CN111007269A - 总ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法,属于体外检测技术领域。解决了现有的检测总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的方法检测时间长、灵敏度低、重复性差的问题。本发明的试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和R3试剂:R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒;R2试剂包括化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体;R3试剂包括偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体。该试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、重复性好、检测范围广、检测时间短、成本相对较低。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域,具体涉及一种总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(TotalP1NP)化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
骨质疏松症是一种静态疾病:发生骨折前腰背痛等非特异性症状常常被忽视,这极大地提高了医疗费用。早期诊断能够帮助减少医疗经费。目前我国的各级医院主要以骨密度为辅助诊断骨质疏松的标准,尚未全面使用骨代谢标志物指标。如果能做到早期准确诊断,骨质疏松疾病应该是一种可以治疗、控制、甚至治愈的慢性病。
骨基质的有机成分中,I型胶原的含量超过90%。纤维母细胞和成骨细胞先合成I型前胶原,后者继而形成I型胶原。I型前胶原在其氨基端(N端)和羧基端(C端)存在延伸肽链。这些延伸肽链(前肽)在前胶原转化为胶原的过程中将被特异性的蛋白酶切割。当成熟的胶原形成后会沉积于骨基质中。I型胶原蛋白的单链分子量139KDa,由1460个氨基酸组成。其空间结构为三个肽链的螺旋区和两端的非螺旋区组成。Ⅰ型胶原氨基端延长肽(PINP)是N端的异三聚体片段,分子量约100KDa。P1NP反映的是I型胶原的沉积情况,因此是作为一项骨形成标志物。在I型胶原的形成过程中,P1NP被释放至细胞外间隙最终进入血液。P1NP为三聚体形式(由三聚体胶原转化而来),但很快会在热降解作用下成为单体形式。P1NP试剂检测的是血液中所有的P1NP形式。结构完整的P1NP抗原获取困难。发明P1NP试剂检测的是血液中所有的P1NP形式,因此称为总P1NP。
定量检测血清或肝素血浆中的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(Total P1NP),对骨质疏松的诊断起辅助作用。
在国内,血清总Ⅰ型胶原氨基端延长肽检测临床主要以国外罗氏公司试剂应用为主,国外进口试剂价格非常昂贵,给患者带来很大的经济负担,不利于在基层普及。因此,有待开发一种血清总Ⅰ型胶原氨基端延长肽检测灵敏度高、可靠性好的试剂盒,以降低患者使用成本,并提高推广使用。
化学发光免疫测定(CLIA)是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫测定技术。
由于它既具有免疫反应的高度特异性,又具有发光反应的高敏感性,近年来已被国内外临床实验室及科研单位广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、试剂稳定性好、操作简便、容易实现自动化的优点,是理想的临床微量生化检验分析手段。
现有技术中,化学发光体系有多种,最主要的有:HRP-鲁米诺系统、吖啶酯系统、电化学发光体系等。吖啶酯发光体系相对于其他体系而言具有其特殊的优点:首先吖啶酯标记工艺简单,标记物发光稳定,试剂盒有效期长,成本相对较低;且发光为闪光型,发光快速集中且强大,方便实现快速检测,检测的灵敏度和精密度都很高,对于仪器的要求简单,便于实现全自动化操作;其次,吖啶酯发光系统较为简单,碱性-过氧化氢就可以直接发光,不需要增强剂或者催化剂,干扰因素少,本底极低,信噪比很高。
基于以上情况,研制开发高特异性、高灵敏度的吖啶酯类总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫分析试剂盒,定量检测血清或肝素血浆中的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽,对骨质疏松的诊断起辅助作用,从理论与实际意义上讲是切实可行,并有广泛市场前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的检测总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的方法检测时间长、灵敏度低、重复性差的问题,而提供一种总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
本发明首先提供一种总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和R3试剂:
所述R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒;
所述R2试剂包括化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体;
所述R3试剂包括偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体。
优选的是,所述R1试剂中,链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.01%~1%。
优选的是,所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05~3μm。
优选的是,所述R2试剂中,化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL。
优选的是,所述化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比为1:(1~20)。
优选的是,所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
优选的是,所述R3试剂中,偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/mL。
优选的是,所述偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(1~20)。
优选的是,所述偶联标记物为生物素。
优选的是,所述的试剂盒还包括化学发光激发液,所述化学发光激发液包括A液和B液。
更优选的是,所述A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液,B液为氢氧化钠溶液。
优选的是,所述的试剂盒还包括总Ⅰ型胶原氨基端延长肽校准品。
更优选的是,所述总Ⅰ型胶原氨基端延长肽校准品是浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、750ng/mL和1500ng/mL的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽标准溶液,通过标准品稀释液稀释总Ⅰ型胶原氨基端延长肽纯品制成。
本发明还提供上述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、R1试剂的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到R1试剂;
步骤二、R2试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,然后加入碳酸缓冲液,混匀后加入化学发光标记物溶液离心,将离心管密封后放入避光暗盒中,然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀,加入封闭液,放入气浴恒温振荡器中混匀,将封闭好的抗体经过纯化、收集,然后放入缓冲液中稀释,得到R2试剂;
步骤三、R3试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,然后加入TRIS缓冲液,混匀后加入偶联标记物溶液离心,反应适当时间后加入赖氨酸继续反应,最后将反应液用脱盐柱纯化、收集后放入缓冲液中稀释,得到R3试剂;
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,以链霉亲和素磁颗粒作为固相载体,双抗体夹心原理进行检测,结合发光强度和灵敏度都较高的化学发光物质对总Ⅰ型胶原氨基端延长肽进行标记,采用过氧化氢化学发光体系,以双抗体夹心法实现对总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的定量检测;该试剂盒选择化学发光标记物(吖啶酯)为化学发光免疫分析系统的标记材料,该类标记材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光,不需要酶的参与,节约时间及成本;该试剂盒采用链霉亲和素磁珠与偶联标记物(生物素)标记的类似物可以牢牢的结合在一起,减少非特异性吸附,提高测试样本的准确度,抗干扰能力强。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本,并直接给出数值,减少人为操作误差,并且实现无人值守,缩短了临床检测所需的时间,同时检测精度较高,试剂与仪器组成封闭系统,系统误差小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1的试剂盒和现有的试剂盒(总I型胶原氨基端延长肽检测试剂盒(电化学发光法)-罗氏诊断产品(上海)有限公司)分别检测不同浓度的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽样本得到的标准曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面对本发明的具体实施方式进行详细描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,该试剂盒包括R1试剂、R2试剂和R3试剂:
R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒;
R2试剂包括化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体;
R3试剂包括偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体。
上述技术方案中,根据相应类型的物质的存储需要,R1试剂、R2试剂和R3试剂还分别包括能够保证链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体、偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体稳定存储的缓冲液。此缓冲液没有特殊要求,可根据现有技术中,相应类型的物质的存储需求选择。
上述技术方案,R1试剂中,链霉亲和素磁颗粒质量百分比优选为0.01%~1%,更优选为0.072%。链霉亲和素磁颗粒的粒径优选为0.05~3μm,更优选为3μm。当链霉亲和素磁颗粒的粒径低于0.05μm时,抗原或者抗体与磁珠结合率低,可能导致整体相对发光强度(RLU)偏低;当链霉亲和素磁颗粒的粒径高于3μm时,非特异性结合效果明显,可能导致试剂盒灵敏度差等。
上述技术方案,R2试剂中,化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL。化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比优选为1:(1~20),更优选为1:(3~20)。化学发光标记物优选为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌,更优选为吖啶酯。
上述技术方案,R3试剂中,偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/mL。偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比优选为1:(1~20),更优选为1:(5~20)。偶联标记物优选为生物素。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,根据实际需要,还可以包括化学发光激发液,化学发光激发液可通过商购获得,是本领域技术人员常用物质,包括A液和B液,A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液,B液为氢氧化钠溶液。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,根据实际需要,还可以包括校准品。校准品是浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、750ng/mL和1500ng/mL的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽标准溶液,通过标准品稀释液稀释总Ⅰ型胶原氨基端延长肽纯品制成。总Ⅰ型胶原氨基端延长肽纯品可通过本领域技术人员熟知方式获得,标准品稀释液没有特殊限制,可采用本领域技术人员常用标准品稀释液即可。例如100mM PBS缓冲液,pH6.0。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、R1试剂的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到R1试剂;
其中,链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50~100mg/ml;链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液的体积比优选为(0.5~1):(5~10);混匀时间优选为10~15min;缓冲液优选为50mM MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5或100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH7.2;固相试剂的浓度优选为0.01%~1%,更优选为0.05%;链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购,选自安捷伦公司,货号PL6827-1006;R1试剂优选在2~8℃保存。
步骤二、R2试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,保证抗体位于离心管底部位置(通常需室温下离心10s~30s),然后加入磷酸缓冲液,混匀后加入化学发光标记物溶液离心,离心温度优选为室温,离心时间优选为0.5min~3min,然后将离心管密封后放入避光暗盒中,然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀,混匀时间优选为2~4h,然后加入封闭液,放入气浴恒温振荡器中混匀,封闭时间优选为1~2h,将封闭好的抗体经过纯化、收集,然后放入缓冲液中稀释,得到R2试剂;
其中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比优选为1:(1~20),更优选为1:(3~20);化学发光标记物溶液的浓度优选为2~2.5mg/mL;封闭液优选为赖氨酸,质量分数优选为20~25%;缓冲液优选为50mM MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5或100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH6.0;R2试剂优选在2~8℃保存。
步骤三、R3试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,确保抗体位于离心管底部位置(通常需室温下离心10s~30s),离心后加入TRIS缓冲液充分混匀,然后加入偶联标记物,用离心机室温条件下离心30s,2℃~8℃混匀,混匀时间优选为2~4h,加入封闭液,放入气浴恒温振荡器中混匀(25℃),封闭时间优选为1~2h,将封闭好的抗体经过纯化、收集,然后放入缓冲液中稀释,得到R3试剂;
其中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比优选为为1:(1~20),更优选为1:(5~20);偶联标记物溶液的浓度优选为2~3mg/mL;所述的封闭液优选为赖氨酸,偶联标记物的来源为商购,选自ACROBiosystems公司;缓冲液优选为50mM MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5或100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH6.0;R3试剂优选在2~8℃保存。
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒用于检测总Ⅰ型胶原氨基端延长肽时,利用全自动化学发光免疫分析仪(CM180)对总Ⅰ型胶原氨基端延长肽校准品进行检测,绘制标准曲线,内置于电脑软件;然后根据需求测试临床样本,根据样本的相对发光强度(RLU)计算总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的浓度;最后对总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒进行性能(灵敏度、线性、抗干扰/特异性)的评价。
本发明的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒检测待测物时的过程为:以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测工具,方法学为双抗体夹心法,仪器依次加入10μL的待测物,50μL的R2试剂,50μL的R3试剂,孵育10min,然后加入40μL的R1试剂,孵育10min后,进行磁分离,加入清洗液清洗5次,仪器将反应复合物送入暗室,一次加入发光激发液A液(H2O2溶液+HNO3溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应,采集光信号,记录发光值。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒的制备:
步骤一、R1试剂的制备
取浓度100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5mL(50mg),加入10mL的TBST溶液充分混匀10min,放置于磁分离器上,直至上清无混浊,弃上清,留取磁颗粒。重复清洗3次后使用50mM MES、0.05%吐温、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05%的固相试剂,即为R1试剂,2℃~8℃保存;
步骤二、R2试剂的制备
将250μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入PBS缓冲溶液,充分混匀,混匀后加入5μL 2mg/mL吖啶酯DMF溶液,用离心机室温条件下离心30s。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中,之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃),混匀2h。加入1mL 20%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(25℃),中速混匀,封闭时间为1h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪上进行纯化(葡聚糖凝胶G25预装柱),用PB缓冲液洗脱,分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用50mM MES、0.05%吐温、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL,即为R2试剂,2~8℃保存。
步骤三、R3试剂的制备
将500μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入TRIS缓冲溶液,充分混匀,混匀后加入2ml 2mg/mL生物素的DMF溶液,用离心机室温条件下离心30s。2℃-8℃混匀3h。加入1mL 20%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(25℃),中速混匀,封闭时间为2h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪(葡聚糖凝胶G250柱)纯化,用PB缓冲液洗脱,分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用50mM MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为1.0μg/mL,即为R3试剂,2℃~8℃保存。
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
实施例2
总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒的制备:
步骤一、R1试剂的制备
取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.72mL(72mg),加入15mL的TBST溶液充分混匀15min后,放置于磁分离器上,直至上清无混浊,弃上清,留取磁颗粒。重复清洗3次后在100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072%的固相试剂,即为R1试剂,2℃~8℃保存。
步骤二、R2试剂的制备
将500μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s)后加入TRIS冲溶液,充分混匀,混匀后加入15μL 2.5mg/mL吖啶酯DMF溶液,用离心机室温条件下离心45s。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中,之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(23℃),混匀3.5h。加入2mL 25%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(23℃),中速混匀,封闭时间为1.5h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪上进行纯化(葡聚糖凝胶G25预装柱),用PB缓冲液洗脱,分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH6.0的缓冲液稀释至终浓度为0.2μg/ml,即为R2试剂,2℃~8℃保存。
步骤二、R3试剂的制备
将750μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入磷酸缓冲溶液,充分混匀,混匀后加入5ml 3mg/mL生物素的DMF溶液,用离心机室温条件下离心45s。4℃混匀6h。加入3mL 25%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(23℃),中速混匀,封闭时间为2h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪(葡聚糖凝胶G250柱)纯化,用PB缓冲液洗脱,分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用100mM PBS、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300,pH6.0的缓冲液稀释至终浓度为1.2μg/ml,即为R3试剂,2℃~8℃保存。
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
实施例3
总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒的制备:
步骤一、R1试剂的制备
取浓度100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5mL(50mg),加入10mL的TBST溶液充分混匀10min,放置于磁分离器上,直至上清无混浊,弃上清,留取磁颗粒。重复清洗3次后使用50mM MES、0.05%吐温、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05%的固相试剂,即为R1试剂,2℃~8℃保存。
步骤二、R2试剂的制备
将250μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入PBS缓冲溶液,充分混匀,混匀后加入5μL 2mg/mL吖啶酯DMF溶液,用离心机室温条件下离心0.5min。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中,之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃),混匀4h。加入1mL 20%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(25℃),中速混匀,封闭时间为1h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪上进行纯化(葡聚糖凝胶G25预装柱),用PB缓冲液洗脱,分步收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用50mM MES、0.05%吐温、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.4μg/ml,即为R2试剂,2℃~8℃保存。
步骤二、R3试剂的制备
将500μg抗体放入离心管中,保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入TRIS缓冲溶液,充分混匀,混匀后加入2mL 2mg/mL生物素的DMF溶液,用离心机室温条件下离心30s。2℃~8℃混匀3h。加入1mL 20%赖氨酸封闭液,放入气浴恒温振荡器(25℃),中速混匀,封闭时间为2h。将封闭好的抗体使用AKTA纯化仪(葡聚糖凝胶G250柱)纯化,用PB缓冲液洗脱,分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2℃~8℃保存。使用时将纯化后的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽抗体浓溶液用50mM MES、0.05%吐温-20、0.05%Proclin300,pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为1.4μg/mL,即为R3试剂,2℃~8℃保存。
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
对实施例1-3制备的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒性能进行评价。
检测方法:以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测工具,方法学为双抗体夹心法,仪器依次加入10μL的待测物,50μL的R2试剂,50μL的R3试剂,孵育10min,然后加入40μL的R1试剂,孵育10min后,进行磁分离,加入清洗液清洗5次,仪器将反应复合物送入暗室,一次加入发光激发液A液(H2O2溶液+HNO3溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应,采集光信号,记录发光值。
以下为实施例1的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(Total P1NP)化学发光免疫检测试剂盒的评价数据,实施例2~3在样本不变的情况下,检测效果接近,不再赘述。
检测项目和结果:
1、空白限
平行测定零值一级校准品或样本稀释液20次,记录其信号值,计算均数M和标准差SD,并计算M+2SD的值,测定相邻浓度一级校准品3次,记录其信号值,取平均值。根据零值一级校准品和相邻浓度一级校准品之间的浓度—信号值结果进行两点线性回归拟合出一次方程,M+2SD所对应的信号值带入方程,所得浓度即为空白限,结果应小于2ng/mL。
表1Total P1NP空白限测试数据
2、线性
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,其中低值浓度样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测3次,计算平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,计算线性相关系数r,结果应符合要求(线性范围为0.5ng/mL~300ng/mL,线性相关系数r≥0.9900)。
由表2和图1可以看出,本发明的试剂盒与现有的试剂盒(总I型胶原氨基端延长肽检测试剂盒(电化学发光法)-罗氏诊断产品(上海)有限公司)相比具有更宽的线性范围,以及更高的线性线性相关系数,并且在低值范围内具有更高的分析灵敏度,进而可以保证在检测范围内提供更准确的检验结果。
表2Total P1NP线性测试数据
3、重复性
用低、高两种不同浓度的样本各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD),按公式(2)计算变异系数(CV),变异系数(CV)应≤8.0%。
CV=SD/M×100%…………………………………(2)
式中:CV—变异系数;
SD—测量结果的标准差;
M—测量结果的平均值。
表3Total P1NP重复性测试数据
4、批间差
用三个批号试剂盒分别检测同一份样本,则三个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)≤15.0%。
表4Total P1NP批间差测试数据
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂、R2试剂和R3试剂:
所述R1试剂包括链霉亲和素磁颗粒;
所述R2试剂包括化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体;
所述R3试剂包括偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.01%~1%。
3.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05~3μm。
4.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL。
5.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述化学发光标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比为1:(1~20);所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
6.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述R3试剂中,偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/mL。
7.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述偶联标记物标记的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体中,总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(1~20);所述偶联标记物为生物素。
8.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括化学发光激发液,化学发光激发液包括A液和B液,A液为过氧化氢溶液和硝酸溶液,B液为氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括总Ⅰ型胶原氨基端延长肽校准品;
所述总Ⅰ型胶原氨基端延长肽校准品是浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、750ng/mL和1500ng/mL的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽标准溶液,通过标准品稀释液稀释总Ⅰ型胶原氨基端延长肽纯品制成。
10.权利要求1~9任何一项所述的总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、R1试剂的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后,放置在磁分离器上,直至上清液无混浊,弃上清,留取磁颗粒,清洗后在缓冲液中配成固相试剂,得到R1试剂;
步骤二、R2试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,然后加入碳酸缓冲液,混匀后加入化学发光标记物溶液离心,将离心管密封后放入避光暗盒中,然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀,加入封闭液,放入气浴恒温振荡器中混匀,将封闭好的抗体经过纯化、收集,然后放入缓冲液中稀释,得到R2试剂;
步骤三、R3试剂的制备
将总Ⅰ型胶原氨基端延长肽单克隆抗体放入离心管中离心,然后加入TRIS缓冲液,混匀后加入偶联标记物溶液离心,反应适当时间后加入赖氨酸继续反应,最后将反应液用脱盐柱纯化、收集后放入缓冲液中稀释,得到R3试剂;
步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分装,得到总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的化学发光免疫检测试剂盒。
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