGRP抗体的质量(μg)：偶联标记物溶液的体积(μl)优选为500：2；所述的偶联标记物溶液的浓度优选为2mg/mL；所述的封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为20％；所述的缓冲液为100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0；
本发明的胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒用于检测胃泌素释放肽前体时，利用全自动化学发光免疫分析仪(CM180)对胃泌素释放肽前体校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的相对光单位(RLU)计算胃泌素释放肽前体的浓度；最后对本发明的胃泌素释放肽前体测定试剂盒进行性能的评价。
实施例1胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒的制备
(1)磁颗粒工艺：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒溶液0.72mL(72mg)，加入10mL的TBST溶液充分混匀10min后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mMMES、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH7.4的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的固相试剂，2℃～8℃保存。
(2)吖啶酯标记工艺：将500ug抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入磷酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μL 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4h。加入1mL20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，流速为3mL/min，用PB缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的胃泌素释放肽前体抗体浓溶液用100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0的缓冲液稀释至终浓度为0.2μg/mL，2℃～8℃保存。
(3)生物素偶联标记工艺：将500ug抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入磷酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入2mL 2mg/mL生物素的DMF溶液，用离心机室温条件下离心30s。2℃～8℃混匀4h。加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上AKTA纯化仪(葡聚糖凝胶G250柱)纯化，流速为3mL/min，用PB缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃～8℃保存。使用时将纯化后的胃泌素释放肽前体抗体浓溶液用100mM Bis-tris丙烷、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.0的缓冲液稀释至终浓度为0.7μg/mL，2℃～8℃保存。
实施例2胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测仪器，方法学采用夹心法，即仪器依次加入25μL的样本，50μL吖啶酯标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体，50μL生物素标记的胃泌素释放肽前体类似物及40μL链霉亲和素磁颗粒。反应20min后，进行磁分离。仪器将反应复合物送入暗室，依次加入发光激发液A液(HNO3溶液)和B液(NaOH溶液)进行发光反应，最后记录相对光单位(RLU)。
实施例3胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒性能评价
(1)线性的评价：将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为5种浓度，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，图1为胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒ProGRP标准曲线图；得到线性相关系数r＝1.0000，线性范围为3.00～6000.00pg/mL，结果详见表1。
表1线性的评价结果
Figure BDA0002744870540000081
(2)最低检测限的评价：对零值校准品进行20次测定相对光单位(RLU)，取其平均值减去两倍的标准差，带入标准曲线所得即为灵敏度；计算胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒的最低检测限＜2.00pg/mL，结果详见表2。
表2最低检测限的评价结果
Figure BDA0002744870540000082
Figure BDA0002744870540000091
(3)准确度的评价：将浓度约为2000.00pg/mL(允许其浓度偏差为±20％)的胃泌素释放肽前体样品(A)加入到相应基质的样品(B)中，所加入(A)/(B)的体积比为1:9，计算回收率为101.77％，结果详见表3。
表3准确度的评价结果
Figure BDA0002744870540000092
(4)重复性的评价：分别用浓度为100±20pg/mL和1000±200pg/mL的样本各重复检测10次，计算两个样本重复性变异系数(CV)分别为1.44％和1.03％，结果详见表4。
表4重复性的评价结果
测定次数 重复性样本1 重复性样本2
Rep1 107.31 1020.83
Rep2 110.77 1006.24
Rep3 107.62 1021.09
Rep4 107.02 1015.56
Rep5 105.26 1034.76
Rep6 106.58 1007.35
Rep7 109.25 1005.96
Rep8 108.64 1024.86
Rep9 107.30 1005.87
Rep10 108.81 1028.41
M(pg/mL) 107.86 1017.09
SD 1.55 10.52
CV 1.44％ 1.03％
(5)抗干扰特异性的评价：66mg/dL胆红素、200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、12g/dL总蛋白、15000IU RF的样本，不会显著影响胃泌素释放肽前体的测定。
(6)稳定性：试剂在2℃～8℃和37℃条件下的烘箱放置14天，测试各项性能指标合格，结果详见表5。
表5稳定性评价结果
Figure BDA0002744870540000101
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：
链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体和偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素磁颗粒的质量分数是0.01％～1％。
3.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。
4.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体中，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与化学发光标记物标记的摩尔比例是1:(3～20)。
5.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。
6.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体，胃泌素释放肽前体单克隆抗体与偶联标记物标记的摩尔比例是1:(5～20)。
7.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物为生物素。
8.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括A液和B液，其中所述化学发光激发液A为硝酸和过氧化氢溶液，B为氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的一种胃泌素释放肽前体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括胃泌素释放肽前体校准品，所述胃泌素释放肽前体校准品的浓度分别为0.00pg/mL、15.00pg/mL、50.00pg/mL、100.00pg/mL、500.00pg/mL、1000.00pg/mL、2000.00pg/mL和6000.00pg/mL的胃泌素释放肽前体溶液。
10.根据权利要求1所述的一种上述的胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
步骤二：化学发光标记物标记的胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
将ProGRP抗体放入离心管中离心，与溶解于DMF中的化学发光标记物进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2～6h，反应过程需要避光，标记反应结束后，经纯化、收集；
步骤三：胃泌素释放肽前体单克隆抗体的制备
取ProGRP抗体，与溶解于DMF中的偶联标记物进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2～6h，反应过程需要避光，标记反应结束后，经纯化、收集。
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